Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của việc bổ sung tổ yến và đẳng sâm đến sinh trưởng và hàm lượng adenosine trong nuôi cấy nấm trùng thảo (Cordyceps militaris)

TÓM TẮTDé tài nghiên cứu “Anh hưởng của việc bô sung tô yên và dang sâm đên sinh trưởng và hàm lượng adenosine trong nuôi cấy nam trùng thảo Cordyceps militaris” đã được thực hiện từ thá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

3k 3k sắc sk 3k fe sắc ak 2 2 €

KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP

ANH HUONG CUA VIỆC BO SUNG TO YEN VÀ ĐĂNG SAM

DEN SINH TRUONG VA HAM LƯỢNG ADENOSINE

TRONG NUOI CAY NAM TRUNG THAO

(Cordyceps militaris)

SINH VIÊN THUC HIEN : NGUYEN MINH TRÍ

NGANH : NONG HOC

KHOA : 2019 - 2023

Thành phố Hồ Chi Minh, thang 11/2023

ANH HUONG CUA VIỆC BO SUNG TO YEN VA ĐĂNG SAM

DEN SINH TRUONG VA HAM LUQNG ADENOSINE

TRONG NUOI CAY NAM TRÙNG THẢO

(Cordyceps militaris)

Tac gia NGUYEN MINH TRI

Khóa luận tốt nghiệp được dé trình dé đáp ứng yêu cầu

cấp bằng Kỹ sư Nông học

Giảng viên hướng dẫn

ThS NGUYEN PHAM HONG LAN

Thanh phó Hồ Chí Minh

Tháng 11/2023

1

OI CAM ON

Đề hoàn thành bai khóa luận này, em đã nhận được nhiều sự hướng dan, động

viên và giúp đỡ của mọi người xung quanh Trước hệt, con xin cảm ơn Cha Mẹ đã sinh

ra con và cảm ơn Ông Bà đã nuôi nâng, dưỡng dục con nên người Xin cảm ơn gia

đình và người thân đã luôn ủng hộ và dõi theo con đường mà con chọn.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệmkhoa cùng toàn thể giảng viên khoa Nông học đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho

em những kiến thức và những bài giảng quý báu trong suốt quá trình học tập của mìnhtại Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơnđến Thay Trần Văn Bình có van học tập của lớp DH19NHB đã luôn quan tâm và theosát tiền trình học tập của em

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Phạm Hồng Lan — Giảng viên

bộ môn Cây lương thực Rau Hoa Quả, khoa Nông Học, Trường Đại học Nông lâm TP.

Hồ Chí Minh đã tận tinh hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm dé giúp em

có thê hoàn thành khóa luận của mình Cảm ơn cô đã luôn theo dõi và góp ý những lúc

em gặp khó khăn trong suốt quá trình làm đề tải

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Thanh Khiết giám đốc công ty TNHHYến Thạch Hộc đã tiếp nhận và tạo điều kiện thuận lợi cho em có cơ hội cọ sát thực tế,quy trình thực hiện để củng cố kiến thức đã học của mình

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến những anh, chị và bạn bè đã hết lònggiúp đỡ, san sẻ, đóng góp ý kiến để mình có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cảm

ơn đến tập thể lớp DH19NHB đã đồng hành với mình trong suốt chặng đường đại học

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Minh Trí

il

TÓM TẮT

Dé tài nghiên cứu “Anh hưởng của việc bô sung tô yên và dang sâm đên sinh

trưởng và hàm lượng adenosine trong nuôi cấy nam trùng thảo (Cordyceps militaris)”

đã được thực hiện từ tháng 5/2023 đến tháng 8/2023 tại xã Phước Lại, huyện CầnGiuộc, tỉnh Long An Mục tiêu đề tài là xác định được các liều lượng tổ yến và đẳngsâm phù hợp bồ sung vào cơ chất giúp nam sinh trưởng tốt, cải thiện hàm lượng hoạt

chat adenosine va mang lại hiệu quả kinh tê.

Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoản toàn ngẫu nhiên (CompletelyRandomized Design — CRD), sáu nghiệm thức và ba lần lặp lại Các nghiệm thức trong thínghiệm: NT1: 0 g yến + 0 g dang sâm (đối chứng), NT2: 3 g yến + 0 g dang sâm, NT3: 3

ø yến + 20 g dang sâm, NT4: 3 g yến + 40 g dang sâm, NTS: 3 g yến + 60 g dang sâm,

NT6: 3 g yến + 80 g dang sâm được bồ sung vào cơ chất nền tính trên 1 lít: 30 g glucose +

30 g nhộng tằm xay nhuyễn + 1 g cao nam men + 2 g pepton + 1 g KHzPO¿+ 1 g MgSOu.Các nhóm chỉ tiêu bao gồm: thời gian sinh trưởng; sinh trưởng, ghi nhận tình hình bệnhhại; năng suất; hàm lượng adenosine; hiệu quả kinh tế

Kết quả đề tài cho thấy: Nắm trùng thảo được nuôi cấy trên cơ chất được bésung thêm 3 g yến +80 g dang sâm có khả năng sinh trưởng và phát triển vượt trội vềngày xuất hiện quả thé (8,7 NSC), chiéu cao tan nam dat cao nhat tai thoi diém 45NSC (8,92 cm), chiéu cao qua thé cao nhat (8,6 cm), ty lệ hộp nắm nhiễm bệnh thấp(2.4%), khối lượng tan nắm tươi/hộp (105,8 g), khối lượng phan nam tươi/hộp (42 g),khối lượng phần nắm khô/hộp (8,6 g), tỷ lệ khô/tươi phần nam khô cao (20,6 g) demlại năng suất thực thu phần nam khô cao nhất dat 8,7kg/1.000 hộp, lợi nhuận cao nhất

đạt 106,9 triệu đồng/1.000 hộp có VCR đạt 5,14 lần và đạt hàm lượng adenosine cao

nhất là 814 mg/kg

ili

EiTt LH ae eeraoenntarrrrrểrrrtriortrrtdlanaaaagraorrdrarrarrrrironaaorangu |

IANS) DLỚLsstranxgtttiantosttiEtosfPbbtrtftsiigBSitsưiodgiuigitrtsitts8dlGaflg8diixbiuSrttaditsittrlkBisqiBtiitlitiabksaoasbsag 2

1 2Giới hạn đề tải 5-2 + S21 122122121111 21121121112112111 0111111211111 21211121111 rye 2CHƯƠNG 1 TONG QUAN TÀI LIỆU - 25252552552 2522E2Ezxzxzxeces 31.1 Giới thiệu về nam trùng thảo -2¿2252222222E22E2EEeEESEEerxrrrrerxrrrrrrrersrerrerxc Ð1.1.1 Nguồn gốc, phân loại của nắm C #wiliđris -2 2¿©-z222222+22+z2222zzzzzzzzze 41.1.2 Thành phan hố học trong C /wiÏif4ris 2-©2¿©2225z22222+222222+22E22+zzxzszsze 51.1.3 Tác dụng của nam trùng thao 2- 2-52 522222S22E22E22E22E22E22E 22121222 crkrrei 71.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuối cấy nam C #i]i/aris -. - §

UY 1 5 8

1.2.2 Nhiệt 4G ooeeeecccecscescessesseesssesssesesevesssessnesssssnessnessnesassssnessesssssssseessesssessseseteeeseesees 8

1.2.3 Độ thống khí và độ amr ec cecceccece ess ecsessessessessessessessesseeseeseesessessesseseesseeseeseeseees 91.3.4 Yếu tổ đữh dưỡng ác c.ccccceskkcg ng H1 14 000010006 L8 G0 00000 10016125102/,0 91.3 Một số nguyên liệu làm cơ chất 2 2¿+2222E+2E22EE2EE22EE2EE22E2221222222222222222e 91.3.1 Gao huyét r6ng na 91.3.2 NhOmng 0 5£'£'33%5 10(tk: ND 10

oe: | ee 1]

1.4 Một số nghiên cứu về nam trùng thao ở Việt Nam và trên thế giới 12

CHUONG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

?.1 Thời gian vã địa điểm thí (| 16.210.600 600001674E 14

2.2 Điều kiện thí nghiệm 2-2 SSSSSSESEEE92E2E212112112112112112112112112121 21 xe 14

2S MiQb HU tat 119 BIỂTHTsszeessessessssebssssoEsoss9Eiisk.ös tonya i tee te ieee te arora 14 2A Phone phap thi 1s G HH: scscessnsersaemaman anes nec 16 2.5 Chi tiêu va phương pháp theo dõi - -¿- cece ceeeeeaeesceeecsesecsesseseesens 17 5: Đai: Line ane gril ONTOS xuessasuiassrestoostrnnffdtBrtsgii20038800514603100n8n00135tDNG3483300E01N5S.010g.0A80.0/0160858080 17 2,5 2; Chi tiến sinh HOU 8 iáiiszsexozix542651243135535246385)8313525186L833858828a833-53E28E32814.3836X83385505083 17

2.5.3 Các chỉ tiêu về bệnh hain eee ceccccccccceceecseseesessesscssseesecsssesaesssseseeseeesaesnsaeeseeeees 18

es a 182.5.5 Chỉ tiêu về ham lượng adenosine cscccessesssecseessecseesessessesesesseesessesstesseees 209.356 Hiệu guá Ình tễ u22 001 10H HH M1 c7 9 3.000 6420110 172010x6e giun 203ð Phương pla tL a TĨNH <ceenesxeodhckancirhoguEnhdghik ti ie cen 20

0251 3118 /gi1854ÌxE(191áxe1ip 4Ð TT ốc eee 20

Chương 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 2-22 ©222S22E22E22E22E22E22222222222222Xe2 23Sul Anh hưởng của việc bổ sung tổ yến và dang sâm đến thời gian sinh trưởng trong

NUOL Cay NAM tring 1T 23

3.2 Anh hưởng của việc bố sung tổ yến và đẳng sâm đến khả năng sinh trưởng của

MAM Ung thao 0 25

3.2.1 Ảnh hưởng của việc bổ sung tô yến va dang sâm đến chiều cao tan nam trùng

¡DÙNợNỪÿẶNN 25

3.2.2 Ảnh hưởng của việc bồ sung tô yến và dang sâm đến số lượng và kích thước quả

thé nam tring thao 20 27

3.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung tổ yến và dang sâm đến tình hình bệnh hại trong nuôiCay mam tring g1 J8 :a“<54 303.4 Ảnh hưởng của việc bồ sung tô yến và đắng sâm đến năng suất nắm trùng thao 313.4.1 Ảnh hưởng của việc bổ sung tổ yến và dang sâm đến khối lượng tươi của nam

EMTS TA ese scene se gì ng h5 01301465 30,1800818164358081230 180188308 6.4G0.38:3818500580885488040.i8:3i-3853GBS5.10038.584.80i:6480/08 31

3.4.2 Anh hưởng của việc bổ sung thêm yến và dang sâm đến khói lượng khô của nam

TRUS KHẢ can kg2 211A chất gu G081531141335SDE33:3388,135055013588S40S8KGSE4G455G4S533.X58481SSGGG4LEHSEEE338/54g83gg8Á 32

3.4.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung tổ yến và dang sâm đến tỷ lệ khô/tươi của nam

CUTS THỦ bang ngeinhgnhiiniGiHgtoliGS0G0600058S805005⁄01S8GESBRENGSESS0IS9.H8SSIB/SGEIGGGBESHG4GIG4353088800-01180048003806883.0835808 33

3.4.4 Ảnh hưởng của việc bồ sung tô yến và dang sâm đến năng suất lý thuyết và thực

CH: HOTS nuối CAY mâm TUE KHẢO sececsscsseassrssewsnanenenavonenuescentenevcrensnoeenreameanenennsrnrnarcectes OD

3.5 Anh hưởng của việc bổ sung tổ yến và dang sâm đến hàm lượng adenosine trong nuôicấy nắm trùng thảo 2-2: sSS‡S9E19E19E1521221521111111111111111111111111111111 1 1y 36

3.6 Ảnh hưởng của việc bổ sung tô yến và dang sâm đến hiệu quả kinh tế trong nuôi

cấy nắm trùng thảo - ¿52 ©2222222E2222212231221221121122121211 21 rrev 37KET LUẬN VÀ DE NGHỊ 2 S22SS22S22E2212212212121221212121212121 2121 xe 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 2-22 ©2222S22E222122E222122312212212211221211211 21.2 xe 38

EEE G0000 adBsaaasi 41

VI

DANH SACH CHU VIET TAT

Viết day đủ (Ý nghĩa)

Cộng tác viên

Đông trùng hạ thảo

Đối chứngLần lặp lại

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bang 3.1 Ảnh hưởng của việc bồ sung tổ yến va dang sâm đến ngày xuất hiện tơ, ngày lankin tơ, ngày xuất hiện quả thé và ngày sinh trưởng trong nuôi cấy nấm trùng thảo 26Bảng 3.2 Ảnh hưởng của việc bồ sung tổ yên và dang sâm đến chiều cao tan nam (cm)trong nuôi cay nam trùng thảo tại các thời điểm theo dõi trùng thảo . - 29Bang 3.3 Anh hưởng của việc bồ sung tô yến và dang sâm đến chiều cao quả thé (cm),

đường kính quả thé (mm) và số lượng qua thé (sợi) trong nuôi cấy nam trùng 31

Bang 3.4 Anh hưởng của việc bồ sung thêm yến va dang sâm đến khối lượng tan nam tươi(g), phan quả thé tươi/hộp (g) và phan dé tươi/hộp (g) trong nuôi cấy nam tring thao 34

Bang 3.5 Anh hưởng của việc bồ sung thêm yến và dang sâm đến khối lượng tản nam khô

(g), phần quả thể khô/hộp (g) và phan dé khô/hộp (g) trong nuôi cấy nắm trùng thảo 35Bang 3.6 Ảnh hưởng của việc bổ sung thêm yến và dang sâm đến tỷ lệ khô/tươi tannam (%), tỷ lệ khô/tươi qua thé (%) và tỷ lệ khô/tươi của dé nam (%), tỷ lệ phan namtrong nuôi cấy nam trùng thảO -2- 2: 22SS+SS‡EE9EEEEE921523221271712111111121111111 2 re 36Bang 3.7 Ảnh hưởng của việc bổ sung tổ yến và dang sâm đến năng suất thực thu tannam (kg/1.000 hộp), năng suất lý thuyết và năng suất thực thu phần nam (kg/1.000hộp) trong nuôi cây nấm trùng thảo -2-©22©2222222E22EE22EE2EE£EEE2EE2EE2EE2EErrrrrrrre 38Bang 3.8 Hiệu quả kinh tế của nam trùng thảo nuôi cấy trên cơ chất bổ sung tô yến và

đăng sâm (triệu đồng/1.000 hộp) - 2-2 ©2¿2S+2E+SE+SE2EE2EE22E22E22E21221221221221222222 2e 39

Bảng PL1 Chi phí chung sản xuất 1.000 hộp nam trùng thảo -2 22-552 46Bảng PL2 Tổng chi (triệu đồng/ 1.000 hộp) của các nghiệm thức - 47Bảng PL3 Tổng thu (triệu đồng/ 1.000 hộp) của các nghiệm thức 47Bang PL4 Bảng chuyền đổi số liệu - 22 22©22222E22EE22EE22E122212221222122222222222Xe2 48

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Himh 1.1 Nam tritng thao 8n" 44 Ả.ẢẢ 5Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của cordycepin -+-2222+2++2++2E++EE£2E+2EE2E2Exzrxrsrrer 6Hình 1.3 Cấu trúc hoá học của ađenoSine ¿2 +2 eEx2EEEE£E2E2EEE12E17121221 212 xxeC 7Hình 2.1 Meo giống dạng lỏng 2-©22©22222222E22E222122122212212232221271221221 22.2 xe 17Thi FT ee 17Hình 2.3 Tổ yến đã làm sạch - 2-2 2 2222+2E92E22E22122127122122112127121212121 212 re 17Hình 2.4 Gạo huyết rồng 2 2 22222SS22EE2E1221122122122112112112212112112112211211 21c e0 18Hình 2.5 Nhộng tam sau khi mua VỀ 2-22 ©2222S22E2EE22EE2EEEEE2EE223222222122222xee 18Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm -2- 22 ®+222EE£EE22EE2EEE2E12217312212712211211 22.2 xe 18Hình 2.7 Toàn cảnh khu vực bố trí thí nghiệm - 2-2 5S+SS2SE+EE+2E2£E2£EtZEtzEzzzed 19Hình 2.8 Cách đo đường kính quả thỂ -2- 2 22SS£SS2SE£EE2EE2EEEEEEEE2E22E212322222 2e 20Hình 2.9 Cách cân phần mam -2- 22222212222 22E221221221211221 2122212212211 1.2 xe 21Hình 2.10 Cách cân phan đỀ 2: 2 +SS+SE+EE£EE£EE£EEEEEEEX2212121211121212121 2 re, 21

Hình 2.11 Cách cân qua thỂ - 2-52 SSS22S2SE9222E22E22125121221211212212112122121121211211 21 xe 21

Hình 2.12 Đặc điểm của co chất sau khi cho vào hOp ecssesssesseesseesseeeseesseesseeeseesseenees 32Hình 2.13 Các hộp cơ chất được bỏ vào néi hap khử trùng 2- 25522522: 23Hình 2.14 Hộp cơ chất đã được cấy giống vào hộp 2- 2 22 52+2z+2z+zzzzxzzzzze2 24Hình 2.15 Nắm tại thời điểm thu hoạch + 2 5s+S£2E£EE2E£EEEEEZEEEEEEEEEEEEEErrrrrerxrex 24Hình 3.1 xuất hiện tơ nấm 2: 2 2 2S£SE2ESE£EE2E218212112122121121112112111112111 21.21 c0 27Himh 3.2 Xuat hién qua thé Ồ ẢẢ 35Hình 3.3 Chiều dài qua thé ở các nghiệm thức 2-©2222222222EE2222Ez22zzzzzzzxee 30

1X

Hình 3.4 Quả thé tại thời điểm: a) 15 NSC, b) 25 NSC, c) 35 NSC, đ) 45 NSC 31

Hình 3.5 Tỷ lệ nắm bệnh hại - 2 22 ©222SS£SESEE2EE22E12E1221122122112112212211221212222 33Hình 3.6 Bệnh nắm mốc xám xanh - 2 2 2+SSE£EE2EEEE£EE2EEEEEEE2E71E21711711121e 11x e 33Hình 3.7 Hàm lượng adenosine của nam trùng thảo -22222222z22+z2zz22zze: 39Hình PL1 Pha môi trường cơ chất và dung cụ do lường 2-22 ©2222z22zz222z<: 45Hình PL2 Khối lượng trước và sau khi cho môi trường cơ chất vào hộp 45Hình PL3 Nồi hap và thời gian, nhiệt độ hấp - 2-52 2SS22E£2E22E22E22E 2xx czxze, 45Hình PL4 May sấy thăng hoa 2 2222©2222222EE22122212212212712211221221 22121122 xe 46Hình PLS Khay nam sau khi sấy thăng hoa - 2-22 ©22222222222+222222Exz£Ezzzxee 46

GIỚI THIỆUĐặt vấn đề

Trùng thảo (Cordyceps militaris) là loài nam ký sinh trên côn trùng, thuộc chi

Cordyceps, thuộc lớp Ascomycetes, ngoài tự nhiên thường được phát hiện trong các

khu rừng nhiệt đới và được sử dụng lâu đời như một vị thuốc cổ truyền của các nướcphương Đông (Das va ctv, 2010) Hiện nay, có rất nhiều loài nấm thuộc chiCordyceps Tuy nhiên chỉ có loài C militaris được đưa vào thí nghiệm nuôi cấy thànhcông Loài C militaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính như cordycepin,adenosine, mannitol, cordypolysaccarid, acid amin và nhiều thành phần khác tươngđương, thậm chí còn cao hơn loài Ophiocordyceps sinensis, dé dàng nuôi trồng thành

công trong môi trường nhân tạo (Li và ctv, 1995; Dong va ctv, 2012).

Adenosine cùng với Cordycepin là những thành phần dược tính chính củatrùng thảo Hàm lượng adenosine được phát hiện trong nắm trùng thảo nuôi trồng

(C militaris) cao hơn so với loài đông trùng hạ thao (ĐTHT) trong tự nhiên (O.

sinensis) (Hardeep và ctv., 2014), có tính chống viêm và chống co giật, có thể

điều trị suy tim mãn tính va ức chế sự giải phóng các chat dẫn truyền thần kinh

trong hệ thống thần kinh trung ương, én định sức khỏe tim mạch lam giãn mạchmáu, cải thiện hiệu quả lưu thông máu và duy trì huyết áp ở mức ổn định việcthúc đây giấc ngủ sâu và ức chế sự kích thích, chống loạn thần, điều tiết lưu lượngmáu mạch vành, làm sáng da thông qua quá trình dao thải tế bao có chứa melanin,

tham gia bảo vệ va sửa chữa mô da (Yi, 2015).

Nhằm làm cải thiện hàm lượng dược chat adenosine trong nuôi cấy nấm trùngthảo để sản xuất dược liệu Đẳng sâm được biết đến là một loại được liệu quý từ thiênnhiên vi có tính dược liệu cao cho nên khi bé sung vào cơ chất nuôi cấy nam trùng thảo

sẽ làm cải thiện hàm lượng adenosine trong nam cao hơn nhưng vẫn không làm thay đôihàm lượng cordycepin Nhưng nếu chỉ thêm dang sâm vào thì sẽ làm giảm khả năng lan

tơ và phát triển của nam (Nguyễn Thanh Khiết, 2022)

Tuy nhiên các nghiên cứu về lượng tổ yên và dang sâm phù hợp bổ sung vào cơchất nuôi cấy nam trùng thảo (Cordyceps militaris) chưa nhiều Vì vậy, đề tài “Ảnh

1

hướng của việc bô sung tô yên và dang sâm đến sinh trưởng và hàm lượng adenosine

trong nuôi cây nam trùng thảo (Cordyceps militaris)” đã được thực hiện

Mục tiêu

Xác định được các liều lượng tổ yến và dang sâm phù hợp bổ sung vào cơ chat

nuôi cay nam trùng thảo (C militaris) giúp nam sinh trưởng tốt, cải thiện hàm lượnghoạt chất adenosine và mang lại hiệu quả kinh tế

Yêu cầu

Bồ trí thí nghiệm, theo dõi chặt chẽ sinh trưởng của nam trùng thảo trên cácnghiệm thức trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm, phân tích hàm lượng adenosinecủa các nghiệm thức Bước đầu tính toán hiệu quả kinh tế trên 1.000 hộp nam

Thu thập đầy đủ, chính xác và đúng thời gian về các số liệu, hình ảnh và chỉtiêu đã đề ra

Thực hiện đúng thời gian và địa điểm cho phép

Hệ thống số liệu thí nghiệm đưa ra những kết luận sơ bộ và khuyến cáo phù hợpvới mục tiêu đề tài

Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ được thực hiện trên 5 liều lượng bổ sung tổ yến, dang sâm và 1nghiệm thức đối chứng không bổ sung tổ yến, đẳng sâm vào cơ chất nuôi cấy namTrùng thao (C militaris) vào tai công ty TNHH Yến Thạch Hộc, Cần Giuộc, Long An

từ tháng 5/2023 đến tháng 8/2023

CHƯƠNG 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Giới thiệu về nắm trùng thảo

Nam trùng thảo (còn gọi là nhộng trùng thảo, đông trùng thảo hay đông trùng

hạ thảo) là các loài nắm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số

loài côn trùng Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng nhộng trùng thảo C militaris

có giá trị dinh dưỡng cao, giúp tăng cường sức khoẻ, nâng cao hệ miễn dịch, kháng

khuẩn, kháng virus, hỗ trợ điều trị cho người bị bệnh hen phế quản, viêm phế quảnmãn tính, ho lao, cải thiện chức năng thận, liệt dương, hỗ trợ điều trị ung thư, bảo vệtim mạch và hệ thần kinh (Das va ctv, 2010) Các loài thuộc chi C ordyceps thườngđược gắn với tên gọi ĐTHT là xuất phát từ quan sát thực tế khi vào mùa đông sợi nắmchỉ phát triển trong cơ thể sâu, đến mùa hè quả thể được hình thành, mọc ra ngoài nhôlên khỏi mặt đất giống như một loài thảo mộc

Nam Ophiocordyceps sinensis (hay còn gọi là Cordyceps sinensis) (Sung vàctv, 2007) là một loại nam dược liệu phân bồ rất hạn chế trong tự nhiên và được nuôi

trồng trong điều kiện hoang đã, loài nắm này hiện tại vẫn chưa được nuôi trồng thành

công trong môi trường nhân tao, do đó sản lượng nam thu được không đáp ứng đủ nhucầu của thị trường (Li va ctv, 2006; Stone, 2008; Zhang và ctv, 2012) Loài Cordycepsmilitaris (thường được gọi nam trùng thảo), chứa các hợp chat hóa học tương tự nhưcủa O sinensis, nhưng có thé dé dàng nuôi trồng trong môi trường nhân tạo (Li va ctv,1995; Dong và ctv, 2012) Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về quy trình nuôi trồngnam C militarisis nhằm thay thé cho loài O Sinensis và có nhiều nghiên cứu quantrọng về gen, nhu cầu dinh dưỡng, môi trường nuôi cấy, các đặc tính sinh hóa và dược

ly của nam C militaris Gần đây, bộ gen hoàn chỉnh của C militaris cũng được giảitrình tự làm cơ sở cho nhiều nghiên cứu sâu hơn về loại nắm này (Zheng và ctv, 2011)

Có hơn 400 phân loài thuộc chi Cordyceps đã được tim thay va

3

mô tả, tuy nhiên chỉ có khoảng 36 loài được nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo đề sảnxuất quả thé (Wang, 1995; Sung, 1996; Li va ctv, 2006) Trong số những loài này, chỉ

có loài C militaris đã được trồng ở quy mô lớn do có dược tính rất tốt và có thời giansản xuất ngắn (Li va ctv, 2006)

Do giá trí dược liệu, giá trị kinh tế cao và tinh kha thi của việc nuôi nắm C.milifaris ở quy mô lớn, việc phát triển các nghiên cứu về nuôi trồng nắm C militarisnhằm tăng quy mô sản xuất, đáp ứng nhu cầu của thị trường trong nước và chuyêngiao công nghệ cho các đơn vị sản xuất để đem lại lợi ích kinh tế cho địa phương làhết sức cần thiết

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại của nấm C militaris

C militaris là một trong những loài nấm quan trong trong y học cô truyềnTrung Hoa Phân bố rộng rãi ở Châu Á, Nam Mỹ, Bắc Mỹ, Châu Âu, các khu vực cậnnhiệt đới đến khu vực ôn đới C militaris được sử dụng ở Trung Quốc và một số quốcgia Đông Á và hiện nay cũng được sử dụng rộng rãi ở các quốc gia phương Tây (Cui

và Yuan, 2011; Das và ctv, 2010).

Phân loại nam trùng thảo (C militaris): giới Fungi, ngành Ascomycoa,

ngành phụ Ascomycotina, lớp Ascomycetes/Pyrenomycetes, bộ Hypocreales, ho

Clavicipataceae, chi Cordyceps, loài Cordyceps militaris C militaris, tạo ra

nhiều cordycepin nhất trong số các loài Codyceps và có thé được nuôi trồng trên

môi trường nhân tạo Vì những ly do này, C militaris được sử dụng rộng rãi làm

thảo mộc hoặc thực phẩm chức năng ở khu vực Đông á (Naru và ctv, 2017)

Trong thời gian gần đây, C militaris được xem như là sự thay thé cho

O sinesis vi thành phan hoá học va tinh chất dược liệu của chúng có sự

tương đương với nhau (Dong và ctv, 2012; Huang và ctv, 2009; L1 và ctv,

1995).

1.1.2 Thanh phần hoá học trong C militaris

Trong sinh khối của trùng thảo có chứa các thành phần có hoạt tính

sinh học như cordycepin, adenosine, mannitol và polysaccharide.

1.1.2.1 Cordycepin

Cordycepin (3’-deoxyadenosine) có trong trùng thảo là một dẫn xuấtnucleoside từ nấm thuộc chi Cordyceps Cordycepin không có nhóm

hydroxyl trên số cacbon 3 (3° hydroxyl) và đây là điểm khác biệt duy nhất

so với adenosine (Hardeep và ctv., 2014) Do sự tương đồng về cấu trúc với

adenosine nên RNA polymerase không thể phân biệt khi tham gia tổng hợp

phan tử RNA, cordycepin ngăn chặn quá trình kéo dai thêm RNA và tạo các

phân tử RNA kết thúc sớm Do đó cordycepin được dùng làm chất ức chếquá trình phiên mã ngược trong điều trị các bệnh nhiễm trùng virus kế cả

HIV và viêm gan, cũng như ung thu (Itoh và ctv,1994).

căn bệnh đáng sợ trong tương lai (Hardeep và ctv, 2014).

5

1.1.2.2 Adenosine

Adenosine là một nucleoside purine tự nhiên và hình thành sự phân huỷ cua

adenosine triphosphate (ATP) — nguồn năng lượng chính của tế bào ATP bị phân huỷ

qua vai phản ứng sẽ tạo thành adenosine với sự tham gia xúc tac của enzyme

5’nucleotidase (Enzo va ctv, 2001).

Adenosine có nhiều tác dụng được lý, có thé điều trị suy tim mãn tinh va ức chế

sự giải phóng các chat dẫn truyền thần kinh trong hệ thống thần kinh trung ương (Jian.,2015) Adenosine ức chế mạnh mẽ việc giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh kíchthích Adenosine đóng vai trò quan trong trong việc thúc đây giác ngủ sâu và ức chế sựkích thích, chống loạn thần, điều tiết lưu lượng máu mạch vành, đây là một chức năngsinh lý quan trọng trong hệ thống tim mạch Ngoài ra còn có đặc tính chống viêm vàhoạt động chống co giật (Y1, 2015)

Năm 2007, Shih và ctv đã công bố quả thé nam C militaris có chứa các thành

phần hoá học như protein chiếm 40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,4 mg/g),

vitamin B1 (13,0 mg/g), vitamin B6 (62,2 mg/g), vitamin B12 (70,3 mg/g), vitamin B3

(42,9 mg/g), các nguyên tô khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm);

hợp chất hoá hoc và nhóm hợp chất quan trong: cordycepin (1,52%), codycepic acid

(11,8%), polychaccaride (30%).

Theo Hur (2008), trong quả thé nam C militaris có chứa lượng acid amin tổng số

cao hon trong sinh khối nam (69,32 mg/g trong quả thé và 14,03 mg/g trong sinh khốinam Thanh phan acid amin của mỗi loại trong qua thé bao gồm: lysine (15,06%),

glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g)

va alanine (5,18 mg/g).

Qua thé nắm C militaris có chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70% tổng sốacid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinhkhối Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thé và 33,0%trong sinh khối (Hur, 2008)

Các polysaccharide CPS -1 va CPS — 2 được tách chiết từ nam C militaris chothấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccharide, mannose vàgalactose Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide này có khả năng phục hồi

các tồn thương gan do ethanol do khả năng oxy hoá của các polysaccharide từ nam (Yan

và ctv, 2008).

Chat mannitol có thé tìm thấy ở nhiều thực vật, nhưng ở trùng thảo có hàm lượngdiosmol là cao nhất, D-Mannitol có công dụng chính là hỗ trợ giãn nở cơ tim và machmáu não, cải thiện tuần hoàn máu D-Mannitol xuất hiện trong đông trùng hạ thảo cònmang đến tác dụng giảm Cholesterol trong máu (Phùng Thị Ly, 2020)

1.1.3 Tác dụng của nắm trùng thảo

Nâng cao khả năng miễn dịch: Nấm trùng thảo có khả năng kháng viêm, tăngcường hoạt động miễn dịch dịch thể, giúp nâng cao hoạt tính của đại thực bào và các tếbảo nhiễm khuẩn Chúng điều tiết các đáp ứng của lympho bào B, tăng cường có chọn lọchoạt tinh của lympho bào T, làm tăng nồng độ các kháng thé IgG, IgM trong huyết thanh

Ngăn ngừa ung thư: Hợp chat cordycepin 3’-deoxyadenosine từ nam cho thấy hoạttính kháng vi sinh vật, ung thư, ngừa di căn, điều hoà miễn dịch (Shonkor và ctv, 2010)

Hoạt tính kháng oxy hoá: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2 chứatrong dich nam có tính kháng, hoạt tính khử và tạp phức ở nồng độ (8 mg/g) là 89%

(Fengyao và ctv, 2011)

Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thay khi sử dụng chế

phẩm từ trùng thảo, số lượng tỉnh trùng tăng, số phần trăm tỉnh trùng di động và

hình dạng bình thường tăng Hiệu quả này thậm chí duy trì sau hai tuần ngưng sử

dụng chế phẩm Lượng Cordycepin trong tế bao tăng trong thời gian sử dụng chếphẩm nên có khả năng chat này làm tăng lượng tinh dich và chất lượng tinh trùng

ở lợn (Lin và ctv, 2007).

Tan huyết phổi: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nam C militaris cóhoạt tinh gắn fibrin, do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin Enzyme này có khả năng

sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzyme fibrinolytic mạnh

khác như nattokkinase và enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme này có thé sản

xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzyme

fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hoá ở người

(Jae-Sung và ctv, 2006).

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới qua trình nuôi cấy nắm C militaris

1.2.1 Ánh sáng

Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy và hình thành

quả thé nắm Trong điều kiện không có ánh sáng, việc tạo quả thé bị ức chế (Gao

và ctv, 2000; Sato và Shimazu, 2002) Cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởngcủa nam có thé dao động tuỳ chủng nam, tuy nhiên từ 500 — 1.000 lux được xem

là điều kiện thích hợp nhất

1.2.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng lớn đến việc hình thành quả thể trong nuôicấy nam C militaris Khoảng nhiệt độ 18 — 22°C là tối ưu cho sự sinh trưởng sinhkhối nắm và năng suất quả thé Tuy nhiên, quá trình nay sẽ giảm mạnh khi tangnhiệt độ trên 25°C (Sung và ctv, 1999; Gao và ctv, 2000) Do đó, cần lưu ý về yếu

tố nhiệt độ môi trường khi trồng nắm và phải đảm bảo điều kiện này khi tiến hànhnuôi trồng nam ở khu vực có nhiệt độ môi trường không thích hợp, như sử dụng

máy điêu hòa và máy phun sương tạo độ âm.

1.2.3 Độ thoáng khí và độ 4m

Độ ẩm thích hợp cho nam C militaris dao động từ 70 - 90%, tương đương với

độ 4m không khí trong tự nhiên sẽ phù hợp cho việc tạo quả thé Khi độ ẩm thấp sẽ

làm cho môi trường khô nhanh làm ức chế phát triển của tơ nắm cũng như quả thé Độ

thoáng khí tốt giúp khích thích sự sinh trưởng của nam Các nghiên cứu cho thay việc

sử dụng màng bao HEM (hydrophobic fluoropore Membrane) cho kết quả tốt nhất vềhiệu suất qua thé nắm C.militaris (Zhang và ctv, 2010)

1.2.4 Yếu tố dinh dưỡng

Nguồn dinh dưỡng từ côn trùng: Môi trường nuôi cay nấm có thé dùng các loạinhộng va sâu khác nhau, nhưng hau hết sử dụng nhộng tằm dâu Bombyx mori L.(Hong và ctv., 2010) Các nghiên cứu cũng cho thấy có khả năng sử dụng các loại côntrùng khác để nuôi nam như ấu trùng bướm đêm Antherea pernyi (Wang và ctv.,

2002).

Nguồn dinh dưỡng từ các hợp chất hữu cơ tự nhiên: Việc sử dụng côn trùngtrong nuôi cay nam ở quy mô lớn cho thấy nhiều hạn chế về mặt nguyên liệu sẵn có,

sự tạp nhiễm trong quá trình nuôi cao hơn, do đó các hợp chất hữu cơ đã được sử dụng

dé thay thế côn trùng Xie và ctv cho thấy việc bồ sung gạo litt, lúa mạch và đậu nành

vào môi trường nuôi cấy thích hợp dé thay thé côn trùng (Xie và ctv., 2009)

1.3 Một số nguyên liệu làm cơ chất

1.3.1 Gạo huyết rồng

Gạo huyết rồng (hay gạo đỏ) có tên khoa học là Oryza sativa L., nguồn gốc từnhững vùng khí hậu nhiệt đới châu Phi Ở Việt Nam, gao huyết rồng được trồng nhiều

ở vùng Tứ giác Long Xuyên và Đồng Tháp Mười

Trong môi trường nuôi cấy nam trùng thảo, gạo là thành phan chính Tuy nhiên,không phải loại gạo nào cũng phù hợp để đóng vai trò làm cơ chất chính trong môitrường nuôi cấy nắm trùng thảo Gạo huyết rồng thường được sử dụng do van còn lớp

vỏ cảm bên ngoài hạt chứa nhiều vitamin B1, B2, B3, B5, B6, M, chất XƠ, chất béo,

9

chất dam, các nguyên tố vi lượng như canxi, sắt, magie, photpho, omega 3, omega 6,omega 9 Với hàm lượng dinh dưỡng cao, gạo huyết rồng là nguồn cung cấp giàu đạm

cho nam trùng thảo sinh trưởng và phát triển

1.3.2 Nhộng tằm

Nhộng tằm dâu (Bombyx mori L.) là âu trùng của tằm, là giai đoạn sau khi đãchín vàng sau đó bắt đầu tạo kén Sau quá trình tạo kén kết thúc, tằm lột xác bên trong

để tạo thành nhộng Nhộng tằm rất giàu chất đạm, các vitamin A, BI, B2, C, ngoài ra

còn chứa nhiều acid amin thiết yêu và các chất khoáng như canxi, phốt pho Trong 100

ø nhộng tằm có 79,7 g nước, 13 g protid; 6,5 g lipid và cung cấp tới 206 calo (ChữVăn Lâm, 2020) Hàm lượng protein trong nhộng tằm rất cao, chiếm tới 73,5%, gồmnhiều acid amin quan trọng như leucine, isoleucine, lysin, threonine, cysteine,

phenylalanine, tyrosin, valin, arginin, alanine, glycin.

Theo Tomotake va ctv (2010) đã đánh giá nhộng tằm như một nguồn protein valipid mới Nhóm tác giả chỉ ra tổng lượng protein và lipid tính theo trọng lượng khôcủa nhộng là 55,6% và 32,2%, trong đó những protein và amino acid thiết yếu nhưvaline, methionine va phenylalanine Bên cạnh đó, nhộng tằm cũng chứa một lượnglớn Omega 3, chủ yếu là ø-linolenic acid axit (36,3%) và 1-deoxynojirimycin (DNJ)

có tác dụng là giảm lượng đường trong máu, thông qua việc tác dụng ức chế hoạt độngcủa a-glucosidase Những nghiên cứu ban đầu trên thé giới về môi trường nuôi trồng

C militaris được thực hiện trên côn trùng Tuy nhiên, nhược điểm của phương phápnuôi trồng nảy là giá thành kinh tế cao, sản lượng thấp Gạo trộn với nhộng tằm đượcchứng minh là cơ chất tốt hơn các cơ chất khác và cho đến nay thường được sử dụnglàm môi trường nuôi trồng

1.3.3 Tổ yến

Tô yên là tô của loài chim yên (Aerodramus fuciphagus Amechanus) hiện nay đã

được nuôi rộng rãi ở nhiêu nơi băng các nhà nuôi yên Tô yên được tạo thành từ nước

bot của chim yên, vào mùa sinh sản chim yên trông va chim yên mái sẽ bat dau làm tô

đề chuân bị chào đón chim con ra đời Khi làm tô, chim yên tiệt ra nước bọt có dang sợi

10

như sợi tơ, sau khi tiếp xúc với không khí những sợi này sẽ bị đông cứng lại gắn chặt

vào vách đá hoặc trần nhà dệt thành tổ, có hình dạng như vỏ sò, màu trang đục

Các thành phần dinh dưỡng chính có trong tổ yến là carbohydrate, protein và

glycoprotein ngoài ra nó còn chứa đến 31 nguyên tổ vi lượng trong đó có đồng, brôm,

canxi, sắt, kẽm, mangan, magie Trong kết quả của một số nghiên cứu hiện nay chothấy, trong thành phần tổ yến có chứa đến 18 loại acid amin, một số trong đó có hàmlượng rất cao như aspartic acid, serine, tyrosine, phenylalanine, valine, arginine Năm

2005, Marcone đã chỉ ra rằng hàm lượng dinh dưỡng cơ bản của tổ yến gồm protein

(62 — 63%), carbohydrate (25,62 — 27,26%) va lipid (0,14 — 1,28%).

Trong tổ yến có các nguyên tố đa lượng, vi lượng và các khoáng chất cần thiết

cho cơ thé giúp 6n định thần kinh, tăng cường trí nhớ, kích thích tăng tiêu hoá, làm

sạch phổi và các cơ quan hô hấp, cân bằng quá trình trao đổi chất trong cơ thể vàchống lão hoá

Tổ yến đã được nghiên cứu khi thêm vào cơ chất nuôi nam trùng thảo (C.militaris) với lượng 3 g giúp tối ưu khả năng lan tơ và phát triển nắm nhanh hơn khikhông thêm vào, làm rút ngắn được thời gian ủ tơ thay vì thời gian ủ tơ Đẳng sâm khi

được thêm vào cơ chat sẽ làm chậm đi quá trình lan tơ và hình thành quả thé của nam

vi vậy cần b6 sung tổ yến vào dé tối ưu quá trình lan tơ cũng như hình hành qua thé

của nam Đồng thời tổ yến cung cấp thêm 18 loại acid amin có lợi đối với cơ thé(Nguyễn Thanh Khiết, 2022)

1.3.4 Dang sâm

Đăng sâm có tên khoa học Codonopsis javanica hay còn được gọi là sâm dâyngọc linh, sâm leo, sâm đùi gà, ngân đẳng, sâm nam Là cây leo nhỏ sống lâu năm,

thân leo dai 2 — 4 m màu tím có lông thưa, rễ củ hình trụ 10 — 20 em, đường kính củ

khoảng 1 — 2 em, lá mọc đối hình tim hoặc trứng

Hiện nay các nhà khoa học sau khi tiến hành nghiên cứu đã tìm thấy trong đẳngsâm có chứa các hoạt chất vô cùng quý giá cho sức khỏe con người như hai thành phầnvàng chữa bệnh hàng đầu là saponin, alkaloid, đây là hai chất mà các sâm nào cũng có.Ngoài ra còn có những hoạt chất acid amin, vitamin C 85,5 mg, sterol, codonopsin,

11

codonopsis pilosula, polysaccharides, codonolactone, protid 4,2%, glucid 13,1%, chat

xơ 3,3 %, carotene 3,6 mg Ngoài các thành phần chính dang sâm còn có các thành

phan phụ gồm tinh dau, glucose, sentellarin, chất khoáng, các nguyên tố vô cơ và các

nguyên tố vi lượng có tác dụng bồi bổ năng lượng, giúp cơ thé bệnh nhân phục hồi

một cách nhanh chóng (Vũ Lâm, 2022).

Saponin được biết đến là một trong những thành phần hóa học của các loại thảo

mộc rất có lợi cho sức khỏe của con người Với hợp chất này, người ta phân loại thànhnhiều hợp chất khác nhau bởi mỗi loại sẽ cho tác dụng đặc trưng và tính hiệu quảriêng Có khá nhiều loại thực vật khác cũng có saponin nhưng từ những nghiên cứukhoa học khách quan cho biết saponin ở các loại nhân sâm hay dang sâm lại có nhiềuđiểm khác biệt Saponin có tác dụng giảm cholesterol, giảm nguy cơ ung thư, tăng khả

năng miên dịch, chông oxy hoa.

Nguyễn Thanh Khiết (2022) đã tiến hành thí nghiệm về cơ chất nuôi cấy nắm

trùng thảo (C militaris) b6 sung đăng sâm và đã cho ra kết quả việc bổ sung dang sâm

cải thiện hàm lượng adenosine va saponin trong quả thé nam

1.4 Một số nghiên cứu về nam trùng thảo ở Việt Nam và trên thế giới

Huang va ctv (2009) đã nuôi cấy nhân tạo nam C militaris với kết quả là hàm

lượng cordycepin và adenosine trong quả thê được phân tích tương ứng là 2,654 + 0,02mg/g và 2,45 + 0,03 mg/g; Trong hệ sợi nam thì hàm lượng cordycepin va adenosine

tương ứng là 0,904 + 0,02 mg/g va 1,592 + 0,03 mg/g Ngoài ra, Huang va ctv (2009)

còn cho biết, hàm lượng cordycepin va adenosine được tích luỹ trong quả thé C

militaris in vitro cao hơn qua thê Ở sinenses tự nhiên.

Hong và ctv (2010) đánh giá khả năng lây nhiễm của ba giống nấmDaeseungjam, Baegokjam và keumokjiam trên nhộng tằm Kết quả nhộng bị nhiễm C.milifaris chết trong 2 — 3 ngày và trở nên cứng khoảng 7 ngày sau khi cay nam vào Tỷ

lệ lây nhiễm của C militaris vào nhộng tam rat tốt ở giống Daeseungjiam là 90,8%,tiếp theo là Keumokjam với 76,6%, và Baegokjam với 63,9%

Trần Công Sơn (2014) đã nghiên cứu nuôi cấy hệ sợi nam Cordyceps sinensis 6quy mô phòng thí nghiệm cho kết quả là trên môi trường PGA tốc độ lan tơ của sợi

12

nam C sinenses trong điều kiện tối (0,46 cm/ngày) nhanh hơn điều kiện có chiếu sáng(0,25 cm/ngày), sợi nam C sinenses phát triển tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ buồng

nuôi 20°C và chu kỳ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối

Năm 2017, Đỗ Tuấn Bách nghiên cứu chỉ ra ảnh hưởng của các điều kiện dinh

dưỡng và nhiệt độ tác động đến sự phát triển của mầm qua thé C militaris trong môi trường

nhân tạo Qua khảo sát ở các công thức môi trường, đã rút ra điều kiện nuôi cấy tối ưu C.militaris bao gồm: giá thé 20 g gạo bô sung 32 mL dung dịch dinh dưỡng chứa glucose 40g/L, peptone 5 g/L, MgSOy.7H20 1,5 g/L, KH¿PO¿ 1,5 g/L, NAA 1 mg/L, bột nhộng tam3%; nuôi cay ở điều kiện 12h chiếu sáng ở 25°C, 12h tối ở 20°C Hàm lượng cordycepintrong mẫu quả thé thu được từ môi trường tối ưu đạt 4,33 + 0,08 mg/g, cho thấy tiềm năngcủa nghiên cứu đề áp dụng trên quy mô công nghiệp

Nhìn chung, các nghiên cứu liên quan đến cơ chất nuôi cay nắm C militaris(trùng thảo) còn hạn chế Vì vậy, đề tài “Anh hưởng của việc bé sung dang đến sinhtrưởng va hàm lượng adenosine trong nuôi cay Trùng thảo (Cordyceps militaris)” cầnthiết được thực hiện

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại Công ty TNHH Yến Thạch Hộc, thị tran Cần

Giuộc, tỉnh Long An từ tháng 5/2023 đến 8/2023

2.2 Điều kiện thí nghiệm

Phong cấy có nhiệt độ 20 — 22°C, độ 4m > 70 — 85% có tủ cấy vô trùng và hệthống đèn chiếu sáng Các thiết bị, vật dụng trong phòng cay luôn được vệ sinh và xit

côn sau khi sử dụng.

Phòng ủ tơ nam duy trì ở nhiệt độ 20 — 22°C, độ âm > 45 — 70%, điều kiệnkhông ánh sáng, khử khuẩn sạch sẽ.

Phòng nuôi quả thể nắm ở nhiệt độ 20 — 22°C, độ ẩm > 75 — 99% có hệ thống

phun sương và lay không khí bên ngoài, chiếu sáng bằng đèn LED 12 tiếng mỗi ngày

với cường độ 800 — 1.200 Lux Các hộp nam được đặt trên kệ có chiều dọc 3 m vangang 1,5 m gồm 4 tầng khoảng cách mỗi tan là 50 cm

2.3 Vật liệu thí nghiệm

Giống nam trùng thảo (C militaris) được công ty TNHH Yến Thạch Hộc phân lập

và cung cấp Là giống cấp 2 dạng lỏng có màu vàng cam và khả năng sinh trưởng tốtđược chứa trong chai thủy tinh và có thể tích 200 mL

Nguyên liệu làm cơ chất:

- Gạo huyết rồng được mua từ các cửa hàng bán gạo trong khu vực

- Nhộng tằm được mua từ các cửa hàng, siêu thị là nhộng tằm đông lạnh có màu

vàng nâu.

- Tổ yến được sử dụng là tô yến thô loại 2 có màu trắng nga sam, còn lông, có

vị tanh đặc trưng khi sử dụng cần được ngâm nước và làm sạch lông

14

- Dang sâm được trường đại học Cần Tho cơ sở Măng Den nuôi trồng và cung

cap là dang sâm tươi có màu trắng hơi pha vàng nhạt, trọng lượng từ 15 - 25 g/1 củ

- Đường glucose, cao nấm men, pepton, muối khoáng (KHzPOx, MgSO¿) docông ty TNHH PHACOLAB cung cấp

Dụng cụ và thiết bị cơ bản:

- Nồi hấp tiệt trùng 50 lít với công suất 3kW, điện áp 220V, hap 75 hộp/lần

- Tủ cay vô trùng dùng dé phân lập và cay giống có màng lọc vi sinh và đèn UVdiệt khuẩn

- Súng cấy meo giống thiết bị chuyên dụng dé phun giống nắm lỏng vào hộp cơchất đo công ty CP SUMO Nhật Việt cung cấp

- Máy sấy thăng hoa 10 kg công suất 2,5kW, điện áp 220V

- Nhiệt âm kế điện tử dé đo nhiệt độ và độ âm, máy phun sương, hộp nhựa trụ

vuông (11 x 11 x 9) màu trong suốt, bịch nilong (PE) 20 x 20 em, dây thun

- Hii thủy tinh lục giác thể tích 180 mL

Hình 2.2 Dang sâm

2.4 Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm đơn yếu t6 (Randomized completely design — RCD) được bố trí theokiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức (NT) với 3 lần lặp lại (LLL).

NT 1:0 g tô yén/L + 0 g dang sâm/L (ĐC)

NT2: 3 g tổ yén/L + 0 g dang sâm/L

NT 3: 3 g tổ yến/L + 20 g đẳng sâm/L

NT4: 3 g tổ yên/L + 40 g đẳng sâm/L

NT 5:3 g tổ yến/L + 60 g đẳng sâm/L,

NT 6: 3 g tổ yến/L + 80 g đẳng sâm/L

Cơ chất nền tính trên 1 lít: 30 g glucose + 30 g nhộng tằm xay nhuyễn + 1 g cao

nam men + 2 g pepton + 1 g KHzPO¿ + 1 g MgSO¿ + lượng tổ yên và dang sâm tương

ứng với từng nghiệm thức Pha 90 mL dung dịch cơ chất vào hộp nhựa có sẵn 50 ø gạo

Hình 2.7 Toàn cảnh khu vực bố trí thí nghiệm thời điểm 10 NSC

Quy mô thí nghiệm

- Số ô cơ sở: 6x3=18 ô cơ sở

- Mỗi 6 cơ sở gồm 25 hộp nam, tổng số hộp thí nghiệm là 450 hộp

- Diện tích toàn cảnh khu thí nghiệm: 4,5 m?

in

2.5 Chi tiêu và phương pháp theo dõi

2.5.1 Thời gian sinh trưởng

Quan sát toàn bộ các hộp trong ô cơ sở.

Ngày xuất hiện tơ nam (ngày): Được tính từ khi cấy đến khi thấy xuất hiện sợi

tơ nam dai 1 mm

Ngày lan kin tơ (ngày): Được tinh từ khi cấy đến khi có > 50% số hộp trong 6

cơ sở được tơ nam phủ kín 100% bề mặt hộp phôi

Ngày xuất hiện quả thé (NSC): Được tinh từ ngày cay nam đến khi có > 50% sốhộp nam/6 cơ sở xuất hiện quả thé đạt kích thước 1 mm

2.5.2 Chỉ tiêu sinh trưởng

Bắt đầu đo sau 15 ngày kế từ ngày cấy, đo 9 hộp/ô cơ sở không tinh hàng biên,

dùng bút lông đánh dấu, 10 ngày đo 1 lần và đo trong 4 lần đối với chỉ tiêu chiều cao

tan nam Do sau khi thu hoạch đối với chỉ tiêu chiều cao quả thé, đường kính quả thé

và số lượng quả thé

17

Chiều cao tan nấm (cm): Dùng thước thang do từ chân đế nam đến ngọn củacây nắm cao nhất.

Chiều cao quả thé (cm): Dùng thước thang do từ chân nam tới đỉnh của qua thé,mỗi hộp đo 3 cây nắm có kích thước cao nhất

Đường kính quả thé (mm): Dùng thước kẹp do phan rộng nhất của quả thé, mỗi

hộp đo 3 cây có đường kính to nhất

Hình 2.8 Cách đo đường kính quả thé

Số lượng quả thể (sợi): Đếm toàn bộ số lượng sợi nam có trên | tản nam

2.5.3 Các chỉ tiêu về bệnh hại

Bắt đầu kiểm tra sau 3 ngày cấy, 10 ngày kiểm tra một lần và kiểm tra trong 5 lần

Ti lệ hộp nam bị nhiễm bệnh (%) = (Tổng số hộp bị bệnh/Tổng số hộp của 6 cơ

sở) x 100.

2.5.4 Chỉ tiêu về năng suất

Mỗi ô cơ sở cân 9 hộp và cân sau khi thu hoạch

Khối lượng tản nam tươi (g): Cân cả phan dé nam va phần nam

Khối lượng phan nam tươi/hộp (g): Cân phần nam sau khi đã cắt rời phần dé

Khối lượng phan dé tươi/hộp (g): Cân phan dé sau khi đã cắt rời phần nam

Khối lượng tản nam khô (g): Lay phần nắm khô + phan dé khô

Khối lượng phần nắm khô/hộp (g): Cân phần nắm sau khi được sấy thăng hoa

Khối lượng phan dé khô/hộp (g): Cân phần dé sau khi được sấy thăng hoa

18

Ty lệ khô/tươi của tan nắm (%) = (Khối lượng phần nam khô + Khối lượng

phan dé khô)/Khối lượng tản nam tươi x100

Tỷ lệ khô/tươi của phần nắm (%) = (Khối lượng phần nắm khô/khối lượng phầnnam tươi) x100

Tỷ lệ khô/tươi của dé nam (%) = (Khối lượng phan dé khô/Khối lượng phan dé

tươi) x100

Năng suất lý thuyết phần nắm khô (kg/1.000 hộp) = (Khối lượng phan nắm khô

của 1 hộp) x1.000 Trong đó, khối lượng phan nam khô là khối lượng phan nam đãđược sấy thăng hoa trên một hộp

Năng suất thực thu phan nấm khô (kg/1.000 hộp) = (Khối lượng toàn bộ phan

nam khô của 1 6 cơ sở /25) x 1.000

Hình 2.11 Cách cân tản nắm tươi

19

2.5.5 Chỉ tiêu về hàm lượng adenosine

Phân tích hàm lượng adenosine bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao(HPLC) Chọn ngẫu nhiên 10 g nam/nghiém thức đã sấy thăng hoa gửi đến công tyTNHH Công nghệ NHONHO đề định lượng adenosine (mg/kg) có trong mẫu

2.5.6 Hiệu quả kinh tế

Tổng chi (triệu đồng/1.000 hộp) = Chi phí nhân công + Chi phí điện nước + Chiphí vật liệu (giống, hộp, bịch PE, thun, gạo huyết rồng, tô yến, đẳng sâm, nhộng tam,hoá chất, ) + Chi phí khác (khấu hao)

Tổng thu (triệu đồng/1.000 hộp) = Năng suất thực thu x Giá bán trên thị trường

tại thời điểm thu hoạch

Lợi nhuận (triệu đồng/1.000 hộp) = Tổng thu - Tổng chi

VCR (Value cost Ratio) = Lợi nhuận tăng thém/Chi phí tăng thêm

2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được tổng hợp tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 Các

số liệu trong thí nghiệm được xử lý bằng chương trình R - 4.0.5 Phân tích phương saiANOVA để phát hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức và tiến hành trắc nghiệmphân hạng LSD ở mức ý nghĩa œ = 0,05 hoặc œ = 0,01 (nếu có)

2.7 Quy trình thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và cơ chất

Hình 2.12 Đặc điểm của cơ chất sau khi cho vào hộp

- Cân 50 g gạo huyết rồng cho vào hộp nhựa

20

- Xay nhuyễn dang sâm, nhộng tầm và tổ yến đã làm sạch lông cho vào thùng

đã có đường glucose, cao nắm men, pepton, KHzPO¿ và MgSO4 khuấy đều sau đó đồ

90 mL dung dịch vào hộp đã được chuẩn bị sẵn

Bước 2: Hấp khử trùng

- Dùng bịch PE cột miệng hộp rồi đem hấp tiệt trùng ở 125°C, áp suất 1 atm,

lưu trong 35 phút.

- Dé nguội tự nhiên rồi chuyên qua phòng cấy

Hình 2.13 Các hộp cơ chất được bỏ vào nỗi hấp khử trùng

Bước 3: Cấy giống

- Cấy meo giống gốc dạng lỏng, dùng súng cấy meo phun § mL/hộp các thaotác thực hiện trong tủ cấy đã vô trùng và vệ sinh sạch sẽ bằng cồn, sử dụng đèn cồn dékhử trùng dụng cụ và thao tác cay meo phải nhanh gon, nằm trong phạm vi an toàn của

ngọn lửa đèn côn dé hạn chê sự xâm nhập của vi khuân và nam hại.

Hình 2.14 Hộp cơ chất đã được cấy giống

21

- Sau đó, dùng bich PE buộc kín hộp rồi đem ủ tối nhân sinh trong 1 tuần.

sinh trưởng của sợi nam và giảm năng suất

Bước 5: Dem ra phòng sáng nuôi qua thé

- Các hộp nam đã lan kín tơ sẽ được đem ra phòng nuôi quả thé cần có ánh sáng

dé bắt đầu quá trình hình thành và phát triển qua thé của nam

- Trong thời gian này cần thường xuyên theo dõi để phát hiện và loại bỏ hộpnam bị nhiễm bệnh

Bước 6: Thu hoạch

- Nam được thu hoạch sau 40 ngày ké từ ngày ra quả thé, khi phần đầu quả théphình to và chuyển màu đậm hơn phần thân, dùng dao hoặc tay tách rời phần quả thể

ra khỏi phan dé nam đem sấy thăng hoa (làm đông ở nhiệt độ -18°C trong 6 giờ, thănghoa ở nhiệt độ 40°C trong 17 gid, sấy khan ở nhiệt độ 45°C trong 3 giờ, áp suất 0,7atm), sau khi sây độ âm còn lại trong SỢI nam chi còn từ 1 — 4%

- Bao quan nam bang cách cho vào hũ thủy tinh có gói hút âm đóng kính tránh

tiép súc với không khí làm nam bị mém.

Hình 2.15 Nam tai thời điểm thu hoạch

22