Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá đặc điểm liên quan đến khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của một số dòng Pseudomonas spp

Việc ứng dụng các vi khuân có khả năng sinh các chất kích thích tăng trưởng giúp thực vật dé dàng hap thụ chất dinh dưỡng, tao sức đề kháng chống lại mầm bệnhthực vật đang thu hút được s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ĐÁNH GIA DAC DIEM LIEN QUAN DEN KHẢ NĂNG

THUC DAY TANG TRUONG THUC VAT

CUA MOT SO DONG Pseudomonas spp.

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thuc hiện : PHAM NGOC MAI

Mã số sinh viên : 19126097

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 3/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIÊM LIÊN QUAN ĐÉN KHẢ NĂNG THUC DAY TANG TRUONG THUC VAT

CUA MOT SO DONG Pseudomonas spp.

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực viên

PGS.TS NGUYÊN VŨ PHONG PHAM NGOC MAIThS TRAN TH] THANH HUONG

TP Thu Đức, 3/2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM,Khoa Khoa học Sinh học đã tạo điều kiện cho em có một môi trường tốt trong suốt thời

gian em học tập và nghiên cứu tại trường.

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy PGS.TS Nguyễn VũPhong đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian em làm khóa luận tốt nghiệp,tạo điều kiện và hỗ trợ cho em hết sức có thé dé em có thé hoàn thành dé tài của mìnhtốt nhất

Em xin cảm ơn Thầy/Cô Khoa Khoa học sinh học đã chia sẻ những kiến thức và

có những góp ý trong suốt quá trình thực hiện đề tài để khóa luận của em được hoànthiện nhất

Con cũng cảm ơn bé mẹ và gia đình mình đã ủng hộ, quan tâm và động viên con,

giúp con yên tâm hoàn thành chương trình học tập của mình.

Cuối cùng em cảm ơn tất cả anh/chị, các bạn và các em phòng BIO 301, 303 đãsát cánh, hỗ trợ và chia sẻ kinh nghiệm quý báu cho em trong quá trình hoàn thành đềtài tốt nghiệp nay

Một lần nữa em xin gửi đến Thầy/Cô, Anh/Chi và tat cả bạn bè, các em lời cảm

ơn chân thành và tốt đẹp nhất

Em xin trân trọng cảm on!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Pham Ngọc Mai, MSSV: 19126097, Lớp: DH19SHD thuộc ngành Công

nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP HCM, xin cam đoan: Khóa luận tốtnghiệp “ Đánh giá đặc điểm thúc đây tăng trưởng thực vật ở một số chủng Pseudomonas

spp.” là do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là

hoàn toàn trung thực va khách quan Tôi xin chịu toàn bộ trách nhiệm trước Hội đồng

về những cam kết này

Tp Ho Chi Minh, ngày tháng năm 2024

Người viết cam đoan(Ký và ghi rõ họ tên)

1

xử lí Kết quả của dé tài nghiên cứu chứng minh được hai chủng vi khuẩn Pseudomonasspp P3 và P5 có khả năng thúc đây tăng trưởng thực vật.

Từ khóa: đặc điểm sinh học, [AA, phân giải lan, Pseudomonas, tăng trưởng thực

vật

il

The research was conducted to investigate some plant growth promoting characteristics in some strains of Pseudomonas spp and evaluate the effectiveness of these bacterial strains on tomato plants under in vitro and greenhouse conditions Jn vitro experiment showed that all three strains of Pseudomonas spp showed plant growth promoting traits such as to resolve phosphorus, form biofilm, iron complexes, produce

phytohormones (IAA, GAs) and inability to nitrogen fixation and decompose cellulose.

Bacterial strain P3 helps improve the germination rate of tomatoes compared to the TSB medium control experiment Tomato plants treated with the same strain PI had the longest root length compared to the two control experiment Besides, two strains P3 and P5 significantly affected the initiation of lateral roots Under greenhouse conditions, two bacterial strains P3 and P5 showed the potential to promote growth in plant height, root length, leaf formation and fresh weight superior to the two control treatments from day

14 after treatment with bacteria The results of the research project demonstrated that two strains of Pseudomonas spp P3 and P5 have the ability to promote plant growth.

Keywords: biological characteristics, IAA, phosphous solubilization, plant

growth promoting, Pseudomonas.

IV

MỤC LỤC

Ch, Lo ae c6 E 6 EEtoiD2 DthEgiiBãtEi0x2SEsi20ndaannersssud iXÁC NHAN VA CAM ĐOAN 2-5222 21 21221221221112212111111111111111 211 xe ii

SCOTTI TF oscninccnieinrionetinanantaianeensalnrnataniaeonccnen |

1.1 Đặt vấn đề - + s2 2232212112111211211121111112112111121111112122112122121 2111 re |ee) Sen ằ e== Bì

123, Nội:đung nghiền GỮI<csseesesnsviseseiskEtESESE0530000161000801380M008555010050/09580407090001/018685088 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIBU 22 22222222E22E+22EE22EE22EE2Exzzxzred 32.1 Téng quan vé vi khudin 7.2.7 .ấ 32.1.1 Phân loại và phân b6 Pseudomonas trong tự nhiên -2- 22522 5s2s2s2zz>s2 32.1.2, Đặc điểm về hình thái, sinh hóa, sinh Íý sa S-SnSSSEniiiieiiie 42.2 Đặc điểm, cơ chế tổng hợp kích thích sinh trưởng ở thực vật -. - 52.2.1 Kha nang o0 on ẽ e a ,H 5

2.2.2 Kha Tae hOa tai lÃ::sssecssscscscncgggig 1á ng 01g ngà 0 G3534 c30586.005S5S84453453L41G035.381660438338813488 7 2.2.34 Koha rane sinh, TAA sss 102200465091169961608L611ã600010108)3086iL8)SG1SQMGGS3Q0GIGSDSGtGGGVSRUSRISESNi 0033 8

2.24 Khả;năng hình thành biofilms, sssszcccsssssicssssg26056435446102359256329565365.353L5y965504804005618yEE 9

22.5) Kaman SH: GAS beesereseossssnetareigesttingsbdlg2SggiSCDHIGUGIEBHGSSEGEĐIDMHG1IGG.ĐSHQG.HH00EHIĐU040.G0070-08 10 2.2.6 Kha nang phan hity cellulose 10

2.2.7 Kha năng sinh phức hợp sắt -2- 2 52222222222E22EE22E2EE2EE2EE2EEcrEzrrrrev 11

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài NUGC - 2252252222 +2£szcreesererree 12 231.) GAG Tig HIEN CU HOME TW ¡ssscsessitski.26111263210610255561038.0555880165080016/E9000600300011086000180085E 12 22:5 ATE HTH AO OAL EO occ cosemesaser nse maneneusnpnee aenesa nome nema wmrensusaeasmnasaunmnasmmnvees 13

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHAP © 0 ccssesscsessessesessessesessessesessesseeeees 143.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -¿- 2¿22222++2E+2EE2EE2EE2EE2Exzrxrrrrrrrees 14

3.2 Vật liệu và phương pháp HñghiÊTi CU ses cccceceeseussssersansnsnesncesssssnevseexecunavesnescesensesnzens 14

3.2.1 DOi tuomg nghim 1 °—,.-Ä Ả 143.2.2 Trang thiét bi va Cui) Cie cere oe ee ee ee ee ee 14

3.3, Phin phaj iS WIC GỨUssessseeseiisbhdiiEESELESEISIAS4ĐS12IS9899:914E18203.00300/0:241348/3536-0SE: 14

3.3.1 Khao sát các đặc điểm sinh học liên quan khả năng thúc day tăng trưởng của vi0110Ẽ02)27./2/71777.18)008nn0n8 aad< ẢẢ 14

3.3.1.1 Xac dinh kha 0 0ä 14

3.3.1.2 Xác định khả năng cố định dam oo cece cece cecceessessssesesseesseessessseesseeeveeeseseees 15

3.3.1.3 Xác định kha năng hình thành biofilm - 5 552 5*>+££++£+zz+eezeezess lộ 3.3.1.4 Xác định khả năng sinh [A A - 52 5-+ 2< +3 srrrvrrrrrrrrrrrrrrrrrrerree 16 3.3.1.5 Xác định khả năng sinh GA s - - 5-5 222 S* SE SH HH rrêt 16 3.3.1.6 Xác định kha năng phân giải celÏulOsSG - - 5+5 +5+£++£+z£zzezeeeeersrrrs 17

3.3.1.7 Xác định kha năng sinh phức hợp sắt 2-22 22 ©2222++2z22+zzxzzz+zzzeex T73.3.2 Thử nghiệm khả năng kích thích tăng trưởng của vi khuẩn Pseudomonas spp trêncây cà chua trong điều kiện i7-Vifr0 -2-©2¿©2222222E222E22E22E1221222122122222212212222e 183.3.3 Thử nghiệm hiệu qua thúc day tăng trưởng của vi khuẩn Pseudomonas spp trên

Ay a) Chimeric tinal IHÔösszseixszit1sscstinSssicsicti6cbigBgcebuicsssxicsbtfanrddiSiggbdsooasoctgioGdGi3Sxsas 19

51, XEE bí 194.1 Các đặc điểm liên quan đến khả năng thúc đây tăng trưởng thực vật của các dòng

PP SCUG OIMONASISP Ps gangõ ng hd he sacs ag 3sgghhiàySHiqng43133018930330183ãGta34003AG88018818.3010306880331880889:Ag036.432.85/608388.8ã 20 4.1.1 Kha nang 0.0 S 20

AD oh nate phan P14l lÃTTs<:sssó:s:z956055612434: 38046166 saat RR ERTS 20

4.1.3 Khả nang sinh TAA, và GAs a aisscrsinindioBiltitoiasssisssgix9958163405E130500911338 23020931023 8538 21

4.1.4 Kha năng hình thành biofilm, sinh phức hợp sat và có định đạm 224.2 Đánh giả ảnh hưởng của vi khuẩn đến sự nảy mam và tăng trưởng ở cà chua điều

[070/22A ga 24

4.2.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn đến sự nay mầm của cà chua -2- 22 22552 244.2.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn đến tăng trưởng của cây cà chua - 264.3 Thử nghiệm hiệu quả thúc day tăng trưởng của vi khuẩn Pseudomonas spp trên cây

CarChUA MONS Aba THÔI sassesssiesnsiistodtidiiDEHGlG1010-301i1G3803980340938.013G9881G1GG88100101G0H0EB0530G8M3009880035.46ã.8300P1 28CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA KIÊN NGHI o.00 cecscccsccsesessesecsesececsececsesecersesevsesseeseeees 33

5.1 Kết Wane ccecc ccc ccsessesessesececesssvcscesssvsscesssecseesssveavsussvesesssssssesaseseesseasacsseseseeeeeeees 33

VI

5.2 {in nh .Ầẽ 33TÀI LIEU THAM KHẢO 2 ©2222++22EEE+22EEEE222251112221111227111122111122271112.21 2e 34

vil

DANH SÁCH VIET TAT

BDKH: Biến đổi khí hậu

CMC: Carboxymethyl Cellulose

ĐC: Đối chứng

GA: Gibberrilin Acid

IAA: Indole Acetic Acid

Kha năng phân giải lân của 3 dòng Pseudomonas - 5-55 5<5<+ 20

Kết quả khả năng sinh IAA và GAs (ðig/mL) -22-5552255zz555c+2 21Khả năng hình thành biofilm, cô định đạm và sinh phức hợp sắt 23

Ty lệ nay mam (%) và chiều dai mầm của cà chua (em), - 24Chiều dai rễ và chồi cây cà chua sau 3 ngày (em) s2 +szs+2zz+sz 26Chiều cao cây cà chua sau xử lý với vi khuẩn (cm) -2- 5-52 28

Số lá trên cây cà chua sau xử lý với vi khuẩn (em) -2- 222552 29Chiều dài rễ và khối lượng cây cà chua ở 28 ngày -2- 2: 522222552 30

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hinh 4.1 Vòng phân giải cellulose của các chủng Pseudomonas spp sau 3 ngày .20 Hinh 4 2 Vòng phân giải lân của các dòng Pseudomonas spp ở 5 ngày 21 Hinh 4.3 Khả năng sinh IAA va GAs của các dong Pseudomonas SpĐ 22

Hinh 4 4 Kha nang hinh thanh biofilm (a), có định dam (b) và sinh phức hợp sắt (c)

6Ú8.5 CHUNG › SEHHOIHUTISISDDL sosansnnintisoisiisgiritsiatiolsggiiggGESSH038.063003.480081118613456001884.1888S46828EE8 23

Hình 4.5 Hạt cà chua nảy mầm khi xử lí với vi khuẩn sau 3 ngày . 25Hình 4.6 Chiều dai mam của ca chua khi xử li với vi khuẩn sau 3 ngày 26Hình 4.7 Chiều dai cây cà chua ở 28 ngày sau xử lý trong điều kiện nhà lưới (NTI:

xử lý với H2O; NT2: xử lý với TSB; lần lượt N13, 4, 5 xử lý với dịch vi khuẩn P5, P3,

PT) 2.22222222222222 2222223]

Hình 4.8 Chiều dài rễ của cây cà chua ở 28 ngày sau xử lý trong điều kiện nhà lưới.31

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong quá trình canh tác hiện nay, việc lạm dụng quá mức các hoá chất nông

nghiệp tổng hợp, phân bón hoá học đã dẫn đến tinh trạng 6 nhiễm môi trường đất vànước nghiêm trọng Hệ lụy của quá trình này không những ảnh hưởng trực tiếp tới môi

trường sống mà còn ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm và sức khỏe của người tiêudùng (Pingali, 2012; Bishnoi, 2018; Fasusi và Babalola, 2021) Bên cạnh đó, BDKH va

nóng lên toàn cầu gây ra nhiều vụ sạt lở, lũ quét, nước biển dâng làm giảm rất nhiều

diện tích đất canh tác trồng trọt Dân số thé giới vào năm 2023 đạt 8 tỷ người và theoGlick (2014) dự kiến sẽ tăng lên 10 tỷ người vào năm 2040 Điều này đồng nghĩa vớiviệc phải duy trì sản lượng nông nghiệp mặc cho diện tích canh tác ngày bị thu hẹp Các

chiến lược nông nghiệp dé cung cấp đủ nhu cầu tiêu dùng dang là một thách thức quantrong trong thé ky 21 Dé đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng thì vấn đề sảnlượng và năng suất của cây trồng nông nghiệp cũng cần được tăng lên đồng thời với việcsản xuất và vấn đề chất lượng nông sản, nông nghiệp bền vững cũng phải được đảm bảo

(Basu và ctv, 2021) Như vậy, một cuộc cách mạng mới trong nông nghiệp là thực sự

cần thiết, một cuộc cách mạng sinh học, dựa trên những yêu tố đầu vào chuyên sâu vàthân thiện với môi trường Việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc sinh học khôngnhững giảm thiêu tác động đến môi trường mà còn giúp giảm thiểu việc sử dụng cácchất hóa học, bảo vệ sức khỏe cho chính nông dân và cho người tiêu dùng Trong số cácgiải pháp sinh học ứng dụng trong nông nghiệp, chiến lược sử dụng vi sinh vật đã cómột lịch sử lâu dài, bắt đầu bằng việc trồng các loại cây họ đậu trên diện rộng vào đầu

thế ký 20

Việc ứng dụng các vi khuân có khả năng sinh các chất kích thích tăng trưởng

giúp thực vật dé dàng hap thụ chất dinh dưỡng, tao sức đề kháng chống lại mầm bệnhthực vật đang thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu Trong những thập

kỷ vừa qua, nhiều loài vi khuẩn PGPR đã được phát hiện và nghiên cứu, bao gồm một

số loài thuộc các chi Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia,

Enterobacter, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Paenibacillus, Serratia

Vi khuẩn Pseudomonas phân bố rộng rãi trong đất, nước và các hệ sinh thái nôngnghiệp, nhờ sự đa dạng về các quá trình biến dưỡng và sinh lý, chúng có khả năng thíchnghi cao với những yếu tổ bất lợi từ môi trường như nhiệt độ, độ 4m và dinh dưỡng Chúng sẽ xâm chiếm vùng rễ hoặc nội sinh trong thực vật và thúc day sự tăng trưởngbằng cách gia tăng hàm lượng hoặc tính sẵn có của các nguồn dinh dưỡng thiết yếu chocây Nhiều loài thuộc chi Pseudomonas có tiềm năng rất lớn trong việc ứng dụng làmphân bón sinh học do chúng có khả năng làm giàu các chất hữu cơ cho đất thông qua sựsản sinh của các enzyme thủy phân, cải thiện tính chất vật lý và hóa học của đất, duy trìtính sẵn có của các chất dinh dưỡng trong đất (Tian và ctv, 2020) Từ những lợi ích trên,khiến chúng thành đối tượng ứng dụng day tiềm năng trong lĩnh vực nông nghiệp.

Xuất phát từ thực tiễn, nên đề tài “ Đánh giá đặc điểm liên quan đến khả năngthúc đây tăng trưởng thực vật của một sỐ dòng Pseudomonas spp.” được thực hiện nhằmtìm ra các giải pháp nông nghiệp bền vững

1.2 Mục tiêu đề tài

Đánh giá một số đặc điểm thúc đây tăng trưởng thực vật ở một số dong vi khuẩnPseudomonas spp ở điều kiện in-vitro và điều kiện nhà lưới

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát các đặc điểm sinh học liên quan khả năng thúc đây tăngtrưởng của vi khuẩn Pseudomonas spp

Nội dung 2: Thử nghiệm khả năng kích thích tăng trưởng của vi khuẩnPseudomonas spp trên cây cà chua trong điều kiện in vitro

Nội dung 3: Thử nghiệm hiệu quả thúc đây tăng trưởng của vi khuẩn

Pseudomonas spp trên cây cà chua trong nhà lưới.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas

2.1.1 Phân loại và phân bố Pseudomonas trong tự nhiên

Phân loại của chi Pseudomonas trên NCBI:

Giới: Vi khuẩn

Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas

Vi khuan Pseudomonas thudc ho Pseudomonadaceae, b6 Pseudomonadales La

vi sinh vật linh hoạt có kha năng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu co va organic và sốngtrong các điều kiện môi trường đa dạng Chúng được tìm thấy khắp nơi trong các hệ sinhthái đất và nước và một số loài được tìm thấy ở mẫu bệnh thực vật, động vật và con

người Việc nhận diện va phân loại chính xác các loài thuộc chi này cần phải được thực

hiện một cách nghiêm túc liên quan tới rủi ro về khả năng gây bệnh của chúng cho thựcvật, động vật và cả con người Đề phân biệt vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas với cácchi vi khuẩn khác một cách hệ thống, cần xem xét dựa trên nhiều đặc điểm: tỉ lệ bazơtrong bộ gene, trình tự rRNA, thành phan lipid của tế bào, sự biến dưỡng các aminoacid, các protein của tế bào (Sokatch, 2012)

Trong hệ thống phân loại Bergey, chia các loài của chi dựa trên cơ sở các điểm

tương đồng của rRNA, phản ánh ước tính về mối quan hệ phát sinh loài Các chỉ đượcchia thành năm nhóm khác biệt bao gồm: nhóm I gồm P aeruginosa, P fluorescens, P.putida và các loài có liên quan, còn được gọi là “Pseudomonas thật” hoặc “pseudomonad

huỳnh quang” do khả năng tiết sắc tố huỳnh quang tan trong nước Bốn nhóm còn lại

được phân thành các loại riêng biệt Nhóm II được phân loại lại thành Burkholderia và

Ralstonia Nhóm III gồm P testosteroni phân loại lại thành Comamonas, Delftia Nhóm

IV phân loại thành Hydrogenophaga và P saccharophila (chưa được phân loại lại cho

đến nay) Nhóm V bao gồm P diminuta va P vesicularis được phân loại lại thành

Brevundimonas Hiện này chi Pseudomonas bao g6m 216 loài với 18 phân loại và số

lương không ngừng tăng (Chu Nguyên Thanh, 2018) P aeruginosa là một chất hoạtđộng bé mặt sinh học nổi tiếng sản xuất căng thăng Các chất hoạt động bề mặt sinh học

do chủng nảy tạo ra có hiệu quả trong khoa học môi trường theo một số cách cũng cótiềm năng kiểm soát sinh học do sản xuất chất chuyển hóa kháng nam (Bakthavatchalu

và ctv, 2013) Mặc đù có tầm quan trọng về môi trường và nông nghiệp, nhưng cũng làmột mam bệnh cơ hội của con người có thé gây ra nhiễm trùng ở bệnh nhân xơ nang,

bệnh nhân ung thư cá nhân đang trải qua hóa trị liệu và bị bỏng nặng (Wagner và ctv,

2008; Goncalves-de-Albuquerque va ctv, 2015) Vai trò tích cực và tiêu cực như vậy

của cùng một chủng đòi hỏi ứng dụng can thận của nó cho một mục đích cu thé

2.1.2 Đặc điểm về hình thái, sinh hóa, sinh lý

Pseudomonas có hình que, lông roi thường ở một đầu, kích thước 0,5 — 0,8 uum x

1,5 — 3,0 um Tế bào có hình que thang hoặc hoi cong, không sinh bào tử Di động nhờmột hoặc một số roi ở cực Ngoài roi vùng cực, một số loài (P stutzeri, P mendocina)cũng có thê hình thành roi bên ngắn hơn Số lượng roi có tầm quan trọng về mặt phân

loại Chúng thuộc v1 khuẩn gram âm, hiếu khí nhưng trong điều kiện ky khí thì sử dụng

oxy làm chat nhận điện tử cuối cùng, một số trường hợp có thé sử dụng Nitrat làm chatnhận điện tử thay thế và cho phép tăng trưởng xảy ra Pseudomonas có thé phát triểntrong môi trường chỉ có N và 1 chất hữu có làm C va năng lượng duy nhất, hầu hếtkhông cần thêm các yếu tố tăng trưởng hữu cơ Có khả năng tích lũy Polydydrobutyate

có độ dài cao hơn C trên môi trường chứa ankan và gluconat Dương tính với phản ứng

oxidase, Catalase Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của Pseudomonas là 28 đến 32°C,

và chúng có thể phát triển ở pH từ 5 - 8, không chịu được điều kiện acid (< pH 4,5).Hàm lượng mol% G +C của DNA là 58 — 69% Một đặc tính phố biến của Pseudomonas

là khả năng phát sáng dưới điều kiện tia UV (Sokatch, 2014)

Sự tông hợp đưới những điều kiện sinh trưởng nhất định của các sắc tố màu vànglục, huỳnh quang, hòa tan trong nước là một tính chat đặc trưng của một số Pseudomonasspp Những loài này đều là thành viên của cùng một nhóm tương đồng di truyền củatRNA trong cùng loài Chúng trong nhóm “Pseudomonas thật” bao gồm P aeruginosa,

P putida, P fluorescens và mầm bệnh thực vat của chủng P syringae Một số sắc tốnhư pyoverdine màu vàng lục, phenazine, pyocyanin màu xanh lam Quá trình sinh tổnghợp sắc tố pyoverdine (xanh lục) liên quan tới trình trạng khi vi khuẩn thiếu sắt Cả quá

trình sinh tổng hợp và tính chất hóa học của nó (sự hình thành phức hợp Fe** ồn định)

cho thấy sắc tổ huỳnh quang là một siderophore Nhiều yếu tố môi trường khác nhauảnh hưởng đến quá trình tổng hợp các sắc tố này, đáng chú ý là bản chất hóa học của

carbon hữu cơ và nguồn năng lượng Tuy nhiên cho đến nay, không có vai trò sinh lý rõràng nào được gan cho loại sắc tố này (Meyer va ctv, 1978), pyoverdine từ P aeruginosa

rất cần thiết cho độc lực trong mô hình động vật, Pyoverdine cũng có thể là một công

cu dé xác định Pseudomonas vì mỗi nhóm gen được đặc trưng bởi một loại pyoverdine

cụ thé Các sắc tố khác được tạo ra bởi các loài Pseudomonas bao gồm pyocyanin (P

aeruginosa, mau lam), pyorubin (P aeruginosa, màu đỏ), chlororaphin (P chlororaphis, mau lục), pyomelanin (P aeruginosa, mau nâu/đen) P mendocitia cókha nang tao ra sắc tố caroten (Novik, Savich và Kiseleva, 2015)

2.2 Đặc điểm, cơ chế tổng hợp kích thích sinh trưởng ở thực vật

Vi khuẩn vùng rễ thúc đây tăng trưởng thực vật (PGPR) bao gồm các vi khuẩn

cư trú trong vùng rễ và cải thiện sức khỏe của thực vật, cuối cùng là hỗ trợ tăng cường

sự phát triển của thực vật Chúng được phân loại thành 2 loại vi khuẩn Rhizobacterianội bào (iPGPR) tồn tại bên trong tế bào rễ, đặc biệt là cấu trúc nốt san và vi khuẩnRhizobacteria ngoại bào (ePGPR) có mặt ở vùng rễ hoặc trong khoảng trồng giữa các

tế bào rễ (Jha và Saraf, 2015) Theo Antoun và Kloepper (2001), có khoảng 2 — 5% vikhuẩn vùng rễ là PGPR Vi khuẩn thuộc nhiều chi khác nhau đã được xác định là PGPR,trong đó Bacillus spp và Pseudomonas spp chiếm ưu thê Pseudomonas spp là vi khuẩngram âm thuộc nhóm ePGPR có khả năng tăng cường sinh trưởng của cây trồng thông

qua cơ chế tác động trực tiếp hoặc gián tiếp Một số thuộc tính PGP như hòa tan

phosphate, cố định nitơ, tổng hợp siderophore, tổng hợp các loại hormone kích thích

tăng trưởng, hệ rễ ở cây và chống chịu bảo vệ thực vật khỏi các stress sinh học, phi sinh

học Cơ chế gián tiếp giúp tạo ra sức đề kháng toàn thân, kiểm soát sinh học các mầmbệnh thực vật và ức chế các vi sinh vật có hại khác thông qua ký sinh, cạnh tranh chất

dinh dưỡng.

2.2.1 Khả năng cố định đạm

Nitơ là một chất dinh dưỡng đa lượng quan trọng cho sự tăng trưởng và phát triểncủa thực vật, có liên quan đến quá trình quang hợp, vật liệu xây dựng trong tông hợpprotein và thành phan chính trong nucleic acid ở dạng bazơ nitơ Lượng nitơ trong đấtnông nghiệp rất hạn chế do mắt nitơ thường xuyên Tuy nhiên, thực vật không thể trựctiếp sử dụng nitơ từ khí quyên Trong hoàn cảnh này, PGPR đóng vai trò chính trong

việc cô định nito và bổ sung chất dinh dưỡng vào dat cho cây trồng Các vi sinh vật cóđịnh nito này được phân loại thành hai nhóm khác nhau như các vi sinh vật có định nitơsống cộng sinh và sống tự do (Geller và Barzily-Rokmi, 2017) Vi khuẩn cô định đạmcộng sinh vẫn liên kết chặt chẽ với rễ cây và xâm nhập vào rễ, tạo thành nốt san Các vikhuẩn thúc day tăng trưởng thực vật cộng sinh bao gồm Rhizobium, Sinorhizobium,

Bradyrhizobium, va Mesorhizobium với cây họ đậu và Frankia với cây không họ đậu và

cây bụi (Zahran, 2001) Các chi cố định đạm không cộng sinh bao gồm Azotobacter,

zospirillum, Acetobacter, Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas

Gluconacetobacter và vi khuẩn lam như Anabaena va Nostoc (Vessey, 2003;Bhattacharyya va Jha, 2012) Ca sinh vat có định đạm sống cộng sinh và sống tự do đềuchứa gen nif để cô định đạm

Pseudomonas thuộc cả 2 nhóm vi khuẩn sống tự do và nội sinh Hầu hết, cácchủng pseudomonas không có khả năng cố định đạm Ngoài trừ chủng P s/z/zeri đượcnghiên cứu có khả năng cô định đạm phân lập từ rễ cây cao lương (Krotkzy và ctv 1987).Hiện nay, các thí nghiệm liên quan đến Pseudomonas cô định N2 đều báo cáo là ?.stutzeri Một vùng trong chủng P stutzeri tương ứng với hầu hết gene z// và gen rnf mãhóa enzyme nitrogenase - một loại enzyme quan trọng cần thiết cho có định nitơ Việc

áp dụng PGPR trên cây trồng giúp quản lý tông thể dịch bệnh, thúc đây tăng trưởng,củng có hệ thông phòng thủ của cây trồng và duy trì mức nito trong đất Ngay sau đó,

sự có định Na bởi các chủng khác nhau liên quan đến các loài Pseudomonas được thừa

nhận sau đó đã được báo cáo: P saccharophila ATCC 15946 (Barraquio va ctv, 1986);

P diazotrophicus (Watanabe và ctv, 1987) với phương pháp xác định gen NI Jenni B.

và ctv (1989) đã phân lập được các chủng gần giống với P pseudoflava bằng cách thay

đổi phương pháp phân lập ban dau Các chủng này có thé phát triển tích cực đưới dang

sinh vật tự dưỡng oxy hóa Ha, với Na là nguồn nito duy nhất Khả năng cô định N 2 củachủng P pseudoflava bang thử nghiệm khử axetylen và bằng lai DNA với các gennifHDK của Klebsiella pneumoniae làm mẫu dò Bên cạnh đó, các nghiên cứu hiện nay

đã có những sáng tao thay thế chuyển gene cô định đạm dé tạo ra các chủng vi khuẩn

Pseudomonas biên đôi gen hoạt động như một phân bón sinh học có hoạt tính cố định

đạm sinh học Jing va ctv (2020) đã sử dụng công nghệ nhân ban và chuyền gen đảo nif

(mã hóa enzyme nitrogenase) từ P stutzeri DSM4166 sang P protegens Pf-5 dé xây

dựng chủng tái tô hợp có đặc tính có định đạm và kiểm soát sinh học biểu hiện kiểu hình

thành công trên cây lúa mì và dưa chuột.

2.2.2 Khả năng hòa tan lần

Lân là một trong những chất dinh dưỡng chính chỉ đứng sau nitơ trong nhu cầucủa cây trồng Nhưng thực vật chỉ có thé hấp POs; HPO¿7 là dạng hòa tan củaphosphate Hầu hết lân trong đất tồn tại ở dạng photphate không hòa tan và cây trồngkhông thé sử dụng được Khả năng của một số vi sinh vật chuyên đổi photphat khônghòa tan thành dạng dễ tiếp cận, như orthophosphate đó cũng là một đặc điểm quan trọngtrong PGPR dé tăng năng suất cây trồng Vi khuẩn hòa tan photphat trong vùng rễ có

thê là một nguồn đầy hứa hẹn cho tác nhân thúc đây tăng trưởng thực vật trong nông

nghiệp Cơ chế chính của quá trình hòa tan P dựa trên sự bài tiết acid hữu cơ của vikhuẩn đo quá trình chuyên hóa dextrose Các sinh vật cư trú trong vùng rễ (PGPR) sửdung Dextrose từ dịch tiết của rễ; chuyền hóa nó dé tao ra axit hữu co Acid hữu cơ được

vi khuẩn tiết ra như acetic acid, lactic, malic, succinic, tartaric, gluconic, 2-ketogluconic,

oxalic va citric Các axit này hoạt động như phan ứng chelate cho các cation Ca?” đi kèm

với việc giải phóng photpho từ các hợp chất photpho không hòa tan Axit hữu cơ cũng

có thé tạo phức tan với ion kim loại liên kết với photpho không hòa tan, do đó giải phóng

photphat Cơ chế của nhiều vi khuẩn hòa tan phosphate làm giảm độ pH của môi trường(Bau va ctv, 2021).

Pseudomonas được biết là 1 loài có kha năng hòa tan phosphat tốt trong nhóm

PGP Pseudomonas fluorescens, Erwinia herbicola, Pseudomonas cepacia,

Pseudomonas putida được bao cáo có khả nang sản xuất hiệu qua axit gluconic, đây làtác nhân hiệu quả nhất trong quá trình hòa tan khoáng photpho Những ảnh hưởng tíchcực lên thực vật từ việc bồ sung các chủng vi sinh vật có kha năng hòa tan và khoánghóa photpho hoặc phối hợp với các PGPR khác đã được chứng minh cả trong điều kiện

in vitro lan ngoài đồng ruộng Việc bổ sung dé gia tăng mật độ của các vi sinh vật nàytại vùng rễ là điều cần thiết Theo Kour và ctv (2020) đây là báo cáo đầu tiên về chủngPseudomonas libanensis (EU-LWNA-33) hòa tan một lượng P đáng ké trong điều kiệnthiếu nước có tác động chống lại hạn hán hiệu quả, ảnh hưởng tích cực khả năng nảymam của hạt, thúc đây tăng trưởng của cây trồng He và ctv (2019) đã cho thay chủngPseudomonas putida Rs-198 làm tăng khả năng hap thụ NPK giúp tăng trưởng mạnh

mẽ và giảm stress han mặn trên cây hô tiêu.

2.2.3 Khả nang sinh TAA

Indole—3-acetic acid ([AA) là một thành viên trong họ auxin của phytohormones

có ảnh hưởng đến nhiều chức năng của tế bao trong thực vật và do đó là chất điều hòaquan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật bao gồm quá trình hìnhthành cơ quan, phản ứng nhiệt đới, phản ứng tế bào như tế bảo Auxin, indole-3-aceticacid (IAA), là một phytohormone quan trọng được san xuất bởi một số chủng PGPR và

người ta biết rằng việc xử lý vi khuẩn vùng rễ sản xuất [AA làm tăng sự phát triển của

cây trồng Sự sản sinh IAA của vi khuẩn kết hợp với auxin nội sinh từ thực vật anhhưởng đến sự phân chia, kéo dài và biệt hóa tế bào, khởi phát sự hình thành rễ bên và rễ

bất định làm gia tăng bề mặt và chiều dài rễ vì thế cung cấp cho thực vật nhiều khả năng

hấp thụ dinh dưỡng từ đất Do đó, cây trồng được xử lý IAA trong thời gian dài có bộ

rễ phát triển cao, từ đó cho phép cây hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn, cuối cùng hỗ trợ

sự phát triển tông thé của cây Khoảng 80% hệ vi khuẩn trong vùng rễ tao ra IAA; vivậy việc áp dụng các vi sinh vật như vậy trên đồng ruộng giúp tăng cường mức độ IAAnội sinh của cây trồng và nó có tác dụng đáng kể đối với sự phát triển của cây trồng

(Goswami va ctv, 2016).

Các PGPR khác nhau có các lộ trình tổng hop IAA khác nhau Hau hết các PGPRnày sử dụng L-tryptophan được tiết ra trong dịch tiết của rễ như một tiền chất đề sảnxuất IAA IAA được tổng hợp bởi các vi khuẩn có liên quan đến thực vật thông qua các

con đường độc lập và phụ thuộc vào tryptophan Có ba con đường phụ thuộc vào

L-tryptophan đã được biết đến (1) tổng hợp IAA thông qua con đường Indole-3-pyruvic

acid (IPyA) có các loài đặc trưng như Rhizobium, Bradyrhizobium va Azospirillum (2)

tổng hợp IAA thông qua Con đường Indole-3-acetamide (IAM) tìm thấy chủ yếu ở một

số vi khuẩn gây bệnh như Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas syringae, Pantoea

agglomerans, Rhizobium, Bradyrhizobium va Erwinia herbicola và các loài Pseudomonas hoại sinh như P putida và P fluorescens (3) thông qua con đường

tryptamine (Meliani va ctv, 2017) Con đường không phụ thuộc vào tryp, phổ biến hơn

ở thực vật nhưng cũng được tim thay ở Azospirilla và Cyanobacteria

Các nhân tố môi trường ảnh hưởng tới sự sinh tổng hop IAA ở vi khuan bao gồm

pH acid, stress thâm thấu và chất nền, sự giới hạn nguồn carbon Bên cạnh đó, yếu tố ditruyền bao gồm vị trí gene và kiểu biểu hiện của gene cũng ảnh hưởng tới mức độ sảnsinh IAA Khi nồng độ IAA trong cây ở mức tối ưu, việc bồ sung IAA từ vi khuan có

thể có các hiệu quả trung tính, tích cực hoặc tiêu cực lên sự tăng trưởng của thực vật.Một bài nghiên cứu của Samira Tabatabaei và ctv (2016) và Nadeem (2016) đã nói đến

sự ức chế tăng trưởng khi nồng độ của phytohormon cao trên cây lúa mì

mặn bằng cách giảm hàm lượng Na” có sẵn cho sự hấp thu của thực vật Sự xâm nhập

hiệu quả vào rễ cây của các vi khuẩn sản xuất EPS giúp giữ P tự do từ P không hòa tantrong đất và luân chuyền chất dinh dưỡng thiết yếu cho cây để tăng trưởng và phát triểnthích hợp và bảo vệ cây khỏi sự tấn công của mầm bệnh ngoại lai

Sự hình thành của ma trận màng sinh học được thực hiện theo từng giai đoạn.

Ban đầu, các vi sinh vật bám vào một bề mặt được gọi là bám dính chính; những vi sinhvật này có cấu trúc tế bào khác nhau như lông hoặc roi và các enzym gọi là chất kết dínhtạo điều kiện thuận lợi cho sự kết dính nay Tinh di động có thể giúp vi sinh vật chốnglại các lực ky nước thường đây chúng ra khỏi bề mặt Trong giai đoạn thứ hai, các visinh vật bám đính thành công bắt đầu phân chia, lan rộng xung quanh vị trí ban đầu vàhình thành các vi khuẩn lạc Giai đoạn tiếp theo bắt đầu với sự bài tiết của các vi sinhvật của các exopolysacaride khác nhau bao gồm alginate, cellulose, n-acetylglucosamine

va galactose Cudi cùng, các vi khuân lạc được nhúng trong ma trận exopolymer bat dau

tự giải phóng khỏi ma trận và có thể lặp lại quá trình ở một vi trí khác (Zboralski va ctv,

2020) Một màng sinh học thường mang lại khả năng tăng cường cho các vi sinh vật tích hop Chi Pseudomonas là một trong những vi sinh vật tạo mang sinh học được nghiên

cứu kỹ lưỡng nhất Chúng tạo ra nhiều loại phân tử hữu cơ, bao gồm polysaccharide,axit nucleic và protein được sử dụng dé tạo thành chất nền mang sinh học (Olanrewaju

và ctv, 2019) Sản lượng EPS được báo cáo ở các chủng như Pseudomonas aeruginosa,

Bacillus subtilis và Streptococcus mutans Theo nghiên cứu của tác giả Ansari va ctv,

Ching Pseudomonas azotoformans (FAP5) làm giảm căng thang hạn hán ở cây lúa mì

có liên quan tới việc sản xuất exopolysacarit (EPS) bởi gen AdnA và FIiC Sản xuất cáctính trạng PGP và phát triển màng sinh học bằng FAPS đã được thể hiện ngay cả trong

điều kiện căng thắng về nước trong ống nghiệm

2.2.5 Khả năng sinh GAs

Gibberellic Acid (GAs) là một nhóm lớn các phytohormone cau thành tới 136phân tử có cấu trúc khác nhau (Hedden, 2000) Nó là một nhóm các kích thích tố thựcvật ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển ở thực vật bậc cao, bao gồm hạt nảy mầm,kéo dài thân, ra hoa và đậu quả Cho đến nay, 136 GA từ 128 loài thực vật đã được biết

đến, 28 GA từ 7 loài nam va chỉ 4 GA (GA 1, GA 3, GA 4 và GA 20) từ 7 loài vi khuẩn

đã được xác định Cấu trúc chung của các loại chất điều hòa sinh trưởng này là một bộxương gồm 19-20 nguyên tử carbon (Gutierrez-Manero va ctv, 2001; Bastian và ctv,

1998; MacMillan, 2001) So dĩ gibberellin có tac dung rõ rệt là do các hormone nay có

thé di chuyên từ rễ đến các bộ phận trên không của cây Ngoài Azospirillum spp vaRhizobium spp việc sản xuất các chất giống như gibberellin cũng đã được tuyên bố ởnhiều loài vi khuẩn Thúc đây tăng trưởng thực vật bởi các loài PGPR tạo ra GAs đã

được báo cáo Axit gibberellic và gibberellin như các hợp chất đã được xác định trong

các nền văn hóa của 4zofobacfer chroococcum, A baijerinckii, A vinelandii, A paspali,nhiều pseudomonas và trực khuẩn Một số chủng pseudomonas sản xuất nhiều loại auxin

và gibberellin ở nồng độ lớn

2.2.6 Khả nang phân hủy cellulose

Cellulose là sản phẩm chính của quá trình quang hợp trong môi trường trên cạn

và nguồn sinh học tái tạo phong phú nhất được tạo ra trong sinh quyên (Jarvis, 2002;Zhang và Lynd, 2004) Thực vật là nguồn cellulose đồi dao nhất và được tìm thấy dướidạng vi sợi (“đường kính 2-20 nm” va chiều đài “100-40.000 nm”) Cellulase là một

10

trong những enzyme được sản xuất chủ yếu bởi nam, vi khuẩn và động vật nguyên sinhxúc tác quá trình phân giải cellulose (sự phân hủy cellulose và một số polysacarit có liênquan) Vi khuân có tốc độ tăng trưởng cao so với nam có tiềm năng tốt dé sử dụng trongsản xuất cellulose Tuy nhiên, việc ứng dung vi khuẩn trong sản xuất cellulase là không

được sử dụng rộng rãi Khả năng phân giải tế bào của một số chi vi khuân nhưCellulomonas, Cellvibrio, Pseudomonas spp (Nakamura va Kitamura, 1982) Một ứng

dụng thường thay của các vi khuẩn có lợi trong nông nghiệp là khả năng phân hủy cácvật liệu hữu cơ như cellulose Sự phân hủy của cellulose trong các phế phẩm nôngnghiệp giúp thúc đây nhanh quá trình hình thành compost, cải thiện các đặc tính hóa lý

của dat, tạo môi trường thuận lợi cho sự phát triển của quần xã vi sinh vật, thúc đây tăng

trưởng thực vật Theo Yamane va ctv (1971) cho rang Pseudomonas flourescens được

cho là vi khuẩn có kha năng phân giải được cellulose nhờ hệ enzyme ngoài bao (A; B)

và 1 hệ enzyme liên kết bên trong tế bào (C) Pseudomonas mucidolens được phân lập

từ trùn quế có xúc tác enzyme cellulase ứng dụng trong phân hủy polyethylene

(Krishnaswamy và ctv, 2022).

2.2.7 Khả năng sinh phức hợp sắt

Sắt là một chất dinh đưỡng cần thiết cho cây trồng Nó hoạt động như một đồngyếu tố trong một số enzyme cần thiết cho các quá trình sinh lý quan trọng như hô hấp,quang hợp và có định đạm nên sự thiếu hụt của nó được thé hiện trong các biến đổi traođổi chất nghiêm trọng Sắt có khá nhiều trong đất nhưng thường không có sẵn đối vớithực vật hoặc vi sinh vật trong đất Loại hóa chất chiếm ưu thé, Fe** là dạng oxy hóa

phản ứng tạo thành các oxit và hydroxit không hoa tan mà thực vật và vi sinh vật không

thể tiếp cận được Thực vật đã phát triển hai chiến lược dé hấp thụ sắt hiệu quả Đầu tiênbao gồm giải phóng các hợp chất hữu cơ có khả năng chelating sắt, do đó làm cho nóhòa tan ở nơi nó khuếch tán về phía cây trồng, bị khử và hấp thụ bằng hệ thống enzym

có trong màng tế bào của cây trồng Chiến lược hai các phytosiderophores được hìnhthành bởi hợp chất hữu cơ và Fe*", trong đó sắt bị khử bên trong cây và dé dang hap thụ.PGPR đã hình thành các cơ chế chuyên biệt để đồng hóa sắt, bao gồm sản xuất các hợpchất phức hợp sắt có trọng lượng phân tử thấp được gọi là siderophores, giúp vận chuyênnguyên tố Fe vào tế bào của thực vật (Payne, 1994)

Siderophore là các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, thường dưới 1 kDa,chứa các nhóm chức năng có khả năng liên kết sắt theo cách thuận nghịch Siderophores

11

được chia thành ba nhóm chính, tùy thuộc vào nhóm chức năng đặc trưng Các vi sinh

vật tạo ra nhiều loại siderophores Các nhóm chức siderophore phổ biến nhất của vikhuẩn là catecholate (tức là enterobactin) và một số là carboxylat (tức là rhizobactin) vahydroxamate (tức là ferrioxamine B) Nong độ siderophore trong đất vào khoảng10-30M Vi khuẩn sản xuất siderophore thường thuộc chi Pseudomonas, trong đó cácsinh vật được nghiên cứu nhiều nhất là Pseudomonas fluorescens và Pseudomonas

aeruginosa giải phóng loại siderophores pyochelin và pyoverdine (Haas và Défago,

2005) Một hợp chất khác có hoạt tinh siderophore được tạo ra bởi Pseudomonas spp

là salicylic acid (SA; 2-hydroxybenzoic acid), đồng thời cũng là tiền chất trung giantong hợp siderophore như pyochelin và dihydroaeruginoic acid ở P aerugionosa hoặcpseudomonine ở P fluorescens Vi khuẩn vùng rễ giải phóng các hợp chat này dé tăng

khả năng cạnh tranh của chúng, vì chúng có hoạt tính kháng sinh và cải thiện dinh dưỡng

sắt cho cây trồng PGP sản xuất Siderophore cải thiện sức khỏe thực vật ở nhiều mức độ

khác nhau: (1) tổng hợp phức hợp sắt ở quanh vùng rễ giúp thực vật cải thiện dinh dưỡngsắt; (2) ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác bằng cách giải phóng phân tử khángsinh của chung; (3) cản trở sự phát triển của nắm bệnh bằng cách cạnh tranh lượng sắt

có sẵn đề nắm bệnh không thê hấp thụ phức hợp siderophore (Shen và ctv, 2013)

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Tình hình hiện nay, các nghiên cứu trong nước về PGPR còn khá khiêm tốn Rấtnhiều báo cáo khoa học về Pseudomonas spp về tuyên chon chủng có hoạt tinh khángkhuẩn, khả năng đối kháng với bệnh thực vật do nam hoặc vi khuẩn gây ra, xác định đặctính dé tìm ra hướng chữa bệnh trên người Phương hướng nghiên cứu của PGP trong

nước đang chú trọng đến phân lập, tuyên chọn chủng, khảo sát một số đặc điểm sinh hóa

liên quan đến khả năng thúc đây tăng trưởng thực vật, đánh giá hiệu quả tác động lênthực vật hoặc hiệu quả kiểm soát sinh học Đã có các báo cáo công bồ về đánh giá tác

động của vi khuẩn với PGP trong điều kiện in-vitro Đặng Thị Ngọc Thanh và ctv (2016)

đã chọn lọc và đánh giá vi khuẩn Bacillus subtilis và Azotobacter vinelandii ảnh hưởng

đến sự tăng trưởng của cây bắp (Zea mays L.) trồng trong chậu Ở điều kiện 75% NPKcác dòng đều làm gia tăng có ý nghĩa thống kê chiều cao cây, khối lượng thân lá và rễtươi, khối lượng chất khô Chu Nguyên Thanh (2018) đánh phân lập và đánh giá thành

công chủng P faiwanensis thuộc nhóm P putida thúc day sự tăng trưởng rễ và chéi của

12

hai đối tượng thực vật được nghiên cứu là A thaliana và Zea mays L.(cây bắp) Một sốnghiên cứu của các tác giả thành công trong việc ứng dụng một số PGP trên đối tượngcây trồng ở quy mô nhà lưới và đồng ruộng.

2.3.2 Tình hình ngoài nước

Đến nay, các nghiên cứu về khả năng thúc đây tăng trưởng thực vật và ứng dụngcủa PGPR trong thực hành nông nghiệp trên thế giới được quan tâm và đạt nhiều thànhcông Các phương pháp nghiên cứu chủ đạo là phân lập vi khuẩn, đánh giá chọn lọcchủng có hoạt tính cao trên mô hình in vitro, trong điều kiện vườn ươm cũng như trênquy mô đồng ruộng

Nghiên cứu của Sharma va Sushil (2011) từ 13 chủng đã chọn ra được 5 chủng

Pseudomonas spp đều làm tăng đáng ké hoạt động của enzyme trong đất, ngoại trừ acidphosphatase, tông năng suất của hệ thống và sự hấp thu chất đinh đưỡng trong đánh giá

thực địa ngoài ruộng của cây đậu nành và lúa mì.

Bên cạnh đó, các chủng PGPR còn được đánh giá, nghiên cứu khả năng kiểmsoát sinh học của PGPR đối với các tác nhân gây hại như côn trùng, tuyến trùng MariaPéchy-Tarr va ctv (2013) cho rang Pseudomonas fluorescens CHAO là một tác nhânkiểm soát sinh học liên quan ức chế hoạt động của các loại côn trùng gây hại thông quaviệc chủ động tạo ra độc tổ trên gen fitD Alaa Fathalla Mohammed (2018) và Maqshoof

Ahmad (2013) đã xác định hiệu quả exopolysaccharides và mang sinh hoc (biofilm),

sinh IAA hình thành tăng trưởng thực vật thúc đây rhizobacteria đáp ứng cải thiện tình

trạng stress phi sinh học (khả năng chịu mặn, ) của đậu faba (Vicia faba L.) cây bông

vải (Dilfuza Egamberdieva và ctv, 2015) và cây đậu xanh (Vigna radiata L.) Chủ đềnày nhận được nhiều sự quan tâm, nhất là trong tình hình biến đổi khí hậu ngày một gia

tăng và sự lạm dụng các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học gây ảnh hưởng đếnsức khỏe con người.

13

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

3.1 Thời gian va địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 3 năm 2023 đến tháng 3 năm 2024 tại Phòng Sinhhọc Tích hợp Thực vat, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ

Chí Minh.

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguồn: dòng vi khuân Pseudomonas P1, P3, P5 được cung cấp từ phòng PhongSinh học Thực vật Ứng dụng thuộc Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học NôngLam Thành phó Hồ Chí Minh Hạt giống cà chua Phú Nông F1, Việt Nam

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Cân kỹ thuật, noi hap tiét tring, may vortex, may ly tam, tu cay, tu lanh,

kinh hién vi, 16 vi song, may lac, may do pH, may do OD, tu say

Dung cu: Que cấy, nước cat, tăm bông vô trùng, micropipette 10 pl, 100 pl, 1000

ul va các loại dau tip tương ứng, dia petri, ống nghiệm, đèn cồn, cốc thủy tinh, ống dong

và một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm

Nhà lưới, kích thước chậu trồng 25 x 21 cm, khay ươm hạt, thước dây, cân điện

tử, bình phun, dụng cụ ghi chép số liệu, giá thể: đất sạch, phân chuồng, vôi, tro với tỉ lệ

4:1:1:1.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát các đặc điểm sinh học liên quan kha năng thúc day tăng trưởng của

vi khuẩn Pseudomonas spp

Nội dung này được thực hiện thông qua các khảo sát gồm: khả năng phân giảilân, cố định đạm, phân giải cellulose, sinh phức hợp sắt, hình thành biofilm, sinh tổng

hop IAA và GAs,

3.3.1.1 Xác định kha phân giải lan

Phương pháp: Nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường TSB (hãng Hi-media, Pancreatic

digest of Casein (17 g/L); Enzymatic digest of soya bean (3 g/L); NaCl (5 g/L); KaHPOx

(2,5 g/L); dextrose (2,5 g/L) trong 24h, 30°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút Lay dich vikhuẩn nuôi cấy (OD 600nm = 0,1) chấm điểm trên môi trường Pikovskaya Agar

(dextrose 10 g/l; (NH4)2SOu4 0,5 g/l; NaCl 0,2 g/l; MgSO4.7H20 0,1 g/l; KCI 0,2 g/l;

14

Yeast extract 0,5 g/l; MnSOa.HaO 0,002 g/l; FeSO4.7H20 0,002 g/1, Ca:POa 5g/1)) Cho

cho khô rồi ủ ở 30°C trong 3 ngày

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗinghiệm thức sẽ thực hiện ba lần lặp lại Thí nghiệm được bố trí giống nhau ở 3 chủng

Pseudomonas.

Chỉ tiêu theo dõi: Sự hiện diện của vòng tan xung quanh khuẩn lạc chỉ ra khả

năng hòa tan các nguồn P Chi số hòa tan P có thé được tính bang cách lấy tông đường

kính vòng tan (khuẩn lạc + vòng tan) chia cho đường kính khuẩn lạc

3.3.1.2 Xác định khả năng cố định đạm

Phương pháp: Nuôi cay vi khuẩn ở môi trường TSB (Hi-media, Pancreatic digest

of Casein (17 g/L); Enzymatic digest of soya bean (3 g/L); NaCl (5 g/L); KzHPO¿ (2,5

g/L); dextrose (2,5 g/L)) trong 24h Cay ria vi khuẩn trên môi trường Burk’s vô đạm

(sucrose 10 g/L, KH2PO, 0,41 g/L, K2HPOs, 0,52 g/L, NaSO¿ 0,05 g/L, CaC]› 0,2 g/L,

MgS0Ou4.7H20 0,1 g/L, FeSO4.7H20 0,005 g/L, NaMoOxz.2H20 0,0025 g/L) (Park va ctv,

Phương pháp: Nuôi cay vi khuẩn ở môi trường TSB (Hi-media, Pancreatic digest

of Casein (17 g/L); Enzymatic digest of soya bean (3 g/L); NaCl (5 g/L); KzHPOa

(2,5 g/L); dextrose (2,5 g/L) trong 24 giờ Hút 100 ul dich huyền phù vi khuẩn (OD600nm = 0,1) cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường TSB Nuôi cấy ở 30°C trong

5 ngày rồi nhẹ nhàng đồ bỏ dịch nuôi cấy Rửa ống nghiệm với nước cat, dé khô rồi

nhuộm với dung dịch Crystal Violet 0,1% (0,2 g Crystal Violet; 100 ml CH30H; 20 ml

CH:COOH; 80 ml H20) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Dé bỏ thuốc nhuộm và rửa lạibằng nước cất 3 lần

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗinghiệm thức sẽ thực hiện ba lần lặp lại Thí nghiệm được bố trí giống nhau ở 3 chủng

Pseudomonas.

15

Chỉ tiêu theo dõi: Sự hình thành biofilm trên thành ống được phát hiện khi cómột vạch hoặc các mang bat màu thuốc nhuộm bám trên thành hoặc đáy ống nghiệm.

3.3.1.4 Xác định kha năng sinh IAA

Phương pháp: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSB (Hi-media, Pancreaticdigest of Casein (17 g/L); Enzymatic digest of soya bean (3 g/L); NaCl (5 g/L); KaHPOx

(2,5 g/L); dextrose (2,5 g/L) bổ sung L-trytophan 100 mg/L ở 30°C, tốc độ lắc 150vòng/phút trong 5 ngày Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút dé loại bỏ sinh khối Hút

2 mL dịch nổi phía trên cho vào ống nghiệm mới Thêm 4 mL thuốc thử Salkowski(FeC1: 0,5 M 15 ml, H›SO¿ 98% 300 ml, nước cất 500 ml) U hỗn hợp ở nhiệt độ phòng,

tránh ánh sáng trong 25 phút Do độ hap thu của hỗn hợp ở bước sóng 530 nm

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi

nghiệm thức sẽ thực hiện ba lần lặp lại Thí nghiệm được bồ trí giống nhau ở 3 chủng

Pseudomonas.

Chỉ tiêu theo doi: Hỗn hợp chuyên sang màu hồng chỉ ra sự hiện diện của IAAtrong dịch nuôi cay Nồng độ IAA được xác định dựa trên đường tương quan giữa nồng

độ IAA chuẩn với giá trị OD 530 nm

3.3.1.5 Xác định khả năng sinh GAs

Phương pháp: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường NB (peptone (5 g/L), NaCl(5 g/L); beef extract (1,5 g/L); yeast extract (1,5 g/L) ở 30°C, tốc độ lắc 150 vòng/phúttrong 5 ngày Ly tâm 15 mL môi trường dịch thể Nutrient Broth trong 10 phút với tốc

độ 8000 vòng/phút Lấy 10 mL phần dung dịch trên bề mặt (phần nước trong), thêm

2 mL dung dịch kẽm axetat và 2 mL kali ferrocyanide vào Sau đó mang đi ly tâm trong

10 phút ở tốc độ 8000 vòng/phút Lay 5 mL phan nổi phía trên thêm vào 5 mL acidclohydric 30% và ủ ở 27°C trong 75 phút Do độ hấp thu của hỗn hợp ở bước sóng

3.3.1.6 Xác định khả năng phân giải cellulose

Phương pháp: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSB (Hi-media, Pancreatic

digest of Casein (17 g/L); Enzymatic digest of soya bean (3 g/L); NaCl (5 g/L); KaHPOx

(2,5 g/L); dextrose (2,5 g/L) ) ở 30°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24h Cay huyềnphu vi khuẩn (OD 600 nm = 0,1) tại trên môi truong CMC agar (CMC (5 g/L); agar

(20 g/L); Na2HPOs (6,8 g/L); KH2PO, (3 g/L); NaCl (0,5 g/L); (NH4)2SO4 (1,3 g/L);

MgSOu.7H20 (0,5 g/L) Chờ cho khô rồi ủ ở 30°C trong 3 ngày Cho thuốc thử Lugol(2 g KI; 1 g Iodua, 100 ml nước cất) vào đĩa môi trường, dé yên trong 5 phút rồi gan bỏphần thuốc thử dư thừa

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗinghiệm thức sẽ thực hiện ba lần lặp lại Thí nghiệm được bố trí giống nhau ở 3 chủng

Pseudomonas.

Chỉ tiêu theo dõi: CMC trong môi trường sé phản ứng với thuốc nhuộm cho maunâu sam Vòng sáng màu vàng xung quanh khuẩn lạc chỉ ra khả năng phân hủy cellulose.Chỉ số phân giải CMC có thé được tinh bằng cách lay tong đường kính phân giải (khuẩnlạc + vòng phân giải) chia cho đường kính khuẩn lạc

3.3.1.7 Xác định khả năng sinh phức hợp sắt

Phương pháp: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSB (Hi-media, Pancreatic

digest of Casein (17 g/L); Enzymatic digest of soya bean (3 g/L); NaCl (5 g/L); K2HPO«

(2,5 g/L); dextrose (2,5 g/L) ở 30°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ Cay riahuyền phù vi khuẩn tại trên môi trường Chrome Azurol S CAS agar (Điều chế CAS:trộn 60,5 mg Chrome Azurol S hòa tan trong 50 ml nước cat với 10 ml FeCls.6H20 1

mM trong HCI 10 mM sau đó trộn với 72,9 mg CTAB hòa tan trong 40 ml nước cất.Môi trường thạch CAS: 100 ml CAS điều chế với 900 ml King B (Peptone 20 g, KaHPO¿1,5 g, MgSO4.7H20 1,5 g, agar 20 g) và độ pH cuối cùng được điều chỉnh thành 6,8)

Chờ khô ủ 30°C trong 5 ngày.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗinghiệm thức sẽ thực hiện ba lần lặp lại Thí nghiệm được bố trí giống nhau ở 3 chủng

Pseudomonas.

Chi tiêu theo đối: Sự hiện diện của quang sáng màu cam xung quanh khuẩn lạcchỉ ra khả năng sinh phức sắt

17

3.3.2 Thử nghiệm khả năng kích thích tăng trưởng của vi khuẩn Pseudomonas spp.trên cây cà chua trong điều kiện in vitro.

Nuôi cấy và chuẩn bị dich vi khuẩn: vi khuẩn được tăng sinh 24 giờ trên môi

trường TSB (Hi-media, Pancreatic digest of Casein (17 g/L); Enzymatic digest of soya

bean (3 g/L); NaCl (5 g/L); KaHPO¿ (2,5 g/L); dextrose (2,5 g/L) ở 30°C, tốc độ lắc 150vòng/phút Pha loãng dịch huyền phù vi khuẩn đến khi giá tri OD 600 nm đạt khoảng

0,1 (tương đương với khoảng 10° CFU/ml).

Chuẩn bị dich lọc vi khuẩn: Vi khuẩn được tăng sinh 24 giờ trên môi trường TSB

(Hi-media, Pancreatic digest of Casein (17 g/L); Enzymatic digest of soya bean (3 g/L);

NaCl (5 g/L); K2HPOs (2,5 g/L); dextrose (2,5 g/L) ở 30°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút

Ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút và thu nhận phan dịch nổi phía trên Sau đó,dịch được lọc qua màng (kích thước lỗ lọc 0,45 um) để loại bỏ hoàn toàn tế bao vi khuẩn

Khử trùng bề mặt hạt cà chua: Hạt cà chua được khử trùng bề mặt bằng ethanol70% trong 5 phút, sau đó rửa lại 5 lần với nước cất khử trùng

Ảnh hưởng của vi khuẩn nên sự nảy mầm của cây cà chua: Hạt cà chua được khửtrùng, sau đó ngâm trong huyền phù vi khuẩn (10° CFU/ml) trong 2 giờ Ở nghiệm thức

đối chứng, hạt sau khi khử trùng được xử lý với nước cất và môi trường TSB Ở mỗi

nghiệm thức, ít nhất 30 hạt được gieo lên đĩa petri chứa bông gòn ẩm đã tâm nước cat

U các đĩa ở 25 + 1°C Theo đõi sự nảy mầm của hạt trong 2 và 3 ngày và tính tỉ lệ nảy

mam, chiều dai mầm (cm)

Kha nang thúc day tăng trưởng của Pseudomonas spp đối với cây cà chua in vitro:

Hat cà chua được khử trùng sau đó được gieo trên môi trường khoáng (MS 1⁄4 ) Sau khi

nảy mầm 4 ngày, các cây con đồng nhất về kích thước được chuyên sang đĩa môi trường

mới Các đĩa môi trường này được chia thành hai phần riêng biệt bởi một rãnh ngăn cách

sự khuếch tán qua lại của các chất Trên mỗi đĩa môi trường, cấy 6 cây con chia đều cho

2 phần và các đĩa giấy chứa dịch lọc vi khuẩn được đặt cách đầu mút rễ cây 2,5 cm.Nghiệm thức đối chứng sử dung nước cất thay cho huyền phù vi khuẩn Các đĩa môi

trường sau đó được đặt dựng đứng trong buồng tăng trưởng Đồng nuôi cấy 5 ngày ởđiều kiện 16 giờ sáng/§ giờ tối, nhiệt độ 25°C, ghi nhận kết quả

18

3.3.3 Thử nghiệm hiệu quả thúc day tăng trưởng của vi khuẩn Pseudomonas spp.

trên cay cà chua trong nhà lưới.

Ngâm giống và ủ giống: Hạt giống ca chua được ngâm trong nước ấm với tỉ lệ 2sôi 3 lạnh trong 3 - 4 giờ, sau đó ủ hạt giống bằng cánh trải đều hạt giống đã ngâm trênkhăn giấy thấm nước, khi hạt giống nứt vỏ nảy mầm gieo trồng trong khay ươm Saukhi cây đạt đến 7 — 10 ngày, cây 3 lá thật, chọn các cây con phát triển đồng đều, sau đótrồng các cây vào chậu Tưới nước hằng ngày với liều lượng 200 mL/chậu

Tưới 4 ml dịch vi khuẩn (10° CFU/ml) vào mỗi gốc cây Tuoi 1 tuần/lần, liên tục

trong 4 tuần Cây cả chua trong thời gian thí nghiệm được chăm sóc, tưới tiêu theo chế

độ chăm sóc cây cà chua bình thường Không sử dụng phân bón trong suốt quá trình thínghiệm.

Bồ trí thí nghiệm: trồng cà chua trong chậu, bồ trí thí nghiệm theo kiêu hoàn toànngẫu nhiên, gồm 4 NT, mỗi NT 6 cây Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

NTI: Đối chứng chỉ phun nước

NT2: Đối chứng phun môi trường dinh dưỡng TSB

NT3: Phun vi khuẩn Pseudomonas spp (P5)

NT4: Phun vi khuẩn Pseudomonas spp (P3)

NTS: Phun vi khuẩn Pseudomonas spp (P1)

Chi tiêu theo đối:

Chiều cao cây (cm): Do chiều cao cây từ gốc sát mặt đất đến dot cao nhất trên thân chính

Số lá: Đếm toàn bộ số lá trên cây

Chiều dài rễ: Nhồ cây đo chiều dài rễ

Trọng lượng rễ tươi cây: Cân trọng lượng tươi của cả rễ và thân

3.4 Xử lý số liệu

Dữ liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16 Phân tích ANOVA 1yếu tô được thực hiện dé so sánh giá trị trung bình giữa các nghiệm thức Đồ thị thé hiện

các giá trị trung bình + SD và các nghiệm thức được ký hiệu bởi các chữ cái khác nhau

chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức Trắc nghiệm phân hạngbằng phương pháp Tukey, p-value = 95%

19

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Các đặc điểm liên quan đến khả năng thúc đấy tăng trưởng thực vật của cácdòng Pseudomonas spp.

4.1.1 Kha nang phan giai cellulose

Kha năng phân giải cellulose cua các chủng Pseudomonas spp được khảo sat

bằng phương pháp cham điểm trên môi trường bổ sung cơ chất CMC Dựa vào hình 4.1,

không thấy sự xuất hiện vòng sáng xung quanh khuẩn lạc Như thé có thé thấy rằng cả

3 dòng Pseudomonas spp đều không có khả năng phân giải cellulose

Hình 4.1 Vòng phân giải cellulose của các chủng Pseudomonas spp sau 3 ngày 4.1.2 Khả năng phân giải lần

Sau nito, lân là chất dinh dưỡng chính trong nhu cầu của cây trồng Mặc dù nguồnphotpho luôn đồi đào và có sẵn trong các loại đất ở cả hai dạng hữu cơ và vô cơ nhưngthực vật lại không thé sử dung vì 95-99% photpho tồn tại ở dạng không tan, dang cố

định Pseudomonas theo báo cáo trước đây là dòng có khả năng phân giải hotpho mạnh

mẽ, chuyên hóa photpho vô cơ thành các dang dễ tiếp cận như HPO¿?, H;POx,

Kha năng phân giải lân của các dòng vi khuẩn được đánh giá qua phương pháp

cham điểm trên môi trường Pikovskaya’s Agar và được thé hiện dựa trên Bảng 4.1Bảng 4.1 Kha năng phân giải lân của 3 dòng Pseudomonas (mm)

Chủng Đường kính phân giải lân ở các lần lặp lại Đường kính trung bình