(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo (solanum hainanense hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỒN NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY CALLUS CÀ GAI LEO (SOLANUM HAINANENSE HANCE) VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH ỨNG ĐẾN SỰ TÍCH LŨY HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG CALLUS Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác, thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Đoàn Ngọc Hân ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, cán kĩ thuật, bạn bè người thân Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô, cán nhân viên Phịng Cơng nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học Nông Nghiệp – Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thanh Phương - cán Viện Sinh học Nông nghiệp, người sát cánh bên tơi, nhiệt tình giúp đỡ, bảo tơi suốt thời gian thực tập Viện Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh – Viện trưởng Viện Sinh học Nơng nghiệp tận tình hướng dẫn giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình thực luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè, người ln bên cạnh động viên giúp đỡ tơi q trình học tập thực đề tài Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Đoàn Ngọc Hân iii MỤC LỤC Lời cam đoan .ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt .vii Danh mục bảng .viii Danh mục hình x Trích yếu luận văn xii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài .1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .2 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Vai trò hợp chất thứ cấp thực vật 2.1.2 Tầm quan trọng nuôi cấy tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp .3 2.1.3 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp .4 2.1.4 Các nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp nuôi cấy mô tế bào thực vật .6 2.2 Ứng dụng chất kích ứng để cải thiện tích lũy hợp chất thứ cấp ni cấy tế bào thực vật 2.2.1 Giới thiệu chất kích ứng 2.2.2 Cơ chế tác động 2.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng chất kích ứng ni cấy tế bào thực vật 10 2.3 Cây cà gai leo 11 2.3.1 Giới thiệu chung cà gai leo 11 2.3.2 Một số nghiên cứu khác cà gai leo 13 2.4 Đánh giá tích lũy hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học chiết xuất dược liệu 14 iv 2.4.1 Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thơng qua q trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột 2.4.2 14 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan chiết xuất dược liệu chuột bị nhiễm độc CCl4 in vivo .15 2.4.3 Một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan chiết xuất dược liệu 15 Phần Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu .17 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 17 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .17 3.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 17 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.2.1 Xác định mơi trường thích hợp cảm ứng tạo callus cà gai leo 17 3.2.2 Nhân sinh khối callus 18 3.2.3 Đánh giá tích lũy hoạt chất thứ cấp thơng qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên 20 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 22 3.3.2 Nuôi cấy in vitro 22 3.3.3 Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus 23 3.3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus 23 3.3.5 Xử lý số liệu .24 Phần Kết thảo luận 25 4.1 Kết 25 4.1.1 Xác định môi trường thích hợp cảm ứng tạo callus cà gai leo 25 4.1.2 Nhân sinh khối callus 33 4.1.3 Đánh giá tích lũy hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên .45 4.2 Thảo luận 49 4.2.1 Cảm ứng tạo callus .49 4.2.2 Nhân sinh khối callus 50 4.2.3 Đánh giá tích lũy hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus 52 v Phần Kết luận đề nghị 54 5.1 Kết luận .54 5.2 Đề nghị 54 Tài liệu tham khảo 55 Phụ lục 59 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt αNAANAA αNAA- naphtyl axetic acid BA Benzyl adenine CT Công thức DAM Dialdehyt malonyl ĐC Đối chứng HCTC Hợp chất thứ cấp HTCO Hoạt tính chống oxy hóa LED Light emitting diode LSD5% Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% MS Murashige and Skoog NADCC Sodium dichloroisocyanurate POL Q trình peroxyd hóa lipit TB Trung bình TN Thí nghiệm YE Yeast extract 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyscetic acid vii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng tổ hợp BA αNAA-NAA đến khả tạo callus từ đoạn thân cà gai leo 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng tổ hợp BA αNAA-NAA đến khả tạo callus từ mảnh cà gai leo 26 Bảng 4.3 Ảnh hưởng tổ hợp BA 2,4-D đến khả tạo callus từ đoạn thân cà gai leo 28 Bảng 4.4 Ảnh hưởng tổ hợp BA 2,4-D đến khả tạo callus từ mảnh cà gai leo 29 Bảng 4.5 Ảnh hưởng tổ hợp BA 2,4-D đến khả tạo callus từ đoạn thân cà gai leo 30 Bảng 4.6 Ảnh hưởng tổ hợp BA 2,4-D đến khả tạo callus từ mảnh cà gai leo 31 Bảng 4.7 Ảnh hưởng môi trường đến nhân sinh khối callus từ đoạn thân cà gai leo 33 Bảng 4.8 Ảnh hưởng môi trường đến nhân sinh khối callus từ mảnh cà gai leo 34 Bảng 4.9 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ đoạn thân cà gai leo 35 Bảng 4.10 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ mảnh cà gai leo 36 Bảng 4.11 Ảnh hưởng chiếu sáng đèn LED đến khả nhân sinh khối callus từ đoạn thân .37 Bảng 4.12 Ảnh hưởng chiếu sáng đèn LED đến khả nhân sinh khối callus từ mảnh 38 Bảng 4.13 Ảnh hưởng acid salisylic đến khả nhân sinh khối .40 Bảng 4.14 Ảnh hưởng acid salisylic đến khả nhân sinh khối callus môi trường A2 41 Bảng 4.15 Ảnh hưởng chất chiết nấm men đến khả nhân sinh khối callus môi trường A1 42 Bảng 4.16 Ảnh hưởng chất chiết nấm men đến khả nhân sinh khối callus môi trường A2 43 viii Bảng 4.17 Tổng hợp kết yếu tố ảnh hưởng đến nhân sinh khối callus .45 Bảng 4.18 Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết cà gai leo 46 Bảng 4.19 Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết callus nhân sinh khối mơi trường A2 46 Bảng 4.20 Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết callus nhân sinh khối môi trường A2 + g/l nấm men 47 Bảng 4.21 Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết callus nhân sinh khối mơi trường A2 + 100µM acid salisylic 48 Bảng 4.22 So sánh hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên .49 ix