Báo cáo thực hành hóa sinh Đại cương bài thực hành số 2 bài 3 thực nghiệm về protein và acid amin bài 4 vitamin và các hợp chất thứ cấp

Phản ứng Ninhydrin  Giới thiệu chung  Thử nghiệm ninhydrin được sử dụng để kiểm tra xem một chất phân tích nhất định có chứa amin hay axit α-amino hay không  Trong thử nghiệm, Ninhydr

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO

THỰC HÀNH HÓA SINH ĐẠI CƯƠNG

BÀI THỰC HÀNH SỐ 2

Ngày thí nghiệm:

15/12/2023

Ngày nộp báo cáo:

28/12/2023

Nhóm 2:

Trịnh Nhật Thanh - 22125262 - Nhóm trưởng Trần Thị Thảo My - 22125149

Lê Phan Thái Bình - 22125019 Trương Mỹ Hằng - 22125070 Trần Đào Đình Nguyên - 22125190 Nguyễn Hữu Khoa - 22125116

MỤC LỤC

Bài 3: Thực nghiệm về Protein và Acid Amin

3.1 Phản ứng Ninhydrin

3.2 Phản ứng Biurette

3.3 Phản ứng Xanthoprotein

3.4 Khảo sát tính chất sa lắng và biến tính của Protein

Bài 4: Vitamin và các hợp chất thứ cấp

4.1 Định lượng độ acid toàn phần

4.2 Định tính và định lượng tanin trong trà

4.3 Định lượng Vitamin C bằng Iod

5 Định lượng vitamin C bằng phương pháp sắc khí lỏng hiệu nâng cao

BÀI 3: THỰC NGHIỆM VỀ PROTEIN VÀ ACID AMIN

3.1 Phản ứng Ninhydrin

 Giới thiệu chung

 Thử nghiệm ninhydrin được sử dụng để kiểm tra xem một chất phân tích nhất định có chứa amin hay axit α-amino hay không

 Trong thử nghiệm, Ninhydrin được thêm vào dung dịch thử nghiệm của chất phân tích Sự phát triển của màu xanh đậm cho thấy sự hiện diện của amoniac, amin bậc một/thứ cấp hoặc axit amin trong chất phân tích

 Nguyên tắc

 Phản ứng Ninhhydrin là phán ứng xác định nhóm α-amin trong phân

tử amino acid, các sản phẩm chuyển hóa protein và các chất có nhóm phi protein (NPN)

 Ninhydrin tác dụng với nhóm amin tạo phức chất màu tím

 Hóa chất

 Thuốc thử Ninhydrin

 Dung dịch amino acid 1%: glycine, alanine

 Dung dịch protein1%: lòng trắng trứng, gelatin

 Phương pháp

 Chuẩn bị ống nghiệm, hút 2ml dung dich lòng trắng trứng 1% cho vào ống nghiệm, cho thêm vào ống nghiệm 1ml Ninhydrin, đem đun cách thủy, quan sát màu tím xuất hiện

 Lặp lại thí nghiệm với 3 chất còn lại

 Ghi nhận kết quả

 Kết quả - thảo luận

 Kết quả: 3 ống nghiệm chứa lòng trắng trứng, glycine, alanine đổi màu tím Ống chứa gelatin không đổi màu

 Giải thích:

_ Các a.a và các peptid khi phản ứng với Ninhydrin sẽ bị dezamin hóa, oxy-hóa và decacboxy hóa tạo thành NH3,CO2,và andehit tương ứng _ Ninhydrin tạo nhóm phức chất màu tím Độ đậm nhạt tùy vào lượng amin tự do có trong dung dịch

 Thảo luận:

_ Thử nghiệm Ninhydrin là thử nghiệm dùng để phát hiện các axit amin, peptide, protein và amin

_ Kết quả thí nghiệm của nhóm đúng với nguyên tắc thí nghiệm

3.2 Phản ứng Biurette

 Giới thiệu chung

 Thử nghiệm Biuret là thử nghiệm được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của liên kết peptide trong mẫu và kiểm tra sự hiện diện của protein hoặc peptide

 Nguyên tắc

 Phản ứng biurette là một phản ứng định tính xác định liên kết peptit

có trong polypeptid hay protein

 Trong môi trường kiềm, dung dịch sulfat đồng sẽ phản ứng với liên kết peptide, thành lập phức hợp muối đồng nhị theo phản ứng

 Hóa chất

 Dung dịch amino acid 1%: glycine, alanine

 Dung dịch protein1%: lòng trắng trứng, gelatin

 Thuốc thử Biurette

 Phương pháp

 Hút 2ml lòng trắng trứng vào ống nghiệm, cho thêm 2ml dung dịc thuốc thử biurette, lắc và quan sát có màu tím

 Lặp lại thí nghiệm với các chất còn lại

 Kết quả và thảo luận

 Kết quả: của nhóm không như nguyên tắc thí nghiệm do nồng độ của thuốc thử Biurette Nồng độ bazơ trong thuốc thử thấp nên thí nghiệm không thể ra được màu chuẩn như nguyên tắc thí nghiệm tạo nên thí nghiệm Biurette bị âm tính

 Giải thích:

_ Protein tác dụng với Cu2+ trong môi trường kieefmtaoj phức chất có màu hồng, phản ứng xảy ra do có liên kết peptide

_ Lòng trắng trứng, gelatin do có liên kết peptide nên trong môi trường kiềm, dung dịch sulfat đồng phản ứng với liên kết peptide tạo thành phức đồng II có màu tím

_ Do glycine, alanine không có liên kết peptide nên không phản ứng

 Thảo luận: giải quyết vấn đề : pha thêm vài giọt dung dịch natri

hydroxit 5% vào mỗi ống nghiệm để đảm bảo mẫu có tính kiềm Ngoài ra, thuốc thử Biuret bao gồm 5% natri hydroxit và 1% Đồng II sunfat, (NaOH+CuSO4 )

3.3 Phản ứng Xanthoprotein

 Giới thiệu chung

 Thử nghiệm xanthoproteic là một phương pháp sinh hóa, được sử dụng để xác định các axit amin có chứa các nhóm phenolic hoặc indolic như phenylalanine, tyrosine và tryptophan (axit amin thơm)

 Sản phẩm cuối cùng của phản ứng này có màu vàng và tên này xuất phát từ tiếng Hy Lạp 'Xanthos' có nghĩa là màu vàng

 Nguyên tắc

 Các amino acid phenylalanine, tyrosine, tryptophan cho phản ứng xanthoprotein dương tính vì nhân vòng phenolic và indo được nitrate hóa bởi acid nitric đậm đặc tạo ra sản phẩm nitrotyrosine,

nitrotryptophan có màu vàng, sau đó trong môi trường kiểm mạnh như NH4OH hoặc NaOH sẽ tạo phức hợp màu cam

 Hóa chất

 Dung dịch amino acid 1%: glycine, alanine

 Dung dịch protein1%: lòng trắng trứng, gelatin

 Phương pháp

đặc, đun nóng, sau đó làm lạnh ống nghiệm và quan sát màu vàng

 Lặp lại các bước trên với các chất còn lại

 Kết quả và thảo luận

 Kết quả:

_ Lòng trắng trứng cho màu vàng khi tác dụng với HNO3 đậm đặc và

_ Gelatin không đổi màu

_ Glycine, alanine không cho phản ứng màu

 Giải thích:

_ Các amino acid vòng cho phản ứng xanthoprotein dương tính vì nhân vòng phenolic được nitrate hóa bởi acid nitric đậm đặc tạo ra sản phẩm màu vàng, sau đó trong môi trường kiềm mạnh sẽ tạo phức hợp màu cam _ Khi cho HNO3 vào lòng trắng trứng thì các acid amin có trong lòng trắng sẽ bị nitro hóa nhân thơm tạo dẫn xuất nitro màu vàng Sản phẩm nitro hóa khi tác dụng với kiềm tạo muối có màu cam dặc trưng

_ Alanine, glycine

 Thảo luận

_ Lòng trắng trứng, glycine, alanine có amino acid nhân thơm còn gelatin không có amino acid nhân thơm

_ Thử nghiệm xanthoproteic được sử dụng để phát hiện protein và axit amin, để phân biệt axit amin thơm với axit amin không thơm

3.4 Khảo sát tính chất sa lắng và biến tính của protein_

 Nguyên tắc

 Protein hòa tan trong nước tạo thành dung dịch keo bền vững Sự bền vững này do hai yếu tố:

 Sức đầy tĩnh điện giữa các hạt keo protein mang điện tích cùng đầu

 Lớp và thủy hóa

 Nếu làm mất một trong hai yếu tố hoặc cả hai thì hạt keo sẽ kết dính lại và sa lắng Có nhiều các làm sa lắng protein như:

 Sa lắng bởi muối kiềm, amonium sulfate

 Sa lắng bởi các dung môi hữu cơ, aceton, côn, ether

 Sa lắng bởi các kim loại nặng Hg Ag Pb

 Sa lắng bởi các acid mạnh: acid tricloroacetic (TCA)

 Hóa chất

 Lòng trắng trứng

 Dung dịch amonium sulfat bão hòa

 Acetone

 Acetate chì 5%

 Acid tricloroacetic 10%

 Phương pháp

 Lấy 4 ống nghiệm đánh số thứ tự và cho vào các hóa chất theo bsngr sau:

 Quan sát và so sánh sự sa lắng và biến tính của protein lòng trắng trứng ở 4 phương pháp Ghi nhận kết quả

 Kết quả và thảo luận

 Kết quả:

_ Dung dịch anomium sulfat bão hòa: dung dịch màu trắng trong hơi vẫn dục, protein còn nổi lên trên

_ Acetone: dung dịch trong màu trắng ngà

_ Acetate chì 5%: dung dịch màu trắng sữa nhạt

_ Acid tricloroacetic 10%: dung dịch màu trắng sữa phía dưới, phần trên dung dịch trong vẫn đục

_ Cường độ màu:

Acid tricloroacetic >Acetate chì> Acetone >Amonium sulfat bão hòa

 Giải thích:

_ Dung dịch anomium sulfat: protein không có hiện tượng sa lắng, vì ở môi trường pH rất xa pI ( lòng trắng trứng chủ yếu pI khoảng 4.6) Hat keo protein mang điện tích dương Sức đẩy tỉnh điện cho các hạt keo protein đẩy nhau Lớp vỏ thủy hóa không tiếp xúc được với nhau nên không sa lắng

_ Acetone: Protein có hiện tượng sa lắng không rõ rệt vì khi cho acetone làm giảm độ hoa tan của protein do đó dẫn đến đông kết ( vì phá vỡ lớp

vỏ thủy hóa)

_ Acetate chì: protein có hiện tượng sa lắng rõ rệt vì acetate chì là muối kim loại nặng khi đó kim loại gắn vào làm protein kết tủa và gây hiện tượng sa lắng

_ Acid tricloroacetic: protein có hiện tượng sa lắng rõ rệt vì acid

tricloroacetic là axit nên phân ly phá vỡ lớp vỏ thủy hóa pH cũng gần pI của albulmin làm hạt keo protein trung hòa điện tích Dung dịch keo sẽ không bền và sa lắng hoàn toàn

 Thảo luận

_ Acid tricloroacetic có sự sa lắng protein rõ rệt, tiếp đến acetate chì có

sự sa lắng nhẹ, còn acetone sa lắng không rõ Anomium sulfat không có

sự sa lắng protein

BÀI 4: VITAMIN VÀ CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP

4.1 Định lượng độ acid toàn phần

 Giới thiệu chung

 Độ acid toàn phần bao gồm tất cả các acid có thể định lượng được bằng một dung dịch kiềm chuản

 Những acid này chủ yếu là acid hữu cơ như axit axetic, malic, citric, tatric, lactic,…

 Nguyên lý

 Dùng một chất kiềm chuẩn (NaOH hoặc KOH) để trung hòa hết các acid có trong thuecj phẩm, với phenolphtalein

 Hóa chất

 Dung dịch NaOH (hoặc KOH) 0,1N

 Dung dịch phenophtalein 1%

 Phương pháp

 Mẫu lỏng: dùng cam , chanh , tắc , mỗi loại lấy dung dịch 20g , rồi lọc ,sau đó pha loãng với nước đến 200 g , chia thành 3 cốc , mỗi cốc 20g

 Định lượng:

_ Cho vào bình tam giác 10ml (Vml) mẫu đã pha loãng ở trên, sau đó cho

5 giọt thuốc thử phenolphtalein Định lượng bằng cách nhỏ từ từ dung dịch NAOH 0,1N từ burette xuống cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt bền vững

 Tính kết quả:

Độ acid toàn phần (%) = K.n.Vo/V.100/m

n: thể tích NaOH đã dùng

m: trọng lượng mẫu phân tích (xem dung dịch nước chanh như là nước nên 10ml=10g)

K: hệ số của loại acid (mẫu thử là cam, chanh và tắc chứa nhiều Acid citric thì K=0.0064)

 Kết quả định lượng độ acid toàn phần

Mẫu Số ml NaOH 0,1N Độ acid toàn phần

Chanh 9ml 0,443

 Đánh giá: Acid citric có nhiều trong chanh

 Kết quả định lượng acid toàn phần các nhóm

Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4 Trung bình Độ acid toàn phần

Chanh 7,75 3,8 10,0 6,85 7,1 0,078

 Kết quả và thảo luận

 Giải thích: chanh có nhiều acid citric nên khi chuẩn độ dung dịch

chuyển màu hồng nhanh và bền hơn

 Thảo luận: vì các acid trong thực phẩm là acid hữu cơ nên khi trung

hòa bởi dung dịch kiềm thì môi trường luôn lớn hơn

4.2 Định tính tanin

 Giới thiệu chung

 Tanin là nhóm chất có vị chát (lá trà, ổi,…) có thuộc tính da Khi nó

kết hợp với protein của da tạo thành hợp chất không bị thối

 Ở trạng thái tự do, Tanin hòa tan trong nước, rượu, aceton, nhưng khi

kết hợp với protein thì ít tan trong rượu và aceton

 Tính chất quan trọng của tanin là rất dễ bị oxy hóa

 Định tính

 kết quả:

_ Ống FeCl3: dung dịch kết tủa đen

_ Ống Acetat chì: dung dịch kết tủa trắng vón cục

_ Ống Gelatin 1%: dung dịch kết tủa trắng

 Gải thích:

_ Tanin thực (Tanosid) được chia thành hai loại: là tanin thủy phân được (gồm PG và Ellagitanin) và tanin không thủy phân (gồm PC)

_ Phản ứng tạo phức với protein: là phản ứng đặc hiệu của tannin nhờ sự hình thành liên kết Hidro giữa nhóm -OH phenol và Nitơ trong cấu trúc amid của protein: Tanin thực (PC, PG) + Gelatin muối –> Tủa (Phức) _ Phản ứng tạo phức với kim loại đa hóa trị (không đặc hiệu): là phản ứng dùng để phân biệt 2 nhóm tannin:

_ Khi tạo phức với FeCl thì nhóm PG cho màu xanh đen, ₃

còn nhóm PC cho màu xanh rêu

_ Khi tạo phức với Chì acetat –> tủa trắng/ngà vàng (giống flavonoid) _ Dùng để loại bỏ Tanin trong dịch chiết; Sơ bộ nhận định số lượng nhóm -OH; Phức tan/cồn cao độ; Giải độc kim loại nặng

4.3 Định lượng Vitamin C bằng Iod

 Giới thiệu chung

 Định lượng vitamin C là cách để xác định vitamin C có trong thực phẩm

 Vitamin thường được phân tích bằng phương pháp chuẩn độ với 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP) hoặc dùng iod thường làm dung dịch chuẩn độ

 Nguyên tắc

 Vitamin C có thể khử dung dịch iod Dựa vào lượng iod bị khử bởi vitamin C có trong mẫu, suy ra hàm lượng vitamin C

 Hóa chất

 Dung dịch HCL 5%

 Dung dịch I2 0,01N

 Dung dịch tinh bột 1%

 Định lượng

 Cân 0,1g mẫu hòa tan với 10ml HCl 5%, cho nước cất vào đủ 250ml Khuấy đều Lấy 20ml dịch nghiền cho vào erlen dung tích 100ml, chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bột làm chỉ thị màu cho đến màu xanh

Số ml I 2 0,01N Hàm lượng vitamin C

Chanh 6,25ml 0,008

 Kết quả định lượng trung bình vitamin C bằng Iod

Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4 Trung bình Hàm lượng vitamin C

Chanh 6,75 6,25 5,0 6,8 6,2 0,082

 Giải thích: trong chanh có nhiều vitamin C nên khi chuẩn độ xuất

hiện màu xanh nhanh hơn cam và tắc

5 ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÂNG CAO

 Giới thiệu chung

 Hiểu rõ nguyên tắc hoạt động của máy HPLC, biết cách chuẩn bị mẫu

phân tích và tính toán hàm lượng Vitamin C trong mẫu

 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm

 Lấy 1ml nước chanh đem đi ly tâm trong 5 phút để có thể tách hỗn

hợp thành hai phần riêng biệt, từ đó lấy được phần trong phía trên (dễ phân tích hơn)

 Lấy 0.5ml đã được ly tâm + 2ml mobile phase (H3PO4) để pha loãng

dung dịch vì nếu đặc quá thì không thể tiến hành phân tích

 Dùng pitong lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm vào lọ vial, đậy nắp

cho vào máy phân tích sắc ký

Kết quả phân tích sắc ký lần 1

Kết quả phân tích sắc ký lần 2

Diện tích peak Lần 1 Lần 2 Chanh 386137 496410

Trung bình 441273,5

Ta có phương trình đường chuẩn của Vitamin C:

y = 4866258,57 x – 6666,76

Với x là nồng độ của Vitamin C(mg/1ml)

y là diện tích peak (mAU.s)

 x = ((y+6666.76)/4866258.57)*5*100

= 46.02512 (mg/100 mL)

Nồng độ Vitamin C trong nước chanh là 46.02512 (mg/100 mL)