Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chiết xuất chitin-chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen (Hermetia illucens) bằng phương pháp sinh học

TÓM TẮTNghiên cứu này được tiến hành nhằm tạo ra chitin và chitosan từ vỏ nhộng ruôi lính đen Hermetia illucens bằng phương pháp sinh học với thiết kế thử nghiệm Box-Behnken dé tối ưu hó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NGHIÊN CỨU CHIET XUẤT CHITIN-CHITOSAN

TU VO NHONG RUOI LÍNH DEN (Hermetia illucens)

BANG PHUONG PHAP SINH HOC

Nganh hoc : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện =: LÊ QUANG TRUONG

Mã số sinh viên : 19126208

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CHIET XUÁT CHITIN-CHITOSAN

TU AU TRÙNG RUOI LÍNH ĐEN (Hermefia illucens)

BANG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS NGUYÊN NGỌC HÀ LÊ QUANG TRƯỜNG

TP Thủ Đức, 03/2023

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Trường Đại học

Nông Lâm TP.HCM đến nay, em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Khoa học Sinh học đã luôn

tạo điều kiện thuận lợi để em học tập rèn luyện kỹ năng, tận tâm truyền đạt kiến thức vàkinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Ngọc Hà đã tậntình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm và đưa ra những lời khuyên bổích giúp em giải quyết các van đề gặp phải trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tai

Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Thùy Dung và chị Thái Thị Thanh Thủy

đã nhiệt tình chỉ dạy em những kiến thức, kỹ năng phòng thí nghiệm, cảm ơn 2 chị đã luônđồng hành, ủng hộ và cổ vũ em Xin cảm ơn các bạn K19 cùng tập thé phòng Độc chat họcMôi trường đã luôn đoàn kết, yêu thương và giúp đỡ nhau trong suốt quá trình thực hiện đề

tải.

Và đặc biệt con xin cảm ơn gia đình, cảm on ba me, chị hai đã luôn tin tưởng, yêu

thương va ủng hộ những lựa chọn của con, luôn tạo cho con điều kiện tốt nhất dé học tập

và phát triển bản thân Gia đình là động lực dé con phan đấu, là chỗ dựa tinh thần mỗi khi

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên là Lê Quang Trường, MSSV: 19126208, lớp: DH19SM (số đi động:

0368979370, email: 19126208(2sthemuafedu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh học,

trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, xin cam đoan: Đây là khóa luận do bản thân tôi trực

tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Ngọc Hà trong khuôn khô đề tài cấp cơ

sở MS: CS — CB22 — Vien CNSH - 02 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàntoan trung thực khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng về nhữngcam kết này

Tp Hồ Chí Minh ngày thang năm 2024

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

Lê Quang Trường

il

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm tạo ra chitin và chitosan từ vỏ nhộng ruôi lính

đen (Hermetia illucens) bằng phương pháp sinh học với thiết kế thử nghiệm Box-Behnken

dé tối ưu hóa các điều kiện của các quá trình khử protein, khử khoáng và khử deacetyl.Điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein vỏ nhộng ruồi lính den bang enzyme Alcalase

với các yếu tố khảo sát như: tỷ lệ enzyme/co chất là 2% (w/v); tỷ lệ cơ chat/dung dich là1:17,5 (w/v); nhiệt độ là 57,5 °C; thời gian là 4 giờ; pH là 7,25 Điều kiện tối ưu cho quátrình khử khoáng bằng axit lactic VỚI các yếu tố khảo sát như: tỷ lệ mẫu/axit là 1:4,5 (w/v);thời gian là 2,65 giờ; nồng độ axit lactic là 6% Điều kiện tối ưu cho quá trình khử deacetylbằng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens với các yêu tô khảo sát như: pH là 6,37; thời gian

là 1,9 ngày; nhiệt độ là 37,6 °C Chitin được tạo ra có hàm lượng protein là 37,26%; hamlượng khoáng là 1,27% và hiệu suất tạo chitin là 63,21% Hiệu suất tạo chitosan của nghiêncứu là 2,02%.

Từ khóa: ruồi lính den, chitin, chitosan, enzyme Alcalase, axit lactic, Bacillusamyloliquefaciens.

11

This study was conducted to extract chitin and chitosan from black soldier fly cocoons (Hermetia illucens) using biological methods with a Box-Behnken experimental design to optimize the conditions of the deproteinization, demineralization and deacetylation processes Optimal conditions for the deproteinization of black soldier fly cocoons using

Alcalase enzyme with investigation factors such as: enzyme/substrate ratio is 2% (w/w),

substrate/solution ratio is 1:17,5 (w/v); temperature is 57,5°C; time is 4 hours; pH 1s 7,25 Optimal conditions for the demineralization process using lactic acid with investigation factors such as: substrate/acid is 1:4,5 (w/v); time is 2,65 hours; lactic acid concentration 1s

6 % Optimal conditions for the deacetylation process using Bacillus amyloliquefaciens

with investigation factors such as: pH is 6,37; time is 1,9 days; temperature 1s 37,6°C Chitin produced has 37,26% protein; 1,27% mineral and chitin production efficiency is 63,21% The chitosan production efficiency of the study is 2,02%.

Key words: black soldier fly, chitin, chitosan, enzyme Alcalase, lactic acid, Bacillus

amyloliquefacens.

IV

MỤC LỤC

Trang

a i

XÁC NHAN VA CAM ĐOAN - 2 5+ 12 12212112112112111211211211111 11212222211 12k ii

TOM TAT Ú iii

1 ——————— ——=—=———=—— 1V MUG LUC scencesaen cena VDANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TẮTT -5222+222+++22E++tEEEttrtEkrrrrkrrrtrrrrrrrrrrek viii

ERAGE CAS ĐỊT HUẾ cneeeniernercrenrenicsnaseuninonesnianiniantirianstientatinenneshitindieainnsasntinnass ixTHANH SÁEH GAC BUN enssnannennnanconisiennnamanumannaiataumnneneasia’ x01115008)/9527 00005 Ắ.- ẢẢ |1.1 Đặt vấn đề 5-52 s22 2 22122121211212112111211112111121111212121111211210121112012 112112 |

1ð Nho fiÊu đi BÀ ee een 21.3 N61 dung thurc 0 '"”'.” 2

Chương 2: TONG QUAN TÀI LIỆU 2 22222SE+EE+2E2E22EE2EE2EE2EE22E22E222222222222222Xe2 3

ph? 1n 8.6.7 8 Ô.ÔỀ

2.2.1 Cau trúc hóa học và nguồn gốc của chitin - 2222 ©2222222222E2£Ez£E22222+22zzzzcrxez 43.32 Câu trúc hỏa lược và tính chất của chitosan cccsssccsvsciesusscsnssnssveassassvesiesevvnasensssssseuvnes 52.2.3 Ứng dụng của Chitin va Chitosan 0 cccccccccccssesssessessessessesseessessessessessessesesesseeneeees 72.3 Các phương pháp chiết xuất Chitin-Chitosan 0 0.ccccccccccsesscsssessessessesseestestessessesseeees 82.3.1 Một số quy trình chiết xuất Chitin-Chitosam 0.00.cccccccccsessesseessessesseeseeseeetseteesee 102.3.2 Chiết xuất Chitin va Chitosan bằng phương pháp sinh học - 13

L6 MEN UG a (Gai caaGiGGkiSGloaoicdsecuesi 13 2.3.2.3 Qua trinh Deacety] ha oo cece cee ceecceecceecceeseeeseeeneecceeeseecscecnaeeeaceeseeesseeeneeenseeees 14 2.3.2.4 Enzyme Chitin Deacetylase (CÁ ¡các con 006 104024018 1á xá seuneueataaterens 152.3.2.5 Vi khuân Bacillus amyÏoliqweƒf4CieH -2-52-5222222222222222222232232222222222222e+ 16

2.4 Phương pháp bề mặt đáp ứng (R.SM)) 2-22©22222E++2E++EEE2EEErEEErrrrrrrrrrrrree 17

Chương 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 2 2222 222SE+EE2EE2E2E2EzEE2EzzEzzxzed 193.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 2 2¿ 2+222SE2SE22E22E22E225122122122122122122212122 xe 19

°inW) o6 193.1.2 Địa điỄm ccccocccensnicHiEg H2 g H5 0 00 g4 ga GáUH0 GEN GH HA 0 20048000 G1013 210001803513000102000G5010480.G 1905a, Ki LỆ Ni ĐINH Ví Nữ | H59400i3ớiG3ã01gã8040ữ/884lUG00808gÌS60/0)88 4ã 19

ee 19

Se | 20

3.2.1.2 DUM CU 20

52D, PAV ai vi Wik CATE A Si 02 ẽ apie taceindiaarencaitete 20

3.3, Phương pháp thực BIỂN ssueseadeaddnngiinddateiaete@i00250018100001A8000345003001339983910000886310138/80038 20

3.3.1 Tối ưu hóa quá trình khử protein vỏ nhộng RLĐ bang enzyme Alcalase 2,4 L 203.3.1.1 Chuan bị mẫu và xác định các thành phần dinh dưỡng của nền mẫu ban dau 203.3.1.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein vỏDOs KL bang SHAS 2Ã lG8|4RG 2 Al oscwsicecacnsanecuennsoncssanecinasnisinncnscuanneumen inevonanancantntainnta 203.3.2 Tối wu cho quá trình khử khoáng vỏ nhộng RLĐ bang axit lactic 223.3.3 Tối ưu hóa quá trình chuyền chitin thành chitosan bằng phương pháp sinh hoc 233.3.3.1 Thiết kế thí nghiệm khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình khử deacetyl chitin0ì0⁄901106150:3520001555 2

3.3.3.2 Dinh tinh 06.9 07 -av 25 3,4,1 hương phán a I eeeeessessesoekidieeiglAsta6glEinigi<ig00si40ueS83.1008500061-48003000056/185310/400580-0,LE 26

3.5 Phương pháp xử lý số liệu -2-2¿©222222222E12EE22E2E231231221221221712121.221 22c xe a7Chương 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2 222222E22222E22222212212212322222222222 xe 29

4.1 Tối ưu hóa quá trình khử protein vỏ nhộng ruồi lính đen 2 222522552 294.1.1 Thành phần hóa học của vỏ nhộng ruồi lính đen -2- 2222225222252 294.1.2 Tối ưu các điều kiện cho quá trình khử protein bang enzyme Alcalase 2,4L 30

4.2 Tối ưu hóa quá trình khử khoáng bằng axit lactic 2-2 222222222222z2zzzzzzzz2 35

4.3 Đặc điểm ly hóa của Chitin 2.0 cece ecceccseesesseeseesseseeesessesseeseessssesseesessesseesesseeseeesees 42

4.3.1 Độ tinh khiết va cấu trúc hóa hOC oe eeeecceesessesessesessesesseseceesesessssesesesesesseseeseeeeseeees 424.3.2 Cầu trúc be mặt c c6 SSS2210111011020010101 1111010000101 1610601100101 L01500100011 146 444.4 Chuyén hóa chitin thành chitosan bằng phương pháp sinh học - 454.4.1 Tối ưu các điều kiện cho quá trình khử deacetyl bằng vi khuẩn Bacillus

TURRET THÍ GHIDNNE rnin ican ole ein mre lah a eam aero 454.4.2 Kết qua kiểm tra thực nghiệm - 2 222+2E2SE£2EEEE2EE2EE2EEEEEEEEZEZESErrrrrree 50

AAS Dink THAW GHHIOSHTirseeseensiesneirtoooiosahepolientosstsseHiÃgtSai424SSESSSASSESG0SAXEG-4SIS2I4G01g0iSuS0lggfSpiee 52

Chương 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 2 2+22+2E+2E22E22212E12212212122222222222 xe 54

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

RLĐ : Ruồi lính đen

NADG : N- acetyl-D-glucosamine CHS : Chitosan

DP : Hiệu suất khử protein

DA : Hiệu suất khử khoángCDA : Chitin Deacetylase

DD : Hiệu suất thu hồi chitosanw/w : weight/weight

wiv : weight/volume

Vill

DANH SÁCH CAC BANG

TrangBang 2.1 So sánh các phương pháp chiết xuất chitin-chitosan -©22© 2222 5s22522 9

Bang 3.1 Pham vi các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình khử protein 22

Bang 3.2 Pham vi các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình khử khoáng - 23Bang 3.3 Phạm vi các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình khử deacetyl 24Bảng 4.1 Thành phan vỏ nhộng RLĐ - 22-222 22222S22EE22E222E225222322222212221223222xee 20Bang 4.2 Kết qua quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box-Behnken cho quá trình khửTDLEOLGIeseeobexeiesg soEtirittrgig8M24603100k66ig8080o83/56o5860700SnMãc2Zgi06đ182i:334068idc0rS/1UB404802580Em12n2Htokergiibiticast2540c3i081đ255811/2A0-Đ18 30Bang 4.3 Kết qua ANOVA ảnh hưởng của các yếu tô đến hiệu suất khử protein 32Bảng 4.4 Hiệu suất khử protein lý thuyết và thực nghiệm 2- 2 525225522 34Bảng 4.5 Kết quả quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box-Behnken cho quá trình khử

00101115 36Bảng 4.6 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất khử

[s10 11 37Bang 4.7 Hiệu suất khử khoáng lý thuyết và thực nghiệm -2- 22 22 5z5522- 40Bảng 4.8 Chất lượng chitin sau quá trình khử mau (chitin thành phẩm) 4]Bang 4.9 Kết quả quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box-Behnken cho quá trình khửEHGGIV gu bg ng án in B005 eee ee ee ee ee eee 46Bảng 4.10 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yêu tố đến hiệu suất thu hồi

BI eA I sc ez eB A A Egil i ae ON uum ona norm 47Bang 4.11 Hiệu suất thu hồi chitosan lý thuyết và thực nghiệm -2- 52522 50Bảng 4.12 Hiệu suất tạo chitin-chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính den bằng phương pháp sinh

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Ni 1 ni vanguaGG a gc i i Sel 3

Ha 22 VOUS thối GỮA LCG HOT oasuaosaaksesiiidiiiidiniduiQudadiidiuiihsiilnGiindgdiud9800.3ud63,45 3

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học phân tử chitin 0 0.0.cc.cccccccecesscssesseseseesessesseseseseessesseseseeeeaees 4

Hình 2.4 Sự sắp xếp của chuỗi chitin: a-chitin, B-chitin, y-chitin -2-22-5552 5

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của chitOSan 2-5 s+SEE+E2E£EE£EEEE2EEEEEEEEE2E212121 22x cxe2 6Hình 2.6 Quy trình chiết xuất chitin từ ấu trùng RLĐ 2 22©222222252222z22xze2 10Hình 2.7 Quy trình chiết xuất chitin-chitosan từ ấu trùng RLD bang hai phương pháp:

Iya hơn võ Ine sinh: Biết THÊ nano BaooiidioivGtaMESSBGIGGISES40406021004/G:00601G0230575)40I805G001G0 05024003030 11

Hình 2.8 Quy trình chiết xuất chitin-chitosan từ vỏ nhộng ruôi lính den bằng phương

KH 04 THEE naaaeintstrgtaGrriogiGDDG81S0DN10000001900g03008500g)40BSSI0DRIS0fQySt8g0Mi40:08080d52040800d3i-1 EN |Hình 2.9 Khuan lạc Bacillus amyloliquefaciens trên môi trường LB - 16Hình 3.1 Vỏ nhộng RLD thu nhận tại nhà nuôi ruồ - 2 2 22222E2£E22£22z222zzzzx2 20

Hình 3.2 Phương pháp thu hồi chitosan 22 2 2222S22E22EE22EE2EE2EE2ZEE2EErzErzrrrzred 26Hình 4.1 Đồ thị 3D biểu diễn sự ảnh hưởng của 3 yếu tố đến quá trình khử protein 33Hình 4.2 Đồ thị 3D biểu diễn sự ảnh hưởng của 3 yếu tố đến hiệu suất khử khoáng 38

Hình 4.3 Su thay đôi màu sac qua các giai đoạn (vỏ ban dau, vỏ sau khử protein, vỏ saukhi khoáng, chitin thành Phat) c»eseeesesreeoeoentioisS0i0D14400720x150001600000046590010012150160g0 67G 42Hình 4.4 Phố hồng ngoại FTIR của chitin 22 222S22S+2E+2E22E22EE2EE22E22E22222222222222e 43Hình 4.5 Hình ảnh chụp SEM cua chitin ở độ phóng đại 500x -5- 45Hình 4.6 Đồ thị 3D biểu diễn ảnh hưởng của 3 yếu tố đến hiệu suất thu hồi chitosan 48Hình 4.7 Màu sắc của chitoan -+-5222222+222+t22 E2 reo 52Hình 4.8 Kết quả định tính chitosan bằng phương pháp thử Lugol/HaSO/ 53

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chitin là polysaccharide đứng thứ hai về mức độ phong phú trong tự nhiên trên trái

đất chỉ sau cellulose, nhưng khả năng ứng dụng của nó bị hạn chế do độ kết tỉnh cao và độ

hòa tan thấp Chitin có thể được chuyền đổi thành các dẫn xuất với các đặc tính được cảithiện, chang hạn như chitosan (CHS), chitooligosaccharide (COS) và N-acetylglucosamine(GlcNAc) Trong đó, chitosan là một dẫn xuất phố biến của chitin được tạo ra bằng phản

ứng khử oxy hóa Do đặc tính sinh học và hóa học đặc biệt của nó, chitosan đã thu hút sựchú ý của nhiều dự án nghiên cứu trên toàn thế giới Chitosan có thể được ứng dụng trongnhiều lĩnh vực như: công nghiệp, y sinh, từ phân phối thuốc và mỹ phẩm đến chế biến thựcphẩm và nông nghiệp, khả năng tạo mang, tao gel, tính phân giải cham, tính kháng oxy hóa,kháng nam, kháng khuẩn Chitin — chitosan thường có nguồn gốc từ động vật giáp xác nhưtôm, cua, ghe và một số loài nam, lớp biểu bì của, vỏ của một số loài côn trùng Hiện nayviệc sử dụng côn trùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất chitin-chitosan đang được quan

tâm Rudi lính đen ngày càng được nuôi phô biến và nghiên cứu nhờ vào tính ứng dung của

nó, vỏ nhộng ruồi lính đen được xem là phế phẩm trong quá trình nuôi nhưng đây đượcxem là nguồn nguyên liệu mới và đồi dào dé chiết xuất chitin-chitosan Quy trình sản xuấtcông nghiệp chitin-chitosan chủ yếu bằng phương pháp hóa học bao gồm việc loại bỏcacbonat canxi, protein bằng các bước khử khoáng và khử protein tương ứng Thông

thường, xử lý hóa học cung cấp chitin va chitosan tinh khiết, nhưng nó tạo ra khối lượng

lớn chất thải do nồng độ hóa chất được sử dụng cao

Việc chiết xuất chitosan ở Việt Nam chủ yếu bằng phương pháp hóa học, điều đó gây

một áp lực lớn cho môi trường Bên cạnh đó hiện nay ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu

nao công bố về chiết xuất chitosan 6 Ruồi lính den, đặc biệt bằng phương pháp sinh học

Từ những thực tế trên cho thấy đây là hướng nghiên cứu tiềm năng cần được quan tâmnhiều hơn và đó cũng là lý do đề tài “Nghiên cứu chiết xuất Chitin-chitosan từ vỏ nhộngruôi lính đen (Hermetia illucens) bằng phương pháp sinh học” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Xây dựng được quy trình chiết xuất chitin - chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính den bang

phương pháp sinh học.

1.3 Nội dung thực hiện

Khử protein vỏ nhộng ruồi lính đen bang enzyme Alcalase

Khử khoáng vỏ nhộng ruôi lính den bằng axit lactic

Chuyên hóa chitin thành chitosan bang vi khuan Bacillus amyloliquefaciens

Chương 2: TÔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Đặc diém của Ruôi lính den

Ruồi lính đen trưởng thành có mau đen, dài 12 — 20 mm, trông hình dạng dé lẫn lộn

với loài ong; có vòng đời khoảng hon 1 tháng, bat đầu từ trứng, ấu trùng, nhộng, cuối cùng

lột xác thành rudi lính đen Rudi trưởng thành chỉ sống khoảng 3 — 5 ngày và hoàn toànkhông ăn uống gì cho đến chết Con cái trưởng thành đẻ từ 500-800 trứng

Vòng đời của ruồi lính đen có 5 giai đoạn chính bao gồm: trứng, ấu trùng, giai đoạn

tiền nhộng, nhộng và ruôi trưởng thành (Smets và ctv, 2020)

2-3 ngày

Trứng va âu trùng (1-18 ngày)

Ở hình 2.2 là vòng đời được nuôi và nghiên cứu trực tiếp tại khu thực nghiệm Black

Solder Project RIBE-CJ KOREA, thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi

trường Trứng sẽ được nở từ 2 — 3 ngày, chúng sẽ được cung cấp dinh đưỡng trong suốt quá

trình phát triển Từ ngày 1 đến khoảng ngày thứ 18 là giai đoạn tiền nhộng, sau đó 7 ngàychúng phát triển thành nhộng khi đó vỏ bên ngoài của chúng có màu đen Từ nhộng pháttriển thành ruồi trưởng thành mất khoảng 7 ngày, khi chúng đã tưởng thành sẽ giao phối

trong giai đoạn này chúng không cần thức ăn và sau 2 ngày chúng đẻ trứng, tiếp tục vòng

đời sinh trưởng.

2.2 Chitin và Chitosan

2.2.1 Cau trúc hóa học và nguồn gốc của chitin

Chitin được cấu tao từ các don vị N-acetyl - D-glucosamine (NADG) liên kết với nhau

Hình 2.3 Cau trúc hóa học phan tử chitin

Dựa trên nguồn gốc và cấu trúc hóa học, chitin được chia làm 3 dạng: Dạng a-chitin

đã được thương mại hóa và có nguồn thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ Trong khi dạng

6-chitin thu nhận từ mai mực va dạng y-chitin thu nhận từ vách tế bào nam, nam men Badạng chitin này khác nhau về số mạch chitin, sự sắp xếp các mạch này và kích thước củachúng trong mỗi đơn vị cấu trúc Cụ thé, a-chitin gồm các mach chitin sắp xếp song songngược chiều nhau được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua và vỏ ghẹ Còn B-chitin gồm các mạchchitin sắp xếp song song cùng chiều, có tính hydrat hóa cao Trong khi, y-chitin là sự kếthop của 2 dang ơ và và thường được thu nhận từ vách tế bào nam và vách tế bao vi khuẩn.Các cấu trúc khác nhau dẫn đến tính chất cũng khác nhau Cụ thể, ơ-chitin có độ rắn tinhthé (Cr]) cao nhất, còn B-chitin thì có độ rắn thấp nhất

4

a-chitin B-chitin y-chitin

Hình 2.4 Sự sắp xếp của chuỗi chitin: ơ-chitin, B-chitin, y-chitin

Chitin không tan trong nước, axit loãng, kiềm và một số dung môi như ete, rượu mà

tan trong dung dich đặc nóng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi(Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo.

Chitin kết tinh ở dang vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac (NH3) Điềunày có thé là do sự thay đổi nhóm hydroxy (-OH) tại vị tri C2 bằng nhóm acetamic(NHCOCH:) đã ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết Khi đun nóng chitin trongdung dich NaOH đậm đặc thì chitin sẽ bị khử mat gốc acetyl tạo thành chitosan Khi đun

nóng chitin trong HCI đặc thi chitin sẽ bị thủy phân tạo thành glucosamine và axit axetic.

Chitin thường được phân lập từ bộ xương ngoài của động vật giáp xác, đặc biệt là vỏ

tôm và cua có nhiều o-chitin (Minke va Blackwell, 1978) Ở thực vat chitin tồn tại trongvách tế bao của một số loài nam (Mucor rouxi và Aspergillis) (Kafetzopoulos và ctv, 1993)

và một số loài tảo Ngoài ra chitin còn có ở một số loài côn trùng, lớp vỏ ngoài của bọ cánhcứng.

2.2.2 Cầu trúc hóa học và tính chất của chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl khỏi machchitin còn gọi là quá trình deacetyl hoá, vì vay chitosan là polyme chứa rất nhiều các đơn

vị glucosamine nên có rất nhiều nhóm amin Công thức cấu tạo của chitosan gần giống nhưchitin va cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon vi trí thứ 2.

Chitosan là một polysaccharide mach thang được cấu tạo từ các D-glucosamine (đơn

vị đã deacetyl hóa) và N-acetyl-D-Glucosamine (đơn vị chứa nhóm acetyl) liên kết tại vị

5

trí B-(1-4) Nó được sản xuất từ quá trình xử ly vỏ các loài giáp xác với dung dich kiềm

Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của chitosan

Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong cácaxit hữu co thông thường như axit formic, axit acetic, axit propionic, axit citric, axit lactic.Hang số phân li axit (pKa) của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8 nên khi hoà tan trong môitrường axit loãng chitosan tạo thành dung dịch keo dương, đây là một điểm rất đặc biệt vì

đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm Trong khi chitosan tích điện dương nên

có khả năng bám đính bề mặt trên các ion tích điện âm, có khả năng tạo phức với các ionkim loại và tương tác tốt với các polyme tích điện âm Ngoài ra, loại dung môi axit cũngảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học của chitosan khi hòa tan Các đặc tính như khả nănghút nước, khả năng hấp phụ chất màu, hấp phụ kim loại, kết dính với chất béo, tính khángkhuẩn, kháng nắm, mang DNA, phân giải chậm, của chitosan phụ thuộc rất lớn vào độ

deacetyl hóa Chitosan có độ deacetyl càng cao thì có khả năng hap phụ chất mau, tạo phức

với kim loại càng tốt Tương tu, khả năng kháng khuẩn, kháng nắm của chitosan cao hơn ởcác mẫu chitosan có độ deacetyl cao Cụ thé, khả năng kháng khuẩn tốt đối với chitosan có

độ deacetyl trên 90%.

Chitosan được sản xuất trong công nghiệp bằng phương pháp deacetyl hóa chitin, vốn

là chat tạo nên cấu trúc của lớp vỏ của các loài giáp xác và thành tế bao của loài nam Độdeacetyl hóa có thé được xác định bằng phương pháp đo phổ NMR, độ deacetyl hóa của

chitosan thương mại thường dao động trong khoảng từ 60 đến 100 % Nhìn chung, phân tử

lượng của chitosan thương mại nằm trong khoảng 3800 - 20000 Daltons Phương pháp

6

deacetyl hóa chitosan thông dụng là sử dụng lượng dư dung dich NaOH Phương pháp này

cho phép thu được sản pham có độ deacetyl hóa cao đến 98%

Chitosan là polysacharide có đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn Chitosan

có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và axit

đậm đặc nhưng tan trong axit loãng (pH 6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng

tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 — 31 1°C

Trong tự nhiên, chitosan rất hiém gặp, chỉ có trong vách ở một số lớp vi nam và ở vailoài côn trùng.

2.2.3 Ứng dụng của Chitin va Chitosan

Chitin và chitosan đều được quan tâm, chủ yếu về lĩnh vực thương mại, nhờ vào tỷ lệnito cao (6,89%) trong cau tạo, so với cellulose thay thế tổng hợp (chỉ 1,25%) Điều này

khiến chitin trở thành chất chelatin hữu ích Hầu hết các polyme ngày nay là vật liệu tổnghợp, vì thế tính tương hợp sinh học và khả năng phân hủy sinh học của chúng bị giảm đinhiều, so với các polyme có nguồn gốc tự nhiên như cellulose, chitin, chitosan và các dẫnxuất của chúng Tuy nhiên, những nguồn tự nhiên này cũng thê hiện sự hạn chế trong khả

năng phản ứng, khả năng xử lý và ứng dụng Về mặt này, chitin và chitosan được khuyến

cáo là nguyên liệu phù hợp, bởi vì những polyme tự nhiên này có các đặc tính tối ưu nhưtính tương hợp sinh học, kha năng phân hủy sinh học, không độc hai, khả năng hap thu,

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan thích hợp được sử dụng không chỉ trong các ứngdụng y sinh mà còn được sử dụng như một vật liệu phủ biopolymer tự nhiên để bảo quảnchất lượng và kéo đài thời hạn sử dụng của thực phẩm tươi sống Màng hoạt tính dựa trênchitosan chống lại sự ô nhiễm và hư hỏng đo vi sinh vật đã được sử dụng thành công trongbao bi trái cây, rau, trứng và thịt (Dehnad, 2014).

Chitosan cũng cho thấy tiềm năng tuyệt vời trong việc băng bó vết thương Trước đây,chitosan có tiềm năng làm thuốc bôi cầm máu cho các mô động vật: chitosan bám vao các

tế bào hồng cau, do đó lay tiêu cầu dé ngưng kết (Stricker, 2018) Trong mỹ phẩm, chitosan

được ứng dụng trong sản xuất kem và nước dưỡng da Nó được sử dụng như một chất giữ4m và bảo vệ da khỏi tia UV (Casadidio, 2019) Một ứng dụng khác cua chitosan là trong

xử lý nước thải, nơi nó được sử dụng như một chất keo tụ nhờ khả năng chelation các cation

|

và hấp thụ các phân tử chất thải từ nước, chẳng hạn như kim loại nặng (Pinotti, 2001) Nó

được sử dụng trong vải làm việc cho bệnh viện hoặc phòng thí nghiệm sinh học và dé làm

chỉ khâu, chỉ và sợi trong hàng đệt y tế (Hahn, 2019) Chitosan cũng được sử dung dé hoànthiện chống tĩnh điện trong quần áo làm việc cho nhân viên trong lĩnh vực điện tử (Xiao,

2018).

Chitosan có thê được dùng trong nông nghiệp với vai trò xử lý hạt giống và thuốc trừdich hại sinh học, giúp cây trồng chống lại các loại bệnh do nam Trong sản xuất rượu vang,

nó có thê được sử dụng như là tác nhân lọc cặn và bảo quản Trong công nghiệp, nó có thể

được sử dụng trong sơn tự làm liền vết trầy xước polyurethane Trong y học, nó có thé đượcứng dụng trong băng gạc y tế để làm giảm chảy máu và chống nhiễm khuẩn; truyền tải

thuốc qua da

Một ứng dụng khác còn gây tranh cãi là, chitosan được xác nhận là có tác dụng hạnchế việc hấp thu chất béo, tạo tiềm năng lớn cho các sản phẩm giảm béo tuy nhiên cũng cónhững bằng chứng phủ nhận điều này

2.3 Các phương pháp chiết xuất Chitin-Chitosan

Quy trình sản xuất chitin thông thường gồm các công đoạn khử protein, khử khoáng

và tây màu Đối với công đoạn tay màu ở các nước nhiệt đới như Việt Nam thường thựchiện kết hợp với quá trình phơi khô trực tiếp sản phẩm chitin đưới ánh nắng mặt trời Sau

đó quá trình deacetyl chitin được thực hiện nhằm tách nhóm acetyl thu nhận sản phẩm

chitosan (deacetylation) Hiện nay, tat cả các công đoạn trên có thể thực hiện thông qua 3

phương pháp: Phương pháp hóa học, phương pháp sinh học và phương pháp kết hợp hóa

học và sinh học tùy theo loại nguyên liệu, công nghệ, và yêu cầu về chất lượng sản phẩm

chitin va chitosan mà các điêu kiện xử lý sẽ khác nhau.

Bang 2.1 So sánh các phương pháp chiết xuất chitin-chitosan

Đặc điêm Phương pháp hóa học Phương pháp sinh học Quá trình khử protein

Sử dụng dung dịch kiềm (thông

thường là NaOH, KOH) dé loạiprotein có trong mau.

Sử dung axit vô co dé loại bỏkhoáng, axit thông dụng nhất làHCl,

Dung dich kiềm đậm đặc được sửdụng để loại bỏ gốc N-acetyl rakhỏi phân tử chitin và tạo thành chitosan.

Được dùng tạo chitin/chitosan

thương mại.

Mức DA cao.

Phương pháp này cho phép loại

bỏ gần như hoàn toàn các muốihữu cơ, nhưng đồng thời có théxảy ra các phản ứng khử oxy hóa.

Không thân thiện với môi trường.

Khó tách sản phâm phụ do axit vàkiêm đậm đặc.

Sử dụng enzyme hay sửdụng vi sinh vật để loại bỏprotein Enzyme thường

được sử dụng là protease

(Alcalase, Papain, ).

Axit hữu co được sử dụng

dé loại bỏ khoáng trong mẫu

như: axit lactic,axit axetic, axit oxalic,

Su dung enzyme Chitin

Deacetylase dé loại bỏ gốcN-acetyl Một phương pháp khác là lên men trạng tháirắn, sử dụng vi sinh vật phângiải chitin thành chitosan.

An toan với môi trường.Protein và khoáng chất hòatan có thé được sử dụng làm

chất dinh dưỡng cho người

và động vật.

Các quy trình chỉ giới hạn trong các nghiên cứu quy

mô phòng thí nghiệm.

Mặc đù có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết xuất và ứng dụng của chitin

và chitosan Tuy nhiên cho đến nay hau hết các nghiên cứu này chi tập trung vào chiết xuấtchitin va chitosan từ giáp xác Chitosan thương mại cũng được thu chính từ vỏ tôm Chỉ cómột số ít các công trình nghiên cứu thu nhận chitin va chitosan từ các nguồn khác như cua,ghe, nam va mai mực Ngày nay, ruôi lính đen đã và dang trở thành một nguồn cung cấpchitin-chitosan tiềm năng và ngày càng có nhiều nghiên cứu về việc chiết xuất chitin-chitosan từ ruôi lính đen.

2.3.1 Một số quy trình chiết xuất Chitin-Chitosan

Năm 2016, Wasko va ctv đã đưa ra quy trình chiết xuất chitin từ ấu trùng RLĐ (Hình2.6) Đây là nghiên cứu đầu tiên trên thế giới về chiết xuất chitin từ ấu trùng RLD, đưa rabáo cáo đầu tiên vê tinh chất hóa lý của chitin từ au trùng RLD

Hình 2.6 Quy trình chiết xuất chitin từ âu trùng RLD (Wasko, 2016)

Năm 2017, Lê Thị Thay Hằng nghiên cứu quy trình chiết xuất chitosan thir ấu trùng

RLĐ bằng 2 phương pháp: hóa học và hóa sinh kết hợp (Hình 2.7) Chitosan tạo được cóhiệu suất tạo chitosan là 3,79% (phương pháp hóa) và 12,99% (phương pháp hóa sinh kếthợp).

10

Au trùng RLD

| Say khé, nghién

|

Nhộng (protein, Nhộng (protein, È no

khoáng,chitin ) khoáng,chitin, )

NaOH 5%, 90°C, Enzyme Alcalase 0,2%,

4 gio 8 gio, 55°C, pH 8

Ba ( khoang, chitin, ) Ba ( khoáng, chitin, )

HCI 4%, 12 giờ, Axit lactic 3%, 12 giờ, nhiệt độ phòng nhiệt độ phòng

Hình 2.7 Quy trình chiết xuất chitin-chitosan từ ấu trùng RLD bang hai phương pháp:

hóa học và hóa sinh kết hợp (Lê Thị Thúy Hằng, 2017)

Nguyễn Ngọc Hà và ctv (2022) đã nghiên cứu và chiết xuất thành công chitin vàchitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen bằng bằng phương pháp hóa học qua các bước khửprotein, khử khoáng, khử màu và khử deacetyl Hiệu suất thu hồi chitin từ vỏ nhộng RLĐđạt khá cao (khoảng 35,5%) Chitosan được tạo ra từ chitin bằng phương pháp xử lý NaOH

có hiệu suất thu hồi là 77,88% với hàm lượng protein và khoáng thấp (<1%); độ deaceylcao (>70%); độ nhớt là 14,31 cP cùng khối lượng phân tử là 194883 Da Chất lượng củachitosan chiết xuất từ vỏ nhộng ruồi lính den bằng phương pháp hóa học đạt yêu cầu của

chitosan thương mại.

1]

Xử lý với HCl 4%, tỷ lệ 1:15 (w/v) trong 12 giờ, nhiệt độ phòng

Rửa sạch đến pH trung tính, say khô ở 60 + 0,5 °C

Xử lý với NaOH 70 %, tỷ lệ 1:15 (w/v) ở 80 °C, 8 giờ

Rửa sạch đến pH trung tinh, sấy khô ở 60 + 0,5 °C

Khử màu bằng KMnO¿ và axit oxalic

Hình 2.8 Quy trình chiết xuất chitin-chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính den bằng phương

pháp hóa học (Nguyễn Ngọc Hà và ctv, 2022)

Chitin và Chitosan được sản xuất ở quy mô công nghiệp chủ yếu sử dụng phương

pháp hóa học, điều này gây ra một áp lực lớn cho môi trường Vì vậy phương pháp sinhhọc đã và đang được quan tâm như một giải pháp thay thế thân thiện với môi trường chocác quy trình hóa học Các phương pháp sinh học chủ yếu dựa trên việc sử dụng các proteasecủa vi sinh vật hoặc toàn bộ vi sinh vat dé loại bỏ protein và ứng dụng deacetylase dé khửmen chitin Tuy nhiên, các quy trình công nghệ sinh học cho năng suất thấp hơn, tốn nhiềuthời gian và dan đến sản phẩm có độ tinh khiết thấp hơn

12

2.3.2 Chiết xuất Chitin và Chitosan bằng phương pháp sinh học

2.3.2.1 Quá trình khử khoáng

Vỏ giáp xác chứa một lượng lớn chất khoáng, có thé lên đến 50% trong vỏ cua và

tôm Ngược lại, côn trùng có hàm lượng khoáng chất thấp hơn nhiều, thường dao động từ

2 đến 10% đối với toàn bộ côn trùng Tuy nhiên, giá trị này thay đôi tùy theo loài và giaiđoạn phát triển (Finke, 2013) Quá trình khử khoáng của các mẫu côn trùng bao gồm sự

phân hủy các khoáng chất thành các muối hòa tan trong nước tương ứng của chúng Cácmuối hòa tan có thé được tách ra khỏi chitin bằng cách lọc và rửa pha rắn Xử lý bằng axit

cũng giải phóng các hợp chất catechol và dẫn đến sự đổi màu nhẹ của sinh khối Quá trình

khử khoáng có thé bị ảnh hưởng bởi loại va nồng độ axit được sử dụng, thời gian và nhiệt

độ xử lý, kích thước hạt của mẫu và tỷ lệ chất tan trên dung môi

Đối với phương pháp sinh học, các axit hữu cơ, cụ thé là axit lactic, axit axetic và axit

oxalic, có thể là một thay thé hợp lệ cho axit clohydric dé khử khoáng trong sinh khối côntrùng Việc sử dụng các axit hữu cơ cũng mang lại những lợi ích khác vì chúng ít gây hại

cho môi trường, có thé bảo tồn các đặc tính của chitin tinh khiết, có thé được sản xuất từ

sinh khối với chi phí thấp và các muối hữu cơ chiết xuất được có thể được sử dụng cho các

ứng dụng khác (Mahmoud, 2007) Khi các khoáng chất đã được hòa tan và loại bỏ, sinh

khối côn trùng được rửa bằng nước cất cho đến khi độ pH của nó được phục hồi về mứctrung tính Sau bước trung hòa, các mẫu côn trùng được khử protein

2.3.2.2 Quá trình khử protein

Đối với phương pháp sinh học, nguyên tắc chung là sử dụng các emzyme từ vi sinh

vật dé thủy phân loại bỏ protein ra khỏi mẫu

Từ những năm 1960, một số nghiên cứu đã ứng dụng enzyme protease đề thủy phânprotein trong phế liệu giáp xác đã được thực hiện bởi Takeda và Abe (1962), Takeda vàKatsuura (1964) Synowiecki va ctv (2000) dùng enzyme Alcalase dé thủy phân protein từphế liệu tôm Crangon, thu hồi được 64.3% protein Sử dung protease dé thay thế cho NaOHkhắc phục được các hạn chế của việc sử dụng hóa chất

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã ứng dụng protease (Papain, Alcalase, Protamex,

Flavourzyme) dé khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản Tuy nhiên,

13

các nghiên cứu này chỉ mới triển khai ở quy mô phòng thí nghiệm và kết quả nghiên cứucho thấy sử dụng enzyme không khử triệt đê được protein từ phế liệu thủy sản và hàm lượngprotein còn lại ở mẫu chitin khá cao (6 - 9%) Vì vậy, dé triển khai ở quy mô sản xuất lớncần nghiên cứu thêm dé nâng cao hiệu quả quy trình có sử dung enzyme và thử nghiệm 6quy mô lớn.

Phương pháp này có ưu điểm là khi sử dụng enzyme hoặc vi sinh vật lên men khi để

thủy phân, loại protein thì sản phẩm chitin, chitosan thu được có phân tử lượng lớn và độ

nhớt cao hơn so với sản phẩm thu được từ quy trình xử lý hóa học Tuy nhiên, các quy trìnhthủy phân protein bang enzyme hoặc sử dụng quá trình lên men đều có nhược điểm là khôngtách triệt dé protein, thông thường lượng protein còn lại trong chitin tương đối cao từ 6-12% Ngoài ra, chi phí xử lý bằng enzyme thường cao hơn xử lý bằng phương pháp hoáhọc, quá trình lên men thì cần nhiều thời gian từ 5 - 14 ngày Đây chính là một số khó khănchính khi triển khai ở quy mô lớn trong quá trình sản xuất chitin

2.3.2.3 Quá trình Deacetyl hóa

Đối với phương pháp sinh học, giai đoạn deacetyl hóa được thực hiện dựa trên tac

động cua enzyme Chitin Deacetylase (CDA) được tạo ra bởi các vi sinh vật Quá trình này

được thực hiện bằng cách lên men trạng thái rắn chitin cùng với các vi sinh vật

Theo Aris Toharisman và ctv (2008), nghiên cứu chuyên hóa chitin thành chitosanbằng cach lên men sử dung chủng vi khuẩn Bacillus thermoleovorans LW-4-11 Theo đó,thành phan môi trường lên men bao gồm: 0,7% (NH¿); SOx; 0,1% KzHPO‹; 0,1% NaCl;0,01% MgSOa.7HaO: 0,2% dịch chiết nắm men,0,1% Bacto trypton và 1% keo chitin Quátrình lên men diễn ra trong 3 ngày ở 70°C Sản phẩm sau lên men được tiến hành thu hồichitosan.

Một nghiên cứu khác của Kuldeep Kaur va ctv (2012) về việc phân lập chủng vi khuẩnsinh enzyme CDA ở bờ biển Chennai, An Độ Trong đó, các chung vi khuẩn được sàng lọc

trên môi trường chọn lọc gồm chitin 1%, NaNO3 0,2%, K2HPO, 0,1%, KH2PO, 0,1%,

MgSO, 0,05%, P và N 0,05%, và thạch 2%, sau đó được ủ 2 ngày ở nhiệt độ 30°C nhằm

thu được các khuẩn lạc mong muốn Tiếp theo các khuẩn lạc vi khuẩn đó được lên men

cùng với 50 mg chitin; 1 g chiết xuất nắm men; 0,4 g amoni sulfat, và 0,15 g kali dihydro

14

photphat (pH 8,0) ở 25°C trong vòng 2 ngày: sản phẩm sau lên men được tiến hành thu hồi

chitosan Quá trình định danh vi khuan được thực hiện bằng kỹ thuật sinh học phân tử và

các thử nghiệm sinh hóa xác định được 2 chủng vi khuẩn sinh ezyme CDA gồm có Bacillus

sp và Serritia sp., trong đó hiệu suất thu hồi từ quá trình deacetyl hóa của 2 chủng vi khuanlần lượt là 16% và 10%

Ching vi khuẩn Paenibacillus sp cũng được sử dụng dé lên men để chuyên chitinthành chitosan (Jinghe Du va ctv, 2020) Thành phan cho quá trình lên men gồm có: 1%chitin, 0,05% MgSO¿-7H2O, 1,2% urea, 0.03% KH¿PO¿ 0,5% NaCl, 0,07% KaHPO¿ 0,3%dịch chiết nam men, pH của hỗn hợp lên men được điều chỉnh đến 4,5 và được ủ trong vòng78h Kết thúc quá trình lên men, sản phẩm được tiến hành thu hồi chitosan

Nhìn chung, hiệu suất của quá trình deacetyl hóa bằng phương pháp sinh học dựa trên

vi sinh vật là tương đối thấp Vì vậy, dé triển khai ở quy mô sản xuất lớn cần nghiên cứuthêm dé nâng cao hiệu quả quy trình có sử dụng vi sinh vật và thử nghiệm ở quy mô lớn

2.3.2.4 Enzyme Chitin Deacetylase (CDA)

CDA thuộc họ 4 của carbohydrate esterase có thé thủy phân các nhóm Nacetamidocủa gốc N-acetyl-D-glucosamine trong chitin (Lombard và ctv, 2014) CDA xúc tác choviệc loại bỏ các nhóm acetyl khỏi chuỗi chitin tự nhiên thông qua một tập hợp cơ chế đatan công dẫn đến việc tạo ra cả monome Gle và GleNac trong polyme (Ghormade va ctv,2017) Khối lượng phân tử của CDA được tìm thay nằm trong khoảng 25 — 80 kDa (Zhao

và ctv, 2010).

Các nguồn chính của CDA là nam, men, vi khuẩn và côn trùng Trong số các loạinam, sản xuất CDA ttr Mucor spp (Kafetzopoulos va ctv, 1993; Chatterjee va ctv, 2018);Rhizopus spp (Jeraj va ctv, 2006; Chatterjee va ctv, 2008; Zhang va ctv, 2014); Metarhizium spp (Nahar va ctv, 2004); Penicillium spp (Pareek va ctv,2011, 2014); va Colletotrichum spp (Suresh va ctv, 2011) đã được nghiên cứu rộng rãi Saccha romyces cerevisiae (Martinou va ctv, 2002) va Schizosaccharomyces pombe (Matsuo va ctv, 2005)

là những loài nam men được báo cáo dé sản xuất CDA Trường hop vi khuẩn chủ yếu là vikhuẩn biển, Vibrionaceae spp (Kadokura va ctv, 2007; Li và ctv, 2007; Pascual và Planas,

15

2018) va Bacillus spp (Bhushan,2000; Zhou và ctv, 2010) được biết đến với việc sản xuất

CDA Hơn nữa, CDA cũng đã được phát hiện ở côn trùng.

2.3.2.5 Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

amyloliquefaciens trên môi trường LB.

Năm 1943, nhà khoa học Nhật Bản Juichiro Fukumoto lần đầu tiên phân lập được vi

khuẩn Bacillus amyloliquefaciens từ đất Loài này được đặt tên theo đặc điểm độc đáo của

nó bởi vì nó tạo ra (faciens) một a -amylase (amylo) hóa lỏng (que).

Vi khuẩn thuộc nhóm hoạt động Bacillus amyloliquefaciens (OGBa) đều là Gram

dương, hình thành nội bào tử và hình que.

Chúng được phân phối rộng rãi trong các môi trường khác nhau bao gồm đất, thực

vật, thức ăn và nước Các thành viên của OG Ba được gọi là vi khuẩn thúc đây tăng trưởngthực vật (PGPB) do kha năng cố định dam, hòa tan photphate và sản xuất siderophore và

phytohormone, cũng như các hợp chất kháng vi sinh vật Hơn nữa, chúng cũng được báo

cáo là sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau bao gồm: a-amylase, protease, lipase,cellulase, xylanase, pectinase, aminotransferase, barnase, peroxidase va laccase Các hợpchat kháng khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của mam bệnh bao gồm các peptide và

polyketide phi ribosome cũng được sản xuất bởi các vi khuẩn này Khai thác bộ gen đã tiết

lộ các ứng dụng tiềm năng của các thành viên của OG Ba để loại bỏ thuốc trừ sâuorganophosphorus (Ops).

16

2.4 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng được sử dụng dé xác định mức yếu tố làm thỏa mãn

đồng thời các thông số kỹ thuật mong muốn; kết hợp tối ưu hóa cho các yếu tổ dé cho ra

kết quả mong muốn đạt được và mô tả kết quả tối ưu; cho ra các kết quả đặc trưng khi nó

bị ảnh hưởng bởi những thay đôi của các yếu tổ vượt quá mức quan tâm Các mô hình được

sử dụng nhiều của RSM là thiết kế Box — Behnken (BBD) và thiết kế Central composit(CCD) Trong nghiên cứu nay, mô hình được sử dung là thiết kế Box — Behnken

Phuong pháp bề mặt đáp ứng là phương pháp thống kê sử dung các dữ liệu định lượng

từ các thí nghiệm dé xác định và giải thích nhiều biến phương trình RSM khám phá cácmối quan hệ giữ các biến và giải thích một hay nhiều biến phản ứng Phương pháp này

được giới thiệu bởi GEP Box và KB Wilson vào năm 1951.

Ý tưởng chính là sử dụng các chuỗi thí nghiệm được thiết kế để có một phản ứng tối

ưu Đề làm điều này, Box và Wilson đã sử dụng một mô hình đa thức bậc hai Mô hình này

chỉ xấp xỉ nhưng lại đễ dàng áp dụng

Nguyên tac: trong trường hợp chung, người ta gọi là bề mặt đáp ứng, đại diện cho

hình học hàm mục tiêu của một quá trình vật lý không gian — thời gian ngẫu nhiên cho

những biến kích thích Đặc tính được nghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự

chuyền đổi bằng một chức năng đáp ứng rõ ràng (hay còn gọi là chức năng chuyền đôi) Sự

thay đối giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay đổi chức năng của các biến kích

thích, xác định các giai đoạn quan sát và tính toán sai SỐ Những biến đầu vào X; (=1,

2, n) cũng được gọi là các biến cơ sở, chúng được đặc trưng bởi một loạt các thông tinthống kê (chức năng phân phối độc lập hoặc tương quan, cơ hội chuẩn hóa, ) Trong

trường hợp chung, các biến Xj là những biến thay đổi theo không gian và thời gian

Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thí nghiệm được sử dụng dé tiễn hành tối ưu

hóa bằng phương pháp quy hoạch mô hình Box — Behnken Số lượng thí nghiệm cần thựchiện theo phương pháp đáp ứng bề mặt được tính theo công thức: N = 2*+ 2k + nọ Trong

đó, N là số thí nghiệm, k là số yếu tố ảnh hưởng, no là số thí nghiệm ở tâm Phân tích thong

kê cho thay mô hình thống kê biểu diễn sự phụ thuộc hàm mục tiêu Y vào các điều kiện

ảnh hưởng được mã hóa là một phương trình đa thức bậc hai có dạng:

17

Y= Bot ZBiXit 2 Bị XiXị + DZ Pax?

Trong do:

Y: Ham mục tiêu — dự đoán

Bo: hệ số héi quy bậc 0

Xj nhân tổ độc lập thứ i ảnh hưởng đến hàm mục tiêu Y

Bi: hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố Xj tới hàm mục tiêu Y

Bi: hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng của yếu tố Xj tới Y

Bij: hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời của Xi va Xj với Y

Sau khi thực hiện N số thí nghiệm, tiến hành xử lý thống kê với phần mềm RSM Giátrị p của mô hình với p < 0,05 cho thấy mô hình đã chọn có ý nghĩa và phù hợp khi tiếnhành thực nghiệm và thông số Adeq Precision lớn hơn 4 là cần thiết (Zabeti và ctv, 2009)

Đồng thời đánh giá sự không tương thích của mô hình (Lack of fit) được xác định bởi giá

trị p> 0,05, do đó có thé khang định rang mô hình phù hợp với dữ liệu thu thập ở mức tincậy 95% Từ đó sẽ cho ra mô hình hồi quy đa chiều mô tả mối quan hệ giữa các biến độclập và hàm mục tiêu được thiêt lập, bên cạnh đó Guan Yao (2008) đã cho rằng mô hình

tương quan được đánh giá tốt khi khi hệ số xác định tương quan R7 > 0,8 và hiệu số của

Adiusted R? va Predicted R? nhỏ hơn 0,2 Khi xác định mô hình đã chọn có ý nghĩa và phù

hợp thì tiến hành thực nghiệm dé kiểm tra, nếu kết quả thực nghiệm phù hợp với dự đoánthì từ đó đưa ra điều kiện tối ưu của thí nghiệm

18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

3.1.1 Thời gian ;

Từ tháng 8/2023 đên thang 11/2023.

3.1.2 Dia diém

Thí nghiệm được thực hiện tai Phòng Độc chất học môi trường (RIBE 104-106), AI,

Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

3.2 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Vỏ nhộng ruồi lính đen được thu nhận tại khu thực nghiệm Black Solder Project RIBE

- CJ KOREA, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM.

Enzyme Alcalase 2,4L được sản xuất bởi Công ty Novozyme của Dan Mach có hoạt

độ enzyme là 1925 UI/g.

Giông vi khuân Bacillus amyloliquefaciens được cung cap bởi Viện Nghiên cứu nuôitrồng Thủy sản II

Hình 3.1 Vo nhộng RLD thu nhận tại nhà nuôi ruồi a) V6 nhộng RLĐ ban dau,

b) Vo nhộng RLĐ sau khi xay nhỏ

19

3.3.1.1 Chuẩn bị mẫu và xác định các thành phần dinh dưỡng của nền mẫu ban đầu

Sử dụng vỏ có hàm lượng chitin cao đề khảo sát các điều kiện chiết xuất chitin

Mau vỏ nhộng RLD được thu nhận từ nha bay sau đó rửa sạch dé loại bỏ tạp chat, sấykhô ở 60°C trong 24 giờ Sau khi sấy khô, vỏ nhộng được xay nhỏ và tiến hành phân tíchmột số thành phần hóa học có trong vo nhộng RLD như: độ am, khoang, nito tong sé, nito

- protein, chất hữu co, axit humic, axit fulvic, canxi, magie, photpho, kali

3.3.1.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sat các điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein vỏnhộng RLD bang enzyme Alcalase 2,4L

Chon miền khảo sát

20

Khi nghiên cứu điều kiện phù hợp cho quá trình khử protein đạt hiệu suất cao thì phụthuộc vào nhiều yếu tố như: tỷ lệ enzyme/cơ chat, tỷ lệ cơ chat/dung dịch, nhiệt độ, thờigian, pH Dựa vào đặc tính của enzyme, kết quả của các nghiên cứu tham khảo thì xác định

được mô hình tối ưu tương ứng với các điều kiện khử protein được trình bày trong bảng

3.1.

Bảng 3.1 Phạm vi các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình khử protein

Yêu tô Đơn vị Ký hiệu Mức độ

Phuong phap quy hoach thuc nghiém

Dé xác định chính xác giá trị tối ưu các thông số: A (tỷ lệ enzyme/co chất), B (ty lệ

cơ chất/dung dịch), C (nhiệt độ), D (thời gian), E (pH) ảnh hưởng đến hiệu suất khử protein(DP %); tiến hành tối ưu hóa quá trình khử protein bằng phương pháp thiết kế thử nghiệmBox-Behnken và phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) để tối ưu các thông số Quy hoạchthực nghiệm đưa ra ma trận gồm 46 nghiệm thức, 6 nghiệm thức lặp lại tại tâm dé đánh giásai SỐ

Thực hiện quá trình khử protein bằng enzyme Alcalase 2,4L; điều chỉnh pH dung dịchbằng KOH IN; nhiệt độ được duy trì ôn định trong bồn lắc 6n nhiệt Sau mỗi thí nghiệm,bất hoạt enzyme bằng cách nâng nhiệt độ lên 90 °C trong 5 phút

Mau sau quá trình khử protein kết thúc sẽ được ly tâm loại bỏ dich, phần rắn được rửabằng nước cất đến pH trung tính, say khô ở 60°C và tiến hành xác định nito-protein, khoáng

và hiệu suất khử protein

5]

Sau khi đưa ra điều kiện tối cho quá trình khử protein, vỏ nhộng RLĐ được khửprotein lượng lớn đề tiếp tục quá trình khử khoáng.

3.3.2 Tối ưu cho quá trình khử khoáng vỏ nhộng RLĐ bằng axit lactic

Chọn miền khảo sát

Khi nghiên cứu điều kiện phù hợp cho quá trình khử khoáng đạt hiệu suất cao thìphụ thuộc vào nhiều yếu tô như: tỷ lệ mẫu/axit, thời gian và nồng độ axit Dựa vào kết quacủa các nghiên cứu tham khảo thì xác định được mô hình tối ưu tương ứng với các điềukiện khử khoáng được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2 Phạm vi các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình khử khoáng

Yêu tổ Đơn vị Ký hiệu Mức độ

Thấp (-1) Cao (+1)

Tỷ lệ mau/ g/mL A HỊ 1:8

axit

Thoi gian giờ B 0,3 Z

Nong độ axit % & 3 9

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Dé xác định chính xác giá trị tối ưu các thông số: A (tỷ lệ mẫu/axiÐ), B (thời gian), C

(nồng độ axit) ảnh hưởng đến hiệu suất khử khoáng (DA %); tiến hành tối ưu hóa quá trìnhkhử khoáng bằng phương pháp thiết kế thử nghiệm Box-Behnken và phương pháp bề mặt

đáp ứng (RSM) để tối ưu các thông số Quy hoạch thực nghiệm đưa ra ma trận gồm 17

nghiệm thức, 5 nghiệm thức lặp lại tại tâm dé đánh gia sai SỐ

Thực hiện quá trình khử khoáng bằng axit lactic; các nghiệm thức khử khoáng đượcthực hiện ở nhiệt độ phòng.

Mau sau quá trình khử khoáng kết thúc sẽ được rửa bằng nước cất đến pH trung

tính, say khô ở 60°C sẽ thu được chitin Sau đó, tiễn hành xác định ham lượng khoáng vàhiệu suất khử khoáng và hiệu suất tao chitin

22

Khử mau chitin bằng KMnO¿ và axit oxalic (Wasko và ctv, 2016) Cân khối lượngchitin thô, cho KMnO¿ 1% (tỷ lệ 1:20 w/v) để ngắm đều mẫu Tiến hành thí nghiệm ở nhiệt

độ phòng trong 1 giờ, sau đó lọc rửa sạch mẫu bằng nước cất Tiếp tục loại màu KMnO¿

trong mẫu bằng axit oxalic 4% ở nhiệt độ 60°C trong 1 giờ, khuấy đều mẫu dé khử đều

màu Sau đó rửa sạch mẫu bang nước cất đến pH trung tinh, say mẫu mẫu ở 60°C đến khô

Đánh giá hiệu quả quá trình khử màu qua việc quan sát và ghi nhận màu sắc của mâu

chitin sau khử mau.

Sau đó, chitin tiếp tục được sử dụng để tiến hành khử deacetyl dé tạo thành chitosan

3.3.3 Tối ưu hóa quá trình chuyển hóa chitin thành chitosan bằng phương pháp sinhhọc

Quá trình chuyền hóa chitin thành chitosan (hay còn gọi là quá trình khử deacetyl)

bằng phương pháp sinh học dién ra nhờ hoạt động của enzyme Chitin Deacetylase (CDA)

sinh ra trong quá trình lên men vi sinh vật Có nhiều chủng vi sinh vật được công bố rang

có khả năng sinh enzyme CDA, trong đó nổi bật là chủng Bacillus amyloliquefaciens

3.3.3.1 Thiết kế thí nghiệm khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình khử deacetylchitin từ vỏ nhộng RLD.

Chọn miền khảo sát

Khi nghiên cứu điều kiện phù hợp cho quá trình khử deacetyl đạt hiệu suất cao thìphụ thuộc vào nhiều yếu tố như: pH, thời gian và nhiệt độ Dựa vào đặc tinh của chủng vikhuẩn Bacillus amyloliquefaciens cùng với kết quả của các nghiên cứu tham khảo thì xác

định được mô hình tối ưu tương ứng với các điều kiện khử deacetyl được trình bày ở bảng

đói.

Bảng 3.3 Phạm vi các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình khử deacetyl

Yêu tổ Đơn vị Ký hiệu Mức độ

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Dé xác định chính xác giá trị tối ưu các thông số: A (pH), B (thời gian), C (nhiệt độ)ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi chitosan (DD%); tiến hành tối ưu hóa quá trình khửdeacetyl bằng phương pháp thiết kế thử nghiệm Box-Behnken và phương pháp bề mặt đáp

ứng (RSM) dé tối ưu các thông số

Như vậy, quy hoạch thực nghiệm đưa ra ma trận gồm 20 nghiệm thức, 5 nghiệm thứclặp lại tại tâm dé đánh giá sai số

Thực hiện quá trình khử deacetyl bằng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens Tăngsinh vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens trong môi trường LB lỏng trong 24 giờ, sau đópha loãng dịch vi khuẩn va do giá trị OD ở bước sóng 600 nm Pha loãng dich vi khuẩn sao

cho giá trị ODsoo = 0,5 tương đương mật độ 6 x 10° CFU/mL (Leonel và ctv, 2006) Sử

dụng chitin chiết xuất được từ nội dung trước làm cơ chất chính Mỗi nghiệm thức chứa 50

mL môi trường lên men bao gồm: 0,44 g chitin; 1,22 g tinh bột; 0,5 ø cao nắm men; 0,25 gNaCl, 0,0095 g MgSOx; 0,015 g KzHPO¿ (Guoying Zhou va ctv, 2014), đồng thời bé sung

1 mL dich vi khuan Bacillus amyloliquefaciens

Mau sau quá trình lên men kết thúc được tién hành thu hồi chitosan theo phương phápcủa Vadake (1998) (Hình 3.2) Kết tủa sau khi sấy khô sẽ được tiến hành định tính, định

lượng và xác định hiệu suất thu hồi chitosan

24

Rửa bằng nước cat đến pH trung tính Sấy khô

Hình 3.2 Phương pháp thu hồi chitosan (Vadake, 1998)

3.3.3.2 Dinh tính Chitosan

Định tinh chitosan bằng phương pháp thử Lugol/H2SO, (Richards, 1951):

Trên kết tủa khô nhỏ 2-3 giọt iot/KI

Hỗn hợp được axit hóa với 2-3 giọt HaSOu 1%

3.4 Phương pháp phân tích

Xác định độ âm theo TCVN 4048:2011 Nguyên tắc: dựa trên sự chênh lệch về khốilượng giữa mẫu khô không khí và mẫu khô kiệt sau sấy ở nhiệt độ từ 100 °C đến 105 °Cđến khối lượng không đổi dé tính độ âm và hệ số khô kiệt của mẫu

Xác định hàm lượng tro khoáng theo TCVN 5105:2009 Nguyên tắc: mẫu thử được

nung trong khoảng nhiệt độ từ 500 °C đến 550 °C dé đốt cháy toàn bộ các hợp chat hữu co,

sau đó, thu được phân tro còn lại và cân khôi lượng.

Xác định hàm lượng nito tổng số theo TCVN 8557:2010 Nguyên tắc: chuyên hóa các

hợp chat nitơ trong mẫu thành amoni (NH¿') bằng hỗn hợp giữa H2SOx với chat xúc tác,

sau đó cất amoni nhờ dung dịch kiểm, thu NH3 bang dung dịch axit boric, chuẩn độ amon

tetraborat bằng axit tiêu chuẩn, từ đó suy ra hàm lượng nitơ trong mẫu

Xác định hàm lượng nitơ-protein hòa tan bằng NaOH 5% Nguyên tắc: hòa tan nitơ

dang protein bằng dung dich NaOH 5% ở 90 °C, sau đó tiễn hành xác định nito theo phươngpháp KJeldhal.

Xác định hàm lượng chất hữu cơ theo TCVN 9294:2012 Nguyên tắc: oxy hóa cacbon

hữu cơ bằng dung dich kali dicromat du trong môi trường axit sunfuric, sử dụng nhiệt do

quá trình hòa tan axit sunfuric đậm đặc vào dung dich dicromat, sau đó chuẩn độ lượng dư

bicromat bang dung dịch sắt hai, từ đó suy ra hàm lượng các bon hữu cơ

Xác định hàm lượng axit humic và axit fulvic theo TCVN 8561:2010 Nguyên tac:

dựa vao tinh chất hòa tan của axit humic và axit fulvic trong môi trường kiềm, xác định

được tông axit humic và axit fulvic; dựa vào tinh chất không hòa tan trong môi trường axit

của axit humic dé tách riêng axit humic và xác định được axit humic, từ đó suy ra ham

lượng axit fulvic.

Xác định hàm lượng canxi-magie theo TCVN 12598:2018 Nguyên tắc: phân hủy và

chuyển hóa canxi, magiê trong mẫu phân bón bằng hỗn hợp axit nitric và axit clohydric

đậm đặc Xác định hàm lượng canxi, magiê trong dung dịch bằng phép chuẩn độ tạo phức

với EDTA

26

Xác định hàm lượng photpho theo TCVN 8940:2011 Nguyên tắc: sử dụng axitsunfuric và axit pecloric dé phá mẫu và hòa tan các hợp chất phospho trong mẫu Xác địnhhàm lượng phospho trong dung dịch bằng phương pháp đo màu.

Xác định hàm lượng kali theo TCVN 8562:2010 Nguyên tắc: sử dụng HzSOx va

HCIO¿ đặc dé chuyên hóa các hợp chất chứa kali trong mẫu thành kali hòa tan, sau đó xácđịnh kali trong dung dich mẫu bằng quan kế ngọn lửa

Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp Anson Nguyên tắc: casein bị phân giảitrong môi trường kiềm dưới tác dung của protease tao sản phẩm là các đoạn peptide ngắn

hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định lượng tyrosine và tryptophan hòa tan bởi

Pì, P2: Hàm lượng protein trước và sau khi xử lí (g/g).

Ai, Az: Hàm lượng khoáng trước và sau khi xử lí (g/g).

mt, ms: Khối lượng mẫu trước và sau khi xử lí (g)

Xác định hiệu suất thu hồi chitin/chitosan theo phương pháp khối lượng

Khối lượng chitin/chitosan

H(%)= : = x 100(%) Khối lượng mau

3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2016

Thiết kế thử nghiệm bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

27

Phân tích số liệu thực nghiệm tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert 11 được sửdụng để phân tích phương sai (ANOVA), tính toán hệ số của phương trình hồi quy và đềxuất giải pháp cho mô hình tối ưu hóa.

28