Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA đến khả năng hình thành chồi và sinh trưởng cây ráng ổ rồng (Plantycerium ridleyi Christ.) trong điều kiện in vitro

Về sau này thuật ngữ “nuôi cay mô tế bào thực vật” được dùng để mô tả về phương pháp nhân giông cây trông băng cách tác động trực tiêp mô tê bào, cây được nhân nuôi trong môi trường phòn

TRUONG ĐẠI HOC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NONG HOC

28 28 2 2k 28 2K Ok

KHOA LUAN TOT NGHIEP

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ BA, NAA DEN KHẢ NANG HINH THANH CHOI VA SINH TRUONG CAY

RANG O RONG (Plantycerium ridleyi Christ.)

TRONG DIEU KIEN IN VITRO

SINH VIÊN THUC HIEN : TRAN QUANG PHUNGANH : NONG HOC

KHOA : 2019 - 2023

Thanh phố Hồ Chi Minh, tháng 11 năm 2023

ANH HUONG CUA NONG ĐỘ BA, NAA DEN KHẢ NANG

HINH THANH CHOI VA SINH TRUONG CAY

RANG O RONG (Plantycerium ridleyi Christ.)

TRONG DIEU KIEN IN VITRO

Tac gia

TRAN QUANG PHU

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu

LỜI CẢM ƠNCon xin gởi lời cảm ơn đến Cha Mẹ và những bậc sinh thành đã sinh con ra và

nuôi dạy con đên ngày hôm nay.

Xin gởi lời cảm ơn đến Ban Chủ nhiệm Khoa, các Thầy Cô khoa Nông học,Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức

và kinh nghiệm bồ ích trong suốt thời gian em học tập tại trường

Xin gởi lời cảm ơn đến những Thay Cô bộ môn Cây Lương thực — Rau — Hoa —Quả đã tạo điều kiện cho em thực hiện khóa luận và cho em những lời góp ý sâu sắc để

em hoàn thiện khóa luận của mình hơn.

Em xin trân trọng cảm ơn cô Nguyễn Phạm Hồng Lan và anh Nguyễn HoàngQuân đã tận tình hướng dẫn, hết lòng truyền đạt cho em những kinh nghiệm trong

nghiên cứu khoa học, từng thao tác kỹ thuật Luôn quan tâm đưa ra những định hướng

hỗ trợ em khi em gặp khó khăn trong khi thực hiện khóa luận, luôn động viên, quan

tâm em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành gởi lời cảm ơn đến tập thể quý anh chị Công ty TNHH khoa

học kỹ thuật công nghệ Việt Sinh Em xin cám ơn quý công ty đã tạo mọi điều kiện về

cơ sở vật chất và nhân lực hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Em xin gởi lời cảm ơn đến quý anh chị đã hỗ trợ em trong suốt quá trình thực

hiện kháo luận, nhờ sự nhiệt tình giúp đỡ và động viện từ các anh chị mà em đã không

bị nản chí và mất định hướng trong quá trình thực hiện khóa luận này

Xin được gởi lời cảm ơn đến các bạn, các em là những người luôn nhiệt thình

hỗ trợ và đồng hành cùng mình trong suốt khóa luận Nhờ sự động viên và hỗ trợ kỹthuật của các bạn, các em mà mình đã hoàn thành khóa luận tốt đẹp

Xin chân thành cám ơn!

TP Hồ Chi Minh, tháng 8 năm 2023

Sinh viên

Trần Quang Phú

il

kiện in vitro.

Đề tài gồm 2 thi nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completerandomized design — CRD) với ba lần lặp lại Thí nghiệm 1 là thí nghiệm 2 yếu tốkhảo sát 5 nồng độ của BA là 0 mg/L, 2 mg/L, 4 mg/L, 6 mg/L, 8 mg/L kết hợp 3 nồng

độ NAA là 0 mg/L, 0,1 mg/L, 0,2 mg/L đến khả năng hình thành chồi của cây rang 6rồng in vitro Thí nghiệm 2 là thí nghiệm 1 yếu tố khảo sát 5 nồng độ NAA là 0 mg/L,0,2 mg/L, 0,4 mg/L, 0,6 mg/L, 0,8 mg/L lên giai đoạn sinh trưởng cây rang 6 rồng invitro Cac chỉ tiêu theo dõi bao gồm các chỉ tiêu về sinh trưởng, khối lượng củaprothallus ở thí nghiệm 1 và của cây ráng ô rồng ở thí nghiệm 2

Cây rang 6 rồng được nhân giống trong môi trường MS có bé sung 4 mg/L BAkết hop 0,1 mg/L NAA cho két quả vượt trội về số chéi (20,20 chéi), chiều cao chéi(0,95 cm), đường kính chồi (0,75 cm), số lá (41,50 lá), khối lượng chồi (0,65 g),đường kính một prothallus đạt 1,77 em và khối lượng đạt 3,32 g sau 60 ngày nuôi cấy.Bên cạnh đó, cây ráng 6 rồng sinh trưởng tốt về chiều cao (1 em), khối lượng (0,61 g)

và số lá (2,65 lá) khi bố sung 0,4 mg/L NAA sau 60 ngày nuôi cay

MỤC LỤC

Trang

TRANG TH kugartrrrnrtbrrirttityrtittoniigttiprisinptitgttipintstsgttoWgtyiatangtaaniingnrvgessgi i(aCe | —— ẽreaereerrrrrrrrrtrrrtyordalonaayrrdrrrrtioraoaioraaasanend ii

i ee iii

MUC LUC 00255 HH ,ÔỎ iv

TRAINED GAC CHỮ VIỆT WALD wicrcccnciscscercisnsinncasenasrnssnadsnacanaeieenteunincentivinasnesirnncaes viDANH SÁCH BANG imrmmuenmcuccnrerensncmannnanmenannanusanaauamennesl vii

1.1 Tổng quan về ngành Dương xi và cây Rang 6 rồng -22©52 5522222222252 3

173 Phương thiúerihfn piÖnH, cv SA 2n22-20050122042E12020<Es152EA0.00120-4212022g07<2- 71.3 Chat điều hòa sinh trưởng BA, NAA o cccccesseccsessscssesssessesseessseseesecesecenessesseesteesess 9Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2d ING) LRT TB NIST CU os 5S 1Ẻ ốc 14

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên Cir oo cece ccc ecc ccs eecsessesseesseesessecseessessessesseeseesseens 14Phe Kiện Desh a ess cnt oscsrnnornnrtnansanntenncnccstnorinsnadcnrmnteneinidetenmrnsetananisiaomace 14

2:4, Viak WG0 thi 118 DICH sangcgntn tot ng Lai Ga GGSLSISGESNHSSARINGDHAGANHRHSSEHEBRIGSIIIBEGIIVRSIRIGOEĐHuES 14

2.6 Phương pháp xử lý số liệu - 2 2¿©2++2+2E+2EE2EEE2EE22EE2EE22E221271221221 22x 20

2.7 Cách thực hiện thí nghiệm 5 2G 2222223222231 253222E 2531212112121 E1.11xxre 21

Choong KẾT QUA VA THÁU LUA sưnngnngrnsotrenbatasrautitisnttsiostissstssne 243.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến giai đoạn nhân chồi cây

a 24

1V

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến giai đoạn sinh trưởng của câyANG 6 LOM t4 35

A Ae ee 5 | ene 38TÀI LIEU THAM KHAO.Q cccsssssssssssecscsssccssessccssssnscsnscsasssasssaccenccsnccencssacsenccencesses 39

OE ————————— 43

DANH SÁCH CHU VIET TAT

Viết tắt Viết đầy đủ (Ý nghĩa)

IAA Indol-3-acetic acid

IBA 1H-indole-3-butyric acid

LiL Lan lap lai

MS Murashine va Skoog (1962)

NaOH Sodium hydroxide

NAA Naphthalenne acetic acid

NaOCl Sodium hypochlorite

NN Môi trường Nitsch and Nitsch (1969)

N Mau nhiém

P ridleyi Platycerium ridleyi Christ.

P&T Parker’s and Thompson

SH Schenk and Hildebrandt (1972)

SLCD Số liệu chuyên đổi

TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N-1, 2, 3-thiadiazol-5-ylurea)

TB Trung binh

TN Thí nghiệm

WPM Woody Plant Medium

vi

DANH SÁCH BANG

Trang

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA vàNAA đến số chồi (chéi) cây 6 rồng P ridleyi 25Bang 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chéi (cm) cây 6 rồng 28Bang 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến đường kính (cm), số lá (lá), khốilượng (g) của chồi cây 6 rồng P riđileyi :-22-©2¿22222222E22222232221221221221 22122 xe 30Bang 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến đường kính (cm) và khối lượng (g)của prothallus cây 6 rồng P Ñ¿đleyi 2 2-©2222222222E22222EE2EE2EE2EEEEESEErrxrzrrrrev 33Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến chiều cao chỗi (em), số lá của chồi (lá) vàkhối lượng tươi của chỗi (g) cây 6 rồng P riđleyi 2 2¿©22©722c5z2cszcszzcscsez 36Bảng PL 2.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến số chổi hình thành (chéi) củacây 6 rồng P ridleyi in ViẨFO 2-52 s+SE‡SE9EE9EE£EEEEE221221711121212121112111 2111 xe 47Bảng PL 2.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến chiều cao chồi (cm) của cây

Š rừng P rilevÌ Wy VIG seesssesesensdebointirtsdEtgSgdEGA0E40469099000180009100000001 00091004000 48Bang PL 2.1.3 Số liệu thực về ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến đường kính

chéi (cm) của cây 6 rồng P ridleyi in ViẨfO 2- 2-52 5222S2E22E£2E22E2ZEZEZEzEzxezxez 49

Bảng PL 2.1.4 Số liệu chuyên đổi về ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến đườngkính chéi (cm) của cây 6 rồng P ridleyi im VifrO -2¿©22©222222S+2E+2E2E2EzEzzzzxzez 50Bang PL 2.1.5 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến đường kính (cm) va khốilượng (g) prothallus của cây 6 rồng P ridleyi in VitrO -2 2 5z22+22++2z+22xzex 51Bảng PL3 Các thành phần môi trường MS (Murashige T., Skoog F., 1962) 66

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cây rang 6 rồng Platycerium ridleyi Christ (Kla, 2023) - 4

Hình 1.2 Qui trình tạo và nhân giống cây rang 6 rồng bằng con đường in vitro 9

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử từ góc nhìn 2D (Pubchem, 2023) 2-2-2 10 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử từ góc nhìn 2D (Pubchem, 2023)11 Hình 2.1 Mẫu prothallus cây rang 6 rồng được nuôi trong môi trường MS có bồ sung than hoạt tính ở điều kiện in ViẨrO - 2 2+ 2+S2+S£SE£EE2E2EE£EE2E22E2212171212122122121 22 xe, 15 Hình 2.2 Mẫu chồi cây rang 6 rồng đạt chiều cao chỗồi 3 + 1mm được nuôi trong môi trường MS có bồ sung than hoạt ở điều kện in vitO 2- 2222 2222z22+z2zz+zzzz+z 15 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm l 2- 2-22 522SE+SE2EE2EE2EE2EE22E22E22E2E222222222e2 7 Hình 2.4 Cách bố trí mẫu trong bich cấy 2-©2222222222EE22E22E22212232222222222zze 17 Hình 2.5 Cách chọn mẫu dé theo dõi và chỉ tiêu thí nghiệm l - - 2-52 19 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 2- 2 S+SE+2E22E2EE2EE22E22E212212122122122222222Xe2 19 Hình 2.7 Cách chọn mẫu để theo dõi và đo chỉ tiêu thí nghiệm 2 ss- ce- 21 Hình 2.8 Quy trình xử ly mẫu bao tử cây 6 rồng và bồ trí thí nghiệm 1 22

Hình 2.9 Quy trình cấy chuyền mẫu cây 6 rồng va bố trí thi nghiệm 2 22,

Hinh 2.10 Mau prothallus, chồi bị chết (trai) và mau prothallus, chồi bị nhiễm nắm (00) ee 0370-3058 s8 22 Hình 3.1 Số chéi phát sinh ở nghiệm thức B4N0, 2¿©2252225222+z25z2zzz>+2 26 Hình 3.2 Chiều cao chéi của 15 nghiệm thức tại thời điểm 60 NSC - 29

Hình 3.3 Đường kính chéi của 15 nghiệm thức tai thời điểm 60 N§C 32

Hình 3.4 Đường kính cụm prothallus của 15 nghiệm thức tại thời điểm 60 NSC 35

Hình 3.5 Chiều cao chỗi cây rang 6 rồng từ của 5 nghiệm thức . - 3

Hình 3.6 Số lá của chéi cây rang 6 rồng của 5 nghiệm thức -2- 222 5s+2zzz4 37 Hình PL1 Cân khối lượng chéi (trai) va prothallus (phải) tại thời điểm 60 NSC 43

Hình PL2 Mẫu prothallus phát sinh rhizoid tại thời điểm 25 NSC 43 Hình PL3 Mẫu cụm chéi tại thời điểm 60 NSC - 222ccccccccrrrreerrrrreed 44 Hình PL4 Do đường kính cụm prothallus tai thời điểm 60 NSC 2-52 44

vill

Hình PL5 Chi phát triển trong môi trường chỉ b6 sung NAA ở thí nghiệm 2 tại thời

Hình PL6 Đường kính prothallus ở 15 nghiệm thức từ 1 — 15 tương ứng từ nghiệm

thức BONO — B8N0 2 nen ng nnõ menvenenmnemencn cnr 45

Hình PL7 Do chỉ tiêu đường kính prothallus tại thời điểm 60 NSC - 45Hình PL8 Bao tử cây rang 6 rong P ridleyi (trai) và Bao tử cây rang 6 rồng được khử

trùng bằng dung dịch javel tỷ lệ 1:5 (Phải) 2: 22 22 525S+2E+2E+£E2EzEzxzxzzsez 46

Hình PL9 Mẫu cây rang 6 rồng nảy mam sau 1 tháng nuôi trong môi trường in vitro(trái) và mẫu rang 6 rồng sau khi được cấy chuyên lần 1 (phải) - 46

GIỚI THIỆU

x L$ À

Đặt van de

Ngành dương xi là ngành thực vật bậc cao xuất hiện sớm nhất trên trái đất Đây

là ngành thực vật có sự đa dang cao về số loài và đặc điểm sinh sống Rang 6 rồng làmột loài trong ngành dương xi thuộc họ Polypodiaceae có tiềm năng về cảnh quan hapdẫn không kém loài P coronarium (Tawan và ctv, 2005) Rang 6 rồng cũng là loài cónhiều công dụng về mặt dược liệu và tính điều hoà không khí cao (Lưu Nguyễn Mai

chưa cao.

Hiện nay, có rất nhiều chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong nuôi cấy

mô, các chất điều hoà sinh trưởng đóng vai quan trọng trong sự phát sinh hình thái các

cơ quan thực vật bao gồm tạo rễ, thân, lá Đặc biệt các chất BA, NAA thường được sửdụng bởi cơ chế tác động hiệu quả và giá thành hợp lý BA thuộc nhóm cytokinin cócông dụng tạo chồi bat định, ức chế tạo rễ, kích thích phân chia tế bào, điều hòa khởitao callus, kích thích phá ngủ chổi nách, ức chế kéo dai chéi và ức chế sự già hóa lá(Vũ Văn Tiến, 2018) NAA thuộc nhóm auxin có công dụng tạo rễ bất định (nồng độ

cao), tạo chồi bất định (nồng độ thấp), cảm ứng tạo phôi sôma, phân chia tế bào, tạo và

kích thích sinh trưởng mô seo, ức chế chổi nách, ức chế kéo dai rễ (Vũ Văn Tiến,2018) Tuy nhiên mỗi loại cây ở mỗi giai đoạn sinh trưởng thích hợp với nồng độ chấtđiều hòa sinh trưởng khác nhau Thêm vào đó các nghiên cứu về nồng độ chất điềuhòa sinh trưởng trên cây rang 6 rồng Platycerium ridleyi Christ còn hạn chế

Từ những cơ sở trên đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ BA, NAA đến khả nănghình thành chồi va sinh trưởng của cây rang 6 rồng (Plantycerium ridleyi Christ.) trongđiều kiện in vitro” được thực hiện.

Mục tiêu

Xác định được nồng độ BA kết hợp NAA cho giai đoạn nhân chồi của cây rang

6 rồng (Platycerium ridleyi Christ.) trong diéu kién in vitro

Xác định được nồng độ NAA cho giai đoạn sinh trưởng của cây rang 6 rồng(Platycerium ridleyi Christ.) trong điều kiện in vitro

Yêu cau

Bồ trí thí nghiệm va thu thập số liệu đúng thời gian, dam bảo tinh khách quan

Đánh giá, theo dõi, thu thập các chỉ tiêu sinh trưởng của cụm chéi va chồi cayrang 6 rồng ở điều kiện in vitro

Đánh giá, theo dõi, thu thập các chỉ tiêu sinh trưởng của chồi cây rang 6 rồng ởđiều kiện in vitro

Phân tích dữ liệu sinh trưởng theo phương pháp thống kê sinh học

Giới hạn đề tài

Đề tài chỉ tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp NAA đếngiai đoạn nhân chi (thí nghiệm 1) và nồng độ NAA đến giai đoạn sinh trưởng của câyrang ô rồng (Plantycerium ridleyi Christ.) trong điều kiện in vitro tại Công ty TNHHkhoa học kỹ thuật công nghệ Việt Sinh từ tháng 2 đến thang 8 năm 2023

Đề tài không phân tích hiệu qua kinh tế của cây 6 rồng P ridleyi

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về ngành Dương xỉ và cây Ráng ỗ rồng

1.1.1 Tổng quan ngành Dương xỉ

Ngành Dương xi (Pteridophyta) là một ngảnh thực vật lớn, với hơn 300 chi và

bao gồm hơn 12.000 loài phân bố rộng khắp trên Trái đất Phân bố loài chủ yếu ở cácrừng nhiệt đới có khí hậu nóng am, đặc biệt là các vùng rừng cận xích đạo Dương xỉ

là một trong những ngành thực vật đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành

thảm thực vật đưới tán rừng Chúng có tác dụng giữ độ ẩm, chống xói mòn Ở Việt

Nam hiện nay, các nhà thực vật học đã phát hiện được 718 loài với 135 chi thuộc 29

họ của ngành dương xỉ (Đậu Bá Thìn và Phạm Hồng Ban, 2015)

Các loài thuộc ngành dương xỉ là các loài thực vật có mạch, không có hạt, sinh

sản thông qua các bào tử bằng cả hai hình thức: sinh sản vô tính và hữu tính Cây sinhdưỡng có thân, rễ, lá, các túi bào tử thường hình thành ở mặt dưới phiến lá Thể bào tử

được sinh ra từ hợp tử và mang các túi bào tử Lúc chín, các túi bào tử phát tán các bảo

tử bằng nhiều con đường khác nhau dẫn đến độ đa dạng sinh học thực vật của ngànhdương xi rat cao vì chúng thích nghi và sinh sống ở bat cứ môi trường nào có đủ điềukiện sinh thái đối với chúng

1.1.2 Nguồn gốc Ráng ỗ rồng

Rang 6 rồng (Plantycerium ridleyi Christ.) được phát hiện ở trong rừng đầm laythan bùn đất thấp phân bố ở khu vực bán đảo Malaysia, Borneo thuộc Brunei vàSarawak (Tawan va ctv, 2005) Theo tiếng địa phương P ridleyi được gọi là dương xi

sừng hươu Ridleyi hoặc Tandukrusa hoặc Lukud (Wong, 1990).

1.1.3 Phân loại

Giới: Thực vật (Plantae); Ngành: Duong xi (Pteridophyta); Lớp: Dương xi (Polypodiopsida); Bộ: Dương xỉ (Polypodiales); Họ: Ráng đa túc (Polypodiaceae);Chi: Ô phượng (Platycerium); Loài: P ridleyi

Rang 6 rồng (Platycerium ridleyi Christ.) là một loài thuộc họ Polypodiaceae

(Họ Rang da túc) (Phạm Hoàng Hộ, 1999) Ho rang đa túc (Polypodiaceae) ở Việt

Nam có khoảng 114 loài, chủ yếu có môi trường sống dưới tán rừng thường xanh và

có hình thức sinh sản bằng bào tử (Phạm Hoàng Hộ, 1999).

1.1.4 Đặc điểm thực vật học

Rang 6 rồng (Platycerium ridleyi Christ.) sống biéu sinh, cây có hai loại lá là: lá

tổ và lá tán Thân rễ ngắn, phủ đầy lông ở phần giữ và phần ngọn của lá tô Lá nonhoặc lá tổ phát triển ở phần đỉnh trung tâm được bao phủ bởi những sợi lông hình saomau nâu Lá tan phát triển hơn lá tổ Lá tổ tròn, có chiều rộng và chiều dài lá là 25 - 36

cm x 30 70 em, có gân sâu, dày, cứng, khi trưởng thành có lớp vở nhăn, bám chắc vào

cây ký chủ hoặc giá thể, gân lá phân đôi, nhô cao, mép nguyên, mỏng, hơi trong, lục

nhạt Lá già chuyên sang màu xanh đậm, đến nâu vàng, đến nâu sam và héo dan, lá già

sẽ không rụng mà nằm lại trên cây giúp bảo vệ rễ, giữ nước và cung cấp chất dinhdưỡng cho cây Bảo tử phân bố dày đặc và đều ở trong túi bào tử (Tawan và ctv, 2005)

Prothallus: thể nguyên tản, gồm tập hợp của tế bào giao từ đực và giao tử cái

Prothallus có thé tồn tai ở dạng don tinh hoặc lưỡng tinh Đây là giai đoạn xuất hiện ởquá trình phat tan bao tử những cây ho Duong xi.

Hình 1.1 Cây rang 6 rồng Platycerium ridleyi Christ (Kla, 2023)

1.1.5 Đặc điểm sinh thái

Trong tự nhiên môi trường của P ridleyi phân bố chủ yếu trong rừng đầm layđất thấp và thường được phát hiện gần các con sông nơi có độ âm trong không khí cao(Wong, 1990) Ở Sarawak P ridleyi được ghi nhận xuất hiện trong ba khu rừng đầmlầy than bùn (Tawan và ctv, 2005) Nơi thích hợp của loài này là trên các hốc của câylớn, tại các chạng ba, nơi nhận được ánh sáng và mưa trực tiếp, nhưng đây cũng là nơilượng nước bốc hơi nhanh dẫn đến cây dễ bị thiếu nước và héo Trong môi trường

nhân tao dé trồng và chăm sóc được rang 6 rồng cần cho cây vào môi trường không

khí âm.

1.1.6 Giá trị cây Rang 6 rồng

1.1.6.1 Giá trị sinh thái

Rang 6 rồng là một loài thuộc ngành đương xi đóng vai trò vô cùng quan trọng

trong đa dạng sinh học thực vật Trong y học, một số loài rang lộ rồng mang dược tính

có tác dụng tiêu phù, giảm ngứa, làm liền xương nên được sử dụng dé chữa ghẻ lở,

mẫn ngứa, gãy xương và chứng phù thũng (Phạm Thị Linh, 2021) Các cây thuộc

ngành dương xi còn có tác dung trong điều hoa và lọc không khí, chúng được ví như

máy lọc không khí sinh học cho môi trường (Lưu Nguyễn Mai Phương, 2020) Có

nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đương xỉ là loài cây có khả năng hấp thu asen rất cao,

Ma và ctv (2002) đã phát hiện ra những cây dương xi diều hau (Preris vittata L.) mọc

tại một khu rừng được bảo tồn nhưng đã bị bỏ hoang do nhiễm độc asen Khi phân tích

lá của chúng, họ phát hiện thấy nồng độ asen (As) lớn gấp 200 lần so với vùng đấtxung quanh (Phan Thị Truyền, 2017)

1.1.6.2 Giá trị cảnh quan

Rang 6 rồng là loài cây có sức sống mạnh, hình dang đẹp lạ, thường được sử

dụng trong trang trí cảnh quan các công trình, biệt thự, quán cà phê hay quán ăn,

khuôn viên nhà ở (Phan Thị Truyền, 2017).

Theo thông tư số 22/2019/TT-BXD, ban hành ngày 31/12/2019 của Bộ Xâydựng, quy định tỷ lệ đất cần dành cho cây xanh trong các khu đất xây dựng công trìnhthuộc nhóm nhà chung cư là ít nhất 20% Mật độ xây dựng mảng xanh của các tòa nhàchung cư tối đa phụ thuộc vào diện tích lô đất và chiều cao của công trình Mật độ này

có thể biến đổi từ 35% đến 75%, tùy thuộc vào kích thước lô đất và chiều cao của tòa

nhà Những quy định này nhằm đảm bảo rằng việc xây dựng đô thị sẽ thực hiện có sự

cân nhắc giữa sự phát triển và bảo vệ môi trường sống Điều này sẽ tạo ra không gian

sống xanh, thoải mái và bền vững cho cư dân Các đặc điểm về sinh thái của cây 6rong P ridleyi phù hợp với môi trường sống trong các tòa nhà chung cư hay dưới tán

cây cảnh quan lớn nên tiềm năng phát triển cây 6 rồng P ridleyi thành cây cảnh quan

phục vụ trang trí trong các công trình dân dụng là rất cao

1.1.6.3 Giá trị phong thuỷ

Theo quan niệm người Á Đông, phong thủy là một phần văn hóa lâu đời khôngthé thiếu trong đời sống tinh than, từ đó các thuyết âm dương, ngũ hành là kim, mộc,thủy, hỏa, thô ra đời Nhu cầu về cây xanh trong nhà hay những địa điểm quan trọngkhông còn đơn thuần chi là việc tạo mảng xanh mang lại không khí trong lành ma cònmang theo những biểu tượng tinh than của con người

Rang 6 rồng là loài cây biểu tượng cho sự may mắn, tài khí sung mãn, gia chủbình yên Cây tượng trưng cho sự gắn kết, hoà hợp, tình cảm đong đầy giữa các thành

viên trong gia đình (Vườn mặt trời, 2023).

1.1.6.4 Giá trị kinh tế

Cây 6 rồng P riđleyi mang hình dạng đặc biệt giống gac hươu, có giá trị kinh tế

rất cao Hiện cây đang được rao bán trên nhiều san giao dịch trực tuyến va tại các nhà

vườn trong nước với giá dao động từ không dưới 200 đồng đến vài triệu đồng Hiệnnay việc nhân giống 6 rồng P ridleyi cũng như các giống 6 rồng ngoại khác được nhập

về Viêt Nam rất khó khăn về kỹ thuật chăm sóc và mat rất nhiều thời gian để có mộtlượng cây giống lớn cung cấp cho nhu cầu thị trường

1.2 Phương thức nhân giống

Rang 6 rồng (Platycerium ridleyi) là loài thuộc ngành dương xi, phương thứcnhân giống chủ yếu bằng bảo tử Nhân giống cây ráng ô rồng trong môi trường và điềukiện bình thường sẽ đạt hiệu quả thấp Vì thế nhằm nâng cao số lượng và chất lượng

cây con, rút ngắn thời gian nhân giống, rang 6 rồng được nhân giống bằng phương

pháp nuôi cấy mô

Năm 1982, ba loài dương xi thuộc chi Nephrolepis được nhân giống vô tínhthành công bằng phương pháp nuôi cấy mô (Padhya va Mehta, 1982)

Năm 1986, giống dương xi Nephrolepis exaltata đã được nhân giống thànhcông bằng cách nuôi cấy xúc tu trong môi trường MS có bồ sung 0,1 mg/L NAA, 0,1

mg/L BA và 15% nước dừa Dưới ánh sáng 3.000 lux của đèn huỳnh quang trong 16

giờ/ngày, ở nhiệt độ 25 - 27°C, trong vòng 12 - 16 tuần, kết quả cây con đã tái sinhđược chéi và hình thành được rễ (Kijwijan, 1986)

1.2.1 Tống quan phương pháp nuôi cấy mô

Dựa vào nguyên lý tính toàn năng của tế bào thực vật, ý tưởng về phương phápnuôi cay mô tế bào thực vat được Gottlieb Haberlandt, người đặt nền móng cho nuôicấy mô tế bào thực vật, trình bày cơ sở lý luận tại Viện Hàn lâm Khoa học Đức năm

1902 (Thorpe, 2007) Tính toàn năng của tế bảo (Totipotency) là khả năng của tế bào

có thé phát triển thành cây hoàn chỉnh do tế bào có chứa hệ gen quy định toàn bộ kiểugen của loài (George ,1993) Sự phân hóa tế bao (Differentiation) là sự biến đối củacác tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng

khác nhau (George ,1993).

Về sau này thuật ngữ “nuôi cay mô tế bào thực vật” được dùng để mô tả về

phương pháp nhân giông cây trông băng cách tác động trực tiêp mô tê bào, cây được

nhân nuôi trong môi trường phòng thí nghiệm, các điều kiện sống của cây được kiểm

soát hoàn toan bởi con người.

1.2.2 Các giai đoạn của một quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu

Đầu tiên là chọn vật liệu làm khởi đầu quy trình nuôi cấy, về mặt nguyên tắc thìcác tế bao sông đã phân hóa đều có khả năng phản phân hóa dé trở lại trạng thái trẻ hóa

và tái lập khả năng phân chia (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Tiếp theo mẫu được khửtrùng dé loại bỏ các vi sinh vật bám trên và bên trong bề mặt mẫu cấy Khi chon đúngphương pháp khử trùng sẽ mang lại tỷ lệ sống cao cho mẫu, đồng thời chọn môi trườngdinh dưỡng thích hợp sẽ giúp mẫu đạt được tốc độ tăng trưởng nhanh Các chất khử

trùng thường sử dụng là: HgCl; 0,1% xử lý trong 5 10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5

-7% xử lý trong 15 - 20 phút, H2O2, dung dịch Br (Dương Công Kiên, 2003).

Giai đoạn 2: Nhân nhanh

Các mẫu sau khi được khử trùng và còn sống được chuyển sang môi trường

nhân nhanh có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin dé tái sinh

nhiều chéi từ một chỗi nuôi cấy Đề đạt hiệu quả cao nhất phải xác định được môi

trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp Chế độ nuôi cay thường là 25 — 27°C và 16giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2.000 — 4.000 lux, ánh sáng tím là thành phầnquan trọng dé kích thích phân hóa chồi (Weiss và Jaffe, 1969)

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Kết thúc giai đoạn nhân nhanh sẽ thu được một số lượng lớn chéi nhung détrồng được ngoài môi trường tự nhiên các chồi này cần có một bộ rễ đề thành cây hoànchỉnh, môi trường sử dụng trong giai đoạn này là môi trường có bổ sung các chất điềuhòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin hoặc môi trường không bổ sung thêm chat điều hòasinh trưởng Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chấtđiều hòa sinh trưởng hoặc môi trường có chứa cytokinin nồng độ thấp thì phôi pháttriển thành cây hoàn chỉnh (Dương Công Kiên, 2003)

Giai đoạn 5: Dua cây ra vườn ươm

Là giai đoạn cuối của quy trình Mục đích chuyên cây từ trong điều kiện phòngthí nghiệm ra ngoài tự nhiên Cần có giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước tốt tiếp nhận cây

in vitro Phải chủ động điêu chỉnh được âm độ và sự chiêu sáng của vườn ươm cũng

như có chế độ dinh dưỡng thích hợp (Dương Công Kiên, 2003)

Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu và cấy Giai đoạn 3: Sau | tháng bào tử nay

vào môi trường MS ⁄Z 2 NG mầm thành prothallus

ta Mẫu bào tử đã được cấy vào L2) Os ;

môi trường cấp LE

Giai đoạn 1: Thu thập bao tử ( ) Giai đoạn 4: Cay chuyền vào môi

trường MS bổ sung than hoạt tính

sau 40 ngày prothallus nảy chồi

Giai đoạn 7: Thuần dưỡng oe a Giai đoạn 6: Cay chuyền, nuôi

và đưa ra vườn ươm chăm sóc chồi có thân lá hoàn chỉnh sau đó

cấy vào môi trường tạo rễ Mau cây hoàn chỉnh trong bình mô

Hình 1.2 Qui trình tao và nhân giống cây rang 6 rồng bang con đường in vitro

1.3 Chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA

1.3.1 Tổng quan về BA

Trong quá trình nuôi cấy mô các chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò là công

cụ giúp người nuôi cay điều khiển và tác động đến mẫu cây, quá trình phân chia phânhoá tế bào trong mô tế bào thực vật

BA hoặc 6 — BA có tên khoa học là 6-Benzylaminopurine là một chất điều hoa

sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin.

Miller, 1961, khang định nhóm này thường có công dụng kích thích sự phânchia tế bào Sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Vũ Văn Vụ và ctv, 2009)

Công thức hoa học: C¡zHi1Ns

Nghiên cứu về BA

— Theo Skirvin và Chu (1979), sự nhân chổi của hoa hồng nhà kính 'Forever

Yours' (Rosa hybrida L.) đã dat được thành công khi nuôi cấy trong ống nghiệm bangcách sử dụng môi trường Murashige và Skoog (MS) cải tiến có bổ sung 6-benzylamino

purine (BA) ở mức 2,0 mg/L và axit naphthaleneacetic (NAA) ở mức 0,1 mg/L.

— Năm 1996, loài Jatropha curcas L được tai sinh thành công bằng kỹ thuật nuôicấy in vitro trong môi trường có bổ sung BA và môi trường có bé sung BA kết hợpIBA, trên môi trường bồ sung cytokinin và IBA (4,9 uM), sự tạo mô sẹo có liên quanđến sự hình thành chồi trực tiếp Các mẫu dưới lá mam và cuống lá phông lên ở gốcsau 7 - 10 ngày nuôi cấy và các mam non ngẫu nhiên xuất hiện ở vùng chuyển tiếpgiữa các phần mở rộng và phần ban đầu của mẫu trong vòng 21 — 30 ngày (Sujatha và

ctv, 1996).

— Theo Moncalean và ctv (2001), đã khảo sát được sự ảnh hưởng về nồng độ BAtrong môi trường nuôi cấy lên quá trình tạo chồi của mẫu cây Actinidia deliciosa Từlần cây chuyền thứ 1 và thứ 3 số lượng chổi và kích thước chéi khác nhau rõ rệt khicấy mẫu trong môi trường có bồ sung BA

— Theo Zheng và ctv (2007), bao tử dương xi Preris vittata L được tái sinh trong

môi trường kết hợp tối ưu của 1⁄2 MS + 1,0 mg/LGA + 0,5 mg/L 6 — BA + 300 mg/L

LH đã thúc day sự hình thành bao tử trên 75 + 10% mô sẹo

— Theo Vũ Văn Tiến (2018), nồng độ BA va NAA chênh lệch trong môi trường

sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện khác nhau của mẫu Nồng độ BA lớn hơn NAA mẫu tao

chối, ngược lại mẫu tạo rễ, nếu nông độ BA băng NAA mẫu tạo mô sẹo.

1.3.2 Tổng quan về NAA

NAA hay ơ — NAA là một chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm Auxin có tên

khoa học là a - Naphthylacetic acid.

Theo Vũ Văn Vụ và ctv, 2009, nhóm chất này được đưa vào môi trường nhằmthúc day sự sinh trưởng và giản nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp

và trao đối chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô

tính.

Công thức hoa học: Ci2Hi002

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử từ góc nhìn 2D (Pubchem, 2023)

Nghiên cứu về NAA

— Theo Khup và Sink (1982), chất điều hoà sinh trưởng NAA ảnh hưởng rất lớnkhi kích thích ra rễ Rosa hybrida Kết quả cho thấy việc sử dụng NAA đơn hoặc khikết hợp với IBA hoặc IAA cho việc tạo rễ trong nuôi cay invitro rất hiệu quả Rễ đượchình thành từ mô sẹo ở các đầu bị cắt của mẫu cấy trụ dưới lá mầm trong môi trường

bồ sung IBA (9,8 và 24,6 uM) hoặc NAA (5,37 uM) Các mẫu cuống lá tạo ra mô sẹonhỏ gọn màu trắng và đĩa lá tạo ra mô sẹo nhỏ gọn màu xanh lá cây trong môi trườngchỉ bé sung auxin nhưng không xảy ra quá trình phát sinh cơ quan

— Theo Haddad và ctv (2014), trong in vitro Asplenium nidus sinh trưởng tốt

trong môi trường MS chứa 1 mg/L số lá đạt 5,39 lá so với trong môi trường MS được

bồ sung 0,5 mg/L NAA

11

— Theo Phan Thị Truyền (2017), trong môi trường nuôi cây mẫu cây dương xi lá

nhún (Polypodium sp.) khả nang sinh trưởng tốt nhất là khi mẫu chỗồi được nuôi cấytrong môi trường MS có bồ sung 0,6 mg/l NAA số lá đạt 8,6 lá/mẫu, chiều cao cây đạt

2,08 em.

— Năm 2017, mức độ ảnh hưởng của các chất hữu cơ và NAA đối với sinh trưởngtrong in vitro của loài Coelogyne pandurata Lindley (Hartati va ctv, 2017) Tối ưu hóađược sự tăng trưởng và tăng sản lượng lan lai C pandurata Lindley và C rumphii vềmặt định tính và định lượng có thể được thực hiện bằng cách điều chỉnh môi trườngKnudson C thông qua việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các hợp chấthữu cơ Việc bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng và các hợp chất hữu cơ có thé kíchthích quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan lai

1.3.3 Một số nghiên cứu về nhân giống cây P ridleyi và các cây ngành Dương xi

Theo Morini (2000), bào tử đương xỉ Osmunda regalis được nhân giống bằngcon đường in vitro phát triển tốt trên môi trường MS và môi trường H&A không bổ

sung cytokinins.

Theo Cox va ctv (2002), bào tử Schizaea dichotoma được khử tring và vô mẫu

bằng NaOCl kết hợp streptomycin Tỷ lệ nay man cao nhất đạt 34% được ghi nhận

trên môi trường MS 1/4 C so với môi trường MS 1/2, môi trường BB, môi trường MM.

Theo Khan và ctv (2008), bào tử Asplenium nidus được vô mẫu và nhân lênthành công trong môi trường MS bồ sung 1 — 4 mg/L BAP và 0,1 - 0,5 mg/L NAA

Kích thích sự ra rễ tối ưu nhất trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L IBA

Theo Taha và ctv (2011), sự tái sinh của thể bào tử Platycerium coronariumthành công từ mẫu thé giao tử đã được quan sát thấy trong môi trường MS bổ sung 1,0

— 1,5 mg/L GA3 và 30 g/L sucrose, ở độ pH 5,8 trong 16 giờ ánh sáng và 8 giờ tối

Theo Haddad và ctv (2014), trong in vitro Asplenium nidus phát triển và nhânlên các prothallus tốt nhất trong môi trường MS bồ sung 3 mg/L Kinetin kết hợp với0,1 mg/L NAA Môi trường thích hợp phát sinh nhiều rễ là MS có bé sung 1 mg/L

NAA, và môi trường có tỉ lệ rễ dai, số lá nhiều nhất trong nghiên cứu là MS bé sung

0,5 mg/L NAA.

Theo Jirakiatkul và ctv (2018), khảo sát về kha năng sống sót của bào tử P.ridleyi, bào tử xanh chứa trong bọc bao tử cao từ 76,81 + 15,41 đến 85,00 + 6,56 %

sau khi bao tử được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS va MS không có chất điều hòa

sinh trưởng thực vật (PGRs), môi trường 1/2 MS bồ sung 0,2 mg/l và môi trường MS

bổ sung 0,5 mg/l BA trong 8 tuần Sự phát triển của prothallus lần đầu tiên được quansát thấy vào 6 tuần sau khi cấy bào tử và sự phát triển của prothallus tiếp theo chỉ xảy

ra trên môi trường 1/2 MS không có PGR Rhizoids đã xuất hiện từ những prothallusđược phát triển trên môi trường 1/2 MS không có PGR ở tuần thứ 24 sau khi cấy

Theo Lin va ctv (2022) các bào tử in vitro của Platycerium ridleyi Christ được

sử dụng làm nguyên liệu thực vat va nuôi cay trên 4 môi trường cơ ban chứa các muối

vô co MS khác nhau (MS, 1/2 MS, 1/4 MS, 1/8 MS) Sau khi nuôi cấy trong ba tháng,muối vô cơ 1/2 MS được sang lọc là môi trường cơ bản tối ưu cho sự sinh trưởng vaphát triển của P ridleyi Sự kết hợp của 1 mg/L NAA, 2 mg/L BAP và 0,1% AC làphù hợp cho sự nhân lên của bảo tử với tỷ lệ nhân lên 100% và mericlones phát triểntốt

Nhìn chung tài liệu nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinhtrưởng lên cây rang 6 rong P ridleyi còn hạn ché, vì vậy dé tài “Anh hưởng của nồng

độ BA, NAA đến khả năng hình thành chổi và sinh trưởng của cây rang 6 rồng(Plantycerium ridleyi Christ.) trong điều kiện in vitro” cần thiết được thực hiện

13

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến kha năng hình thànhchổi cây rang 6 rồng P ridleyi in vitro

Thí nghiệm 2: Anh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng của chéi rang 6rồng P ridleyi in vitro

2.2 Thời gian va dia điểm nghiên cứu

Đề tài đã được thực hiện 4 tháng, thí nghiệm 1 từ tháng 2 đến tháng 4, thínghiệm 2 từ tháng 5 đến tháng 7 tại khu thí nghiệm và phòng nuôi cấy mô của Công ty

TNHH khoa học kỹ thuật công nghệ Việt Sinh.

2.3 Điều kiện khu thí nghiệm

Khu thí nghiệm gồm 7 khu phòng thao tác: Phòng pha môi trường; phòng xử lý

mẫu; phòng cấy; phòng sinh trưởng; phòng huấn luyện cây; phòng vệ sinh dụng cụ,

bao bì; vườn ươm cây con.

Điều kiện của phòng sinh trưởng: cường độ chiếu sáng 2.500 + 500 lux, thờigian chiếu sáng 10 h/ngày, âm độ của phòng nuôi cấy được duy trì 70 - 80%., nhiệt độ

phòng nuôi cấy được duy trì ở 25 + 20C

2.4 Vật liệu thí nghiệm

2.4.1 Mẫu rang 6 rồng P ridleyi

Mau prothallus và mẫu chổi cây rang 6 rồng được sử dung lam thí nghiệm làcác mẫu được khử trùng, cay chuyền và nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sungthan hoạt tính ở điều kiện in vitro tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô công ty TNHH

khoa học kỹ thuật công nghệ Việt Sinh.

Trong đó các mẫu cụm prothallus sử dụng trong thí nghiệm tạo chéi có đặcđiểm cụm xanh đan vào nhau tạo thành mảng gồm nhiều prothallus và rhizoids Cácmẫu cụm prothallus của cây rang 6 rồng (Hình 2.1) được chọn trong thí nghiệm 1 làcác mẫu có đường kính 3 + Imm và đồng đều nhau, đã được cấy chuyền 1 lần và nuôinuôi cấy trong môi trường MS có bồ sung than hoạt tính ở điều kiện in vitro.

Các chôi của cây rang 6 rông được chọn trong các bô tri thí nghiệm 2 là các

mẫu có chiều cao 3 + Imm (hình 2.2) và đồng đều nhau, đã được cấy chuyền 4 lần

Hình 2.1 Mẫu prothallus cây rang 6 rồng được nuôi trong môi trường MS có bổ

sung than hoạt tính ở điều kiện in vitro

Hình 2.2 Mẫu chồi cây rang 6 rồng đạt chiều cao chổi 3 + Imm được nuôi trong môi

trường MS có bồ sung than hoạt ở điều kện in vitro2.4.2 Hóa chất và môi trường

Chat điều hòa sinh trưởng BA tinh khiết 99%, dạng bột khan, màu trắng (BIO

BASIC- Canada).

15

Chất điều hoà sinh trưởng NAA tinh khiết 99%, dang bột khan, mau trắng (BIO

BASIC- Canada).

Môi trường MS pha sẵn gồm các thành phần đã mô tả ở mục 1.2.2.3.2, cồn 96

và cồn 70 độ, javel, xa phòng, KOH 1N, HCI 1%, dung dịch chuẩn pH 7, KCl 3.5M,đường, agar, than hoạt tính, nước cất vô trùng

2.4.3 Dụng cụ

Dụng cụ thí nghiệm gồm dao cấy (dao cán số 3, cán dao số 7, lưỡi số 11, dao

cán số 4, lưỡi số 22), pence, đĩa cấy, găng tay, đèn cồn inox, ống đong 50 mL, ống

dong 100 mL, bình tam giác, cốc đong 500 mL, cốc đong 1 L, cốc đong 2 L, bình tia

250 mL, phễu đong, bao bì chai thủy tỉnh 250 mL cấy mô, bịch cấy mô quy cách 8 x 6

x 19 cm.

2.4.4 Thiết bị

Các thiết bị phòng thí nghiệm: Cân điện tử 4 số, máy khuấy từ gia nhiệt, nồihấp tiệt trùng Visitech (Việt Nam), tủ cay vô trùng Visitech (Việt Nam), may lọcnước Kangaroo (Việt Nam), bút đo pH cầm tay, micro pipette, máy lạnh Daikin(Nhật Bản), hệ thống đèn UV khử trùng không gian phòng thí nghiệm

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến giai đoạn nhân chồicây 6 rồng

Yếu tổ B là 5 nồng độ BA (mg/L), gồm: BO: 0 mg/L BA; B2: 2 mg/L BA; B4: 4

mg/L BA; B6: 6 mg/L BA; B8: 8 mg/L BA

Yếu tô N là 3 nồng độ NAA (mg/L), gồm: N0: 0 mg/L NAA; NO,1: 0,1 mg/L

NAA; NO,2: 0,2 mg/L NAA

B0N0 (ĐC) B6NO,1 B4NO,1 BONO,1 BO6NO,1

Hình 2.3 So đồ bố tri thi nghiệm 1

2.5.1.3 Quy mô thí nghiệm

Tổng số ô thí nghiệm: 5 mức BA x 3 mức NAA x 3 LLL = 45

Tổng số bịch sử dụng trong thí nghiệm: 45 ô x 5 bịch = 225 bịch

Số mau/bich: 5

Tổng số mẫu thí nghiệm 1: 225 x 5 = 1.125 mau

Hình 2.4 Cách bồ tri mẫu trong bịch cấy

17

2.5.1.4 Cách thực hiện

Thí nghiệm này được thực hiện bằng cách chọn và tách nhỏ từng cụmprothallus có đường kính 3 + 1mm và đồng đều nhau, tiếp theo cấy và bố trí mẫu vàocác môi trường đã được chuẩn bị cho thí nghiệm 1 (cách thực hiện đã được mô tả ởmục 2.6.3.1) Sau đó sắp xếp mẫu sau cấy lên dàn nuôi và bố trí theo sơ đồ thí nghiệm

1 (Hình 2.3), quan sát, theo dõi và ghi nhận các chỉ tiêu mẫu.

2.5.1.5 Chỉ tiêu theo dõi

Số chéi/mau (choi): đếm, ghi nhận và so sánh tat cả số chôi hình thành của cả

thí nghiệm trên mỗi mẫu prothallus cay ban dau và tại thời điểm 40, 60 ngày sau cấy

Đường kính trung bình của mẫu chồi lớn nhất/mẫu (cm): dùng thước kỹ thuật

đo đường kính rộng nhất của cụm chồi, tính trung bình ghi nhận tại thời điểm 60 ngàysau cay, 15 mẫu/ô cơ sở

Chiều cao trung bình của chéi (cm): dùng thước có vạch chia đo chiều cao từsốc chéi hình thành cho đến đỉnh ngọn, 15 mẫu/ô cơ sở Theo dõi tại thời điểm 40, 60ngày sau cấy

Số lá/chôi (1á): đếm số lá phát sinh trên mỗi cây Theo dõi tại thời điểm 60 ngày

sau cây.

Hình 2.5 Cách chọn mẫu dé theo dõi và chỉ tiêu thí nghiệm 1

Khối lượng tươi của cụm chéi (g): can va tinh khéi lượng trung bình được ghi

nhận tại thời điểm 60 ngày sau cấy, 15 mẫu/ô cơ sở

Đường kính prothallus (cm): dùng thước kỹ thuật đo đường kính rộng nhất củacụm prothallus, tính trung bình ghi nhận tai thời điểm 60 ngày sau cấy, 15 mẫu/ô cơ sở.

Khối lượng prothallus (g): cân và tính khối lượng trung bình được ghi nhận tại

thời điểm 60 ngày sau cấy, 15 mẫu/ô cơ sở

2.5.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng của cây 6 rồng

2.5.2.1 Mục tiêu

Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho giai đoạn sinh trưởng của cây ráng

6 rông trong môi trường in vitro.

2.5.2.2 Bồ trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 3 lần lặplại, 5 nồng độ NAA đặt là yếu tố N gồm NO: 0 mg/L NAA; NO,2: 0,2 mg/L NAA; N0.4:

0,4 mg/L NAA; N0,6: 0,6 mg/L NAA; N0,§: 0,8 mg/L NAA và nghiệm thức đói chứng là

nghiệm thức không bồ sung chất điều hòa sinh trưởng (môi trường nén)

— Tổng số mẫu thí nghiệm 1: 75 bich x 5 mẫu/ bịch = 375 mẫu

2.5.2.4 Cách thực hiện

Chọn ra những chéi có chiều cao 3 + 1mm có đủ các bộ phận thân lá, trong môitrường MS có bổ sung than hoạt tính, cấy và bồ trí mẫu (Hình 2.4) vào các môi trường

đã được chuẩn bi cho thí nghiệm 2 Tiếp theo sắp xếp mẫu lên dàn nuôi, bồ trí theo sơ

đồ thí nghiệm 2 (Hình 2.6), quan sát, theo dõi và ghi nhận các chỉ tiêu mẫu

2.5.2.5 Chỉ tiêu theo dõi

Chiều cao trung bình của cây (cm): dùng thước có chia vạch đo chiều cao từmặt thạch cho đến đỉnh ngọn Lấy số liệu vào ngày 60 sau cay, 15 mẫu/ô cơ sở

Số lá/cây (1a): đếm, ghi nhận và so sánh số lá phát sinh trên mỗi mẫu cay tạithời điểm 1 ngày sau cấy và 60 ngày sau cấy, 15 mẫu/ô cơ sở

Khối lượng tươi cây (g): cân và tính khối lượng trung bình được ghi nhận tại

thời điểm 60 ngày sau cấy, 15 mẫu/ô cơ sở

Hình 2.7 Cách chọn mẫu để theo dõi và đo chỉ tiêu thí nghiệm 2

2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và phân tíchbảng ANOVA, tính trắc nghiệm phân hạng (nếu có) ở mức ý nghĩa œ = 0,01 trắcnghiệm phân hạng bằng chương trình SAS 9.4

2.7 Cách thực hiện thí nghiệm

Quy trình thu thập mau bào tử, xử lý mau, cấy chuyền mẫu rang 6 rồng P.ridleyi và bé tri thí nghiệm 1

Sau khi thu thập mẫu bao tử già của cây rang 6 rồng P ridleyi và xử ly mau

theo quy trình dưới đây:

- Bước 1: ngâm rửa mẫu một lần bằng nước cat vô trùng và lọc mẫu qua giấy lọc

- Bước 2: Khử trùng mẫu bằng dung dịch javel pha loãng tỷ lệ 1:5 trong 10phút và lọc mẫu qua giấy lọc

- Bước 3: Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng, lọc qua giấy lọc và lặp lại 5 lần,mẫu được dé ráo

- Bước 4: Mẫu bao tử sau khi khử trùng duoc cấy trai trên bề mặt của môi

trường MS.

- Bước 5: Mẫu được nuôi trong phòng sinh trưởng với điều kiện ánh sáng, nhiệt

độ nhân tao Sau 1 tháng nuôi cấy, các bao tử nảy mầm và sau đó 1 tháng các mầmhình thành các prothalllus Các prothallus được cấy chuyền lên môi trường MS có bổsung 0,3 g than hoạt tính dé lưu trữ mau và thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

Quy trình khử trùng này được cải biến lại cho phù hợp với khóa luận dựa theobài viết nghiên cứu của Jirakiattikul va ctv (2018):

Thu thập mẫu bào tử già

Cấy chuyền prothallus vào môi trường MS

có bỗ sine than hoat tính

Quy trình cấy chuyền mẫu rang 6 rông P ridleyi và bé trí thí nghiệm 2

Phương pháp cấy chuyên:

- Bao tử sau 2 tháng nuôi cấy sẽ nảy mam thành các prothallus, chúng phát triểndính lấy nhau thành mảng thực hiện cấy chuyền các prothallus như sau: tách nhỏ cácmang prothallus ra thành từng cụm, cấy chuyền các cụm này trên môi trường MS có bổ

sung than hoạt tính, sau đó nuôi các mẫu trong phòng sinh trưởng ở điều kiện thích hợp

(đã mô tả ở mục 2.3), các mẫu được cấy chuyền 3 tuần/ lần dé lưu trữ và tạo chi

Mẫu cụm chồi thí nghiệm 1

Cây chuyền vào môi trường MS bổ sung 4 mg/L BA kết hợp 0,1 mg/L NAA

wf

'

Cây chuyển prothallus vào môi trường MS

có bé sung 0,3 g than hoạt tính

§-::›

Cây chuyền tách cụm chổi thành chồi don,

bố trí thí nghiệm 2

J

Hình 2.9 Quy trình cấy chuyền mau cây 6 rồng và bố trí thi nghiệm 2

- Cay chuyền đồng thời thực hiện thí nghiệm 1 Đến khi các prothallus tạothành chỗi và đạt chiều cao chồi là 3 + 1 mm, chọn lọc chéi đồng đều với nhau về kíchthước dé bồ trí thí nghiệm 2

Hình 2.10 Mẫu prothallus, chéi bị chết (trái) va mẫu prothallus, chồi bị nhiễm nam (phải)

Trong quá trình thực hiện đề tải, công việc theo dõi mẫu và quan sát mẫu nhận

đã nhận thấy được những biểu hiện nhiễm và chết của mẫu P ridleyi in vitro, các mẫuchết vì tiết nhiều phenol trong quá trình nuôi cấy, các mẫu bị nhiễm do nam, sau khimẫu được cấy từ 7 — 10 ngày nếu bị nhiễm nấm, các bao tử nắm sẽ bắt đầu phát triển

và biêu hiện rõ trên mặt môi trường bao lây các khôi prothallus và các chôi con.

Chương 3

KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến giai đoạn nhân chồi

cây rang 6 rồng

Các nghiên cứu cho thấy nhóm cytokinin đóng vai trò quan trọng trong quátrình phát triển chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô tế bảo thực vật Cytokinin khôngchỉ kích thích sự phát triển của chồi nách mà còn thúc đây phân chia tế bào (NguyễnBảo Toàn ,2004) Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), cytokinin rấthiệu quả trong việc kích thích sự phát triển chéi bên Việc nhân chéi đạt hiệu quả caokhi cytokinin được kết hợp với auxin ở tỷ lệ thích hợp Các nghiên cứu đã chỉ ra tínhhiệu quả của cytokinin, đặc biệt là BA, khi được sử dụng kết hợp với auxin Nhữngnghiên cứu về sự kết hợp này đã cung cấp thông tin quan trọng và cơ sở khoa học choviệc điều chỉnh các chất điều hòa sinh trưởng trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thựcvật Vì vậy, đề tài này lựa chọn sử dụng hai loại chất điều hòa sinh trưởng chính là

BA va NAA để khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu cây rang 6 rồng P ridleyi

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chéi hình thành của cây 6rồng P ridleyi in vitro:

Sau thời gian theo dõi thí nghiệm, ảnh hưởng của BA va NAA lên số chồi đượcthống kê và phân tích anova như Bảng 3.1

Kết quả Bảng 3.1 cho thấy việc bổ sung nồng độ BA kết hợp nồng độ NAAkhác nhau mang lại sự khác biệt có ý nghĩa trong thống kê về số chồi của cây 6 rồng P

ridleyi in vitro trong giai đoạn từ 40 - 60 NSC.

Từ kết quả về khả năng nhân tạo chồi của cây P ridleyi trong thí nghiệm chothay sự kết hợp các nồng độ BA va NAA ở nồng độ 4 mg/L BA và 0,1 mg/L NAA rất

có ý nghĩa trong thống kê góp phan nâng chiều cao chồi của loài P ridleyi

Bảng 3.1 Anh hưởng của nồng độ BA va NAA đến số chồi (chồi) cây 6 rồng P ridleyi

Ngày sau Nong độ BA Tông đổ NI (Hi) bin ttcây (mL/L) 0 0,1 0,2 độ BA

Ghi chi Trong cùng một cội, các số có cùng ký tự di kèm thé hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thong

kê; **: khác biệt có ý nghĩa ở mức a < 0,01.

Tại thời điểm 40 NSC, xét yếu tố BA kết hợp yếu tố NAA, ở nghiệm thức bổsung 4 mg/L BA kết hợp 0,1 mg/L NAA cho số chổi cao nhất là 9,33 chồi, sự khácbiệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại Sự khác biệt không có ýnghĩa thống kê so với nghiệm thức bổ sung 8 mg/L BA kết hợp 0,1 mg/L NAA vànghiệm thức 8 mg/L BA kết hợp 0,2 mg/L NAA, số chỗi đạt được là 0,17 chéi Khixét theo yếu tố nồng độ BA, số chéi ở các nghiệm thức bổ sung 4 mg/L BA cho sốchồi cao nhất là 6,32 chồi, sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thứccòn lại Khi xét yếu tố nồng độ nồng độ NAA, ở nghiệm thức chỉ b6 sung 0,1 mg/LNAA cho môi trường, số chéi cao nhất là 2,39 chồi, sự khác biệt rất có ý nghĩa trongthông kê so với các nghiệm thức còn lại

Tại thời điểm trước 60 NSC, nghiệm thức bắt đầu hình thành chồi Mẫu cấy đãcảm ứng được với môi trường đề phát sinh chỗồi mới, các prothallus bat đầu cảm ứngmôi trường và phát triển tạo chéi

25

Tại thời điểm 60 NSC, xét yếu tố nồng độ BA kết hợp yếu tố nồng độ NAA, ởnghiệm thức b6 sung 4 mg/L BA kết hợp 0,1 mg/L NAA cho số chồi cao nhất là 20,17chéi, sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại Sự khác biệtkhông có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức bổ sung 8 mg/L BA kết hợp 0,2 mg/LNAA, số chéi đạt được là 1,34 chồi Khi xét theo yếu tố nồng độ BA, số chồi ở cácnghiệm thức bé sung 4 mg/L BA cho số chỗi cao nhất là 17,66 chéi, sự khác biệt rat có

ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại Khi xét yếu tố nồng độ nồng độNAA, ở nghiệm thức chỉ bổ sung 0,1 mg/L NAA cho môi trường, số chồi cao nhất là

6,34 chồi, sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê so với các nghiệm thức còn lại

Kết quả từ khả năng nhân tạo chỗi của thí nghiệm cho thấy sự kết hợp các nồng

độ BA va NAA ở mức 4 mg/L BA và 0,1 mg/L NAA có ý nghĩa góp phan nâng cao hệnhân giống của loài P ridleyi

Theo Vũ Văn Tiến (2018), nồng độ BA và NAA chênh lệch trong môi trường

sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện khác nhau của mẫu Nồng độ BA lớn hơn NAA mẫu tạochồi, ngược lại mẫu tạo rễ, nếu nồng độ BA bằng NAA mẫu tạo mô sẹo Điều nàyđúng với nghiên cứu của Lin và ctv (2022) khi sử dụng môi trường 1/2 MS bồ sung 2mg/L BA kết hợp 1 mg/L NAA đạt tỷ lệ phát triển chồi là 100% Nghiên cứu trongkhóa luận này sử dụng môi trường MS bổ sung BA kết hợp NAA ở các mức nồng độkhác nhau cũng cho thay sự tương tác của hai chất điều hòa sinh trưởng lên mẫu cây 6rồng P ridleyi

Hình 3.1 Số chéi phát sinh ở nghiệm thức B4N0,1

Trong thí nghiệm, nghiệm thức hiệu quả nhất là 4 mg/L BA kết hợp 0,1 mg/L

NAA vẫn còn sự xuất hiện của prothallus, các prothallus vẫn chưa hoàn toàn tạo thành

chồi mà vẫn nhân lên ở hình thái prothallus Trong quá trình nhân giống cây 6 rồng P.ridleyi việc có thê nhân lên cùng lúc hai hình thái là prothallus và chồi có thé làm tăng

hệ số nhân nhân giống của loài này lên gấp nhiều lần

3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến chiều cao chỗồi của cây P ridleyi

in vitro giai đoạn từ 40 - 60 NSC.

Kết quả từ khả năng nhân tạo chéi của thí nghiệm cho thấy sự kết hợp các nồng

độ BA và NAA ở nồng độ 4 mg/L BA và 0,1 mg/L NAA rất có ý nghĩa trong thống kêgóp phan nâng chiều cao chồi của loài P ridleyi

Tại thời điểm 40 NSC, xét theo yếu tố nồng độ BA, số chồi ở các nghiệm thức

bồ sung 4 mg/L BA cho chiều cao chỗi cao nhất là 0,21 cm, sự khác biệt rất có ý nghĩathong kê so với các nghiệm thức còn lại Khi xét yếu tổ nồng độ nồng độ NAA, ởnghiệm thức chỉ bổ sung 0,1 mg/L NAA cho môi trường, chiều cao chéi cao nhất là0,13 cm, sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê so với các nghiệm thức còn lại Xétyếu tố nồng độ BA kết hợp yếu tố nồng độ NAA, ở nghiệm thức bồ sung 4 mg/L BAkết hợp 0,1 mg/L NAA cho chiều cao chồi cao nhất là 0,3 cm, sự khác biệt rất có ýnghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

so với nghiệm thức bổ sung 8 mg/L BA kết hợp 0,2 mg/L NAA, chiều cao chồi dat

được là 0,06 cm.

Tại thời điểm trước 60 NSC, nghiệm thức bắt đầu hình thành chồi Mẫu cấy đã

cảm ứng được với môi trường dé phát sinh chéi mới, các prothallus bắt đầu cảm ứngmôi trường và phát triển tạo chi

27

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA va NAA đến chiều cao chỗi (cm) cây 6 rồng

Ngày Néng độ BA Nồng độ NAA (mL/L) “ae rt

CV (%) = 2.82; F (B) = 135,09**: F (N) = 31,92**; F (BxN) =9,50**

Ghi chú Trong cùng một cột, các số có cùng ký tự đi kèm thé hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thong

kê, **: khác biệt có ý nghĩa ở mức a < 0,01.

Tại thời điểm 60 NSC, xét theo yếu tổ nồng độ BA, số chồi ở các nghiệm thức

bồ sung 4 mg/L BA cho chiều cao chéi cao nhất là 0,65 em, sự khác biệt rất có ý nghĩathống kê so với các nghiệm thức còn lại Khi xét yêu tổ nồng độ nồng độ NAA, ởnghiệm thức chỉ b6 sung 0,1 mg/L NAA cho môi trường, chiều cao chồi cao nhất là0,41 em, sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê so với các nghiệm thức còn lại Xétyếu tố BA kết hợp yếu tố NAA, ở nghiệm thức bổ sung 4 mg/L BA kết hợp 0,1 mg/LNAA cho chiều cao chéi cao nhất là 0,95 cm, sự khác biệt rất có ý nghĩa thống kê sovới các nghiệm thức còn lại Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệmthức bé sung 8 mg/L BA kết hợp 0,2 mg/L NAA, chiều cao chồi đạt được là 0,19 em

Kết quả cho thấy nghiệm thức đạt hiệu quả là 4 mg/L BA kết hợp 0,1 mg/LNAA, ngoài khả năng nâng cao hệ sô nhân trong việc nhân giống cây 6 rồng mànghiệm thức này còn tạo ra những chéi khỏe có chiều cao lớn