Báo cáo thực hành nhóm 2 thứ 6 ca 3

Chiết xuất bằng dung môi kết hợp tác nhân vật lý được sử dụng rộng rãi nhất bao gồm các bước sau: - Dung môi thâm nhập vào chất nền/ nguyên liệu.. Phương pháp chiết bằng dung môi dưới sự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ NÂNG CAO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRỊNH THỊ PHI LY Vũ Phan Đình Hiệp 21126344

TP Hồ Chí Minh, 11/2024

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Chiết xuất hợp chất 1

1.2 Phương pháp chiết bằng dung môi dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm (hóa lý) 1

1.3 Sắc ký cột 2

1.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 2

CHƯƠNG 2: LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 4

2.1 Mục đích 4

2.2 Vật liệu và phương pháp 4

2.2.1 Vật liệu 4

2.2.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 4

2.2.3 Quy trình thực hiện 4

2.3 Kết quả và thảo luận 8

2.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu 9

2.3.3 Thảo luận 9

CHƯƠNG 3: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÝ CỘT 10

3.1 Mục đích 10

3.2 Vật liệu và phương pháp 10

3.2.1 Nguyên liệu 10

3.2.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 10

3.2.3 Quy trình thực hiện 11

3.3 Kết quả và thảo luận 12

3.3.1 Kết quả thực hiện 12

3.3.2 Thảo luận 13

CHƯƠNG 4: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT TLC 14

4.1 Mục đích 14

4.2 Vật liệu và phương pháp 14

4.2.1 Vật liệu 14

4.2.2 Dụng cụ, thiết bị 14

4.2.3 Phương pháp thực hiện 14

4.3 Kết quả và thảo luận 14

4.3.1 Kết quả thực hiện 15

4.3.2 Thảo luận 16

CHƯƠNG 5: BÀI TẬP 17

iii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 1 4

Bảng 2.2 Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 1 4

Bảng 2.3 Khối lượng các thành phần trong thí nghiệm tính hàm lượng chất chiết thô 8 Bảng 2.4 Khối lượng thành phần trong thí nghiệm xác định độ ẩm nguyên liệu 9

Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 2 10

Bảng 3.2 Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 2 10

Bảng 4.1 Giá trị Rf của các sắc tố 16

Bảng 5.1 Kết quả sắc ký đồ thu được từ các nồng độ protocatechuic acid chuẩn 17

Bảng 5.2 Kết quả sắc ký đồ thu được từ các nồng độ chlorogenic acid chuẩn 18

Bảng 5.3 Kết quả sắc ký đồ thu được từ các nồng độ caffeic acid chuẩn 18

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cân giấy lọc 5

Hình 2.2 Cân mẫu bột vỏ măng cụt 5

Hình 2.3 Mẫu siêu âm trong 15 phút và mẫu khi siêu âm xong 5

Hình 2.4 Lọc mẫu thu dịch chiết 6

Hình 2.5 Dịch chiết sau khi sấy khô 6

Hình 2.6 Khối lượng các chén chuyên dụng 7

Hình 2.7 Cân mẫu bột vỏ măng cụt 7

Hình 2.8 Dịch chiết sau khi sấy khô 8

Hình 3.1 Các bước chuẩn bị dịch chiết sắc tố 11

Hình 3.2 Silica gel đã được ngâm trong n-Hexane 15 phút 11

Hình 3.3 Cột sắc ký sau khi được nhỏ dịch chiết 12

Hình 3.4 Dịch chiết thu được 12

Hình 4.1 Dịch chiết đã được đưa vào bản mỏng 14

Hình 4.2 Bản mỏng dưới đèn UV bước sóng 254 nm 15

Hình 4.3 Kết quả phân tách sắc tố bằng kĩ thuật TLC trong hệ dung môi hexan:aceton (7:3) và (6:4) 15

Hình 5.1 Đồ thị đường chuẩn protocatechuic acid 17

Hình 5.2 Đồ thị đường chuẩn chlorogenic acid 18

Hình 5.3 Đồ thị đường chuẩn caffeic acid 19

- Phương pháp hóa học sử dụng dung môi

- Phương pháp hóa lý kết hợp: dung môi + nhiệt độ/áp suất/sóng siêu âm/vi sóng Chiết xuất bằng dung môi kết hợp tác nhân vật lý được sử dụng rộng rãi nhất bao gồm các bước sau:

- Dung môi thâm nhập vào chất nền/ nguyên liệu

- Chất phân tích hòa tan trong dung môi

- Chất tan được khuếch tán ra khỏi chất nền/ nguyên liệu

- Thu nhận các chất tan đã chiết

1.2 Phương pháp chiết bằng dung môi dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm (hóa lý)

Chiết xuất hỗ trợ bằng siêu âm (Ultrasound-Assisted Extraction - UAE) là một kỹ thuật hiện đại được sử dụng để chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau, như thực vật, thực phẩm và dược phẩm Phương pháp này sử dụng sóng siêu âm để tạo ra các bọt khí trong dung môi, sau đó các bọt khí này sụp đổ

và tạo ra áp suất và nhiệt độ cục bộ cao Quá trình này tăng cường sự chuyển khối và phá vỡ thành tế bào, dẫn đến việc chiết xuất các hợp chất mong muốn hiệu quả hơn Khai thác hỗ trợ siêu âm (UAE) đã được áp dụng rộng rãi như một phương pháp chiết xuất mới, xanh và phát triển nhanh chóng phù hợp để nâng cấp và nâng cao hiệu quả chiết xuất của các hợp chất hoạt tính sinh học UAE có những lợi thế đáng kể như tiêu thụ dung môi và năng lượng thấp, đơn giản hóa thao tác và gia công, năng suất chiết xuất cao và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng UAE cũng có thể tạo cơ hội tăng cường khai thác các thành phần thực phẩm và hoạt tính sinh học nhạy cảm với nhiệt ở nhiệt độ chế biến thấp hơn

Ưu điểm của UAE:

- Hiệu quả cao: UAE có thể tăng đáng kể hiệu suất và chất lượng của các hợp chất được chiết xuấtso với các phương pháp truyền thống

- Giảm sử dụng dung môi: Thường yêu cầu ít dung môi hơn, làm cho nó trở thành một lựa chọn thân thiện với môi trường hơn

- Tiết kiệm thời gian: Quá trình chiết xuất nhanh hơn, có thể tiết kiệm thời gian trong các ứng dụng công nghiệp

- Nhiệt độ thấp: UAE có thể được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn, có lợi cho việc chiết xuất các hợp chất nhạy cảm với nhiệt

1.3 Sắc ký cột

Phương pháp sắc ký cột là một kỹ thuật phân tích hóa học phổ biến được sử dụng

để tách và phân tích các chất hóa học trong một hỗn hợp Cơ sở lý thuyết của phương pháp này dựa trên nguyên lý tách chất dựa trên tương tác giữa chúng và một chất tương tác trong cột sắc ký

- Chất pha tĩnh: Là chất được phủ hoặc được đặt trong cột sắc ký và tương tác với các phân tử trong mẫu Chất pha tĩnh có thể là các hạt rắn (sắc ký cột truyền thống) hoặc chất lỏng (sắc ký cột lỏng) Các chất thường được sử dụng làm pha tĩnh là nhôm oxide (Al2O3), silica gel (SiO2), CaCO3, than hoạt tính, đã được tiêu chuẩn hóa

- Chất pha động: Là chất di chuyển qua cột và mang theo các phân tử trong mẫu Thường là chất lỏng hoặc khí Chất pha động di chuyển thông qua chất pha tĩnh

và giúp tách các chất trong mẫu

Sự tương tác giữa pha tĩnh và pha động tách chất dựa trên tương tác giữa chúng và chất pha tĩnh Các tương tác có thể bao gồm sự hấp thụ, sự tương tác dipole - dipole, sự tương tác ion, hoặc sự phân bố khối lượng phân tử

1.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC) là một phương pháp sắc ký đơn giản, phổ biến, được sử dụng để tách, nhận diện, và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất hóa học trong hỗn hợp Phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp, và hiệu quả trong các phân tích định tính Kĩ thuật này dùng để tách các chất không bay hơi, được tiến hành trên một bảng mỏng bằng nhôm hoặc kính khi cho pha động (dung môi)

di chuyển qua pha tĩnh (chất hấp phụ)

Nguyên tắc cơ bản: Sắc ký bảng mỏng hoạt động dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành phần trong hỗn hợp giữa hai pha:

- Bình ly giải là bình kính, đảm bảo cho dung môi không bay hơi

Khi hỗn hợp mẫu được chấm lên bản mỏng và cho dung môi di chuyển, các thành phần sẽ phân tách dựa trên độ tương tác khác nhau giữa chúng với pha tĩnh và pha động Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuỵển của chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất tan và quãng đường di chuyển của dung môi:

Rf = a

b

Trong đó:

- Rf là hệ số lưu giữ

- a là quãng đường di chuyển của chất tan

- b là quãng đường di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu

Rf càng nhỏ thì độ phân cực càng cao

CHƯƠNG 2: LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

2.1 Mục đích

Đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng chất chiết thô

2.2 Vật liệu và phương pháp

2.2.1 Vật liệu

Mẫu: vỏ măng cụt được sấy ở 50 - 60 °C, nghiền nhỏ 1 mm

Dung môi: Methanol, Etyl acetat

2.2.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 1

Bảng 2.2 Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 1

9 Bể rửa siêu âm gia nhiệt Ultrasons - HD

Selecta Tây Ban Nha tần số 40 kHz

Hỗ trợ chiết mẫu

2.2.3 Quy trình thực hiện

2.2.3.1 Phương pháp chiết bằng dung môi dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm

Bước 1: Cân giấy lọc, thực hiện 2 lần

5

Hình 2.1 Cân giấy lọc.(A) Giấy dùng cho dung môimethanol (0,7854 g); (B) Giấy lọc

dùng cho dung môi etyl acetat (0,7836 g)

Bước 2: Cân 1 g bột vỏ măng cho vào bình erlen Thực hiện 2 lần lặp lại

Hình 2.2 Cân mẫu bột vỏ măng cụt (A) Bột vỏ măng cụt dùng cho dung môi Methanol

(1,0049) g); (B) Bột vỏ măng cụt dùng cho dung môi Etyl acetat (1,0065 g)

Bước 3: Thêm vào 15 ml dung môi để thấm ướt mẫu, và cho và máy siêu âm trong 15 phút

Hình 2.3 Mẫu siêu âm trong 15 phút và mẫu khi siêu âm xong

Bước 4: Lọc dịch chiết bằng giấy lọc

Bước 5: Thêm 15 ml dung môi mới vào bã lọc và tiếp tục siêu âm lần 2 trong 15 phút, tiếp tục lọc dịch chiết

Hình 2.5 Dịch chiết sau khi sấy khô Khối lượng dịch chiết với dung dịch methanol (1,5235 g) (A);Khối lượng

dịch chiết với dung dịch etyl acetat (1,6543 g) (B).

2.2.3.2 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy

7

Bước 1: Cân khối lượng chén thủy tinh chuyên dụng đã được sấy khô ở 105°C và để nguội trong bình hút ẩm, cân 2 chén thủy tinh

Hình 2.6 Khối lượng các chén chuyên dụng

Khối lượng chén thứ nhất là 18,0703 g (A);

Khối lượng chén thứ hai là 18,6434 g (B)

Bước 2: Cân 2 g bột vỏ măng cụt vào từng bộ chén

Hình 2.7 Cân mẫu bột vỏ măng cụt.(A) Bộ 1 trọng lượng mẫu bột vỏ măng cụt 2,0052g (đã trừ trọng lượng bộ

chén); (B) Bộ 2 trọng lượng mẫu vỏ măng cụt 2,0017g (đã trừ trọng lượng bộ chén)

Bước 3: Đem bộ chén chứa mẫu đi sấy ở 105°C

Bước 4: Để nguội trong bình hút ẩm, sau đó cân khối lượng sau khi sấy khô

Hình 2.8 Dịch chiết sau khi sấy khô Khối lượng dịch chiết với dung dịch methanol (19,9892 g) (A);Khối lượng

dịch chiết với dung dịch etyl acetat (19,9460 g) (B)

2.3 Kết quả và thảo luận

2.3.1 Tính toán hàm lượng chất chiết thô

Công thức tính hàm lượng chất chiết thô:

H% = m1− m2

Trong đó:

m1 là khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (g)

m2 là khối lượng bã khô còn lại trên giấy lọc (g)

Bảng 2.3 Khối lượng các thành phần trong thí nghiệm tính hàm lượng chất chiết thô

Methanol Etyl acetat

Hàm lượng chiết chất thô đối với 2 dung môi methanol và etyl acetat là:

W1 là khối lượng của mẫu thử và chén trước khi sấy (g)

W2 là khối lượng của mẫu thử và chén sau khi sấy (g)

m là khối lượng của mẫu thử trước khi sấy

Bảng 2.4 Khối lượng thành phần trong thí nghiệm xác định độ ẩm nguyên liệu

Khối lượng chén và mẫu sau khi sấy (g) 19,9892 19,9460

Độ ẩm hao hụt của nguyên liệu sau quá trình sấy khô là:

W%methanol =18,0703 + 2,0052 − 19,9892

W%etyl acetat =18,6434 + 2,0017 − 19,9460

Dựa vào kết quả tính toán, ta có thể thấy được khi sử dụng dung môi methanol thì độ

ẩm bay hơi ít hơn so với khi sử dụng dung môi etyl acetat

2.3.3 Thảo luận

Kết quả thí nghiệm và hiệu suất chiết xuất thô từ bột vỏ măng cụt bằng hai dung môi methanol và etyl acetat, ta nhận thấy hiệu quả từ phương pháp sử dụng dung môi methanol cao hơn khi sử dụng dung môi etyl acetat Và thời gian chiết xuất từ dung môi methanol dài hơn nhiều so với dung môi etyl acetat

Lý do tính phân cực khác nhau của hai dung môi này Dung môi etyl acetat là hợp chất không phân cực, còn dung môi methanol là hợp chất phân cực cao Trong khi đó các hợp chất trong bột măng cụt thô được chiết ra mang nhiều nhóm phân cực do đó chúng hoà tan tốt trong các dung môi phân cực, vì vậy mà methanol có hiệu suất tốt hơn

so với etyl acetat Ngoài ra dung môi etyl acetat và methanol là những hợp chất dễ bay hơi, trong quá trình thao tác cũng có khả năng làm hao hụt dung môi qua các bước, sự bay hơi cũng có thể làm giảm tỷ lệ của dung môi, làm giảm hiệu quả chiết

- Dung môi 10 ml n-Hexane : Acetone (8:2)

- 1 g mẫu bột rau chân vịt

- Chiết bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm trong 5 phút

3.2.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ

Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 2

1 n-Hexane : Acetone (8:2) Dung môi tách chiết

3 n-Hexane : Acetone (7:3) Rửa giải diệp lục tố, rửa giải Carotenoid

4 Hạt silica gel (230 – 400 mesh) Pha tĩnh sắc ký cột

Bảng 3.2 Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 2

7 Cột thủy tinh (Pipet Pasteur) Cột dùng để làm sắc ký

11

3.2.3 Quy trình thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị dịch chiết sắc tố: Cân 1 g bột rau chân vịt, hòa vào trong 20 ml dung môi n-Hexane : Acetone (8:2) Sau đó cho vào máy đánh sóng siêu âm trong 5 phút rồi lọc qua giấy lọc thu dịch chiết rau chân vịt

Hình 3.1 Các bước chuẩn bị dịch chiết sắc tố (A) Cân bột rau chân vịt; (B) Lọc dịch chiết rau chân vịt sau khi

chiết bằng sóng siêu âm

Bước 2: Chuẩn bị cột (nhồi cột): Nhét 1 lớp bông thủy tinh dưới đáy pipet Pasteur, nhồi silica gel đã được ngâm trong n-Hexane 15 phút vào cột, khi nhồi lắc nhẹ thành cột

để silica gel lắng đọng và phân bổ đều

Hình 3.2 Silica gel đã được ngâm trong n-Hexane 15 phút

Bước 3: Đổ 1 mL dịch chiết đã chuẩn bị trước vào cột sắc ký Sử dụng n-Hexane để nhỏ qua cột, tránh cột bị khô Khi pha động di chuyển đến gần với nút bông thủy tinh, dùng ống nghiệm hứng cột thu được dịch chiết sắc tố

Hình 3.3 Cột sắc ký sau khi được nhỏ dịch chiết

Bước 4: Rửa giải: Nhóm Carotenoid màu vàng cam được rửa giải trước bằng dung

môi n-Hexane, dùng ống nghiệm để thu lại Sau khi dịch vàng được thu hết sử dụng

dung môi n-Hexane : Acetone (7:3) ( có độ phân cực hơn) để rửa giải diệp lục tố

Lưu ý:

- Trước khi cho hạt silica gel vào cột cần cho dung dịch n-Hexane đi qua cột vài

lần để làm ướt bông thủy tinh Cho dịch chiết vào từ từ trên thành cột, không cho

trực tiếp từ trên xuống sẽ làm pha tĩnh bị rung động

- Cần xoay đều và gõ nhẹ cột trong quá trình nhồi pha động để hạt silica gel được

trải đều và không tích không khí

- Không được để pha động khô

3.3 Kết quả và thảo luận

3.3.1 Kết quả thực hiện

- Nhóm thành công thu được hai loại dịch chiết sắc tố là diệp lục tố và carotenoid

Đánh giá cảm quan và nhận xét cho thấy kết quả đúng như mong đợi, hai sản phẩm thu

được đều không có dấu hiệu bất thường

Hình 3.4 Dịch chiết thu được

(A) dịch chiết diệp lục tố (màu xanh lá cây); (B) dịch chiết carotenoid (màu vàng)

13

3.3.2 Thảo luận

Vì Carotenoid có tính phân cực gần như là không có nên tương tác với pha tĩnh là silica gel có tính phân cực mạnh rất kém và tương tác với pha động là n-Hexane : Acetone (8:2) tốt hơn Do thành phần Acetone có tỷ lệ thấp trong hỗn hợp nên pha động

là một hệ có tính phân cực tương đối yếu vì vậy sẽ tương tác tốt hơn với Carotenoid trong dịch chiết và đi qua cột sắc ký nhanh hơn so với diệp lục tố Vì vậy ta thu được dịch chiết Carotenoid đầu tiên

Diệp lục tố ngược lại có tính phân cực khá mạnh, nên tương tác rất tốt với pha tĩnh silica gel, cần sử dụng dung môi rửa giải có tính phân cực lớn hơn là n-Hexane : Acetone (7:3) để rửa giải Tăng tỷ lệ Acetone sẽ làm tăng độ phân cực của pha động, từ đó tương tác với dịch chiết diệp lục tố tốt hơn nên sẽ rửa giải được diệp lục tố ra khỏi cột Thu được dịch chiết diệp lục tố

Kỹ thuật sắc ký cột là kỹ thuật sắc ký cơ bản và được phát triển đầu tiên trong các

kỹ thuật sắc ký Tuy lâu đời, nhưng vẫn là một trong những kỹ thuật mang lại hiệu quả cao đòi hỏi chi phí thấp Rất thích hợp để sử dụng như một phương pháp nghiên cứu trong các lĩnh vực sinh hóa, hóa lý, kết hợp với kỹ thuật quang,