Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nghiên cứu quy trình tạo hạt nanochitosan từ chitosan ruồi lính đen (Hermetla illucens)

TOM TATNghiên cứu được tiến hành dé khảo sát các điều kiện anh hưởng đến kích thướcviên bao Chitosan bằng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM từ đó đưa ra được điềukiện tối ưu tạo viên bao Ch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT NANOCHITOSAN

TỪ CHITOSAN RUOI LÍNH ĐEN (Hermetla illucens)

Nganh hoc : CONG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : VŨ THỊ HUYEN TRANG

Mã số sinh viên : 19126198

Niên khóa : 2019-2023

TP Hồ Chí Minh, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT NANOCHITOSAN

TỪ CHITOSAN RUOI LÍNH ĐEN (Hermetla illucens)

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

TS NGUYÊN PHÚC CẢM TÚ VŨ THỊ HUYEN TRANG

TP Hồ Chí Minh, 03/2024

LỜI CÁM ƠN

Không có sự thanh công nào không gan liền với sự cố gang, nỗ lực va kiên trì.Bên cạnh đó không thể thiếu đi sự hỗ trợ, động viên và giúp đỡ từ những người xungquanh Trong suốt thời gian làm đề tài đến nay, em đã nhận được sự quan tâm chỉ bảo,

giúp đỡ của quý thầy cô trường Đại học Nông Lâm rất nhiều

Với tình cảm chân thành, em xin gửi lời cảm ơn trân thành đến TS Nguyễn PhúcCam Tú va TS Nguyễn Ngoc Hà đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý

báu Em cảm ơn cô Truyện Nhã Định Huệ đã cung cấp nguồn vi khuẩn cho đề tài Em

cảm ơn thầy, cô đã giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình trong suốt thời gian qua, tạo điềukiện giúp em hoàn thành tốt dé tài nay và đưa ra những lời khuyên bồ ích giúp em giảiquyết các vấn đề gặp phải trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài

Em xin chân thành cảm ơn hai chị Nguyễn Thị Thùy Dung, chị Thái Thị Thanh

Thủy đã nhiệt tình chỉ day những kiến thức kỹ năng phòng thí nghiệm, cảm ơn hai chị

đã luôn đồng hành, ủng hộ và cô vũ cho em trong suốt quá trình làm đề tài Xin cảm ơncác bạn K19 đã luôn yêu thương và giúp đỡ mình trong cuộc sống cũng như trong họctập Cảm ơn các em K20, K21 đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài

Với điều kiện và kinh nghiệm còn nhiều hạn chế, em rất mong nhận được sự chỉ

bao, đóng góp ý kiến của các Quý Thay Cô dé từ đó bồ sung những kiến thức, kỹ nănghọc tập vả làm việc.

Em xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Vũ Thị Huyền Trang, MSSV 19126198, lớp DH19SM ( số di động

0855295041, Email 19126198@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh họcĐại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, xin cam đoan Đây là khóa luận do bản thân tôi

trực tiếp thực hiện với sự hướng dẫn của TS Nguyễn Phúc Cẩm Tú và TS NguyễnNgọc Hà trong khuôn khổ đề tài cấp cơ sở MS CS - CB22 - Vien CNSH - 02 Các số

liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toan trung thực và khách quan Tôi xin hoàn

toàn chịu trách nhiệm trước hội động về những cam kết này

Tp Hô Chi Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

Vũ Thị Huyền Trang

i

TOM TAT

Nghiên cứu được tiến hành dé khảo sát các điều kiện anh hưởng đến kích thướcviên bao Chitosan bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) từ đó đưa ra được điềukiện tối ưu tạo viên bao Chitosan kích thước nano bao gồm nồng độ CS 0,625 mg/ml;nồng độ TPP 0,3 mg/ml; pH 4; tốc độ khuấy 500 rpm Các hạt viên bao được tổng hợp

nhờ phương pháp tạo gel ion giữa Chitosan va TPP, viên bao nano có kích thước trung

bình là 179,11 nm Hình dáng hạt viên bao được xác định bằng phương pháp chụpFESEM cho thấy hạt có dạnh hình cầu, kích thước tương đối đồng đều Bên cạnh đó,hoạt tính kháng khuẩn của viên bao nano cũng được quan tâm

Từ khóa Chitosan, hạt Nano, gel lon, phương pháp bề mặt đáp ứng

iil

SUMMARYThe research was conducted to investigate the conditions affecting the size of Chitosan-based nanoparticles using the Response Surface Methodology (RSM) The optimal conditions for producing nano-sized Chitosan capsules were determined as follows Chitosan concentration of 0,625 mg/ml, TPP concentration of 0,3 mg/ml, pH

4, and stirring speed of 500 rpm The capsules were synthesized through the 1on gelation method between Chitosan and TPP, resulting in nano-sized capsules with an average size of 179,11 nm The morphology of the capsules was determined using FESEM

imaging, revealing spherical particles with relatively uniform sizes Additionally, the

antimicrobial activity of the nano capsules was investigated.

Keywords Chitosan, Nano particles, lon gelation, Response Surface Methodology.

1V

76/222 5 000 uc ,.111111111 1! iXÁC NHẬN VA CAM DOAN ccssssssesssssessessessessessessessvesessessecseesecsessesesseeseeesesseeseesees ii

1z? Mie tiểu 11 SHIH GỨ sen bessseesEisSELE35SE2LP.11S180G3650065:.8031/g.u.S61410E BS013E18K8.qLĐ804 x5ExggRo 2

1.3 N61 dung thre W160 01177 = 2

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIỆU -22222222EE22E22EE+EEzEzzxezrrzrxszszrsrrs-exs -3

2.0), (CHOSE ocxasnexsnecasenousvsnneaieaxcavensssenrenessannanees enw nesaosawersenesenvayanceassaucnnnsneesenusersnnnvuonecnseesD

2.1] RAT 101 Ct ose wee enter en seeshen ence ween eieniiennioe remeron enemies 3 2.1.2 Đặc tính của C1fOSa1 - G22 22 122218231 11211 193112111 111011 1118 11191 g1 ng ng re 4

2.1.9 Chitosan tir VÕ nhộn RUD isscssuesãccg100055 0363638340 4305.00891435880,4uEE5841018540881438.0ã.023,ẢÓ 4

2.1.4 Ứng dụng của Chifosan - 2- 222 S2222222212212121221211212212112122121121 112121 xe 4

2.2 Sodium Tripolyphosphate 5 + + n3 ng TH ngưng Hư rệt 5

2.3 Phương pháp tao hat nanoChIfosa1n - - - 2 222222 222 2122 2215121111111 re 6

2.4 Giới thiệu về hạt nanoChitosann - +52 2+SSE£SE2E£EE£EE2EE2EEEE2E21212112112215 2122 e 62.4.1 Các phương pháp phổ biến 2-2: ©222S22S22EES2E22EE2EE22E122122312212232221221 212222 7

2.4.2 Phuong phap tao gel 1011C 0 7

2.5 Giới thiệu về Phương pháp Bề mat Dap ứng (RSM]) 2 22©7255ccccce: 9

2.5.1 Nguyên tẮc 2-2221 21 212221221121127112112112112112112112112112111121121121 121cc 9

25.2) CONS UN Bre TA RSM ¿ sssssssasdesdekiei2sseosesEEdblisibdedbuoau SoAglodipuSEk.sdbtcdnueidEganullkasigsbsguSbssaalukr 10

2.6 Các nghiên cứu về viên bao Chitosan có kích thước nano (hat nanoChitosan) 11Chương 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP ©22 22 22SE+2E+2E22E2EZEzEezxezxee 123.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2-22++222++22++22E+2EEEttrxrrrrrrrrrrrrrrree 12

S2: VEE (SUM BAT CI TT screams ca tren eh co RT 12

E2 OANH 00000 (000 000 1251.3 VI;XKhuin:DpHÌfNH seeessssusesonntsitniosvkcinntiAS091010039000001850019009/89010001000091001091050 123.2.3 Hoa chat 50 13

33 Phương phap nghiền Ciliisc.cssnensvsrenemmerraenanennsnenmes em menmeneneTT 13

3.3.1 Điều chế Chitosan từ vỏ nhộng Ruồi lính den c.cccccccecsesseesesseeseseeesesseesesseees 13

3.3.2 Khảo sát các điều kiện tối ưu tạo viên bao kích thước nano -2- 153.3.3 Tổng hợp viên bao Chitosan có kích thước nano bằng phương pháp tạo gel ion 173.3.4 Tiến hành thí nghiệm kiểm chứng 2-22 ©2222222E22EE2EE2EE2EE22EE2EEZErzrxee 17

3.3.5 Phương pháp phân tích các đặc tính lý, hóa của viên bao Chitosan có kích thước

MANO tONg NOP Ng: 173.3.6 Thử nghiệm hoạt tính khang khuẩn của viên bao Chitosan có kích thước nano 183.3.7 Xử lý số liệu -2 ©2-22222212221221122112211211121112111211211211211211111.11 11 e0 18

Chương 4 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN co SĂG 222222200 101212 xe 19

4.1 Chitosan tổng hợp bằng phương pháp hóa học 2 -2-©2222++22+zzc2+zze- 194.2 Mô hình tương quan giữa các yếu tố ảnh hưởng và kích thước viên bao 20

4.3 Hình thái của viên bao Chitosan kích thước nano - 5+ ++++++s£+z>+eresess 25

4.4 Đường kính và phân bố kích thước hạt của viên bao -2-222255z22z+c+2 264.5 Khao sát hoạt tinh kháng khuẩn của viên bao Chitosan kích thước nano 27Chương 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, -2- 2222222E22E22EE2EE2222221222222122222xee 295.1 Kết luận - 522222 E22122121521221211211121121112112111211111121121012111112221112 21x re 29

VI

5.2 Đề nghị 2-2-2 Ss 21221221221212212211111111111111111111111211111121 11a, 29TÀI LIEU THAM KHẢO 22++2222++22EEEE+22EEEE2222E1112223111222111272112271EeeEEyee 30

VII

RSM Response Surface Methods

DLS Dynamic Light Scattering

Vill

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 3.1 Giới hạn khảo sát của các yếu tỐ + 2-52+©2222+22222E2EEEEEerxrrrrrrrrrer 15Bang 3.2 Thiết kế 29 nghiệm thức thí nghiệm theo mô hình BBD - 16Bảng 4.1 Thành phan Chitosan tổng hợp - 2-22 ©22222+222+22E22EE+22E+zzz+zzxze 19Bang 4.2 Kết quả đo kích thước viên bao -©22- 222222222E22E222E22E222222EzErzrxez 21Bảng 4.3 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố dến kích thước viên

Bang 4.4 Bảng đánh giá khác biệt ý nghĩa của thực nghiệm «2.0.0.0 eee 25

Bảng 4.5 Kết quả Kích thước và phân bố hạt 2- 2 222222SE22EZ2EE2EE22ZE222222zzz22 26Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm đo vòng kháng khuân 2-52 ©22222222222zz222 a

1X

Hình 3.3 Quy trình tạo viên bao Chitosan có kích thước nano - - s5 17

Hình 4.1 Chitosan tổng hợp 2- 252222222E22E22EE22E222122112212211221271221122121.22 2e 19Hình 4.2 Ảnh chụp FE — SEM của Chitosan 2-52 5S2S+SE+2E+£E£2E+2E2E2ZEz22z2ze2 19Hnh.3.5,PhốT TÍE.cũa Chitosan BÍ xuseeeiokeeieioniavdioidiD0Ecgg200k4458166)46000/10000036 410188 20Hình 4.4 Đồ thị 3D biéu diễn sự ảnh hưởng của 4 yếu tố đến kích thước viên bao nồng

độ Chitosan (A), nồng độ TPP (B), pH (C), tốc độ khuấy (D) - 2-2: 23Hình 4.5 Hình chụp FESEM của hat Chitosan ở độ phóng đại 50.0k 26

Hình 4.6 Đồ thị phân bố kích thước hạt 222 22S2+S2SE2E£2E££E£EE2E£E2E22EZEzzxze, Z7Hình 4.7 Khả năng kháng khuẩn của viên bao Chitosan 2- 2252222222252: 28

Vỏ nhộng là vật liệu được thải ra, trong quá trình sản xuất âu trùng ruồi lính đen, nó lànguồn vật liệu rất phù hợp đề sản xuất ra Chitosan.

Xu thế hiện nay các nhà khoa học trên thế giới đang nghiên cứu các chất có hoạttinh sinh học có nguồn gốc tự nhiên và từ đó cải biến dé tạo ra các chất có hoạt tính đượcnâng cao, một trong những trường hợp đó là Chitosan, một hợp chất deacetyl hóa từ

chitin, một polymer tự nhiên được tạo thành từ các đơn phân N-acetyl glucosamine, hiện

diện trong vỏ của các loài giáp xác, côn trùng và trong vách của tế bào nam Chitosanđược sử dụng làm nguyên liệu sinh hóa bởi những hoạt tính kháng khuẩn, giảmcholesterol, giảm huyết áp, kháng viêm, khang oxi hóa Ngoài ra, Chitosan là nguyênliệu rẻ tiền, dé phân hủy sinh học và tan trong một số acid hữu cơ với pH nhỏ hon 6.5

như acid formic, acetic, tartaric, citric.

Gan đây, hướng nghiên cứu sử dung hat Nanochitosan thay thế Chitosan được

quan tâm nhằm tăng cường và mở rộng hơn nữa tiềm năng ứng dụng của hợp chất này

cho các mục đích công nghệ sinh học và hóa học Do có kích thước siêu nhỏ nên hạt

nanoChitosan dé dang đi qua màng tế bao, ảnh hưởng đến các quá trình sinh hóa của visinh vật và ức chế khả năng phát triển của vi sinh vật

Dé tạo hạt Nanochitosan trên vật liệu cơ ban Chitosan, đề tai đã thực hiện chế tạo

bằng phương pháp tạo gel ion với tác nhân tạo liên kết ngang là sodium tripolyphophate(TPP) So với những chat tạo liên kết ngang hóa học như glutaraldehyde; glyoxal; 2,2-dimethoxy phenylacetophenone thi TPP là chất không có độc tính, ngoài ra nó còn làmột muối khá dé tan, kích thước nhỏ Từ những tinh chất đó, TPP được chọn làm tácnhân liên kết ngang trong tạo hạt đạng nano

Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu tạo hạt Nanochitosan bằng phương pháp tạo

gel ion với nhiêu kêt quả được ghi nhận Tuy nhiên, chưa có nhiêu công trình nghiên

cứu tông hợp quá trình tối ưu hóa dé tạo hạt Nanochitosan bằng phương pháp tạo gel

ion.

1.2 Muc tiéu nghién ciru

Mục dich của nghiên cứu nay là tìm ra điều kiện tối ưu để chế tạo hạtNanochitosan từ Chitosan RLĐ bên cạnh đó đánh giá tính kháng khuan và các tính chathóa ly của hat NanoChitosan được tao từ RLĐ dé tạo tiền dé cho các nghiên cứu chuyên

sâu hơn.

1.3 Nội dung thực hiện

- Khảo sát điều kiện tối ưu hóa tạo hạt Nanochitosan bằng phương pháp tao gel

Chương 2 TỎNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Chitosan

2.1.1 Khái niệm

Chitosan (CS) là một dẫn xuất phổ biến của chitin được tạo ra bởi phản ứng

deacetyl hóa Do đặc tính sinh hoc và hóa học đặc biệt của nó, Chitosan đã thu hút sự

chú ý rộng rãi đến các dự án nghiên cứu trên toàn thế giới và có thé được sử dụng trongnhiều ngành công nghiệp và các ứng dụng y sinh, từ phân phối thuốc và mỹ phẩm đếnchế biến thực phẩm và nông nghiệp

Chitosan là một polysaccharide an toàn, tương thích sinh học và có khả năng

phân hủy sinh hoc Chitosan là một chất đồng trùng hợp tuyến tính của B(1 — 4) với cácđơn vị N-acetyl glucosamine và glucosamine được phân bố ngẫu nhiên

Hình 2.1 Cong thức hóa học của chitin va Chitosan.

Chitin là loại polysaccharide phổ biến thứ hai trên trái đất sau cellulose Chitin

từ các động vật không xương sống ở biển như cua, nhuyễn thé, tôm hùm, và nam đãđược phân lập ở quy mô thương mại Các báo cáo gần đây trong tài liệu mở nhân mạnhcôn trùng là nguồn cung cấp chitin hữu hiệu Côn trùng chiếm 95% thế giới động vật và

do đó có thé là nguồn cung cấp chitin rất hứa hẹn (Liu và cộng sự, 2012) Được biết,

chitin chiếm tới 50% bộ xương ngoài của côn trùng Công nghệ mới trong nuôiRuồi lính đen (Hermetia illucens) ngày càng trở nên phổ biến trên toàn thế giới(Khayrova cộng sự, 2019) Hầu hết Chitosan thương mại đều có mức độ khử trung bình

khoảng 70% - 90% (Rodrigues và cộng sự, 2020).

2.1.2 Đặc tính của Chitosan

Chitosan có những tính chất cơ bản sau

« Tinh tan Chitosan không hoà tan trong nước và dung dich kiềm Chitosan làmột polysaccharide cơ bản có pKa khoảng 6,5 nên chỉ hòa tan trong điều kiện axit loãng

tạo nhanh một dung dịch keo có độ nhớt cao.

* Chitosan tác dụng với lod trong môi trường HaSO¿ cho phản ứng lên mau tim.

Day là phản ứng dùng trong phân tích định tinh Chitosan.

» Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một

polycationic (pH < 6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein,

aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm

amino (-NH¿) Chính tính chất này giúp cho Chitosan thé hiện được khả năng khángnam, kháng khuẩn cao của mình khi liên kết với phan mang điện tích âm trên thành thé

bao vi sinh vật.

* Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ

sinh học.

2.1.3 Chitosan từ vỏ nhộng RLD

Chitosan từ RLĐ có các đặc tính của CS thông thường Ngoài ra, nó còn có một

vài đặc điểm khác như cau trúc bề mặt của CS từ RLĐ có hình thái bề mặt nhan với cấutrúc không xốp và các đơn vị vi sợi lục giác lặp lại được tổ chức tốt giống như tô ong

Cấu trúc tinh thé của CS từ RLD có giá trị chỉ số tinh thé thấp hơn CS ở lớp biéu

bì ấu trùng bọ cánh cứng và nhộng tằm exuvia (Lin và cộng sự, 2021) Giá trị chỉ số tinhthé của Chitosan có cau trúc tinh thé thấp hơn sẽ ưu việt hơn khi sử dụng trong xử lynước thải dé loại bỏ các chất 6 nhiễm như ion kim loại nặng và thuốc nhuộm

2.1.4 Ung dụng của Chitosan

Chitosan, có nguồn gốc tự nhiên và không độc hại, được ưa chuộng ngày càngnhiều trong các ứng đụng bảo vệ và chăm sóc sản phẩm nông nghiệp

Trong lĩnh vực y tế, Chitosan có nhiều ứng dụng quan trọng như chất khángkhuẩn, lớp vỏ cho thuốc giải phóng có kiểm soát, cố định enzyme, và giảm cholesterol

trong mau (Iriunfo và cộng sự, 2022).

Trong công nghiệp thực phẩm, tính kháng nắm và kháng khuẩn của Chitosangiúp giảm lượng chất bảo quản trong thực phẩm tổng hợp Dẫn xuất N,O-

carboxymethylated Chitosan, có khả năng hòa tan trong nước, cũng được phát hiện có

4

hoạt tính kháng nam Chitosan không chi được sử dụng bên trong mà còn trở thành thànhphần chính của màng bọc thực phẩm hoặc lớp phủ thực phẩm, tăng cường khả năngkháng khuẩn và kháng nam.

Trong lĩnh vực công nghiệp giấy, Chitosan đóng vai trò quan trọng trong việctăng độ bền mà không làm giảm độ sáng của giấy và cải thiện tính chất chống điện từcủa giấy ảnh, giải quyết vấn đề ảnh hưởng của điện từ đối với chất lượng hình ảnh

Trong mỹ phẩm, Chitosan được ứng dụng làm chat tay trang do tính an toàn vàkhông độc hại, cũng như khả năng làm nhớt axit hữu cơ khi tiếp xúc, giúp dé dàng loại

bỏ chúng khỏi bề mặt

Trong lĩnh vực nông nghiệp, Chitosan được sử dụng làm lớp phủ bảo vệ hat, phân

bón giải phóng chậm, đồng thời cải thiện khả năng nảy mầm và độ âm đất, giảm nguy

cơ nhiễm nam và bệnh cho cây trồng, từ đó tăng sản lượng cây trồng (Triunfo và cộng

sự, 2022).

Trong xử lý nước thải, Chitosan được ứng dụng rộng rãi như một chất hấp phụcho các chat ô nhiễm trong nước thải Chitosan, với phần điện tích dương trong nước từcác nhóm chức -NH, có khả năng phá vỡ các phan tử thực phẩm, bao gồm hệ keo huyền

phù mang điện tích âm dựa trên protein và chất rắn lơ lửng, mà có thể được đông tụ

bằng Chitosan Điều này tạo ra khả năng thu gom và sử dụng Chitosan như một nguồnprotein cho thức ăn chăn nuôi Ngoài ra, Chitosan còn có khả năng loại bỏ thuốc nhuộm

anion khỏi nước thải từ quá trình dệt nhuộm ở pH acid thông qua việc tạo phức giữa

proton amine và các anion trong thuốc nhuộm

2.2 Sodium Tripolyphosphate

Sodium tripolyphosphate (TPP), là một hợp chất vô cơ có công thức hóa họcNasP3Ono, là muối natri của penta-anion polyphosphate, được sử dụng phổ biến trongnhiều loại sản phẩm tây rửa, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, quy trình làm sạch côngnghiệp và công nghiệp gốm sứ (Gurses và cộng sự, 2018)

Sodium tripolyphosphate được sản xuất bằng cách đun nóng hỗn hợp cân bằnghóa học của dinatri photphat (NazHPO¿) và natri photphat (NaHzPO¿) trong các điềukiện được kiểm soát cần thận (Greenwood và Earnshaw, 2001).

2Na›HPO + NaH›POa — NasP3O10 + 2H20

Từ năm 1947 cho đến cuối những năm 1980, TPP hầu như chỉ được sử dụng làmchất tạo phức (chất tạo phức) trong chất tây rửa vì tính đa chức năng của nó trong quátrình giặt và làm sạch TPP mang lại nhiều lợi ích, chẳng hạn như cô lập nước cứng cho

phép các chất hoạt động bề mặt hoạt động hiệu quả, đệm pH, nhũ hóa đất và ngăn ngừa

sự lắng đọng (Gurses vả cộng sự, 2018)

2.3 Phương pháp tạo hạt Nanochitosan

2.4 Giới thiệu về hat Nanochitosan

Hạt Nanochitosan( nanocapsule) (viên bao nano) là một hệ thống bao gồm lõidau hoặc lõi nước được bao quanh bởi mang polymer mỏng, có thé được điều chế bang

cả phương pháp trùng hợp và tông hợp bằng các polyme được tạo hình sẵn (Couvreur

và cộng sự, 2002) Một trong những đặc điểm cơ bản của viên bao có kích thước nano

là kích thước, thường được lấy là khoảng 5 và 10 nm với giới hạn kích thước khoảng

1000 nm, mặc dù phạm vi thường thu được là 100 và 500nm (Mora-Huertas cộng sự,

2010) Cau tạo của viên bao nano được thé hiện trong hình 2.3

Hình 2.2 Cấu tạo của viên bao Chitosan có kích thước nano

6

Trong những năm gần đây, công trình nghiên cứu đã cho thấy vai trò đặc biệt

quan trọng của vật liệu viên bao nano trong lĩnh vực y dược và nông nghiệp Sự sử dụng

vật liệu nano với vai trò đóng gói, sử dụng làm chất mang, giải phóng thuốc có kiểmsoát và nâng cao tính ôn định của thuốc (Chauhan và cộng sự, 2017), (González-Reza

và cộng sự, 2021) Ngoài ra, các viên bao Chitosan có kích thước nano còn được ứng dụng trong liệu pháp gen (Gaspar va cộng sự, 2011).

Việc sử dụng viên bao nano không chỉ mang lại hiệu quả trong lĩnh vực y dược

mà còn trong lĩnh vực nông nghiệp Ở khía cạnh nổi bật nhất của những phát triển gầnđây, Chitosan đã được sử dụng lam chất bao gói cho các hợp chất thực vật có hoạt tínhsinh học và hóa chất nông nghiệp bằng các công nghệ khác nhau, chang hạn như sấyphun và nhũ tương nano, dé tăng cường hoạt động kháng khuẩn (Mujtaba và cộng sự,

2020).

2.4.1 Các phương pháp phổ biến

Hiện nay, có nhiều phương pháp tạo viên bao Chitosan có kích thước nano Cócác phương pháp phô biến như sau phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking); phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion-droplet coalescence); khuếch

tán dung môi nhũ tương (emulsion solvent diffusion); phương pháp tạo gel ion (ionic

gelation) (Iyyakkannu và cộng sự, 2021).

Nhũ tương là một hệ thống pha phân tán và pha liên tục là các chất lỏng không

hòa tan hoặc hòa tan một phần với nhau, được thé hiện rõ trong hình 2.4 Trong hầu hết

các hệ nhũ tương, một pha thường là nước và pha còn lại thường là dầu, do đó, có thể

phân nhũ tương thành 2 loại.

- Pha nước phân tán trong pha dau nhũ tương nước trong dau (W/O)

- Pha dầu phân tán trong pha nước nhũ tương dau trong nước (O/W)

2.4.2 Phương phap tạo gel ionic

Kỹ thuật tạo gel ion về cơ bản dựa trên sự tương tác ion giữa các nhóm amino

tích điện dương của Chitosan và các nhóm tích điện âm của polyanion Polyanion nay

thường được gọi là chất liên kết ngang Các chất liên kết ngang khác nhau đã được sửdụng, trong đó có natri tripolyphosphate (TPP).

CS và TPP có thể coi là cặp ion đối kháng “huyền thoại” trong phương pháp tạogel ion bởi tính phô biến của chúng trong các nghiên cứu do độc tính của polyphosphate

rất thấp và được báo cáo là không gây đột biến hoặc gây ung thư (Kulakovskaya và cộng

sự., 2012) (Nagpal và cộng sự, 2013).

Thông thường, các cation và polyanion lần lượt được giải phóng khi hòa tan CS

và TPP trong axit axetic và nước cất Khi TPP nhỏ giọt vào dung dịch CS, polyanion(điện tích âm) liên kết với nhóm amino (điện tích dương) bằng tương tác tĩnh điện, khiến

CS trải qua quá trình ion hóa gel, dẫn đến hình thành các hạt nano (Hoang và ctv, 2022)

Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa Chitosan tích điện

dương và một polyanion như TPP Lúc nay các nhóm -NH: của Chitosan sẽ liên kết vớinhóm H3P30107 của TPP và nhờ đó các hạt nano Chitosan được hình thành Đầu tiên

Chitosan được hòa tan vào dung dịch acid acetic Sau đó Chitosan được trộn lẫn với

polyanion dé tạo hạt nanoChitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục ở nhiệt độ phòng.

Kích thước và điện tích bề mặt phụ thuộc vào tỷ lệ Chitosan va polyanion, pH, và loại

polyanion khác nhau.

OH OH i

O - exe HO

Hình 2.3 Sơ đồ biểu diễn CS liên kết ngang ion với TPP

Phương pháp này có ưu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản, chi phí thấp, dé thựchiện, viên bao nano có kích thước hạt nhỏ, phân bé kích thước đồng đều và điện thế hạtnano cao Đây cũng là phương pháp thường được lựa chọn phổ biến cho các nghiên cứu

ứng dụng viên bao Chitosan có kích thước nano Và cũng là phương pháp được lựa chon

trong bài khóa luận này.

2.5 Giới thiệu về Phương pháp Bề mặt đáp ứng (RSM)

Phương pháp Bè mặt đáp ứng (RSM) là một kỹ thuật thống kê sử dụng dữ liệuđịnh lượng từ các thí nghiệm đề xác định và giải thích nhiều biến của một phương trình.RSM tìm kiếm mối quan hệ giữa các biến và giải thích một hoặc nhiều biến phản ứng

Phương pháp này được giới thiệu bởi GEP Box và KB Wilson vào năm 1951 sử dụng

chuỗi thí nghiệm được thiết kế dé đạt được một phản ứng tối ưu Dé đạt được điều này,

Box và Wilson đã áp dụng một mô hình đa thức bậc hai Mặc dù mô hình này chỉ gần

đúng nhưng lại dé dàng triển khai

2.5.1 Nguyên tắc

Trong tình huống tổng quát, RSM được biết đến như bề mặt đáp ứng, đại diện

cho hình học của hàm mục tiêu của một quá trình vật lý trong không gian - thời gian tự

nhiên đối với các biến kích thích

Hàm mục tiêu Y (Đặc điểm đang được nghiên cứu) là kết quả của sự biến đổi củacác biến đầu vào theo một chức năng đáp ứng rõ rang Sự thay đối giá tri của các biếnđầu vào sẽ dan đến sự biến đổi của chức năng của các biến kích thích, xác định các giaiđoạn quan sát và tính toán sai số

Những biến đầu vào X (i=1 n, còn được gọi là các biến cơ bản) được đặc trưngbởi một loạt thông tin thống kê (phân phối độc lập hoặc tương quan, chuẩn hóa cơhội, ) Trong trường hợp tổng quát, các biến Xj là các biến thay đổi theo không gian va

thời gian.

Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thí nghiệm được sử dụng để thực hiện tối

ưu hóa thông qua phương pháp quy hoạch mô hình Box-Behnken Số lượng thí nghiệmcần thực hiện theo phương pháp bề mặt đáp ứng được tính theo công thức

Với.

N=2kŒ—1)+ne Nla số thi nghiệm

k là sô yêu tô ảnh hưởng

no là số thí nghiệm ở trung tâm

Phân tích thống kê cho thấy rằng mô hình thống kê biểu điễn sự phụ thuộc củahàm mục tiêu Y vào các điều kiện ảnh hưởng được mã hóa là một phương trình đa thức

Y= Bo +) BX + > Bu XX) + > Bux?

Y Ham muc tiéu - Du doan

Bo: Ba hệ số hồi quy bậc 0

bậc hai có dạng.

Trong đó.

X¡: Nhân tố độc lập thứ i anh hưởng đến hàm mục tiêu Y

B;: Hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố Xj đến hàm mục tiêu YØ,¡: Hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng của yếu tố Xi tới Y

Bij: Hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời của Xi va Xj đối với YSau khi thực hiện N thí nghiệm, tiến hành xử lý thống kê bằng phần mềm RSM.Giá trị p của mô hình với p < 0,05 thể hiện mô hình đã chọn có ý nghĩa và phù hợp khithực hiện thí nghiệm, và chỉ số Adeq Precision lớn hơn 4 là cần thiết (Zabeti và cộng

sự, 2009) Đồng thời, đánh gia sự không tương thích của mô hình (Lack of Fit) được

xác định bởi giá trị p > 0,05.

Sau đó thu được mô hình hồi quy đa chiều mô tả mối quan hệ giữa các biến độclập và hàm mục tiêu Mô hình được đánh giá tốt khi hệ số xác định hệ quả R? lớn hơn0,8 Khi xác định mô hình đã chọn có ý nghĩa và phù hop, tiến hành thí nghiệm dé kiểmtra Nếu kết quả thí nghiệm phù hợp với dự đoán, từ đó đưa ra điều kiện tôi ưu của thí

nghiệm.

2.5.2 Công dụng của RSM

Công dụng của RSM bao gồm việc xác định mức yếu tố làm thỏa mãn đồng thờicác thông số kỹ thuật mong muốn, kết hợp tối ưu hóa cho các yếu tô dé đạt được kết quamong muốn và mô tả kết quả tối ưu Nó cung cấp thông tin về đặc tính khi chúng bị ảnhhưởng bởi những biến đổi của các yếu tố vượt quá mức quan tâm Mô hình phổ biến củaRSM là thiết kế Box-Behnken

10

2.6 Các nghiên cứu về viên bao Chitosan có kích thước nano (hạt Nanochitosan)Trong nghiên cứu của (L.H.Chuah và ctv, 2011), tác giả đã chế tạo thành cônghạt Nanochitosan tông hợp bằng phương pháp tạo gel ion có dạng hình cầu và kích thước

thu được là 340 nm (+ 4,5 nm) Tang và cộng sự (2006), ghi nhận được các hạt nano có

kích thước 50 — 80 nm, tác giả cho rằng trọng lượng phân tử của Chitosan ảnh hưởngđến đường kính của hạt nano tạo thành Chitosan có trọng lượng phân tử lớn làm gia

tăng đường kính hạt hoặc kết tụ Còn trong báo cáo của Lê Hồ Khánh Hy va ctv (2015),

các hạt Nanochitosan có kích thước tương đối nhỏ 12 nm tập hợp thành các khối có kích

thước lớn hơn khoảng 61 — 62 nm.

1]

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tai được thực hiện từ tháng 3 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023 tại phòng Độcchất học Môi trường (RIBE 106) và phòng Phân tích đất và phân bón (RIBE 104), thuộcViện Công Nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Dai học Nông Lâm thành phó Hồ Chí

Minh.

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng là vỏ nhộng Ruồi lính đen được thu nhận từ khu thực nghiệm Black

Solder Fly Project RIBE - CJ KOREA, thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và

Môi trường, Trường Dai học Nông Lam TP HCM.

Hình 3.1 Vỏ nhộng Rudi lính đen và vỏ nhộng Rudi lính đen đã qua xử lý

3.2.2 Vĩ khuẩn thử nghiệm

Sinh khối vi khuẩn: Streptococcus agalactiae được cung cấp bởi phòng thinghiệm Bệnh học Thủy Sản, khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

12

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Điều chế Chitosan từ vỏ nhộng Rudi lính den

Chitosan được tổng hợp theo phương pháp hóa học (Nguyễn Ngọc Hà và ctv,2022) Vỏ được xử lý bằng cách rửa sạch, dé ráo nước, trang qua nước cat và say khô ở

60°C sau đó xay nhỏ Thủy phân bằng NaOH 5% trong 4 giờ ở 90°C, rửa mẫu về pH

trung tính và sấy khô Sau đó khử khoáng bằng HCI 4% trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng,rửa mẫu về pH trung tính va say khô Khử màu bằng KMnO¿ 1% trong 1 giờ ở nhiệt độphòng và acid oxalic 4% trong 1 giờ ở 60°C Tiến hành thủy phân bằng NaOH 70%trong 8 giờ ở 80°C, rửa mẫu về pH trung tính và say khô dé được thành phẩm là Chitosan.Nghién nhỏ Chitosan và lọc qua lưới 120 mesh (gan bằng 1mm) Sơ đồ quy trình điềuchế Chitosan từ vỏ nhộng RLD được thé hiện trong hình 3.2

13

Vỏ nhộng đã qua xử lý

3.3.2 Khảo sát các điều kiện tối ưu tạo viên bao kích thước nano

Thí nghiệm được bồ trí như sau:

Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được lựa chon dé ước tính tác độngcủa các yếu tố đầu vào đối với hàm mục tiêu và đánh giá kết quả thực nghiệm Bốn yếu

tố cụ thé là nồng độ CS (mg/ml) (X1); nồng độ TPP (mg/ml) (X2); Ph (X3); tốc độ khuấy(rpm) (X4) với hàm mục tiêu là kích thước hat (nm) bang cách sử dụng quy hoạch trực

giao đối xứng, mỗi yếu tố tiến hành tại 3 mức (-1, 0, +1).

Giới hạn thực nghiệm và mức độ mã hóa được thể hiện trong Bảng 4.2 Danhsách 29 thí nghiệm gồm 24 thí nghiệm thừa số và 5 thí nghiệm ở tâm được trình bày cụthể tại Bảng 4.3 Công thức tính số nghiệm thức

N=2k(k~ 1)+C

Trong đó: klà số yếu tổ khảo sát

Co là số nghiệm thức ở tâmBang 3.1 Giới hạn khảo sát của các yếu tố

Câp mã hóa

Yếu tố Kí hiệu

-1 1Nong độ Chitosan (mg/ml) XI 0,35 0,9

Nông độ TPP (mg/ml) X› 0,3 0,8

pH dung dich X3 4 6

Tốc độ khuấy (rpm) Xi 500 1500

15

Bảng 3.2 Thiết kế 29 nghiệm thức thí nghiệm theo mô hình BBD.

Nghiém thie NôngđộCS NôngđộTPP pH Tốc độ khuấy

Hàm mục tiêu là một phương trình hồi quy bậc 2 được thể hiện như sau.

Bi, Bi, Bij là các hệ số tuyến tính bậc hai và là các giá trị độc lập

3.3.3 Tổng hợp viên bao Chitosan có kích thước nano bằng phương pháp tạo gel ion

Các hạt nano được điều chế bằng phương pháp tạo gel ion theo (Tang và cộng

sự, 2007) Hòa tan Chitosan trong dung dịch 2,0% (v/v) acid acetic Sau đó, nhỏ giọt từ

từ 20 ml dung dich sodium tripolyphosphate vào 40 ml dung dịch trước đó trong 40

phút Dung dịch xuất hiện huyền phù màu trắng đục

CH:COOH

Nhỏ từ từ

TTP

Dung dich vién bao

Hình 3.3 Quy trình tạo viên bao Chitosan có kích thước nano.

3.3.4 Tiến hành thí nghiệm kiểm chứng

Tiến hành kiểm tra tính đúng đắn của mô hình tối ưu, tiến hành thí nghiệm kiểmchứng tại điểm tối ưu mô hình đưa ra với các thông số tối ưu, thí nghiệm lặp lại 10 lần

3.3.5 Phương pháp phân tích các đặc tính lý, hóa của viên bao Chitosan có kích thước

nano tong hợp

Xác định hình dang hat nano CS bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử quét

FESEM Hitachi SU — 8010 tại Viện Công nghệ Nano TP HCM.

17

Đường kính hạt và độ phân tán của hạt được đo bằng máy phân tích kích thướchạt DLS Horiba SZ — 100V2 tại Trung tâm Phân tích Quốc tế — Trường ĐH

Công Thương TP HCM.

3.3.6 Thứ nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cia viên bao Chitosan có kích thước nano

Mục đích khảo sát là đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của viên bao Chitosan

có kích thước nano bằng phương pháp khuếch tán trong môi trường rắn Khả năng khángkhuẩn của mẫu thử được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩnthé hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn trên dia petri

Tiến hành: Cay trang vi khuẩn trên bề mặt môi trường thạch TSA (350 uL dịch

vi khuẩn ở nồng độ 10° (gần bằng 5 x 105 CFU/mL), sau đó đĩa thạch được dé khô 15phút Tiến hành đục các lỗ đường kính 6 mm, sử dụng 40 ul dich thử cho mỗi lỗ Đốichứng dương được sử dung là Penicillin, đối chứng âm là acid acetic 2% U đĩa thạchtrong tủ ấm ở 35 - 37°C Đọc kết quả sau 24 giờ

Đọc và ghi nhận kết qua: Mẫu thử có tác động kháng khuẩn cho vòng ức chếxung quanh giếng chứa mau thử Kích thước vòng kháng khuan = D - 6 (D là đườngkính vòng kháng khuẩn, đơn vị milimet) Dựa vào đường kính vòng vô khuan dé xácđịnh khả năng kháng khuẩn của các dung dịch (Faikoh và cộng sự, 2014)

Chương 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Chitosan tổng hợp bằng phương pháp hóa học

Bảng 4.1 Thanh phan Chitosan tông hợp

Chỉ tiêu CS - RLĐ

Hàm lượng tro (%) 0,03 + 0,01 Hàm lượng protein (%) 0,29 + 0,01

giá thông qua các chỉ tiêu hàm lượng tro; hàm lượng protein; độ deacetyl; độ nhót; khối

lượng phân tử (kDa).

Hình 4.2 Ảnh chụp FE — SEM của Chitosan

(Hình a: độ phóng đại 1000x và Hình b: độ phóng đại 500x).

19