Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phát triển sản phẩm trà túi lọc lá dâu tằm (Morus alba L.)

TÓM TẮTNghiên cứu được tiến hành nhằm xác định thành phần hóa thực vật của lá dau tằmđược trồng tại tỉnh Lâm Đồng Việt Nam và khảo sát quy trình tạo trà túi lọc đồng thờiđánh giá chất lư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHÁT TRIEN SAN PHẨM TRÀ TÚI LOC

LA DAU TAM (Morus alba L.)

: 19126142 : 2019 — 2023

TP Thú Đúc, 04/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAT TRIEN SAN PHAM TRÀ TÚI LOC

LA DAU TAM (Morus alba L.)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS CAO THỊ THANH LOAN NGUYÊN TRANG THÙY QUYÊNThS NGUYEN THỊ VÂN ANH

TP Thủ Đức, 04/2024

LỜI CẢM ƠN

Đề hoàn thành khóa luận này, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban Giámhiệu, khoa Khoa học Sinh học trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh vàViện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và môi trường đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợicho em trong quá trình em thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Cao Thị Thanh Loan và ThS.Nguyễn Thị Vân Anh đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện nghiên cứu đề

tài.

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Huỳnh Vĩnh Khang, KS Võ Trần Quốc Thắng

và KS Lê Hữu Minh Sang và tập thé sinh viên phòng BIO 315 và BIO 305 đã tạo điềukiện, giúp đỡ em khi thực hiện các thí nghiệm trong thời gian hoàn thành khóa luận tốt

nghiệp.

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn và yêu thương đến gia đình vẫn luôn cổ

vũ và động viên trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn.

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên Nguyễn Trang Thùy Quyên, MSSV: 19126142, Lớp: DH19SHD thuộc ngành Côngnghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luậntốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là

hoản toản trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đông về

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 4 năm 2024

Người viét cam đoan

Nguyễn Trang Thùy Quyên

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định thành phần hóa thực vật của lá dau tằmđược trồng tại tỉnh Lâm Đồng (Việt Nam) và khảo sát quy trình tạo trà túi lọc đồng thờiđánh giá chất lượng trà thành phẩm Kết quả nghiên cứu cho thấy trong lá dâu tằm có sự

hiện diện của flavonoid, saponin và đường khử và không có sự hiện diện của alkaloid Bột

lá dâu tằm có độ âm là 5,58%, độ tro là 9,74%, hàm lượng flavonoid là 585,5 mg/100g,polyphenol tổng số là 1367 mg/100g, tannin là 0,01 mg/100g, saponin là 2,58% và đường

khử là 6,60% Công thức phối trộn sản pham nghiên cứu được có ty lệ lá dâu tằm: linh chỉ:

cỏ ngọt lần lượt là 75:15:10 (%) đạt điểm đánh giá cảm quan loại khá (15,65 điểm) Trà túilọc thành phẩm có độ âm 5,83%, độ tro là 7,71%, hàm lượng polyphenol và flavonoid trongtrà lần lượt là 649,85 mg/100g và 213,53 mg/100g Kết quả kiểm tra cho thấy tra tui loc ứcchế enzyme ơ-amylase ở ICso 0,04 mg/mL, thé hiện hoạt tinh kháng oxy hóa ở ICso là 6,75mg/mL, không có sự xuất hiện của nam men, nam mốc, tổng vi sinh vật hiếu khí,Salmolnella, E coli, Coliform Ngoài ra trong sản pham cũng không phát hiện kim loại cóđộc tính cao như cadimi (Cd), chì (Pb) và thủy ngân (Hg) Bên cạnh đó, nghiên cứu cònkhảo sát nhiệt độ, thời gian và lượng nước thích hợp dé pha trà lần lượt là 70 °C, 10 phút

và 60 mL Kết quả cho thay sản phẩm trà dâu tằm có hoạt tính kháng oxi hóa và kha năng

ức chế enzyme a-amylase cao, có thé là một thức uống tiềm năng trong việc hỗ trợ sức

khỏe.

Từ khóa: lá dâu tằm, trà túi lọc, hoạt tính sinh học

The study was conducted to determine the phytochemical composition of mulberry leaves grown in Lam Dong province (Vietnam) and investigate the process making filtered tea bags as well as evaluate the quality of finished tea The results showed that mulberry leaves contain flavonoids, saponins, reducing sugars, but no alkaloids The moisture content

of mulberry leaf powder was 5.58%, ash content was 9.74% Flavonoid and _ total

polyphenol content of the powder was 585.5 mg/100g and 1367 mg/100g, respectively The

optimized formula with ratio of mulberry leaves:lingzhi:stevia was 75:15:10 (%) and achieved a fairly good sensory score (15.65 points) The tea bag has a moisture content of 5.83%, an ash level of 7.71%, polyphenol, and flavonoid content are 649.85 mg/100g and 213.53 mg/100g, respectively The test results showed that tea bags inhibited o-amylase enzyme at ICso of 0.04 mg/mL, showing antioxidant activity at ICso of 6.75 mg/mL, and no yeast, mold, total aerobic microorganisms, Sa/molnella, E.coli, and Coliform were detected.

In addition, highly toxic metals such as cadmium (Cd), lead (Pb) and mercury (Hg) were not detected in the product Furthermore, the study also investigated the appropriate temperature, time and amount of water to make tea at 70 °C, 10 minutes and 60 mL, respectively The results demonstrated that the mulberry tea product has high antioxidant

activity and a-amylase enzyme inhibitory potential, which could be a potential

health-promoting beverage.

Keyword: biological activities, mulberry leaves, tea bag

MỤC LỤC

LOI CAM n0 iXÁC NHẬN VA CAM ĐOANN 2-52 22 22212212112212112111211211211111121121111 212121 xe ii

CO eae iii

ABS TRAD ccc sscorsersnesmuannnesencnnancemun unser taxa asa micah eiusenupn cis ibrmaatan amma eninika ena atelansarnsemimeaD 1V

DANH SÁCH GAS CE VIET TAT +xeeeeseeeseeevcorooabsroe.ogbogMfD<chevgttpDo900020270000g000Z0700 X00 viiiM.0I83.tos8:7 9c ixxM050 oi0n in — 5KinrngrL TỐ TIẾT bạn cai gui bit ghtgitGiAGguaAiGGiclL14G16001Gidl0iGiaQ00-000800300tg0010,x2sgindi 11.1 Đặt vấn đề + +s T21 E212112121121112111111112111121111 0111211212121 |

1.5 fi6i1:dtf BÌNH: GIẾT «-eoeeoeessrkonssnssrrorsorisdtrgErdogbidgretgboliogggti2gigEesgudigidooidgli2tjg dio03n0303Zu.0i120g02g/26 2 IS) (0000:5001) 2

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2 2222SE+EE22E2EE2EE2EE2EE2EE22E22222222222212222-Xe2 3B.1 TÔng giữag: võ HỒN ee ki2.2 Tổng quan về thành phan hóa thực vật của lá dâu tằm -2- ¿-222z+2x+55+2 42.3 Tổng quan các hợp chất trong lá dâu tăm 2-22 ©22©2222z2EE2EE+2E££E2E+2E++Excrxrrxee 4

2.3.1 x94) °ö—>ˆ^ˆ^°ễễ°+£'^ỶÝẲš::::AẢ4‡ä4H ÔỎ 4

Sa F AVON siscacnossonncnsennnamenn ae RRR ERE 5

2.4 Tông quan về 1-deoxymojirimycin 0 cccccssecsecssssescssesesscesesnessessessesecsessessensereeneenees 52.5 Tổng quan về enzyme o-amylase o cccccecscssessesssessessessecsssussuessesseesessecsessessussseesecees 65.6 Tổng OL, ar 62.7 Tình hình nghiên cứu về cây dâu tằm ở Việt Nam và trên thế giới - 7

NAM ee ee Ỹ

2.7.2 Các nghiên cứu trên thế giới - 2© 2+22+SE+EE+EE£2EEEEE2EE221271271712211211221 22122 -XeC §Chương 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2-2 +22E2E££SE2EE2EE2E2E22222222212222Xe2 93,1 Thời gian và địa điểm nghiÊU GÍIN xaasesceseieiontiiioAnISIL000 000101304 82000881600038108444001480 9

3.5 Việt HỆU Đi ho ee 9

3.3 Hóa chất, dung cụ và thiết bị thí nghiệm -2- 2SS+S22S22E2EE2EE2EE2E22222323221222222e2 9a: a 93.3.2 Dung cu và thiết bị thí nghiém oo cece cececcecseceessessessesecsessessessescsessesseatsaeesessesseanees 9

3/1 NGi dung ya phony phốt SNE DỨN sasaeseesesosiedodbidabgbiiosbssg6L35S0AG1480)81668044818004 10

3.4.1 Khảo sát các thành phan hóa thực vật trong lá đâu tằm 2- 2 25522 103.4.1.1 Xác định độ 4m và hàm lượng tro của nguyên liệu 222 22 s22z2522sz2s2 103.4.1.2 Định tính các thành phan hóa thực vật của lá đâu tằm 2 2252252552 11

6 Tinh Wei RO cance eee 153.4.2 Nghiên cứu tạo sản phẩm trà túi loc lá dâu tằm 2 2+ 2222+S+2E+£z+zzzzzcsee 163.4.3 Đánh giá chat lượng trà túi loc thành phẩm 2- 2 22222E22E+2E2£E22z22zzxzze2 183.4.3.1 Độ âm của trà túi LOC -2- 2 5<222SE+E2EEEE2EEE12151121212111211121111211112111 21111 x6 183.4.3.2 Hàm lượng tro tổng số được xác định theo TCVN 5612:2007 -5- 183.4.3.3 Khao sát hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPIH - 2 2 2222222222222: 193.4.3.5 Khao sát khả năng ức chế enzyme o-amylase của tra túi lọc lá dâu tằm 203.4.3.6 Đánh giá an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm trà túi lọc ĐẠI

a Định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo TCVN 7924-2:2008 21

b Quy trình định lượng Coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo TCVN 6848:2007gouÿ4EöB.G408500806008g0fguSG2BBSIEESURGTSSEEQSSGBIMGEEGSIGCGESEDIGLRGIEIBRERSIBGGS-EGHSGSGGEEESIGGGBSESEG-RIIHBARGRRRGSHOLBERSEĐGDNSG00008 21

c Quy trình định tinh Salmonella thực hiện theo TCVN 4829:2005 -+s+- 22

vi

d Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí và tổng nam men nắm mốc theo TCVN 8275-1:

| tasrauieeoazizfiSiZSgùdi3đi6Srdo8BSãHiö8550186080rauiixiBVii4SiLgiE39i0585i987i6;i4368E0iausa1dđBi03:abd#Esizditdiotxii2đi88ig0iá0ã2/008:22780ã8ã2iu/40012Bu53 22

3.5 Phương pháp xử lý số QU eee ccccccecssessessessseenessesseeseessesteesesseesteseesesenssnsseeeeeenees 23Cheoned, KẾT GUA WA THA LUA eveseeesinniedgnELlSESMENOSUAOGGMASS4 S0t0808040018084 244.1 Khao sát thành phan hóa thực vật của lá đâu tằm 2: 222222z22222zz22zz+ 244.1.1 Kết quả định tính các thành phan hóa thực vật của lá đâu tằm - +: 244.1.2 Kết quả định lượng các hợp chất hóa học có trong lá dâu tằm - a4.3 Đánh giá chat lượng tra túi lọc thành phẩm 2-22 22222E£2EE+EEEE+2E222222222zze 274.3.1 Đánh giá an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm trà túi lọc - 27

43.2 .Hodl Tỉnh kháng O8Y N68 seccacsceeneeeeorereeee ne 30

4.3.3 Hoạt tinh ức chế enzyme o-amylase cccccceecsessessessessesssssessessessessessesstssesseens 3l4.3.4 Khảo sát thời gian, nhiệt độ và lượng nước phù hợp cho sử dụng trà túi lọc dâu tằm

C2E12111211211211 1121121211212 11 1211111111211 21 21121111121 211111112121211121111211 2121 ca 32

Choong 3, KET LEAR VÀ KIÊN INGOT ccecnsncqunzonomsenennactinmmeanaacacnmuonsenenes 35 neaieaỶ-ỷỶidaea-Ỷaa.-attrrorrrrnrdroirrrrrriểrroaiairinrarmaararaaaaese 355.2 Kiến nghii oie eccecccccccccsecsesscsecsessessessesvesessessessesecsvssessssrssessesssssessssessessesissreatsseeseseceseaeavess 35TAI LIEU THAM KHAO 0 ececccccssessesescsscssessesvesvcsesscssessesvcsesassussueseseesssssesssseseeseeeseeseeveees 36

Ch, gu rau r6 giao gsoarroeopaaaEisaSuy tia biasSterreasxga

vii

: Hektoen Enteric : Inhibitory concentration 50%

: Nghiệm thức : Tryptone Bile X-glucuronide

: Tiêu chuẩn Việt Nam

: Xylose Lysine Deoxycholate

viii

DANH SÁCH BANG

Trang

Bảng 3.1 Công thức phối trộn các thành phan của trà túi lọc dâu tằm - 177

Hàng 3a Cae Chit tei đ«nh giá ønmi GUAT thề th: ND seesssseesndannoninoonoiiogiaosakSA01010000008K000008 17

Bang 3.3 Bảng xếp loại chất lượng sản phẩm theo điểm cảm quan - 18Bảng 4.1 Kết quả định tính một số hợp chat thứ cấp trong lá dâu tằm - 244Bang 4.2 Kết quả khảo sát thành phần hóa thực vật của nguyên liệu - 255Bảng 4.3 Kết quả đánh giá cảm quan các ty lệ phối trộn trà - 2-2 22 2222222222522 26Bảng 4.4 Độ ầm, hàm lượng tro tổng số của trà túi lọc lá đâu tằm - 2 s+s+=zc+z 27Bang 4.5 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật trong tra túi lọc lá dâu tằm 28Bang 4.6 Kết quả kiêm tra hàm lượng kim loại nặng có trong tra túi lọc lá dâu tằm 30Bang 4.7 Kết quả xác định ICso theo phương pháp DPPH - 2-2222 5522 31Bang 4.8 Nồng độ ức chế 50% enzyme a-amylase của trà lá dâu tam va Acarbose 32

Dịch trà túi lọc lá dâu tằm phối trộn với linh chi và cỏ ngọt với các tỷ lệ khác

Ss SLSR SS SS SEES SEES SST Cs ES EES SSSA SS RSG 27

Kết quả định lượng nam men - nam mốc trên môi trường DRBC 28Kết quả định lượng Salmonella trên môi trường HE va XLD 28Kết quả định lượng Coliform trên môi trường VRBL 2 52- 552552 29Kết quả định lượng E.coli trên môi trường TBX 22©52©5225225z2522 29Kết quả định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA 30Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng nước và thời gian đến hàm lượng polyphenol 33Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng nước và thời gian đến hàm lượng flavonoid 33

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, xu hướng trở về với lối sống thuần tự nhiên kết hợp giữa việc sử dụng cácloại thao được trong việc cải thiện sức khỏe cũng ngày càng được chú trọng và phổ biến vìnhững lợi ích to lớn mà nó mang lại Thảo dược hiện tại không chỉ là nguồn cung cấpnguyên liệu cho khối ngành y dược mà còn được ứng dụng trong các lĩnh vực khác như sảnxuất mỹ phẩm, thực phẩm chức năng Song song với đó, việc sản xuất ra các sản phẩm thiếtyếu với tiêu chí xanh, sạch, hoàn toàn từ thiên nhiên là xu hướng hiện nay hướng tới chămsóc sức khỏe toàn điện Một ví dụ điển hình là cây dâu tằm, trước đây chi được dùng dénuôi tằm, nhưng ít người biết rằng trong lá dâu còn chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinhhọc cao có tác dụng làm thuốc và hỗ trợ điều trị bệnh Theo Chan và cộng tác viên (2016)

đã xác định được các hợp chất phenolic và flavonoid trong lá dâu tằm có tác dụng hạ huyết

áp, chống béo phì, chống oxy hóa, đặc biệt là hợp chất 1- deoxynojirimycin (DNJ) có khảnăng ức chế sự hấp thụ đường từ dạ dày vào máu, giúp kiểm soát lượng đường huyết vàgiảm nguy co mắc bệnh tiểu đường

Trên thé giới đã có các sản phẩm có nguồn gốc từ lá dâu tam, tuy nhiên ở Việt Namlại chưa phô biến Diện tích trồng dâu ở Việt Nam khá lớn đạt khoảng 10 nghìn ha theothong kê của Bộ nông nghiệp và phát triển Nông thôn (2023), điều này cho thấy nguồnnguyên liệu rất đồi dào tuy nhiên vẫn chưa được khai thác hết tiềm năng Từ thực tế đó kếthợp với mục đích tạo ra dạng thức uống nhanh chóng, tiện lợi, hỗ trợ cải thiện sức khỏe vớinguyên liệu chính là lá dâu tằm kết hợp cùng các loại thảo được khác, đề tài “Phat triển sảnphẩm trà túi lọc lá dâu tằm” đã được thực hiện Sản phẩm từ đề tài không chỉ tận dụngnguồn nguyên liệu sẵn có dé góp phan tăng thu nhập cho người dân mà còn giúp đa dạng

hóa các sản phâm từ lá dâu tắm, nâng cao vị thê của nông nghiệp Việt Nam.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo ra sản phẩm trà túi lọc lá dau tam dam bảo theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) 7975

-2008.

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung |: Khao sát các thành phần hóa thực vật của lá dâu tam

Nội dung 2: Khảo sát quy trình làm trà túi lọc lá dâu tằm

Nội dung 3: Đánh giá chất lượng trà

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU

Tén khoa hoc: Morus alba L.

Hình 2.1 Cây dâu tằm (Nguồn: Raibenefit, 2023)

Theo Dược Điền Việt Nam V, dâu tằm thuộc loài cây thân gỗ nhỏ, có chiều cao trungbình khoảng 3 m Lá mọc so le và có hình bầu dục, hình trứng nhộng hoặc hình tim, mềm,đài 5 - 10 em và rộng 4 - 8 em Lá có nhiều gân lớn chạy dọc cuống, mép lá có hình răng

cưa Hoa đơn tính, có thể cùng hoặc khác gốc Cum hoa đực dài 1,5 - 2 cm, có lông thưa,

hoa cái có 4 lá đài Quả dâu tăm khi sông có màu trăng xanh và chín có màu đỏ hông hoặc

3

đen Cây mọc nhiều ở các vùng miền trên cả nước như Lâm Đồng, Hà Tây, Nghệ An, BắcNinh và mùa hoa vào tháng 4 đến tháng 5, mùa quả từ tháng 5 đến tháng 7 Trong Y học

cô truyền, lá dâu có tính mát, có tác dụng bồ âm, giải cảm, thanh nhiệt, mat gan, chữa tri

đau nhức, chảy nước mắt Lá dâu có thé sử dụng nau nước dé uống vừa dé rửa ngoai da.Ngoài ra, lá dâu còn dùng dé chữa mat ngủ, phát ban, đau mat đỏ Dưới đây là những tácdụng của cây thuốc này dựa theo kinh nghiệm dân gian ở nước ta ghi lại trong cuốn sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” ( Đỗ Tất Lợi, 2013)

2.2 Tống quan về thành phan hóa thực vật của lá dâu tằm

Lá dau tằm có chứa các alkaloid iminosugar có tác dung ức chế enzyme glucosidase

ở động vật có vú Hợp chất chiếm ưu thế nhất là 1-deoxynojirimycin với hàm lượng là1,389-3,483 mg/g (Song và ctv, 2009) trong lá dâu khô có tác dụng hạ đường huyết Tổnghàm lượng polyphenol và flavonoid lần lượt là 14,22 mg/g và 2,76 mg/g Ngoài ra, trong

lá dâu tằm còn chứa thành phần khoáng chất như: Phot pho (P) là 2,35 mg/g, Kali (K) là

11,41 mg/g, Canxi (Ca) là 1,39 mg/g, Magie (Mg) là 1,09 mg/g (Ercisli va ctv, 2007).

2.3 Tổng quan các hợp chất trong lá dâu tằm

2.3.1 Polyphenol

Polyphenol được đặc trưng bởi sự hiện diện của it nhất hai nhóm phenolic liên kếttrong các cấu trúc, thường có khối lượng phân tử cao, các phenolic đơn giản (còn gọi làacid phenolic) là tiền chất của polyphenol (Quideau và ctv, 2011) Theo Mongkolsilp(2004), polyphenol có nhiều lợi ích cho sức khỏe vì khả năng chống oxy hóa cao thông quahạn chế sự hình thành các gốc tự do, tăng cường sức đề kháng, hạn chế sự phát triển củacác tế bảo ung thư; chống các tia phóng xạ Ngoài ra, đặc tính sinh học quan trọng củapolyphenol là các hoạt động chống viêm, chống ung thư và chống vi khuẩn (Pandey và ctv,

2009).

2.3.2 Saponin

Saponin là glycoside tự nhiên của steroid hoặc triterpene được liên kết với một hoặcnhiều gốc polysaccharide có nhiều hoạt tính sinh học và dược lý khác nhau (Han và ctv,2000) Saponin có một số tính chất đặc biệt như làm giảm sức căng bé mặt, có thể tạo phứcvới cholesterol hoặc với chất 3-B-hydroxysteroid khác Saponin được nghiên cứu về các

đặc tính hạ đường huyết với mục đích tìm ra các loại thuốc hiệu quả trong điều trị đái tháo

đường Ngoài ra, saponin còn là hợp chất có khả năng tạo bọt 6n định giống như xà phòng

trong nước (Francis và ctv, 2002).

2.3.3 Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Tác dụng có lợi củaflavonoid đối với sức khỏe con người chủ yếu nằm trong hoạt động chống oxy hóa mạnh(Miller, 1996) Theo Phan Quốc Kinh (2011), các chất flavonoid là những chất oxy hóachậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do (có thé là nguyên nhân làm cho tếbào hoạt động khác thường) Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đối chất thường làcác gốc tự do như OH», ROO» (là các yếu tô gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thư, tăng

nhanh sự lão hoá, ) Flavonoid được chứng minh có hoạt tính kháng virus cúm (Rakers

và cộng sự, 2014) va virus viêm gan C (Shibata va ctv, 2014) Ngoài ra, flavonoid còn thêhiện tính gây độc tế bào cụ thê đối với tế bào ung thư, có tiềm năng làm các chất kìm hãmloại tế bào này (Zhang và ctv, 2014)

2.3.4 Tannin

Tannin (thường được gọi là acid tannic) là các polyphenol tan trong nước có trong

nhiều loại thực phẩm thực vật Theo Chung (1998), tannin tăng tốc độ đông máu, giảmhuyết áp, giảm mức lipid huyết thanh, tạo hoại tử gan và điều chỉnh các phản ứng miễndịch Ngoài ra, tannin có các tác dụng phụ như có thé gây ung thư, hoạt động kháng dinhdưỡng, và các tác dụng phụ khác nên không khuyến khích ăn một lượng lớn tannin Tuynhiên, việc hap thụ một lượng nhỏ tannin đúng loại có thé có lợi cho sức khỏe con ngườibằng cách ảnh hướng đến enzyme trao đôi chất, điều hòa miễn dịch, hoặc các chức năng

khác.

2.4 Tổng quan về 1-deoxynojirimycin

1-deoxynojirimycin(2R,3R,4R,5S)-2-(hydroxymethyl piperidine-3,4,5-triol), là hoạt

chất tự nhiên có trong dâu tằm bao gồm lá, thân, rễ và ấu trùng tằm, nhộng tằm 1- DNI làmột alkaloid piperidine có nhiều nhóm hydroxyl, lần đầu tiên được tim thấy 6 Streptomycesdưới dạng kháng sinh (Wang và ctv, 2020) Hoạt chất DNJ trong lá dâu tam là một chất ức

chê mạnh hoạt động của enzyme a-glucosidase, ngăn can và ức chê sự phân giải tinh bột

trong thực phâm thành đường đơn là glucoza và fructoza Do đó, 1- DNJ có khả năng hỗ trợ

ngăn can quá trình tao glucose tại thành ruột và gan, từ đó làm giảm lượng glucose di vào

máu, ức chế sự tăng lên của đường máu ngay sau khi ăn (Kuriyama và ctv, 2008) Ngoài ra,

trong nghiên cứu của Wang và cộng tác viên (2020) đã chứng minh 1-DNJ còn có chức nang

giúp chống béo phì và chống virus

2.5 Tổng quan về enzyme ơ-amylase

Enzyme a-amylase có thé được tìm thấy trong vi sinh vật, thực vật và sinh vat baccao, xúc tác quá trình thủy phân các liên kết o-1,4-glycosid bên trong tinh bột thành glucose

va maltose Các chất ức chế bất hoạt a-amylase bằng cách hình thành phức hợp cân bằnghóa học chặt chẽ 1:1 với enzyme này, ngăn chặn trực tiếp các trung tâm hoạt động của một

số vị trí trên enzyme (Francoise, 2004) Khả năng ức chế enzyme a-amylase phụ thuộc vào

số lượng và vị trí của các nhóm thé hydroxyl trong phân tử và tỷ lệ thuận với số lượng nhómthế hydroxyl trên vòng B Các nhóm hydroxyl có thể hình thành liên kết hydro với cácnhóm -OH trong cấu trúc của các amino acid chức năng của enzyme gây cản trở phản ứnggiữa enzyme o-amylase và tinh bột, từ đó ức chế quá trình thủy phân (Võ Thanh Quang,

2013).

2.6 Téng quan vé tra tui loc

Trà có nguồn gốc từ Trung Quốc va được sử dung lam thức uống từ 2500 năm trướccông nguyên, sau đó được truyền bá đến Nhật và một số nước Châu Á khác Trà túi lọc bắtđầu xuất hiện lần đầu tiên ở nước Anh vào đầu thế kỷ 20 do Thomas Sullivan sáng tạo ra.Cấu tạo của trà túi lọc bao gồm túi lọc thường được làm từ giấy lọc, vật liệu lưới nhẹ hoặcmột số vật liệu khác có khả năng chịu nhiệt, có thể có dạng hình chữ nhật hoặc hình vuôngdùng dé chứa trà hoặc các loại thảo dược Trà túi lọc thường được thiết kế dé sử dụng chỉcần đặt túi trà vào 4m hoặc cốc, thêm nước nóng và chờ cho trà hấp thụ hương vị vào nước.Với ưu điểm thuận tiện, nhanh chóng trà túi lọc thích hợp cho những người có cuộc sốngbận rộn hoặc không có nhiều thời gian dé pha trà truyền thống từ lá trà Thị trường trà túilọc tại Việt Nam hiện nay đang phát triển mạnh mẽ và có sự đa dạng về hương vị, thươnghiệu Theo thong kê của Tổng cục Hải quan, xuất khẩu ché trong tháng 6 năm 2023 đạt 9,7nghìn tấn và có hơn 4000 nhà bán hàng về mặt hàng trà túi lọc trên sàn thương mại điện tử

cho thấy sự phổ biến và mức độ tiêu thụ trà túi lọc đang phát triển mạnh mẽ.

Lá dau tằm có nhiều lợi ích đối với sức khỏe, nhưng các sản phẩm từ lá dâu tằmchưa được phổ biến rộng rãi trên thị trường Tuy nhiên có thể kế đến một số nhãn hiệu trà

lá dâu tằm đã được thương mại hóa như trà lá dâu tằm Đông Son, trà túi lọc lá dâu tằmThaphaco, trà 1a dâu tằm Matsukiyo, trà lá dâu tằm Palm Beach

Hình 2.2 Một số san phẩm tra lá dâu tằm của Việt Nam va thé giới

2.7 Tình hình nghiên cứu về cây dâu tằm ở Việt Nam và trên thế giới

2.7.1 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Theo nghiên cứu của Hoàng Thị Lệ Hằng và cộng tác viên (2013) đã nghiên cứuthành công trà túi lọc cho người bệnh tiêu đường từ lá dâu tằm Trong thành phần lá dâutằm có hoạt chất DNJ (1-deoxynojirimycin) là một hợp chất có hoạt tính sinh học, có tácdụng hạ đường máu, hỗ trợ trong điều trị bệnh tiểu đường — một căn bệnh đang là vấn đề

mà cả thế giới quan tâm

Phan Uyên Uyên và cộng tác viên (2019) đã nghiên cứu cho ra quy trình sản xuấtrượu vang nho xanh dâu tằm với tỷ lệ phối chế nho xanh:dâu tằm là 6:4 lên men ở 20 độBrix và tỷ lệ nam men sử dụng là 2%, cô định ở nhiệt độ 20 °C

Nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Duy Bảo (2023) đã nghiên cứu ra viên nang

chiết xuất từ cao chiết dâu tằm kết hợp với lá sen, trà xanh và quả mướp đắng có tác dụng

hỗ trợ giảm cân.

Năm 2023, nhóm nghiên cứu của Phạm Thị Vân Anh đã tiến hành đánh giá tác dụnggiảm cân của Mubella với thành phần chính là tinh bột củ nưa và cao lá dâu tằm trên chuộtnhắt trắng gây béo phì bằng chế độ ăn giàu chất béo và olanzapin Các chỉ số nghiên cứuđược xác định sau 8 tuần uống thuốc thử ở liều 2,4 g/kg và 7,2 g/kg, bao gồm sự tăng trọnglượng cơ thé, lượng mỡ dưới da bụng và mỡ nội tạng, nông độ lipid huyết thanh, tình trạngnhiễm mỡ và ton thương gan Số liệu nghiên cứu đã cho thấy chế phẩm Mubella có théngăn chặn sự tăng cân và giảm chỉ số BMI ở chuột nhắt béo phì

2.7.2 Các nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu của Mohammadi và cộng tác viên (2008) cho thấy lá dau tằm có hiệuquả trong việc kiêm soát đường huyết và day lùi tình trạng khang insulin, giúp hồi phục vềkích thước và số lượng của tế bào tuyến tụy trên động vật mắc bệnh tiểu đường

Năm 2007, Arabshahi-Delouee và cộng tác viên đã xác định các chất phan ứng vớiacid thiobarbituric (chất chiết màu để đo hàm lượng malondialdehyde trong quá trìnhperoxide hóa lipid) cho thay tác dung ức chế của lá dâu đối với quá trình peroxide hóa lipid.Tác hại do sự peroxide hóa gây ra đó là sự sản xuất các gốc tự do quá mức gây stress oxyhóa trong gan có thé dẫn đến ton thương gan Trong hau hết các trường hợp tôn thương ganđược biết là có liên quan đến stress oxy hóa và được đặc trưng bởi sự tiến triển từ gan nhiễm

mỡ đến viêm gan, xơ hóa, xơ gan và ung thư tế bào biểu mô gan (Lin và ctv, 2008) Trong

mô hình in vitro, chiết xuất lá đâu tằm ức chế sự hình thành malondialdehyde (một sảnphẩm của quá trình peroxide hóa lipid gây đột biến ở tế bào người)

Vào năm 2013, Nade và cộng tác viên đã tiến hành các thí nghiệm trên chuột dénghiên cứu tac dung bảo vệ tim mach của lá dâu tằm trong nhồi máu cơ tim do isoproterenolgây ra Khi so sánh với nhóm không sử dụng lá dâu, nhóm sử dụng lá dâu cho thấy sự cảithiện tốn thương cơ tim do isoproterenol gây ra, diện tích viêm cơ tim và hoại tử cơ nhỏ

hơn.

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: từ tháng 8 - 2023 đến tháng 11 - 2023

Địa điểm: Phòng BIO 305 và BIO 315, Khoa Khoa học Sinh Học, trường Đại họcNông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Lá dâu tằm được mua tại vườn thuộc huyện Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng Vật liệu sau

khi thu thập được rửa sạch, sây trong tủ say ở nhiệt độ 50 °C + 5 °C cho đến khi đạt độ 4mđạt 13% (Dược điển Việt Nam V) Lá dâu tằm sau khi sấy khô được xay nhỏ và rây qua rây

có kích thước lỗ 1 mm Bột nguyên liệu được bảo quản trong túi zip ở nhiệt độ phòng đặt

trong bình hút 4m đề thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

3.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

3.3.1 Hóa chất

Thuốc thử Dragendorff; Wagner; NaOH (CAT#130-732, Xilong); FeCl;(CAT#7705-08-0, Xilong); thuốc thử Folin-Ciocalteu (Cas#1090010100, Merk); Na2CO3(CAT#497198, Xilong); KI (CAT#7681-11-0, Xilong); thuốc thử Fehling, CH3COOK(CAT#1048201000, Merck); thuốc thir DNS (CAT#609-99-4, Macklin), AICl; (CAT#

7784-136, Xilong), KMnOx (CAT#7722-64-7, Xilong); methanol; ethanol; môi trường Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC Agar), Violet Red Bile Lactose Agar (VRBL Agar), Tryptone Bile X-glucuronide (TBX), Hektoen Enteric Agar (HE Agar), Xylose Lysine Deoxycholate (XLD).

3.3.2 Dung cu va thiét bi thi nghiém

Tủ say (Memmert, Đức); cân phân tích (Ohaus PA, Mỹ); thiết bị quang phổ hấp thuphân tử ( Jenway, Anh), thiết bị cô quay chân không (Heidolph, Đức) và các dụng cụ phòng

thí nghiệm.

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Khảo sát các thành phần hóa thực vật trong lá dâu tằm

3.4.1.1 Xác định độ âm và hàm lượng tro của nguyên liệu

Độ âm nguyên liệu được xác định theo TCVN 7975:2008 Cân 5 g mẫu bột tra chovào chén độ âm (chén đã được sấy 105 °C va dé nguội trong bình hút ẩm, cân và ghi nhậnkhối lượng) Cho chén chứa mẫu vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 105 °C+2 °C trong 6 giờ, sau

đó dé nguội trong bình hút âm và ghi nhận khối lượng Lap lại nhiều lần đến khi chênh lệchtrọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 5 mg

Độ âm của nguyên liệu được tính bằng công thức

1n1—1n2 W= x 100 (%)

m1—mo

Trong do:

mo là khối lượng của chén thủy tinh rỗng(g);

mi là khối lượng của chén thủy tinh và phần mẫu thử trước khi say(g);

ma là khối lượng của chén thủy tinh và phần mẫu thử sau say(g)

Hàm lượng tro tổng số được xác định theo TCVN 5611:2007

Cân bột trà (3 — 5 g) vào chén sứ đã say khô và biết trước khối lượng Phan mẫu thửtrong chén được sấy ở nhiệt độ 100 °C cho đến khi hết âm Chuyển chén vào lò nung ở 525

°C + 25 °C cho đến khi tro hoá hoàn toàn (thường cần ít nhất 2 giờ) Dé nguội, và làm 4mtro bằng nước cat, làm khô trên bếp điện Đưa chén trở lại lò nung và nung trong 60 phút,làm nguội trong bình hút âm và cân Nung tiếp trong lò nung 30 phút, để nguội và cân Lặplại các thao tác này, cho đến khi chênh lệch giữa hai lần cân kế tiếp không quá 0,001 g

Hàm lượng tro của nguyên liệu được tính theo công thức:

w= Ze x 100 (%)

mi1i-mo

Trong đó:

mo là khối lượng của chén sứ rỗng (g);

my là khối lượng của chén sứ và phần mẫu thử trước khi tro hóa (8);

ma là khối lượng của chén sứ và mau sau khi tro hóa (g)

10

3.4.1.2 Định tính các thành phần hóa thực vật của lá dâu tằm

Thí nghiệm này được thực hiện nhằm xác định các thành phần hóa thực vật cơ bảntrong lá đâu tằm làm cơ sở đề đánh giá chất lượng đầu vào của nguyên liệu Các nhóm hợpchất được định tính bao gồm alkaloid, flavonoid, saponin, tanin được thực hiện theo phương

pháp của Pham Thanh Ki va ctv (1998), đường khử được xác định theo phương pháp của

Phạm Thị Ánh Hồng (2003)

Chuẩn bị dịch chiết định tính (do một số hợp chất tan tốt trong cồn và cũng có một

số hợp chất tan tốt trong nước) nên chia ra làm 2 loại dịch chiết như sau:

Dịch chiết nước: Cân 5 ø mẫu lá dâu tằm chiết siêu âm với 50 mL nước cắt, lặp lạinhiều lần dé chiết kiệt mẫu

Dịch chiết cồn: Cân 5 g mẫu lá dâu tằm chiết siêu âm với 50 mL dung môi ethanol70%, lặp lại nhiều lần dé chiết kiệt mẫu

mL hỗn hop thu được cho vào bình định mức 100 mL , thêm 20 mL acetic acid va định

mức đến vạch bằng nước cat

Thuốc thử Wagner: Hòa tan 2 g Iod và 4 g KI trong 10 mL nước trong bình địnhmức 100 mL khuấy từ cho hỗn hợp tan hoàn toàn và định mức đến vạch bằng nước cắt.Thêm 3 mL dịch chiết nước và cồn đã chuẩn bị vào ống nghiệm và nhỏ từ từ 5 — 10 giọtthuốc thử Dragendorff hoặc Wagner Phản ứng dương tính với alkaloid xảy ra khi xuất hiệncác kết tủa màu cam đỏ (với thuốc thử Dragendorff) hoặc kết tủa màu nâu đến nâu đen (vớithuốc thử Wagner)

b Flavonoid

Thử nghiệm ferric chloride: lấy 2 mL dịch chiết nước và cồn cho vào ống nghiệm,

11

thêm vào vài giọt dung dich FeCl; 5% và lắc đều Nếu dung dịch có màu xanh den hay xanh

rêu: có flavonoid.

Phản ứng với NaOH 10%: lay 2 mL dịch chiết nước và cồn cho vào ống nghiệm,thêm vài giọt NaOH 10% Đa số các flavonoid sẽ làm dung dịch chuyển sang màu vànghoặc vàng cam.

ta được thuốc thử Fehling

Lay 2 mL dich chiết nước, thêm vào 1 mL thuốc thử Fehling, lắc đều, đun sôi cáchthủy trong 3 phút Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: có các hợp chất khử

3.4.1.3 Định lượng các hợp chất hóa học có trong lá dâu tằm

Dựa vào kết quả định tính ở trên, nghiên cứu tiếp tục định lượng các nhóm chất cóhiện diện trong lá dâu tằm qua nhằm xác định thành phần có hoạt tính sinh học cao làm cơ

sở cho những nghiên cứu tiếp theo của đề tài

12

a Định lượng phenolic tông số

Folin-đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ gallic acid và độ hap thu tương ứng

Dịch chiết được tiễn hành tương tự chất chuẩn (pha loãng khi độ hấp thu vượt quáđường chuẩn) Ethanol được sử dụng làm mẫu trắng Hàm lượng phenolic tổng số được xácđịnh bằng công thức sau (Singh, 2017):

_Ý#U xy

m

W Trong do:

W: ham lượng phenolic tong số (mg GAE/g);

C: nong độ Gallic acid được xác định dựa vào đồ thị chuẩn (mg/mL);

V: thé tích dịch chiết thu được (mL);

m: khối lượng mau lá đem phân tích (g);

£: hệ số pha loãng của dịch chiết

b Định lượng flavonoid

Xây dựng đồ thị chuẩn :

Quercetin được sử dụng lam chất chuẩn trong định lượng flavonoid tong số Cân

chính xác 5 mg Quercetin hòa tan trong 10 mL ethanol 70%, sau đó pha loãng thành các

nồng độ khác nhau: 30, 60, 90, 120 và 150 mg/L Lần lượt hút 0,5 mL các dung dịch chuẩnQuercetin đã pha loãng ở các nồng độ cho vào 5 ống nghiệm, thêm 1,5 mL ethanol 96%,

dé yên trong 5 phút sau đó thêm 0,1 mL nhôm clorua (AICIs) 10%, lắc đều dé yên trong 6phút Tiếp tục thêm 0,1 mL CH3COOK 1M và 2,8 mL nước cất vào Sau khi ủ ở nhiệt độphòng trong 15 phút, độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 430 nm bằng

13

thiết bị UV - Vis Dựng đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ Quercetin và độ hấp

thu tương ứng.

Dịch chiết được tiến hành tương tự chất chuẩn (pha loãng khi độ hấp thu vượt quáđường chuẩn) Ethanol được sử dụng làm mẫu trắng Hàm lượng flavonoid tổng số đượcxác định bằng công thức sau:

_ É6XV #ƒ

m WwW

Trong đó:

W: hàm lượng flavonoid tổng số (mg QE/g);

C: nong độ Quercetin được xác định dựa vào đồ thị chuẩn (mg/mL);

V: thể tích dịch chiết thu được (mL);

m: khối lượng mẫu lá đem chiết (g);

f: hệ số pha loãng của dịch chiết

c Đường khử

Thuốc thử DNS (3,5- Dinitrosalicylic acid): Hòa tan hoàn toàn 1 g DNS, 30 g muối

Rochelle và 0,5 g Na2SO3 trong 80 mL NaOH 0,5 N ở 50 © trong bình định mức 100 mL

Sau đó, dung dich được dé nguội ở nhiệt độ phòng, tiếp tục thêm vào 0,5 g phenol và địnhmức đến vạch Thuốc thử được bảo quản lạnh trong bình chứa tối màu, sau đó pha loãng ởcác nồng độ 50, 100, 150, 200, 250, 300 ppm Hút 1 mL mẫu sau đó thêm 1 mL DNS, đuntrong 5 phút (đun 1 cốc nước sôi sau đó bỏ hỗn hợp vào đun và canh 5 phút), lấy ra làmlạnh lập tức (có thể ngâm liền vào nước đá lạnh hoặc xả dưới vòi nước, mục đích là làmcho quá trình oxy hoá khử dừng lại lập tức), thêm 3 mL nước cất vào hỗn hợp và đo ở bước

C: nồng độ glucose được xác định dựa vào đồ thị chuẩn (mg/mL);

V: thé tích dịch chiết thu được (mL);

m: khối lượng mẫu lá đem chiết (g);

f: hệ số pha loãng của dịch chiết

d Định lượng tanin

Xác định bằng phương pháp chuẩn độ với dung dịch chuân KMnO¿ Hút 5 mL dịchchiết được hòa tan với 5 mL dung dịch indigo-carmin và 150 mL nước Hỗn hợp đượcchuẩn độ với dung dịch KMnOy làm dung dịch chuyền từ màu xanh sang màu vàng

Mẫu trắng thêm 5 mL nước cất sau đó thêm 5 mL indigo-carmin và 150 mL nướcsau đó chuẩn độ như bình thường (thể tích chuẩn độ dưới 2 mL) Hàm lượng tanin được

tính theo công thức:

_— (V— Vo) x 0.004157 x 100 x 100

m x 25

W Trong đó:

V: là thể tích KMnO¿ được sử dung cho chuẩn độ mẫu (mL);

Vo: là thé tích KMnO¿ 0,1N được dùng dé chuẩn độ mau trắng (mL);

0,004157: đương lượng tamn trong ImL KMnOx0,1N;

m: khối lượng mẫu (g);

100: thể tích dich chiết (mL)

e Định lượng saponin

Hàm lượng saponin được xác định theo phương pháp khối lượng của Aziz và cộngtác viên (2019) và Dược điển Việt Nam V và có hiệu chỉnh đề phù hợp với điều kiện phòngthí nghiệm Trong phương pháp này, saponin được chiết xuất theo cách truyền thống bằng

hỗn hop alcohol — nước, sau đó tùy thuộc vào tinh tan của saponin trong các dung môi có

độ phân cực khác nhau mà sử dụng các phân đoạn dé thu lay saponin từ nền dịch chiết tong

số Can sau khi tinh chế được sấy khô va cân đề xác định hàm lượng saponin thô Bột dượcliệu được chiết với hỗn hợp methanol — nước (4:1, v/v) bằng siêu âm kết hợp ủ nhiệt trong

bể lắc Dịch chiết được loại methanol đưới áp suất giảm bằng thiết bị cô quay chân khôngcho đến cắn, cắn được hòa lại với nước cất Pha nước được loại màu với các dung môi

không phân cực và tái phân đoạn với n-butanol bão hòa nước Phân đoạn n-butanol được

15

rửa nhiều lần với KOH 1% dé loại các hop chat phenolic và flavonoid (Woo và ctv, 1980).Tiếp tục rửa lại phân đoạn-butanol với nước cất đến pH trung tính Cô quay loại n-butanolcho đến cắn, căn được sấy đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút âm và cân.

Hàm lượng saponin thô trong mẫu được tính theo công thức sau:

_ mi—m0

W X 100 (%)

m

Trong do:

W: hàm lượng saponin thô của mẫu (%);

mo: Khối lượng bình cầu rong (8);

m1: Khối lượng bình và cắn saponin sau khi sấy (g);

m: Khối lượng mau thử (g)

3.4.2 Nghiên cứu tạo sản phẩm trà túi lọc lá dâu tằm

Trà túi lọc từ dé tài được tạo ra nhằm mục đích giúp ồn định đường huyết, hạ huyết

áp Lá dâu tằm có chứa các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao nhưng khi sử dụng

để làm trà thì không tạo được vị đắng đặc trưng của trà dẫn đến cảm quan kém đối vớingười sử dụng do đó cần phối hợp với các thảo được khác giúp gia tăng mùi vị, kích thích

vị giác tốt hơn Đề tài đã tiến hành nghiên cứu công thức phối trộn sản phẩm gồm có bổsung thêm linh chi và cỏ ngọt Linh chi ngoài có vị đắng còn có công dụng giải độc, hanchế nguy cơ mắc bệnh tim mạch trong khi đó cỏ ngọt là một chất làm ngọt tự nhiên cónguồn góc từ thực vat là một lựa chọn phù hợp cho những người giảm cân hoặc có tiền sửbệnh đái tháo đường hoặc nồng độ cholesterol máu cao Việc kết hợp các dược liệu này với

lá dâu tằm vừa tạo được vị ngọt cho trà vừa mang lại nhiều lợi ích đối với sức khỏe

Theo khảo sát sơ bộ về các tỷ lệ phối trộn chia ra các công thức phối trộn khác nhau

(bang 3.1) được tiến hành phân tích hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số, đánh giá

chất lượng cảm quan các tiêu chí mùi, vị, độ trong, màu theo TCVN 3215 - 79.

16

Bảng 3.1 Công thức phối trộn các thành phần của trà túi lọc dâu tằm

Công thức Ty lệ phối trộn lá đâu tằm: linh chỉ: cỏ ngọt (%)

CTI 85:10:25 CT2 80:15:5 CT3 72 Lộ 10

Đối với các sản phâm là trà, chỉ tiêu vị đóng vai trò quan trọng nên chiếm 50% điềmtrọng lượng, tiếp theo là mùi chiếm 20%, màu chiếm 20% và cuối cùng là độ trong chiếm10% và tiễn hành cảm quan theo hướng dẫn của TCVN 3215 - 79

Bảng 3.2 Các chỉ tiêu đánh giá cảm quan trà túi lọc

Tên chỉ tiêu Ty trọng điểm (%)

Vi 50

Mui 20

Mau 20 D6 trong 10

Khi đánh giá cảm quan sản phẩm thực pham bằng phương pháp cho điểm theoTCVN 3215-79 thì tat cả các chỉ tiêu cảm quan hay từng chỉ tiêu riêng của sản phẩm dùng

hệ điểm 20 dé xây dựng một thang điểm thống nhất 6 bậc 5 điểm (từ 0 đến 5) trong đó điểm

0 tương ứng với mức chất lượng sản phẩm bi hỏng, còn từ 1 — 5 tương ứng với mức chấtlượng tăng dan Ở điểm 5 sản phẩm coi như không có lỗi nào trong tính chất nhận xét, sảnphẩm có tính chat tốt đặc trưng và rõ rệt cho chỉ tiêu đó

17

Bang 3.3 Bảng xếp loại chất lượng sản pham theo điểm cảm quan

3.4.3 Đánh giá chất lượng trà túi lọc thành phẩm

Từ các công thức trà được cảm quan ở nội dung 3.4.2 lựa chọn công thức có điểm

số cao nhất dé đánh giá chất lượng của sản phẩm tra túi lọc lá dâu tằm thông qua các chỉtiêu về độ âm, tro tổng số, chỉ tiêu vi sinh vật, chỉ tiêu kim loại nặng, đồng thời khảo sáthoạt tính chống oxy hóa, khả năng ức chế enzyme

3.4.3.1 Độ 4m của trà túi lọc

Độ âm của trà túi lọc được xác định theo TCVN 7975:2008 Cân chính xác 5 ø mẫucho vào chén độ ẩm (chén đã được say 105 °C và dé nguội trong bình hút âm, cân và ghinhận khối lượng) Cho chén chứa mẫu vào tủ say, say ở nhiệt độ 105 °C + 2 °C trong 6 giờ,sau đó dé nguội trong bình hút 4m và ghi nhận khối lượng Lap lại nhiều lần đến khi chênhlệch trọng lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 5 mg

3.4.3.2 Hàm lượng tro tổng số được xác định theo TCVN 5612:2007

Cân chính xác 3 — 5 g nguyên liệu vào chén sứ đã sấy khô và biết trước khối lượng.Phan mau thử trong chén được sấy ở nhiệt độ 100 °C cho đến khi hết 4m Chuyén chén vào

lò nung ở 525 °C + 25 °C cho đến khi tro hoá hoàn toàn (thường can ít nhất 2 gid) Dénguội, và làm ẩm tro bằng nước cat, làm khô trên bếp điện Đưa chén trở lại lò nung vànung trong 60 phút, làm nguội trong bình hút âm và cân Nung tiếp trong lò nung 30 phút,

18

để nguội và cân Lặp lại các thao tác này, cho đến khi chênh lệch giữa hai lần cân kế tiếp

không quá 0,001 g.

3.4.3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa được khảo sát thông qua khả năng trung hòa các gốc tự do

1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) (Blois, 1958; Bondet va ctv, 1997) Phương pháp

này dựa trên cơ sở phan ứng trung hòa gốc tự do và lam giảm cường độ màu thuốc thửDPPH của các chất có tác dụng chống oxy hóa Các gốc DPPH tự do có độ hấp thu cực đại

ở bước sóng 500 — 520 nm Sự thay đổi màu sắc từ tím sang vàng của DPPH tương ứng vớiviệc electron tự do của DPPH bắt cặp với một nguyên tử hydro từ chất chống oxy hóa détạo thành DPPH-H khử Kết quả của sự khử màu tương ứng với lượng nguyên tử hydrođược giữ lại trong DPPH-H: cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ nghịch với nồng độcác chất chống oxy hóa hiện diện trong hỗn hợp khảo sát Ascorbic acid được sử dung làmchất đối chiếu Phản ứng kháng oxy hóa được thực hiện theo phương pháp của Chanda vàDave (2009) có hiệu chỉnh, cụ thé là 0,5 mL thuốc thử được cho vào các ống nghiệm cóchứa sẵn 3 mL ethanol 96%, tiếp tục thêm vào 1 mL DPPH 0,5 mM pha trong methanol vàlắc đều Hỗn hợp được đề yên trong tối 30 phút và đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm Thựchiện song song một mẫu đối chứng âm bằng cách thay dung dịch thử bằng nước cất Đốichứng dương là ascorbic acid được pha trong nước cất ở nồng độ 10 — 50 mg/L Đồ thiđường chuẩn được xây dựng bằng phần mềm Excel với trục tung là tỉ lệ phần trăm hoạttính kháng oxy hóa, trục hoành là nồng độ chất khảo sát Công thức tính tỉ lệ phần trămhoạt tinh kháng oxy hóa được biéu diễn theo công thức sau:

%AA= (ODc-ODs)/ODc x 100

Trong đó

ODc : Giá trị mật độ quang của đối chứng âm;

ODs : Giá trị mật độ quang của mẫu thử;

%AA: Hoạt tinh bắt gốc tự do (%)

Từ tỉ lệ phần trăm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, xây dựng phương trình tương quanhồi quy tuyến tính y = ax + b với y là tỉ lệ phần trăm hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, x lànồng độ mẫu thử Từ đó, xác định được ICso (nồng độ mà tại đó 50% gốc tự do DPPH được

19

trung hòa) Đây là co sở dé so sánh khả năng khang oxy hóa giữa các mẫu Mẫu nào có giátrị ICso càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao.

3.4.3.5 Khảo sát khả năng ức chế enzyme ơ-amylase của trà túi lọc lá dâu tằm

DTD biểu hiện bang lượng glucose trong máu cao hơn bình thường, do đó kiểm soátlượng glucose là một mục tiêu quan trọng để làm giảm nguy cơ biến chứng sức khỏe lâudai của bệnh DTD Carbohydrate là nguồn cung ứng lớn glucose trong cơ thé Phân tửcarbohydrate bị thủy phân thành các oligosaccharide bởi enzyme a-amylase (tụy tạng tiếtra) Do đó, ức chế được enzyme này thì lượng dẫn đến hoạt động biến dưỡng của các

enzyme ở sau cũng bị trì trệ.

Phản ứng ức chế sự thủy phân tinh bột của enzyme a-amylase được thực hiện theophương pháp của Đái Thị Xuân Trang và cộng tác viên (2012) có điều chỉnh như sau: caoethanol được pha loãng thành các mức nồng độ: 20 - 100 (ug/mL) Enzyme a-amylase phatrong dung dịch đệm phosphate pH = 7 ở nồng độ 0,5 U/mL Tinh bột được pha trong nướccất thành nồng độ 1 mg/mL

50 uL enzyme ơ-amylase 0,5 U/mL được ủ với 100 wL cao chiết ở các mức nồng độ

khác nhau và 100 uL dung dịch đệm phosphate pH = 7, ủ ở nhiệt độ 37°C trong thời gian

10 phút Tiếp theo, cho vào hỗn hợp phan ứng 250 uL tỉnh bột 1 mg/ mL và ủ ở nhiệt độ

37 © trong 10 phút Sau đó, hỗn hợp được thêm vào lần lượt 100 pL HCl IN dé dừng phảnứng và 300 pL thuốc thử Iodine 0,1N dé nhận biết lượng tinh bột còn lại dựa trên phản ứngmàu xanh đặc trưng của phức hợp tỉnh bột-iodine Hỗn hợp được đo quang phổ ở bướcsóng A = 660 nm dé xác định lượng tinh bột còn lại sau phản ứng Song song, tiến hànhđánh giá hiệu quả ức chế enzyme ơ-amylase với đối chứng dương là Acarbose ở các mứcnồng độ tương ứng Phan trăm enzyme a-amylase bị ức chế (%): dựa vào lượng tinh bộtban đầu và lượng tinh bột còn lại sau phản ứng thông qua giá trị đo độ hấp thu quang phô

Phan trăm enzyme a-amylase bị ức chế (%) = 100 — Hiệu suất phản ứng (%)

Hiệu suất phản ứng (%) = (Ao — Ai )/ Ao x 100

Trong đó:

Ao: Gia tri quang của dung dịch đối chứng (lượng tinh bột ban đầu)

Ai : Giá tri quang cua dung dịch sau phản ứng (lượng tinh bột còn lại).

20

Tiến hành dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa % enzyme bị ức chế

và nồng độ mẫu Dựa vào phương trình đường chuẩn xác định được giá trị ICso

3.4.3.6 Đánh giá an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm trà túi lọc

a Định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo TCVN 7924-2:2008

Chuẩn bị dung dịch đồng nhất, pha loãng mau dé có độ pha loãng 101, 102, 103.Chuyén 0,1 ml dung dịch 101, 102, 103 vào tâm đĩa petri môi trường thạch, mỗi nồng độlặp lại 2 lần Cấy trải đều và khô, lật ngược đĩa petri và đem ủ ở 44 °C, từ 18-24 giờ (không

ủ quá 24 giờ) Chọn dia petri có số lượng khuẩn lạc điển hình (có màu xanh) nhỏ hơn 150

và tông số khuẩn lạc nhỏ hơn 300 ( gồm ca điển hình và không dién hình) Tính toán mật

độ E coli có trong mẫu thực pham

N=(*a)/(Vx (ni+0,1xn¿)xd ) Trong đó:

Ya: tong số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau hai độpha loãng liên tiếp có ít nhất một dia chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh;

ni: là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ nhất;

V: thé tích dich cay đã dùng trên mỗi đĩa (mL);

na: là số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ hai;

d: hệ số pha loãng tương ứng

b Quy trình định lượng Coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc theo TCVN

6848:2007

Chuẩn bị dung dịch đồng nhất, pha loãng mẫu dé có độ pha loãng 101, 102, 103.Chuyén 0,1 ml dung dich 101, 102, 103 vào tâm đĩa petri môi trường thạch, mỗi nồng độlặp lại 2 lần Rot khoảng 15 ml môi trường Violet Red Bile Lactose Agar (VRBL) ( 44 —

47 °C) vào mỗi đĩa petri Trộn đều môi trường với dịch cấy, để hỗn hợp đông đặc Đồngthời chuẩn bi một đĩa chứa 15 mL môi trường ( không có dịch cấy dé kiểm tra sự vô trùngcủa môi trường) Rót khoảng 4 ml môi trường VRBL ( 44 — 47 °C) lên bề mặt môi trường

cấy ĐỀ cho đông đặc và đem ủ ở 30 °C hoặc 37 °C, 24 giờ Chọn những đĩa có số lượng

khuẩn lạc 10-150, đếm những khuân lạc điển hình có màu đỏ tia có đường kính 0,5 mm trởlên Tính toán mật độ Coliform trong mẫu thực phẩm

21

c Quy trình định tính Salmonella thực hiện theo TCVN 4829:2005

Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 mL môi trường tăng sinh Buffered Peptone Water(BPW), ủ ở 37 °C, 18 -24 giờ Cấy 0,1 mL dịch tăng sinh sang môi trường chọn lọcRappaport Vassiliadis (RV), ủ ở 42 °C, 18 — 24 giờ Dùng que cấy vòng thực hiện kĩ thuậtcay phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dich tăng sinh chon lọc lên đĩa môi trường đặc

trưng cua Salmonella như Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) và Hektoen Enteric (HE).

Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau: môi trường XLD: khuẩn lạc cómàu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen, một số dong có thé có tâm đen bóng rấtlớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc; môi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đôi từ xanhdương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen, một số dòng có thể có tâm đen bóngrất lớn có thể chiếm gần hết khuân lạc

d Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí và tong nắm men nắm mốc theo TCVN

8275-1: 2010

Đồng nhất va pha loãng mẫu dé có độ pha loãng 101, 102, 103 Trải 0,1 ml mẫu

lên đĩa Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC), ủ ngửa đĩa ở 25 °C, 5 -7 ngày

(mỗi nồng độ cấy 2 đĩa) Đếm khuẩn lạc nam men, nam mốc Tính kết quả tổng số vi sinhvật nam men, nam mốc

A= N

nxVxfit.4tnix Vx fi Trong do:

A: số tế bào vi khuan (hay nam mốc nam men) trong 1g hay Iml mẫu(CFU/g);

N: tong số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chon;

V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa (mL);

ni: SỐ lượng đĩa cay tại độ pha loãng thứ 1;

fi: độ pha loãng tương ứng.

22