báo cáo thực hành dược lý 1 2 3báo cáo thực hành dược lý cổ truyền và hiện đại

- Liều LDso và liều có tác dụng được lý ED: eff&ctive dose trên động vật thí nghiệm là một trong những cơ sở để suy ra liều dùng trong điều trị ở người dựa vào một số phương pháp tính ng

DAI HOC Y DUGC TP HO CHI MINH

KHOA Y HOC CO TRUYEN

BAO CAO THUC HANH

BANG PHAN CONG

Nguyễn Thị Diễm Chi

a , Pham Thi Kiéu Diém

Dinh tinh Saponin Phan Xuân Văn

oe Nguyễn Thị Thanh Mai

Định tinh Tannin Võ Thị Huyền Như Ái

* Kỹ thuật được ly:

Mô hình gây phù chân chuột bằng

carrageenin

- Bat chuột, cân, đọc tên: Tân, Đán, Trâm, Diễm

- Do Vo 2 16: Giang, Thúy, Lành, Ái

- Tiêm gan chan 16 2: Khanh, Van - Do V; 2 16: Mai, Chi, Van, Oanh * Két qua bdo cdo:

- Lý thuyết mô hình: Khang, Thúy - Lập bảng kết quả: Tân, Trâm - Tính toán, nhận xét kết quả: Văn

- Bản luận, kết luận: Tân, Chi - Kết quả, kiến nghị: Khanh, Lành

* Kiểm tra,in ấn, nop bai: Dan

1 Phương pháp nghiên cứu 1.1 Đánh giá độc tính cấp

1.1.1 Tam quan trọng của nghiên cứu độc tinh

- Thuốc dùng là phải an toàn, nêu không an toàn thì dù có tác dụng mạnh đến may ciing khéng duoc ding [1]

- Dé co thé tién hanh tht nghiệm thuốc hay một chế phẩm mới trên người, nhất thiết phải có các nghiên cứu khang định được tính an toàn và hiệu quả trước đó trên

động vật thực nghiệm [3]

-_ Đánh giá độc tính bao gồm nghiên cứu độc tính cấp diễn, độc tính dài hạn, độc tính tại chỗ, độc tính đặc biệt trên sinh sản và phát triển, độc tính sinh miễn dịch Trong đó, nghiên cứu độc tính cấp và nghiên cứu độc tính bán trường diễn (là một loại của nghiên cứu dải hạn) có vai trò quan trọng trong thử nghiệm lâm sàng phát triển các thuốc dược liệu [3]

-_ Phải có “quy chế thương quy đánh giá tính an toàn của thuốc” Tùy theo điều kiện của từng nước mà có quy định cụ thê Mỗi nước thường có quy định khác nhau nhưng khuynh hướng chung ngày càng xích lại gần nhau[[]

- Dé lam tot viée nay, phải có kinh phí và phải có đội ngũ cán bộ chất lượng [ I]

-_ Phải hiện đại hóa việc nghiên cứu độc tính, xây dựng phòng nghiên cứu theo tiêu chuẩn “thực hành tốt phòng thí nghiệm” (Good laboratory practice) [1]

- Tại Việt Nam, Bộ Y Tế quản lý, điều hành, đưa ra các hướng dẫn bằng văn bản cụ thể như : quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền năm 1996, hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ được liệu năm 2015 [4],[5]

1.1.2 Cac khai niém co ban |1),[2]:

- Độc tính của thuốc (toxicity): la tinh chat dugc biéu hién bang tac dung khong mong muốn, có hại cho cơ thê Độc tính của thuốc có thê nhẹ như thay đổi hành vi, thay đổi vận động, buồn nôn, mân ngứa, có thê rất nặng, thậm chí gây chết

- Độc tính cấp của thuốc (acute foxicity) là độc tính xảy ra sau khi dùng thuốc một lần hoặc vài ba lần trong ngày

2

- Liéu chết trung bình: viết tắt là MLD (mean lethal dose) thường được ký hiệu hiệu là LDso (lethal dose 50%) Do la liéu lam chét 50% số con vật thí nghiệm trong

những điều kiện nhất định Biểu thị két qua LDso bang 3 cach:

+ Chỉ biểu thị trị số của LDso

+ Biểu thi bằng trị số của LDso và sai số chuẩn: LD:o = LDso + SE

+ Biểu thị băng trị số của LDso va gidi han tin cay: LDso = LDso (Id + It) 6 P=0,05 Với ld là giới hạn tin cậy đưới, lt là giới hạn tin cậy trên, P là ngưỡng xác suất

Tam quan trọng của LDau:

- LDso là một thông số rất quan trọng đề đánh giá độc tính của một thuốc - Biết LDso sẽ có phương hướng đùng liễu thí nghiệm dược lý một cách đúng đắn Theo kinh nghiệm của tác giả Đỗ Trung Đàm, liều có tác dụng được lý thường vào khoảng 1/10 của LDsạ (trong giới hạn từ 1/20 đến 1/5 của LD:o) Do đó, nên xác định LDso trước khi nghiên cứu dược ly

- Liều LDso và liều có tác dụng được lý (ED: eff&ctive dose) trên động vật thí nghiệm là một trong những cơ sở để suy ra liều dùng trong điều trị ở người dựa vào một số phương pháp tính ngoại suy

- Biết LD:o mới xác định được chỉ số điều trị, một thông số rất quan trọng dé quyết định xem có nên đưa thuốc vào dùng trên người hay không

- Liều hữu hiệu trung bình EDs„ (effective dose): là liều có hiệu quả ở 50% số

con vật thí nghiệm

- Chỉ số điễu trị TI (therapeutic index) là tỷ số giữa liều chết trung bình LDa› và

liều hữu hiệu trung bình EDso(effective dose 50%)

Ti=EÐ30

ED50

Chỉ số điều trị được tính ở cùng một loài động vật thí nghiệm và cho khái niệm

về phạm vi điều trị Nếu thử trên các động vật khác nhau thì phải dùng phép ngoại suy Chỉ số điều trị là một chỉ số giúp đánh giá phạm vi điều trị, chỉ số này càng lớn thì phạm vi điều trị càng rộng, độc tính càng thấp

+ Một chất có TI > 10 được đùng trong điều trị và ít gây ra độc hại, nếu dùng ở liều điều trị Vi du: penicillin co TI > 100

3

+ Một chất có TI < 10 thì phạm vi điều trị hẹp, độc tính cao; chỉ dùng trong điều trị nếu có tác dụng điều trị rất rõ rệt; chưa có thuốc nào an toàn hơn thay thế; khi dùng phải rất thận trọng, theo dõi sát tác dụng có hại Ví dụ: Glycosid tim, các loại thuốc chống ung thư,

- Liêu chết tuyệt đối LD¡ao (absolute lethal dose — ALD): là liều nhỏ nhất gây chết 100% con vật thí nghiệm Tất nhiên nếu dùng liéu cao hon LD go thì tất cả các con vật

đều bị chết

- Liêu dụng nạp tôi đa LDạ (maxunum tolerated - MTD): còn gọi là liều dưới liều chết (ILD: infralethal đose), là liều lớn nhất, nhưng không làm chết con vật nào MTD có thê gây độc nhẹ hoặc nặng cho con vật, nhưng không gây chết

- Bước nhảy liễu (dose space): là khoảng cách giữa hai liều kế tiếp Khoảng cách này có thê bằng nhau hoặc xấp xỉ bằng nhau Thường dùng liều dưới bằng 80% liều lớn kề sát; liều trên băng 125% liều nhỏ kề sát Nói chung, chênh lệch giữa 2 liều kế

tiếp so với liều lớn khoảng 10-30% là vừa

Nếu mỗi liều nhỏ đều bằng một tỷ lệ % nhất định của liều lớn kể sát (ví đụ 80%

chăng hạn) thì bước nhảy liều tính theo Logarit của liều đều bằng nhau Vì vậy, khuynh hướng hiện nay, người ta thường đùng bước nhảy liều bằng nhau tính theo logarit

Vi dụ: về tính bước nhảy liêu, băng các thử nhiệm về dò liêu cơ sở ta có liêu cơ

giữa 2 liều kế tiếp

so với liêu lớn E——D Ta có các liều: 40 , 50, 60, 70 , 80 mg/kg

khoảng 10-30% tức

là # 6-18 mg/kg,

làm tròn 10mg/kg

1.1.3 Mục đích nghiên cứu độc tính cấp

- Nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của thuốc, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp: thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính và tác đụng cũng như phạm vi an toàn của thuốc nghiên cứu tiếp theo

[2].[5]

- Ngoai ra c6 thé ding can lam sang đề theo dõi như điện tâm đồ, điện não đồ, chức năng hô hấp: theo dõi sự biến đổi về hình thái, biên độ và tần số của các sóng xuất hiện trên bảng ghi [2].[5]

- Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc trên động vật thí nghiệm mục đích chính là xác định liều chết trung bình LDs› [1]

1.1.4 Cách xúc dinh LDso a Neuyén tac chung [1]:

- Xác định LD50 là tìm liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm

- Con vật được chia thành nhiều lô tương tự nhau về giới tính (đực, cái), khối

b Yêu cẩu về động vật thí nghiệm [ I] [6]:

- Loài: Tốt nhất là tiến hành trên 2 loài động vật thí nghiệm, một loài gậm nham

và loài không gặm nhấm, loài gặm nhắm thường được thử trên chuột nhắt trắng hoặc

chuột cống trăng Loài khác có thể là chó, khi thường chỉ thử trên 3-5 con để nghiên

cứu dung nạp và các biểu hiện độc đối với mỗi liều, chứ ít có khả năng xác định được LDsu

5

- Giới tính: có thể chỉ thử trên các con đực, hoặc chỉ thử trên các con cái Cũng có thê dùng cả đực và cái, khi đó nên chia đều số đực và cái cho các lô Thông thường là chọn giống cái, đo cơ sở lý thuyết của các thử nghiệm LD:¿ thông thường cho thấy mặc dù có sự khác biệt về độ nhạy giữa các giới, nhưng nữ giới thường nhạy cảm hơn một chút

- Trạng thái sinh lý, bệnh lý: phải dùng các con chuột khỏe mạnh, đã trưởng thành Không dùng các con chuột già, có thai hoặc đang nuôi con bú Không dùng các con chuột bị bệnh Lúc bắt đầu đùng thuốc, mỗi con chuột phải từ 8 đến 12 tuần tuôi

và khối lượng của nó cần ở trong giới hạn + 20% khối lượng trung bình của tất cả

động vật đã sử dụng liều trước đó - Điều kiện nuôi đưỡng và chăm sóc:

+ Chuột thử phải được nuôi giữ trong điều kiện môi trường thí nghiệm, yên tĩnh,

thoáng khí, nhiệt độ từ 20-30°C, độ âm phù hợp (không nhỏ hơn 30% và tốt hơn hết

không lớn hơn 70%) Có đủ các phương tiện đề hạn chế ảnh hưởng của tiếng ồn, nhiệt độ quá nóng hoặc quá lạnh

+ Có đủ chuồng đề nuôi giữ chuột Có thể nuôi nhốt theo từng lô tương ứng với các mức liều thử, nhưng số lượng chuột trong mỗi lồng không được cản trở sự quan sát rõ ràng của từng con Chuồng phải có kích thước phù hợp, có đủ máng và chỗ đề thức ăn, nước uống; chuồng cần phải thoáng và đễ làm vệ sinh

+ Chuột cần được lưu giữ trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 2 ngày trước khi thí

nghiệm đề thích nghi với điều kiện phòng thử nghiệm Chế độ ăn uống bình thường đủ

năng lượng, sinh dưỡng và phải đảm bảo đồng đều giữa các lô

- Số lượng chuột trong mỗi lô: số lượng con vật trong mỗi lô càng nhiều càng chính xác Số lượng tối thiểu cần cho mỗi lô vẫn chưa thống nhất Theo kinh nghiệm và nhiều tài liệu trên thế giới thường dùng mỗi lô 10 con Số chuột trong mỗi lô nên bằng nhau Trường hợp không bằng nhau thì có thể lấy số trung bình để tính toán nhưng mức độ chính xác bị giảm

- Số lô thí nghiệm: ít nhất là 5 lô, trong đó có một lô dùng liều LD¿ (liều lớn nhất

không chết con chuột nào) và một lô đùng liều LD¡ø (liều nhỏ nhất làm tất cả các con chuột đều chết) Giữa hai lô trên phải có ít nhất 3 lô nữa dùng 3 liều khác nhau trong

khoảng từ LD¿ đến LD¡ø, thường thì dùng thêm 3-5 lô nữa

c Chuẩn bị mẫu thie [1];

Mẫu thử có thé là nguyên liệu, hóa chất, thuốc tổng hợp hoặc bán tổng hợp, chế phẩm sinh học hoặc chế phẩm tái tô hợp ADN, dược liệu, có thể là các dạng thành phẩm dùng cho người Với mỗi mẫu thử, cần cung cấp càng nhiều thông tin càng tốt dé dé ra liều thăm đò lúc ban đầu được chính xác Các thông tin có thê gồm: nguồn sốc, bản chất, tính chất, công thức, thành phan, tài liệu về độc tính, tác dụng dược lý, công dụng, cách dùng, đường dùng, liều dùng trên người (nếu có) Nên xử lý mẫu theo cách dự kiến sẽ sử dụng trên người, kế cả mẫu thử ở dạng thành phẩm, đặc biệt chú ý đến dung môi pha thuốc, đường dùng thuốc

Thể tích tối đa có thê dùng (ml) theo đường dùng

Loài chuột | Tịnh Bip | Phúc | Dưới Uần Trực

thì nên cho chuột uống 2-3 lằn/ngày Chú ý khi dùng thê tích lớn (thường là Iml trở

lên cho chuột 20g), nếu chuột không chết, ta có thể kết luận, ở liều đó chuột không

Dung môi hòa tan thuốc

Tốt nhất là dùng nước cất Trường hợp thuốc không hòa tan trong nước cất, thì: () Nếu dùng uống: phải nghiền thuốc thật mịn trong nước cất, tạo thành hỗn hợp dịch đồng nhất Nếu cần, thêm dịch gôm đề hỗn dịch phân tán được đồng đều và chậm lắng:

(H) Nếu dùng tiêm: phải dùng loại dung môi dự kiến sẽ dùng chế thuốc để tiềm cho người sau nảy;

(„) Trong một số trường hợp có thê hòa tan trong DMSO (Dimethylsulfoxid) hoặc NaCMC (Natri carboxymethylcellulose) dung dịch 0,5%

d Cách dò liều cơ sở và ngoại suy liễu [L].2]:

Rất quan trọng, mục đích là tìm LDạ và LD¡ø Nếu không làm bước này, thì có thê xảy ra các trường hợp tất cả động vật thí nghiệm đều sống hoặc chết, gây hao tôn tài nguyên, cũng như là làm chết nhiều động vật thí nghiệm một cách không cần thiết Cách làm:

- Dùng 2 con chuột với một liều nào đó dự kiến 1 con chết và l con sống (Liều theo kinh nghiệm/Tham khảo tài liệu)

- Nếu kết quả chết cả 2 con thì thăm dò 2 con khác với liều giảm đi một nửa - Nếu 2 con đều sống thì phải dùng liều gấp đôi

- Cho đến khi thấy một liều làm I con sống, 1 con chết thì lấy đó làm liều cơ sở - Rồi dùng một số liều lớn hơn theo bước nhảy liều, cho đến một liều làm chết tất cả chuột trong lô 72, và dùng một số liều nhỏ hơn liều cơ sở cho đến một liều mà tất cả chuột đều sống TDa

Ngoại suy liều LDạ và LDjø:

8

- Trường hợp đã dùng 5 liều trở lên mà liều cao nhất vẫn không làm chết 100%

chuột trong lô (chưa có liều LDI00) Nếu liều cao nhất đó đã làm chết từ 90% trở lên

các con chuột trong lô thí nghiệm thì có thể ngoại suy là: thêm một lô nữa dùng liều bằng liều cao nhất đã thử, cộng thêm một bước nhảy liều thì chuột sẽ chết 100%

- Trường hợp đã dùng 5 lô liều trở lên rồi mà liều thấp nhất vẫn có con chết (chưa có liều LD0), nhưng tỷ lệ chết không quá 10% thì có thể ngoại suy là: thêm một lô nữa dùng liều bằng liều thấp nhất đã thử, trừ đi một bước nhảy liễu thid chuột sẽ sống

100%

Ví dụ: Thử độc tính cấp của Morphin Sulfat (tiêm dưới da) trên chuột nhat trắng Bằng Tài liệu tham khảo ta có liều 75zzz⁄g , 2 con đều sống Tăng liều 30mg/kg, dén 60 mg/kg thi | con séng/1 con chét => Liéu co so: 60mg/kg

sông => LD, chêt => LD igo

Trường hợp đã lặp 5 liều trên hoặc dưới mà số chuột thí nghiêm vẫn không chết

hoặc không sống 100% nhưng thỏa điều kiện số chuột chết >90% đối với LD¡oo , số

chuột chết <10% đối với LDu, ta có thế dùng phép ngoại suy liều mà không cần tiếp tục thử nghiệm trên lô chuột khác

x5 x5

VON

Chủ ÿ: Số liệu trong ví dụ chỉ để minh họa cho cách tính LD¿ và LDaoo, số liệu này có thế không chính xác tuyệt đối

e Tién hành thí nghiệm [2]:

Chia chuột thành 6 lô, mỗi lô ít nhất 10 con, tỷ lệ đực cái bằng nhau, gồm:

- Lô l: chuột sử dụng thuốc thử ở liều LDạ, được xác định ở bước dò liều - Lô 2 - 5: chuột được sử dụng thuốc thử ở các mức liều trong khoảng từ LD¿ đến LD theo các bước nhảy liều, sao cho chênh lệch giữa hai liều kế tiếp so với liều lớn hơn nên vào khoảng 10 - 30% Ở những liều dự đoán gần LDso nên gia tăng số lượng

động vật thí nghiệm cho mỗi lô (ít nhất 20 con) đề tăng sự chính xác cho kết quả - Lô 6: chuột sử dụng thuốc thử ở liều LD¡øo được xác định ở bước dò liều

Tiến hành theo dõi chuột, ghi lai cac biéu hién déc và mức độ nghiém trong, xuất hiện độc tính, tiễn triển, phục hồi hoặc chết qua thời gian của mỗi chuột Thời gian theo dõi 24 - 72 giờ, tùy vào đường sử dụng thuốc (nếu tiêm tĩnh mạch thì chỉ cần theo dõi 24 giờ; tiêm bắp, tiêm dưới da, tiêm màng bụng thì theo đõi 48 giờ; nếu uống theo doi 72 giờ) Các con vật chết trong thời gian quan sát được tiến hành mồ xác để tìm nguyên nhân có tôn thương đại thể cơ quan nội tạng hay không Kết quả ghi nhận được tổng hợp thành một bảng ghi rõ số lô thí nghiệm, liều dùng, số con vật thử và số con vật chết ở mỗi lô, ví dụ ở Bảng 2

Bảng 2 Kết quả thử độc tính cấp morphin sulfat (tiêm dưới da chuột nhắt trắng)

Lô Liều dùng Logaritliều Số chuộtthử Số chuột chết

10

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp đề tính LD:o từ các kết quả thực nghiệm thu được, bao gồm các phương pháp dùng phép tính số học theo liều như: phương pháp Belhrens, phương pháp Behrens-Karber; các phương pháp tính theo logarit của liều như phương pháp Bliss, phương pháp Thompson Khi dùng các loại đồ thị vẽ trên giấy kẻ milimet có phương pháp Behrens, phương pháp Behrens-Karber, phương pháp Persin, phương pháp Reed-Muench; phương pháp sử dụng giấy logarit - probit như phương pháp Miller-Tainter, phương pháp Litchfield-WIlcoxon, phương pháp Bliss

Trong đó, phương pháp đơn giản nhất và thường được sử dụng nhiều nhất là phương pháp Behrens - Karber Phuong pháp này dùng trực tiếp các trị số của liều để tính toán nên rất đơn giản, nhưng chỉ xác định được tri số LDso ma không thể hiện được sai số chuân hoặc độ tin cậy của giá trị này Các phương pháp thực hiện kết hợp cả đồ thị và toán đồ đề tính toán như phương pháp Litchfield - Wilcoxon, phương pháp Bliss sẽ cho kết quả chính xác hơn, tuy nhiên cách tính toán khá phức tạp và kết quả tính toán giữa nhiều người khác nhau có thê không giống nhau Tùy theo mục đích của nghiên cứu mà các tác giả có thể lựa chọn phương pháp tính toán cho phù hợp Dưới đây trình bày ví dụ về cách tính LDso bằng phương pháp Behrens, phương pháp Behrens-Karber

Tinh LDso theo Phuong phap Behrens [1]:

Lập bảng tính kết quá (xem ví dụ) trong đó % chết tính bằng số chuột chết chia cho tổng số chuột (chết và sống) ở cột kỳ vọng

Vẽ đồ thị theo số liệu trên bảng: trục tụng: chết; trục hoành: mức liều (tính bằng mg hoặc g/kg chuột)

Tĩnh giả trị LDsạ theo công thức sau:

(50-a)xd

[D,,=A+ b—a

Trong do:

A - liều gây chết a% động vật thí nghiệm

a - ?% động vật thí nghiệm chết sát dưới 50% sao cho a < 50% b - % động vật thí nghiệm chết sát trên 50% sao cho b > 50%

S= (Gia tri LDs; va LD jo lay tir dé thi)

n: Số chuột trong mỗi nhóm d: khoảng cách giữa các liều Ví dụ:

Liều thử Số chuột chếtsống Số chuột chết/ sống % chế

_ 183—164 2

S =9,5mg/kg

210,669,510

Soz=Ï 8 =2,8mg/kg

Cach ghi: LDs = LDsy + Stpso (mg/kg)

Tinh LDs theo Phuong pháp Behrens-Karber [2]: Công thức tính :

b

LD» AD mà 8 ) Nth

Nth

LD =LD 1m -

83426

LDu S875 ” "”0mgilg ø Quan sát, ghỉ chép và báo cáo kết quả [L].[4]:

13

- Các phép thử độc tính cấp cần xác định liều an toàn, liều dung nạp tôi đa, liều gây ra độc tính có thê quan sát được, liều thấp nhất có thê gây chết chuột thí nghiệm,

liều LD50, ghi các biểu hiện độc tính và mức độ nghiêm trong, sự xuất hiện độc, tiến

triển và phục hồi hoặc chết qua thời gian của mỗi chuột trong lô Các triệu chứng bệnh lý quan trọng ở chuột không chết hoặc trước khi chết Phải xét nghiệm đại thế ngay sau khi chết đối với chuột bị chết, và làm xét nghiệm đại thể sau khi kết thúc thí nghiệm đối với chuột còn sống Nếu cần thiết thì tiến hành xét nghiệm vi thê một số phủ tạng hoặc tất cả các phủ tạng theo yêu cầu của đề tài và tình hình bệnh lý của phủ tạng có nghi vấn Nếu nhìn chung không thấy có gì đặc biệt thì chỉ làm xét nghiệm gan, thận, ruột Thời gian theo dõi: tiêm tĩnh mạch là 24 giờ; tiêm bắp, đưới đa, màng bụng là 48 giờ; uống thì cần theo đõi 72 giờ Dữ liệu tông hợp thành một bảng ghi rõ số lô thí nghiệm, liều dùng, số chuột thử và số chuột chết ở mỗi lô

- Báo cáo kết quả cần ghi rõ và đủ các thông tin về: động vật thí nghiệm, điều kiện, phương pháp mẫu thử, chi tiết về mẫu thử, nồng độ, độ ôn định, tính đồng nhất của mẫu thử, kết quả về trọng lượng cơ thể hoặc mức độ thay đối; tiêu thụ thức ăn, nước uống; mô tả chỉ tiết những biếu hiện bất thường (ngộ độc) quan sát được; mô tả khả năng, dấu hiệu, thời gian hồi phục (nếu có); kết quả quan sát đại thể; kết quả quan

sát tiêu bản vi thể (nếu có); xử lý thống kê kết quả thử nghiệm (nếu có); bàn luận về kết quả thử nghiệm (nếu có) và kết luận

Chú ý: Kết luận về mức độ độc ngoại suy sang người của mẫu thử được xác định bởi một Hội đồng khoa học sau khi xem xét một cách khách quan tất cả các thông tin về kết quả thử nghiệm, tài liệu về mẫu thử và mục đích sử dụng

h Các trường hợp không xác định LDso [2]:

- Không thể xác định LDso: Thường gặp ở thuốc được liệu Cho chuột uống dược liệu đã cô đặc liều tối đa chuột vẫn không chết thì ta kết luận cho chuột uống với mức liều tối đa dược liệu đó vẫn không gây chết chuột

- Không muốn xác định LD:o: Cho chuột uống dược liệu liều gap 500 lần liều có tác dụng với người chuột vẫn không chết thì ta kết luận cho chuột uống với mức liều 500 lần liều dùng có tác dụng ở người, chuột vẫn không chết Chứng tỏ thuốc có độ an toan cao

1.1.5 Một số mô hình thực hiện [4]

không độc hoặc ít độc, có thể thử trên một loài động vật (gặm nhắm)

- Đối với các chế phẩm có độc cao hoặc có yêu cầu đặc biệt về khoa học, cần

thiết thử trên hai loài động vật thí nghiệm (gặm nhắm và không pặm nhắm)

- Khuyến cáo: Đê bảo vệ động vật, các mô hình sử dụng số ít động vật thí

nghiệm được ưu tiên lựa chọn

b Mô hình liễu có định

Nguyên tắc: Thử nghiệm được thực hiện với các mức liều xác định 5, 50, 300, 2000, 5000mg/kg hay 1,0/kg chuột thí nghiệm Lựa chọn liều thử đầu tiên trên một nhóm 5Š chuột Thử nghiệm tiếp tục cho đến khi xác định mức độ độc dựa trên đáp ứng chuột chết hoặc không và các triệu chứng ngộ độc, khả năng hồi phục quan sát được Xác định giá trị LD50 gần đúng (nếu có) Phép thử phù hợp với tất cả trường hợp cần xác định độc tính cấp

c M6 hinh Tang - Giam

Nguyên tic: Mô hình thử Tăng - Giảm được các nước thuộc OECD (Organization for Economic Co-operation and Development - T6é chire Hop tac va Phát

triển kinh tế) áp dụng và ban hành chính thức năm 2001 (OECD 425) Thử nghiệm

được tiến hành trên các mức liều được tính theo hệ số bước nhảy liều, thực hiện lần lượt trên từng động vật thí nghiệm theo tiến trình tăng hoặc giảm liều và tiếp tục cho

đến khi đạt điều kiện dừng lại Đánh giá kết quả bằng quan sát các biêu hiện và triệu

chứng ngộ độc theo quy định chung và tính giá trị LD:o gần đúng (nếu có) theo quy định riêng của phương pháp

Phương pháp nảy áp dụng phủ hợp cho các chất có thế gây chết nhanh trong 1-2 ngày không phù hợp cho các chất gây chết từ từ trong 5 ngày hoặc hơn Ngoài ra, có

Tiễn hành: Thí nghiệm được bố trí với các nhóm động vật, mỗi nhóm được dùng một mức liều, khoảng cách giữa các liều thử nghiệm phải bằng nhau và số động vật thí nghiệm trong các nhóm bằng nhau Số nhóm thử được bố trí sao cho thu được

các số liệu đủ để tính kết quả, trong đó có ít nhất l nhóm không có động vật thi

nghiệm nào bị chết, và một nhóm có tối thiểu 80% số động vật thí nghiệm bị chết, và có ít nhất 2 nhóm thử với 2 mức liều cho kết quả tương ứng giữa 2 mức liễu trên Tính giá trị LD50 theo quy định của phương pháp nảy

e M6 hinh theo Litchfield - wilcoxon

Nguyên tắc: Mô hình được Litchfield- Wileoxon đề xuất năm 1949 sau khi xem xét, cải tiến và cố găng khắc phục những hạn chế của một số phương pháp trước đó Kết quả được ghi đồ thị trên giấy log-probit và được tính theo phương pháp toán đồ có hiệu chỉnh, do vậy cho kết quả chính xác hơn Trước đây, phương pháp thường được áp dụng trong tính giá trị LDso cho những chất có độc tính cao

1.1.6 Lưu ý khi nghiên cứu độc tính cấp [4]

- Khi đánh giá độc tính của một thuốc đông y trước khi thử nghiệm lâm sàng, không nên chỉ dựa vào LDso, mà phải quan tâm đến các tác dụng phụ không có lợi

- Không nên so LDso của thuốc đông y được nghiên cứu với LDso của các thuốc

đông y khác không được tiến hành trong cùng điều kiện thí nghiệm

- Không nên so LDso của thuốc đông y với LDso của thuốc tân dược là hoạt chất của thuốc đông y như so LDso của Phụ tử với LDa; của Aconitin, LDao của Mã tiền với LDso cua Strychnin

1.2 Đánh giá độc tính bán trường diễn

1.2.1 Định nghĩa [2]

16

Có những độc tính phải trải qua thời gian dài sử dụng thuốc mới được biểu hiện ra hoặc tích lũy dần dần độc tính theo thời gian gây nguy hiểm cho người sử dụng thuốc Chính vì vậy cần thiết phải nghiên cứu các độc tính bán trường diễn và trường diễn của thuốc, đặc biệt đối với các thuốc dự kiến sẽ sử dụng dài ngày trên người

Tùy theo thời gian theo dõi và nghiên cứu độc tính, chia ra các loại độc tính cấp

diễn, bán cấp diễn, bán trường diễn và trường diễn Không có ranh giới rõ ràng khi

phân biệt các loại độc tính theo thời gian, tuy nhiên thông thường độc tính cấp sẽ thé hiện không quá 72 giờ sau dùng thuốc, độc tính bán cấp thế hiện không quá 2 tuần sau dùng thuốc, độc tính bán trường điễn sẽ được theo đõi đến sau L - 2 tháng dùng thuốc và độc tính trường diễn sẽ được theo dõi lâu hơn, sau 3 - 9 tháng dùng thuốc

- Mức liều không hoặc có gây thay đổi dang ké tới chức năng, cơ quan hoặc một số biểu hiện sống có thê quan sát được trên động vật thí nghiệm;

- Những độc tính có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục néu có

- Trường hợp mẫu thử thê hiện độc tính cấp cao, liều gây độc gần với liều có tác

dụng dược lý, cần thiết thử trên 2 loài động vật (gặm nhắm va khong gam nhắm)

1.2.4 Thời gian thứ [2] [4]

17

Thời gian thử trên động vật được tính dựa theo thời gian dự kiến dùng trên người hoặc có thê thử với các khoảng thời gian xác định theo phân loại như đã nói ở phần định nghĩa

Ngoài ra, thời gian thử còn phụ thuộc vào mục đích của thử nghiệm là cung cấp thông tin cho thử lâm sảng giai đoạn nào Khi cần thông tin cho thử lâm sàng giai đoạn I hoặc 2, thời gian có thế ngắn hơn (14-28 ngày); khi cần cung cấp thông tin cho thử lâm sàng giai đoạn 3, thời gian thử cần dài hơn (28-90 ngày)

Hiện nay, tài liệu hướng dẫn của các nước tham gia hòa hợp ICH giới thiệu tính thời gian thử độc tính theo 2 cách:

- Thời gian thử thuốc bằng 3-4 lần thời gian dự kiến dùng trên người - Thời gian thử theo từng khoảng xác định: 14 ngày, 28 hoặc 90 ngày

Lựa chọn từng khoảng thời gian thử tùy theo yêu cầu từng mẫu và điều kiện thử nghiệm Đánh giá mức độ độc sẽ được xem xét trên báo cáo kết quả tương Ứng với từng khoảng thời gian đã thử

1.2.5 Liêu dùng [4]

Thuốc được dùng chủ yếu qua đường uống bằng dụng cụ chuyên biệt

Mức liều thử phải được lựa chọn sao cho có ý nghĩa trong việc đánh giá về khả năng an toàn hay mức độ gây độc của mẫu thử khi dùng nhiều ngày trên động vật Mức liễu thử thường được tính từ các thông tin thu được từ thử độc tính cấp, và được quy đổi tương đương theo liều giữa các loài nếu thử trên loài khác nhau (phụ lục I-

Quyết định Số: 141/QĐ-K2ĐÐT Về việc ban hành tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn thử

Rood

nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ được liệu

Với những nghiên cứu đầy đủ, thử nghiệm được thiết kế với 3 mức liều (tương đương 3 nhóm thử):

- Liều thấp: mức liều đủ để mẫu thử có tác đụng dược lý hoặc điều trị (tức là tương đương mức liều dự kiến dùng để điều trị cho người);

- Liều trung bình: mức liều có thế không gây những độc tính quan sát được hoặc gây ảnh hưởng không đáng kế:

18

- Liều cao: mức liều dự kiến sẽ quan sát được biểu hiện ngộ độc trên cơ quan của ĐVTN hoặc đến mức thể tích giới hạn cao nhất mà ĐVTN có thê dùng được

1.2.6 Cách tiễn hành [4]

Chuột được chia thành 4 lô, mỗi lô ít nhất 20 con (tốt nhất tỷ lệ chuột đực và cái

bằng nhau) Cho chuột uống thuốc mỗi ngày một lần vào một khung giờ có định và

liên tục trong 60 ngày (trừ trường hợp có chế độ liều đặc biệt):

- Lô L: chuột được cho uống đung môi pha thuốc hàng ngày - Lô 2: chuột được uống mức liều thấp

- Lô 3: chuột được uống mức liều trung binh - Lô 4: chuột được uông mức liều cao

Ở nước ta, phần lớn các nghiên cứu có thể chấp nhận với l nhóm chứng và 2 nhóm thử (liều thấp và liều cao)

* Quan sat va ghi lat cac biéu hién déc tinh va thong số đánh giá:

Thực hiện quan sát gh1 lại các biểu hiện và đo các thông số trước khi bắt đầu thí nghiệm và trong quá trình dùng thuốc, bao gồm các thông tin sau:

- Tổng quan chuột: theo đõi hàng ngày về tình trạng sức khỏe, khả năng tiêu thụ thức ăn, nước uống, tình trạng phân, nước tiêu của chuột

- Trọng lượng: xác định trọng lượng khi bắt đầu, hàng tuần và kết thúc thí nghiệm

- Xét nghiệm các chỉ số huyết học và sinh hóa có thể thực hiện vào cuối kỳ khi kết thúc thí nghiệm hoặc thực hiện nhiều lần trong quá trinh thí nghiệm để so sánh,

x x

gom:

+ Huyét học: số lượng hồng cau, bach cau, tiéu cầu, hematocrit, hemoglobin + Sinh hoa: ALT, AST, creatinin, protein toan phan, albumin, glucose huyét, cholesterol, bilirubin

+ Có thê xét nghiệm thêm một số chỉ số khác nếu cần như nồng d6 kali, natri trong mau, gama glutamy] transpeptidase, cac enzyn gan khac, chire nang cac tuyến tùy theo khả năng gây độc của mẫu thử.

19

- Quan sat va m6 ta cac biéu hién bat thuong cua DVTN, dac biệt liên quan tới các chức năng hô hấp, tuần hoàn, tiêu hóa, (nhịp thở, nhỊp tim, tỉnh trạng nôn mửa, ia chảy, sủi bọt mép); trên thần kinh, vận động như hành vi, cử động, đi lại, co giật; phản xạ của các giác quan như nhắm mắt, mũi của con vật Cần có những quan sát đánh giá dé phân biệt các triệu chứng ngộ độc với những biêu hiện do tác dụng dược lý của thuốc (an thần, gây ngủ, hạ huyết áp )

- Phân tích mô bệnh học: mồ những con vật chết trong quá trình nghiên cứu và những con còn sống khi kết thúc thí nghiệm dé quan sat dai thể các tổ chức, ưu tiên các tổ chức gan, thận và cơ quan đích tác dụng của thuốc Quan sát, đánh giá các biều hiện về màu sắc, hình dạng của các tổ chức Xét nghiệm vi thể 2-3 cá thể cho mỗi trường hợp (và 100% số chuột chết trong khi thử) để kiếm tra các biến đổi trên mô học Đánh giá những biến đồi trên vi thể phải được thực hiện ở các phòng thí nghiệm chuyên ngành có kinh nghiệm

- Khi cần theo dõi khả năng hồi phục, phải bố sung số ĐVTN muốn giữ lại để theo dõi (sau khi hết thời gian dùng thuốc) Với cơ quan đã thấy bị tồn thương ở nhóm thử, cần xét nghiệm mô bệnh học trên cơ quan đó ở nhóm phụ đề đánh giá khả năng hồi phục được rõ hơn

Đánh giá kết quả:

Dùng các phép kiểm thống kê đề so sánh các kết quả ận lâm sàng giữa nhóm thử và nhóm chứng đề kết luận có sự khác biệt giữa các kết quả hay không, từ đó rút ra kết luận về các độc tính trường diễn của thuốc

1.2.7 Bao cáo [4]

Báo cáo kết quả cần ghi rõ và đủ các thông tin: Động vật thí nghiệm:

- Loài/chủng đã dùng: - Số lượng, tuổi, giống:

- Nguồn gốc, điều kiện chăm sóc, chế độ ăn Điều kiện, phương pháp thử:

- Chi tiết về mầu thử, nông độ, độ ôn định, tính đông nhật của mẫu thử;

20

- Dung môi pha mẫu thử, chú ý giải thích nêu dùng dung môi khác không phải là nước; - Chuyên đôi từ nỗng độ chất thử/dung dịch cho uống hoặc thức ăn ra liều thực

da dung (mg/kg thé trong/ngay); - Nguyên tắc chọn mức liều thử;

- Mô tả cách cho động vật dùng mẫu thử; - Quy định lượng thức ăn, nước uống hàng ngày;

- Tình trạng, mức độ và thời gian quan sát lâm sàng (có quan sát hồi phục không);

Kết quả:

- Trọng lượng cơ thế khi bắt đầu, kết thúc/thay đôi; - Tiêu thụ thức ăn, nước uống:

- Đánh giá về tình trạng sức khỏe, mức độ hoạt động:

- Kết quả theo dõi và xử lý thống kê về thông số huyết học, sinh hóa; - Những dấu hiệu ngộ độc quan sát được;

- Kết quả quan sát dai thé;

- Kết qua quan sat vi thế, dấu hiệu bệnh lý trên các tô chức, nếu có

Kết luận: Chỉ nên kết luận dựa trên các đữ liệu quan sát được Kết luận về mức độ độc, ngoại suy sang người nên do Hội đồng khoa học xác định sau khi xem xét một cách khách quan tất cả các thông tin về kết quả thử nghiệm, tài liệu về mẫu thử và mục đích sử dụng

Phụ lục 1: Quyết định Số: 141/QĐÐ-K2ĐT Về việc ban hành tài liệu chuyên môn

“Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sảng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ được liệu”) Ngoại suy liều thể tích dung dịch mẫu thử dung cho ĐVTN, phân loại độc Bảng ngoại suy liều tương đương giữa các loài [3]

Loài ngoại Chuột nhất Chuột công Thỏ Chó Người

suy trang

Loài

21

thực nghiệm

Chuột nhắt trăng 1 0,55 0,25 0,15 0,085 Chuột công 1,82 1 0,45 0,27 0,15 Tho 4 2,20 1 0,60 0,34 Chó 6,67 3,67 1,67 1, 0,57 Người 11,76 6,47 2,94 1,76 1

Cách fímh: Từ loài động vật thực nghiệm (ở cột dọc), đối chiếu theo hàng ngang tới cột loài cần ngoại suy được hệ số cần phải nhân theo bảng trên

Câu 2: Lô l: dùng dung môi chiết cao cho chuột uống

Lô 2: dùng liều thử nghiệm trên chuột là liều tương đương có hiệu quả trên người

Lô 3: dùng liều gấp đôi liều có tác dụng được lý mà nhỏ hơn liều LD; ((Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ được thảo, Nguyễn Thượng Dong, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, 2006)

Liều đùng cao chuột được tính là: 40/60 x 12 x 0.15 = 1,2 g/kg

Liều đung cao chuột trên mỗi con chuột nặng 20g: 1,2 x 20 /1000 = 0,024g/chuột Với mỗi chuột uống thê tích 0,lml/10g chuột, ta có:

10ml > 1000¢ (1)

Và liều dung cao chuột là 1,2ø/kg, tức là:

1,2g > 1000g (2) Tu (1) va (2) ta co

10ml dung dich hén hop 1,2g cao thuéc

Với ta lẫy 3g cao thuốc làm thí nghiệm thì ta được: 10ml > 1,2g

?ml > 3g

Ta tam suất được : 3 x 10 / 1,2 =25ml hỗn hợp dung địch cần pha Với liều uống cho lô 2 mỗi con là 0,2ml,

23

Câu 3, câu 4: Các thông số và thời điểm đánh giá

Tình trạng chung, thé trọng của chuột

- Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng câu, thể tích trung bình hông câu, hàm lượng hemoglobin, số lượng bạch câu, công thức bạch câu và sô lượng tiêu cầu 43

~ Đánh giá mức độ tôn thương gan và chức năng gan thông qua các hội chứng: + Hội chứng hủy hoại tế bảo gan thông qua định lượng hoạt độ các enzym trong mau: ALT, AST, GGT

+ Hội chứng ứ mật thông qua định lượng bilirubin toàn phân

+ Hội chứng suy tế bào gan thông qua định lượng albumin và cholesterol toàn phan

- Đánh giá chức năng lọc cầu thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết thanh

Các thông số theo dõi được kiếm tra vào trước lúc uống mẫu thử, sau 4 tuần, sau 8 tuần uống mẫu thử và sau 2 tuần ngừng uống mẫu thử

- Giải phẫu bệnh: Sau 8 tuần uống mẫu thử và 2 tuần ngừng uống mẫu thử, chuột được mô dé quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số chuột ở mỗi lô

1.3 Dinh tinh Alkaloid 13.1 Tổng quan a Giới thiệu

Alkaloid: là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, một số tính trung tính hay mang acid yêu, thường gặp trong thực vật, đôi khi gặp trong động vật (cóc, cá nóc, ếch mũi tên độc ) [2]

Thường có hoạt tính dược lực mạnh b Phân loại

b Protoalkaloid (N từ acid amin không cấu thành dị vòng): ephedrin, capsaicin, colchicin,

€ Pseudoalkaloid: (N không bắt nguồn từ acid amin) caEin, coniin, aconitin, conessin, solanidin

1.3.2 Kiêm nghiệm dược liệu chứa Alkaloid Tìm sen và berberin a Mô tả nguồn dược liệu lâm sen

Sen là một loài thực vật thân thảo, sông dưới nước Rê cây sen (hay còn được gọi là ngó sen) sông ở dưới mặt nước, vùi sâu xuông bùn lây Phân thân cây sen có hình trụ, màu xanh lục Lá sen mọc ra từ thân cây, có hình tỏa tròn, cuông dài, màu xanh lục Lá sen mọc trên mặt nước Bê mặt trên của lá sen không thâm nước

Hoa sen có kích thước to, có màu trắng hoặc màu hồng Các lá noãn rời gắn lên ở mỗi để hoa, về sau noãn phát triển thành quả Trong mỗi quả có chứa một hạt Ở mỗi hạt có một chỗồi nhỏ ở giữa, gọi là tâm sen

Tâm sen: còn gọi Liên tâm; Liên tử tâm

Hình: Liên tâm Tên khoa học: Embryo Nelumbinis (Nguồn: Thuốc dân tộc - Internet)

Vi dang tinh han, tac dụng thanh tâm khử phiền, chỉ huyết sáp tinh[9] + Thành phân hoá học:

Trong tâm sen có asparagin và ít ankaloid chừng 0,06 % nelumbin, 0,4% liensinin, isoliensinin, neferin, lotusin, methylcorypallin, pronucifein[9]

[1], chiết xuất từ cây Vàng đắng và một số

cây khác như Hoàng liên, Hoàng bá, Hoàng đẳng, dưới dạng bột màu vàng sẵm hoặc tỉnh thế màu vàng tươi, vị đắng, tan trong nước Berberin và dẫn chất Berberin clorid có tác dụng diệt amip gây ly và một số vi

khuẩn gây bệnh đường ruột Anh Berberine (Nguon: Internet)

Hình: Công thức cấu trúc hóa học của Berberine (BBR).[7] 1.3.3 Phương pháp thử nghiệm

a Nguyên liệu thứ nghiệm Tam sen va berberine b Hóa chất Cén ethanol acid 5%

Thuốc thử: Dragendorff, Bouchardat c Quy trình dịch chiết tâm sen và berberrine

Lọc dịch chiết

Cô đến căn

Cho vào I0Öml nước nóng khay tan

Loc can lay dich chiét

Chia 3 ống nghiệm đều nhau 2-3ml

Chú giải:

Berberine

1 viên( nghiền nát) Pha 20ml cồn acid 5%

Chưng cách thuỷ 05 phút

27

Alkaloid tồn tại tế bảo thực vật dưới dạng muối tan trong nước, khi thêm dung dịch cồn acid 5% các Alkaloid trong dược liệu sẽ hoà tan và chiết ra Vì dung dịch cồn acid là dung môi hoà tan được nhiều chất nên dịch chiết có thêm một số chất amin, cacbohydrat

Lọc nóng qua giấy lọc loại bỏ tạp chất không tan trong cồn acid

Sau khi dịch chiết cô đến cắn (cồn bay hơi), thu được alkaloid ở dạng muối và cho tan trong nước nóng, lọc tạp chất thu được dịch thử nghiệm.

28

HINH ANH THUC HANH

Hình ảnh: Chuẩn bị nguyên liệu

Pha 20ml cồn Acid 5%, chưng cách thuỷ 5-

15”, lọc qua giấy lọc loại bỏ tạp chất thu dịch chiết

+ Tiến hành nhỏ vào mỗi ống nghiệm từ 2-3 giọt thuốc thử

Ống nghiệm (L) mẫu chứng màu vàng trong