Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá độ ổn định di truyền của mẫu xáo tam phân in vitro bằng chỉ thị SCoT

Dựa vào hệ số tương đồng di truyền phân tích bằng phương pháp UPGMA từ công cụ NTSYS, 13 mẫu nghiên cứu được phân chia thành 2 nhóm chính: nhóm 1bao gồm một mẫu phôi vô tính bưởi đối chứ

‹ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO _ ;

TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHI MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ĐÁNH GIA ĐỘ ON ĐỊNH DI TRUYEN CUA

MẪU XAO TAM PHAN in vitro BẰNG CHỈ THỊ SCoT

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ CAM VÂN

Mã số sinh viên : 19126225

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ ĐỘ ON ĐỊNH DI TRUYEN CUA MAU XAO TAM PHAN in vitro BẰNG CHÍ THỊ SCoT

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:PGS TS NGUYEN VŨ PHONG VO THI CAM VAN

TP Thu Đức, 03/2023

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ ChíMinh và thay cô trong Khoa Khoa học Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trongsuốt quá trình học tập

Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Phong đã tận tình hướng dẫn và động

viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Tôi xin cảm ơn có van học tập của lớp DH19SHD và các bạn cùng đã giúp đỡ tôi

trong quá trình học.

Xin cảm ơn chị Đặng Huỳnh Thuý Vy, chị Đoàn Thị Thanh Tuyền cùng các đồngnghiệp trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận

Và cuối cùng, xin cảm ơn bố me và rất nhiều bạn bè đã cùng tôi chịu đựng suốt

chặng đường dai, luôn ủng hộ và yêu thương tôi.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Võ Thị Cam Vân, MSSV: 19126225, Lớp: DH19SHD thuộc ngành Công

nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khoáluận tốt nghiệp do bản thân tôi thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu làhoàn toản trung thực và khách quan Tôi xin hoản toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng

về những cam kết này

TP Thủ Đức, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người việt cam đoan

ll

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu đánh giá độ én định di truyén cuamau phôi vô tinh xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum) nuôi cay in vitro,thông qua việc sử dung chi thi Start Codon Targeted (SCoT) Trong số 13 chi thi phân

tử SCoT áp dụng, có 1 chi thi không tao ra sản phẩm khuếch dai, còn 12 chỉ thị khác tạo

thành tông số 50 băng Phân tích điện di sản phâm PCR với 12 primer SCoT đã chỉ ra

rằng các mẫu phôi vô tinh, lá cây 5 năm tuôi và hai mẫu lá cây 1 năm tuôi mang kết qua

đồng hình Dựa vào hệ số tương đồng di truyền phân tích bằng phương pháp UPGMA

từ công cụ NTSYS, 13 mẫu nghiên cứu được phân chia thành 2 nhóm chính: nhóm 1bao gồm một mẫu phôi vô tính bưởi (đối chứng) với hệ số tương đồng là 0,2; nhóm 2gồm mẫu lá xáo tam phân 5 năm tuổi, hai mẫu lá xáo tam phan | năm tuổi được trồng

từ hạt cùng 9 mẫu phôi vô tính từ mau lá này, có hệ số tương đồng là 1,00 Các kết quathu được có thể khẳng định tính hiệu quả cua chỉ thị SCoT trong việc phân biệt én định

và đa dạng di truyền của các mẫu thực vật, góp phần nghiên cứu và bảo tồn đa dạng di

truyền của xáo tam phân.

Từ khoá: chỉ thị SCoT, độ ôn định di truyền, hệ số tương đồng, phôi vô tính, xáo tam phân

ill

This study was conducted with the aim of evaluating the genetic stability of in vitro cultured somatic embryos of Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum using Start Codon Targeted (SCoT) markers Among the 13 SCoT markers applied, one did not produce any amplification product, while the remaining 12 markers generated a total of 50 bands Gel electrophoresis analysis of the PCR products with 12 SCoT primers showed that the somatic embryos, 5-year-old leaf samples and two I-year-old leaf samples were monomorphic Based on the genetic similarity coefficients analyzed using the UPGMA method from the NTSYS tool, the 13 samples were divided into two main groups: Group

1 included one somatic embryo of pomelo (control) with a similarity coefficient of 0.2; and Group 3 comprised one 5-year-old leaf sample, two 1-year-old Paramignya trimera leaf samples grown from seeds along with 9 somatic embryos derived from this leaf sample, with a similarity coefficient of 1.00 The results obtained affirm the

effectiveness of the SCoT markers in distinguishing the genetic stability and diversity

of plant samples, contributing to the research and conservation of the genetic diversity

of Paramignya trimera.

Keywords: genetic stability, Paramignya trimera, SCoT markers, similarity coefficient,

somatic embryo.

IV

MỤC LỤC

Trang

LOI CẢM ƠN 5-5221 21 E1 211211211211211211211211211211111111111121121121111 1112112111112 de i

a ae eerereenmecn acta ii TOM TAT ooceccccccscssessessessessssssessessessesssssessessessessrsssssussissssssessesinssessesssssssusssssessensessessessessesseseees iii

TT ee iv MỤC LỤC 22-52 2222222212211221211221121121112111211211211111211211121111121121121121121121122 1e V

DANH SÁCH CHU VIET TẮTT 2 2-©2222E2EE2EE2SEE2EE+2EE22312211221211271211221 21T cre vii DANH SÁCH BẢNG 2-22-222221222122112112112112112111211211211211211121111211221121121 11 ca x IM.9s8 (0:80:00 Đ.Đ xi CHƯƠNG 1 MỞ DAU ooo cecccescessesscsssesssessessessesssessseessessessessiessusssessessiessiesseesisesessessessseeseeasees 1 1.1 Đặt vấn đề -¿- + s2 1212112111111 21121111 110111 2121212121211 1211121221111 rrrye | 1.2 Mục tiêu đề tải ¿5s Ss S2 x21 112212211211 211 211211 112010121 21212111111 212211 ae 2

1:3 Nội dưag;nghiẾn CU ssssssssosssrssssseesuesx664666156156106160310159309584513635555454001680001391555900010446885E 2

CHƯƠNG 2, TONG QUAN sscivcnsesssicacceunssasennonenertenmensperr eerie nnisscouensevernicauieenteomnmnuye 3 2.1 Giới thiệu về xáo tam phan ceccccccsessseesseesosessseessessseesssesstessseesresssesesessssesssesssessseeeneees 3

D ncba PHOT LƠ Al mccmuesceesecnseneneseactinvanmes ere ene ere ere 3

EL, Eu đốn TT TU bogeanoebodkdttriaglRecbngriltkdosibinistitkotesdtcbtEtigl009:g1000038000180d661 3 2.1.3 Phân BG occ ccccecccessesssessesssessesssessuessessseesessessusssesssesstsnessetssstsssssessiessetsssesesssesaessesseeeesaves 4 2.1.4 Một số kết qua nghiên cứu về quan hệ di truyền cây xáo tam phân - J 2.2 Tinh ồn định di truyền cây in vitro va các nghiên cứu về 6n định di truyền ở cây in vitro 5 23.1, Tĩnh Greil di truy<un ỐNG Be i cuasedhggtuAnH IA cdonhGin G,Q8080.305010640G0000G303/00)480000530400 153 0g 5 2.2.2 Các nghiên cứu về sự ôn định di truyền ở thực vật 2 2 2+ +Se+£z+Ex+Exzrxerxrrxee 6

2.3 Một số phương pháp nghiên cứu sự ôn định di truyền 2-2¿222222zz22+z2z+2zzzze 6

2.3.1 Phương phấp sử dụng chỉ thị hình tHÁIs::acscceoisseoiioiiisissdadsiasi6131681101461611486438588160006 6 2.3.2 Phương pháp sử dung các chỉ thi 1SOZVIN cac 0000180161 1A 1211 ca tê G4 38t140 61 C031 654 7

2.3.3 Phương pháp sử dụng các chỉ thi phẩH LẺ si: sec si ch 0211118 <1 8110 L2E15461140030 233: 7

2.4 Tổng quan về chỉ thi SCOT ccccccccccecsssesssesseessessseesessuesseessessseesesstessnesseeseessessteesessseeseseeees 7 2.4.1 Khái niệm về chỉ thị SCOTT 5-2 2 SS+ES+EE2EEE12E121521112112121211211111111111111111 11 xe 7 DAD, Ủng ung ca chỉ thị SCOT sca coccacervsesencntsnnenynscrsnceresnnaveensaarosesvesvtmmenarsiauesveneeconssveesinesiues 8

2.5 Kỹ thuật ly trích DNA thực vật[ .- HS TT TH TH TH TH TH TH HH Tho nh nh nh như 8

2.5.1 Phương pháp ly trích DNA cee cee 222 2112121121 12121 011 2 H10 HT g1 HH HH 8 2.5.2 Phuong pháp định tính và định lượng , - ee ceeeee cee teeceeceecneceeesseseeressesseeseees 9 2G KY ThuateP OR tauzeostghogtrsttlGiiGùi8300101S00839033656530850f4G8400908A620030188085019881/G010300381983914545308 10

2.6.1 Khái niệm và nguyên tắc của kỹ thuật PCR -2- 2 2+2E£2E£EE2E2E2E2222221221 221 eExeE 10 2.6.2 Thành phần phản ứng PCR - 22 222+2S212EE+2EEE2EE12EE1221222112211221122112212 221 czxe 11

2.7 Cay phat BÌNH: lãi see s0 sgtsziosestagol6958001610<05501001630018888 endian asuesueda gestive tense meen tigen 11

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHAP 0 csscssescesesessessessesessessessseseteneetesessenseaees 13 3.1 Thời gian va dia điểm thực hiện đề tài ¿- 2 2222221221 EE2212211211211211211211 211211 xe 13

Soe; Nat HEU›ïTEhHTEH:€ỮösassbsseonastngiAgIE140851035082353 004 HENSV06giS53 npxstuolgtBBikgscgiotltotiqsg10M908128090040g868 13

3.2.1 (¡800i a ,.Ô 13

c8 ý 1 ee cố 13

3„5:-Eirtnp: pHẩp thG THỂ Thosessesssssecaghossiendricdiglstiohoagzdsiitiosnuss2usb SkSU2i8istsilSBHiGUS0nsaegislHùg3iEi.0giszBngfcgak 14

3.3.1 Ly trích và kiểm tra độ tinh sạch IDNA -2- 2 52S22EE2EE£EEEEEEEE2EE2EE2232212122E2c xe 14 3.3.2 Tối ưu hoá phan ứng PCR +: 22-2222 t222102212111171101111110712111111111 071.0 16 3.3.2.1 Xác định nhiệt độ bat cặp thích hop ccccccccsccessesssessessesssessesssesseessessessversnesseeeseesesens l6 3.3.2.2 Xác định nồng độ primer thích hợp -¿2¿©2+2222++222E+£EE++EEzzE+zEEezzxzrxrexes 17 3.3.3 Đánh giá độ ôn định di truyền của mẫu phôi vô tính xáo tam phân - 18

Se 19 4.1.1 Kết qua ly trích và kiểm tra độ tinh sạch DNA 0 c.cccccsscsscessessessessessessessessnsstessesseesesees 19 4.1.2 Tối ưu hoá phản ứng PCR 22-22 ©2++222+2EEE2EEE22212221271127112211711 271221 21 crxe 20 4.1.2.1 Xác định nhiệt độ bat cặp thích hop cciccccssucsassveonvoresssseivaruieansivacsiusesonsveveensevenveness 20 4.1.2.2 Xác định nồng độ primer thích hợp -2- 22 ©+2©+2E++2E+22EE++EEEztzxrzzxzzrxrersed 22 4.1.3 Đánh giá độ ổn định di truyền của mẫu phôi vô tinh xáo tam phân - 22

CHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHI 0 ccscsccsscssesseessessessessessessessessessessssssecessasenissseseeees 33

5.2 Đề Mghii eee eeccecceccecsessessessessessessecsessssssssssesssessessessessessessessessesssstsaesseesessesaetaessetsesseeseeseeeee 33 TAI LIEU THAM KHẢO 2-2222 SS+S22E22E£EE2EE2E52E5212512122121121121112112121112121211 112 e6 34

PHU LLỤC - 2-2222 2212212221221127121127112112112112111112111112111111121121121111111 01c re 36

VI

DANH SACH CHU VIET TAT

Amplified Fragment Length Polymorphism base pairs

Cetyl Trimethyl Ammonium BromideCây 1 năm tuổi

Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleic acid

Cây 5 năm tudiOptical density Operational Taxonomic Units Polymerase Chain Reaction Phôi vô tính

Phôi vô tính bưởi

Random Amplified Polymorphic DNA

Restriction Fragment Length Polymorphism Start Codon Targeted

Simple Sequence Repeat Single Strand Conformation Polymorphism Tris — Borate -EDTA

Tris -EDTA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic

vil

Chu trình nhiệt xác định nhiệt độ bat cặp - 2 52 ©sz+s+sz£z+zzzzzzzez 17

Thành phan phản ứng PCR xác định nồng độ primer - 2-52 18Chu trình nhiệt xác định nồng b80601510017575= 18Kết quả OD tách chiết DNA tổng số 13 mẫu -2- 22222 52222222522 20Nhiệt độ bắt cặp thích hợp của primer SCoT - 2222522552225: 21

Số băng khuếch dai và băng da hình trên 12 primer SCoT 23

Hệ số đồng dạng di truyền của 13 mẫu -2- 2 2222z+2E22z+2Ezzzzzxe2 29

DANH SÁCH HÌNH

TrangHình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 1% -2-255: 19Hình 4.3 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp PARC Lá cekidLCkLA HH 00000016666 0460 21Hình 4.3 Khao sát nồng độ primer SCoT -2-©2222222+22222E22E222E2222221222222222e2 35Hình 4.4 Sản phâm khuếch đại với primer SCOT - l 2-©22552255z22z>5+2 23Hình 4.5 Sản phâm khuếch đại với primer SCOT - 2 2- 2¿©525255z22zz2+2 24Hình 4.6 Sản pham khuếch đại với primer SCOT - 3 -2- 2¿52¿222222z22zz2+2 24Hình 4.7 Sản phẩm khuếch đại với primer SCOT - 4 -2-©222255z22zz2+2 35Hình 4.8 Sản phâm khuếch đại với primer SCOT - 5 -2-©22522255z22z2222 29Hình 4.9 Sản phẩm khuếch đại với primer SCOT - 7 2-522522525+25z22+>2s2 26

Hình 4.10 Sản pham khuếch đại với primer SCOT - 8 -2-52255255255255+2 26

Hình 4.11 Sản phẩm khuếch đại với primer SCOT - 9 -2-522522222z22z22zz2+2 27Hình 4.12 Sản phẩm khuếch đại với primer SCOT - 10 -2-22-522 5525522552 27Hình 4.13 Sản phẩm khuếch đại với primer SCoT - l] -222z522z22522 28Hình 4.14 Sản phẩm khuếch đại với primer SCOT - 12 22-522 5522522552 28Hình 4.15 Sản phẩm khuếch đại với primer SCoT - 13 -5 22-55-5525522552 29Hình 4.16 Cây phân nhóm di truyền dựa trên kết qua PCR - SCoT 30

XI

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây xáo tam phân là một loại cây thuộc chi Paramignya, có tên khoa học làParamignya trimera (oliv.) Guillaum, thuộc họ Cam (Rutaceae) phân bồ chủ yếu ở tỉnhKhánh Hoà và tinh Ninh Thuận Ở Việt Nam có 7 loài thuộc chi Paramignya, trong đó

P trimera là cây thân gỗ nhỏ, dạng dây trườn, mọc hoang, phân bố ở vùng núi có độ

cao trên 200 m, nơi có khí hậu khô can, lớp đất mặt mỏng Xáo tam phân có giá trị được

liệu cao là vị thuốc quan trọng trong y học cổ truyền đo nó có chứa các nhóm chất quýhiếm như coumarin triterpenoid, flavonoid, saponin, alkaloid và các dẫn xuất củaglycosid Những nhóm chất nay đã được chứng minh là có tác dụng chống viêm, điềutrị bệnh gan, tiêu đường và nhiều dòng tế bào ung thư Cũng chính vì những công dụngtuyệt vời đó mà loài cây này luôn được mọi người được khai thác ráo riết Điều nay dẫnđến việc xáo tam phân có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu không có biện phápbảo tồn hiệu quả

Nhằm duy trì, bảo tồn và phát triển nguồn giống, cũng như là tạo ra một số lượnglớn cây dé phục vụ cho ngành được, nhiều nghiên cứu về nhân giống vô tính xáo tamphân đã được tiến hành dé đáp ứng nhu cầu ngày càng gia tăng hiện nay Phương pháptạo phôi vô tính ở cây xáo tam phân mang lại nhiều ưu điểm vì có thê sản xuất số lượnglớn cây giống chất lượng cao với tỷ lệ sống sót cao trong thời gian ngắn Tuy nhiênviệc nuôi cấy tạo phôi có nguy cơ làm biến đôi di truyền của cây Trên thực tế, sự bién

đổi được phát hiện ở thực vật có nguồn gốc từ nuôi cấy mô là tác động của các biến

thé di truyền và biểu sinh xảy ra trong quá trình nuôi cấy và tính không đồng nhất ditruyền của tế bào mẫu vật (Bhojwani và Dantu, 2013) Sự ồn định đi truyền của phôi

vô tính phụ thuộc vào phương thức tai sinh, môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cay

(Rani va Raina, 2000).

Trong những năm gan đây, cùng với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học,

các kỹ thuật chỉ thị phân tử được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong hỗ trợ đánh giá

mức độ ồn định về mặt di truyền của cây con được nhân giống vô tính Trong đề tài này,chi thị SCoT được sử dung dé đánh giá ôn định di truyền của mẫu phôi vô tính xáo tamphân vì đây là chỉ thị DNA đơn giản, mới và nhắm vào gen dựa trên vùng được bảo tồn

ngắn bên cạnh codon mở dau dịch mã ATG trong gen thực vat (Collard và Mackill,2009) Xuất phát từ thực tế trên, đề tài: “Đánh giá độ ồn định đi truyền của mẫu xáo tamphan in vitro bang chi thị SCoT” được tiến hành.

1.2 Mục tiêu dé tài

Sử dụng chi thị SCoT dé đánh giá độ 6n định di truyền của mẫu phôi vô tính xáotam phân phục vụ công tác nhân giống vô tính

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Ly trích va kiểm tra độ tinh sạch DNA

Nội dung 2: Tối ưu hoá phản ứng PCR - SCoT

Nội dung 3: Đánh giá độ ôn định di truyền của mẫu phôi vô tính xáo tam phân

CHƯƠNG 2 TONG QUAN

2.1 Giới thiệu về xáo tam phân

Loai : Paramignya trimera

2.1.2 Dac diém hinh thai

Xáo tam phân là loài cây thân gỗ nhỏ, dang dây trườn, mọc hoang, phân bố ở vùng

núi đá có độ cao 200 m, nơi có khí hậu khô can, lớp đất mặt mỏng Điểm đặc trưng của

Xáo tam phân bao gồm: lá đơn, mọc cách mép lá nguyên, có nhiều tuyến tinh dầu, chop

lá hình tim, có gai nhọn mọc dưới mỗi cuống lá, mép cong xuống đưới, dài khoảng 0,4

- 1,2 em, cành không lông Cụm hoa dạng chùm mọc ở nách lá gồm 2 - 8 hoa, hoa lưỡngtính, màu trắng ngà Tràng hoa có 3 cánh, 6 nhị đực ngắn hơn cánh hoa, chỉ nhị dày vàdet, bao phan hình bầu duc Quả mong, hình cầu hoặc trứng, không có lông, chứa từ 1 -

2 hạt được bao bọc bởi lớp dịch nhay dạng keo dính (Pham Hoàng Hộ, 1999)

Rễ: rễ hình trụ, tiết diện tròn, đường kính 2 - 6 mm, màu nâu sam hay màu vàngđậm, lõi rễ màu vàng ngà, rễ cây chứa nhiều tinh dau, mùi thơm dịu rất đặc trưng

Thân: thân non màu xanh lục, thân gia màu vàng, san sùi, tiết diện tròn, có gai.Giai thang hay hoi cong xuong ở ngọn, moc ở kẽ lá, tồn tại trên thân sau khi lá rụng,

đài 1 - 4 cm.

Lá: lá đơn, mọc so le, phiến lá day, có nhiều hình dang: hình bau dục đỉnh hơi lõm,

hình thuôn dài đỉnh hơi lõm, hình thuôn dài đỉnh chia hai thùy rõ, hình thuôn dài đỉnh

tròn, đài 7,5 - 13 em, rộng 1 - 2,5 cm, mặt trên mau xanh lục sam hơn mặt dưới, mặt

dưới lá thấy rõ túi tiết dang cham trong mờ; mép lá nguyên; gân lá hình lông chim nỗi

rõ ở mặt dưới Cuống lá cong hoặc hơi cong, dài 5 - 7 mm, hình trụ mặt trên phẳng, màu

xanh lục.

Hoa: hoa đều, lưỡng tính, mẫu 3 Lá bắc và 2 lá bắc con đạng vảy hình tam giácnhỏ, cao 0,4 - 0,5 mm, bề mặt có nhiều lông Cuống hoa hình trụ, dai 1,5 - 2 mm, cólông ở mặt ngoài.

Đài hoa: có 3 lá đài, đều, dính nhau bên dưới tạo thành 1 ống hình chuông cao

0,3-0,4 mm, bên trên chia thành 3 răng hình tam giác, cao 0,3-0,4 - 0,6 mm Lá đài mặt ngoài

Chi Paramignya thuộc họ Rutaceae và phân bồ rộng rãi ở các vùng khô và âm phíanam Việt Nam, miền nam Philippines, Thái Lan, Malaysia, đảo Java của Indonesia, Uc

va Sri Lanka.

Ở Khánh Hoa, P trimera phân bố ở nhiều noi, trong đó có vùng núi Hòn Hèo (xãNinh Vân), Đá Bàn, Lệ Cam, Ninh Giang (thị xã Ninh Hòa), Phước Đồng (thành phốNha Trang), Khánh Vĩnh, Cam Bình, Cam Phước Đông (thành phố Cam Ranh) Đây làloài ban địa và rất hiếm về số lượng Hiện nay, loài cây này chưa được đưa vào danhmục thực vật quý hiém cần được bảo vệ Cây này thường mọc không phải ở rừng nộiđịa mà ở những bãi đất trống nên khó bảo tồn trước sự khai thác của con người (TrầnNam Thắng và Trần Thị Thu Hà, 2016)

2.1.4 Một số kết quả nghiên cứu về quan hệ di truyền cây xáo tam phân

Năm 2020, Phí Thị Câm Miện và ctv đã nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của

P trimera và các cây cùng họ Trong nghiên cứu này, sự kết hợp giữa dữ liệu hình thái

và trình tự DNA đã hỗ trợ cho việc định danh loài P trimera và một số họ hàng thu thập

ở tỉnh Khánh Hòa và Lâm Đồng Việc so sánh hình thái và phân tích cây phát sinh loàicho thấy có sự biến đổi đáng kể ở loài P trimera Hơn nữa, tác giả cũng báo cao rằngmột số loài P trimera có chung đặc điểm hình thái nhưng về đặc điểm phân loại lại có

sự khác biệt khi phân tích DNA Phân tích biến thé di truyền và khoảng cách giữa cácloài và cùng loài bang cách sử dụng trình tự ITS, mafK và rbcL cho thấy P trimera có

liên quan chặt chẽ với A buxifolia, Severinia monophylla và Luvunga scandens Ngoài

ra, trình tự mafK được biểu thị dưới dạng mã vạch DNA có thể sử dụng để xác định vàphân biệt các loài Paramignya với các loài khác thuộc họ Rutaceae.

Năm 2021, Phí Thị Cẩm Miện và ctv đã nghiên cứu mô tả hình thái và mã vạchDNA của xáo tam phân thu thập từ Khánh Hoà, Việt Nam Nghiên cứu đã mô tả đặcđiểm hình thái và phân tích mã vạch DNA dựa trên các chỉ thi ITS, matK và rbcL vềhình thái, xáo tam phân khác với các loài thuộc chi Paramignya ở đặc điểm: lá thon dai,

lá đơn, đầu lá xẻ thùy hình tim, gân lá hình lông chim Cuống lá có gai to, nhọn và thang.Tràng hoa 3, 6 nhị, bầu trên, có 3 lá đài và 2 lá noãn, hạt có vỏ hạt Kết quả phân tíchcác mã vạch DNA ba vùng gen ITS, mafK và rbcL để xác định mối quan hệ di truyền

giữa năm mẫu P trimera thu thập được tại Khánh Hòa Độ dài trình tự nucleotide của

các mẫu đối với ba vùng của gen ITS, mafK và rbeL lần lượt là 850 bp, 850 bp và 500

bp Trên cơ sở phân tích dữ liệu cây kiểu hình cho thấy, các mẫu có cùng nguồn gốc tiếnhoá về trình tự gen Trên cơ sở đó xác định 5 dang hình thái P frimera phân bố ở KhánhHòa là cùng một loài và mở rộng phạm vi phân bố cũng như nghiên cứu chuyên sâu về

hình thái P øimera ở Khanh Hòa, Việt Nam.

2.2 Tính 6n định di truyền cây in vitro và các nghiên cứu về 6n định di truyền ởcây in vitro

2.2.1 Tính 6n định di truyền cây in vitro

Sự 6n định di truyền của cây in vitro là khả năng duy trì và giữ nguyên các đặcđiểm gen của cây qua các thế hệ và trong quá trình nhân giống ở môi trường nuôi cấy

in vitro Sự ôn định di truyền của cây in vitro cần được đánh giá dé phát triển cácchương trình bảo tồn thích hợp Các chương trình bảo tồn chỉ có thể được phát triển

sau khi đánh giá tính ôn định di truyền Đối với các cây trồng có giá trị kinh tế thì cầnbảo tồn nguồn biến di tự nhiên của quan thé dé làm nguồn giống hoặc biến thé mới

(Butiuc-Keul va ctv, 2016).

2.2.2 Cac nghiên cứu về sự 6n định di truyền ở thực vật

Năm 2015, Bùi Văn Thế Vinh và ctv đã nghiên cứu sử dụng thành công chỉ thị

RAPD dé đánh giá đa dạng đi truyền cây sâm Ngọc Linh và đánh giá độ ổn định di

truyền của cây con sau quá trình nhân giống in vitro Nghiên cứu được thực hiện với 15primer chi thi phân tử RAPD, két quả nhận được 14/15 chỉ thi tao ra được 93 băng đồnghình và 5 băng đa hình (chiếm tỉ lệ 5,1%) Kết quả phân loại dựa theo hệ số tương đồng

di truyền đã chia 10 mẫu nghiên cứu thành 2 nhóm chính, trong đó nhóm 1 gồm 4 câythu nhận từ Lâm Đồng và 2 mẫu thu nhận từ Quang Nam có hệ số tương đồng 0,9820

và nhóm 2 gồm 2 cây thu nhận từ Kon Tum và 2 cây thu nhận từ Quảng Nam có hệ s6

tương đồng 0,9762 Hình anh phân tích điện di sản phẩm RAPD cho thay 32 cây con

sâm Ngọc Linh in vitro được đánh giá đều cho kết quả đồng hình

Năm 2021, Parab va ctv đã phân tích độ 6n định di truyền trên cây Ficus caricavar Black Jack nhân giống in vitro va ex vitro Nghiên cứu được thực hiện trên 8 mẫuvới 10 primer ISSR và DAMD Kết quả cho thấy các primer ISSR cho tỷ lệ đơn hình là

97,87% trong khi các primer DAMD cho tỷ lệ đơn hình là 100% Tỷ lệ đa hình 2,13%

đã được quan sát thay đối với primer UBC840 ISSR thực hiện trên 8 mẫu

2.3 Một số phương pháp nghiên cứu sự 6n định di truyền

2.3.1 Phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái

Sự 6n định di truyền có thể phát hiện dựa vào các biểu hiện hình thái Gen thể hiệnban chat di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta cóthể đo đếm được - gen đó có thể xem như chỉ thị

Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái tồn tại trong tự nhiên cũng rất ít, không đáp ứng

được yêu cầu của nhiều chương trình chọn giống và chỉ có ở quy mô hình thái (cơ quan)

hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thé Sự thé hiện các chỉ thị hình thái bị ảnh

hưởng bởi điều kiện môi trường, điều này làm cho chỉ thị hình thái kém thu hút trong

cải tiên giông cây trông.

2.3.2 Phương pháp sử dụng các chỉ thị isozyme

Isozyme là các dạng protein có cùng phan ứng enzyme nhưng có sự khác nhaukhi chạy điện di Kỹ thuật điện di được dùng dé đo sự di động của phân tử proteintrong một khoảng thời gian nhất định, trên điện trường đồng nhất Các protein đột biếnkhác nhau về điện tích sẽ có sự đi chuyển khác nhau nên có thể phát hiện sự khác nhaugiữa chúng bằng kỹ thuật điện di Sự khác nhau này phản ánh sự khác nhau trong kíchthước và cấu trúc của phân tử protein nhiều trường hợp, còn liên quan tới sựthay thế bởi một amino acid trong phân tử protein do đột biến từ alen này sang alen khác

Nhờ kỹ thuật điện di này, cùng lúc có thé phân tích nhiều cá thé trong một quanthé nào đó dé đánh giá chính xác số phan trăm di hợp tử của một gen nhất định Nócho biết sự đa dạng giữa các nhóm sinh vật theo các protein được quan sát

Mặc dù việc ứng dụng chỉ thị isozyme đã làm thay đổi nghiên cứu theo hướng

thuận lợi hơn nhưng số lượng chỉ thị còn quá ít và chưa đáp ứng được nhu cầu nghiên

cứu (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.3 Phương pháp sử dụng các chỉ thị phần tử

Chỉ thị phân tử đã chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dải so với chỉ thịhình thái và chỉ thị isozyme, do số lượng của nó gấp hơn nhiều lần so với chỉ thịisozyme Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được phân biệt giữa hai cá thể, hai dònghoặc hai giống khác nhau đều có thể được xem là một chỉ thị phân tử Các chỉ thị phân

tử có thể chia làm hai nhóm như sau:

Chỉ thị dựa vào phương pháp lai DNA (DNA — DNA hybridization based): RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

Chỉ thị dựa vào phương pháp PCR: AFLP, SSR, SSCP, RAPD

So với chi thị hình thái và chỉ thi isozyme, chi thị phân tử có điểm hơn đó là: đolường trực tiếp các vật chất di truyền, không bị chi phối bởi ảnh hưởng của môi trường

và ảnh hưởng có tính chất phát triển, có nhiều chỉ thị trong quân thể (Yue và ctv, 2006).2.4 Tống quan về chỉ thị SCoT

2.4.1 Khái niệm về chỉ thị SCoT

SCoT (Start Codon Targeted) là các chỉ thị được phát triển dựa trên khu vực đượcbảo tồn ngắn bên cạnh codon khởi đầu dịch mã ATG trong các gen thực vật Phương

pháp này sử dung primer đơn 18 nucleotit trong phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Chỉ

thị này được quan sát trên gel agarose và thuốc nhuộm, làm cho kỹ thuật này phù hợp

với đại đa số các phòng thí nghiệm nghiên cứu thực vật có thiết bị tiêu chuẩn Mức độ

tái tô hợp giữa các SCoT và gen/tính trạng thấp hơn so với các chỉ thị ngẫu nhiên nhưRAPD, ISSR hoặc SSR, vì vậy chỉ thị SCoT có thé sử dụng trực tiếp trong các chươngtrình nhân giống có sự hỗ trợ của đấu hiệu (Collard và Maekill, 2009)

2.4.2 Ứng dụng của chỉ thị SCoT

Chỉ thị SCoT đã ra đời dựa trên phản ứng PCR khuếch đại các trình tự bảo tồnchứa bộ ba mở đầu ATG của các gen có ưu điểm như đơn giản, tỷ lệ đa hình cao, chỉphí thấp, liên quan trực tiếp tới vùng mã hóa nên gần đây chỉ thị này đã được phát triểnrộng rãi trên một số cây trồng ăn quả quan trọng như nhãn (Chen và ctv, 2010), nho

(Guo và ctv, 2012),

Năm 2014, Rathore và ctv đã thực hiện nghiên cứu đánh giá sự ôn định di truyềncủa cây Cleome gynandra vi nhân giống bằng chỉ thị SCoT Nghiên cứu được thực hiệnvới 24 primer và 7 cây vi nhân giống được chọn ngẫu nhiên Trong tổng số 24 primer

được sang lọc, có 15 primer tạo các dai băng sáng va rõ Tat cả 15 primer tạo ra tông

cộng 65 băng, với trung bình là 4,3, dao động từ 2 - 7 băng trên mỗi primer Không có

tính đa hình nào được phát hiện ở cây tái sinh và cây mẹ Kiểu dải đơn hình ở cây vinhân giống và cây me thu được từ phân tích SCoT đã xác nhận tính ổn định di truyềncủa cây trồng in vitro và chứng minh độ tin cậy của hệ thống vi nhân giống

Năm 2019, Kamiñska và ctv đã tiến hành nghiên cứu đánh giá sự ồn định di truyền

của cây con Taraxacum pieninicum sau khi bảo quản tăng trưởng chậm trong thời giandài bằng cách sử dụng chỉ thị ISSR và SCoT Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự

khác biệt nào được quan sát khi sử dụng 16 primer ISSR và 12 primer SCoT giữa câycon tái sinh sau khi bảo quản và cây được trồng từ hạt trong đất Hơn nữa, các chỉ thịSCoT có hiệu quả nhất trong việc sàng lọc bộ gen của 7: pieninicum và rat hữu ích đốivới các loài vi nhân giống và có nguy cơ tuyệt chủng khác nhau thuộc họ Asteraceae.2.5 Kỹ thuật ly trích DNA thực vật

2.5.1 Phương pháp ly trích DNA

DNA là vật liệu mang thông tin di truyền cấu tạo bởi các nucleotide, là yêu tố mởđầu cho mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử ĐỀ có thé tiến hành các thínghiệm phân tích sâu hơn thì việc thu nhận một lượng DNA lớn và sạch là điều kiệntiên quyết Đối với ly tích DNA thì mối quan tâm hàng đầu là thu nhận các phân tử này

ở trạng thái nguyên vẹn tôi đa, ít bị huỷ do các tác nhân cơ học hay hoá học Quá trình

ly trích DNA cần thực hiện ở nhiệt độ thấp dé ức chế enzyme nội bào (Hồ Huynh Thuy

Dương, 2002) Quy trình ly trích DNA gồm có 3 bước cơ bản:

Bước 1: phá vỡ màng tế bảo

Thông thường, tế bảo hoặc mô được nghiền trong hỗn hợp dung dịch đệm chiết.Hỗn hợp này sẽ phá vỡ vách tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường vàphân huỷ các protein gắn với DNA

Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein

Có thé sử dụng dung dịch CTAB/NaCl dé tạo phức với polysaccharides và proteinrồi kết tủa chúng Loại bỏ protein và phức hợp CTAB — polysaccharide -protein bằng

hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Phenol va chloroform sẽ làm

biến tính protein Ngoài ra chloroform làm cho pha nước va pha hữu co dé dang tach ra.Isoamyl alcohol hạn chế tao bot trong suốt quá trình ly trích Protein bị biến tính sẽ

không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid va sau khi ly tâm sẽ tủa thành một

lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại

Bước 3: kết tủa nucleic acid

Kết tủa trong ethanol lạnh Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa,

vì vậy chúng có thé được loại bỏ bằng cách kết tủa trong isopropanol Nucleic acid sẽ

được thu nhận lại bằng ly tâm Sau đó, cặn tủa phải rửa trong ethanol 70% để loại bỏ

muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn sót lại

2.5.2 Phương pháp định tính và định lượng

DNA thu nhận được phân tích định tính và định lượng bằng một số phương pháp

như đo mật độ quang, điện di.

Định lượng bằng quang phổ kế:

Phương pháp này cho phép ước tính nồng độ tương đối của acid nucleic có trongmẫu sau khi ly trích Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự hấp thụ mạnh

ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine va pyrimidine Giá trị mật

độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm của mẫu cho phép xác định nồng

độ acid nucleic trong mẫu dựa trên mối tương quan: 1 đơn vị OD 260 nm tương ứng vớinồng độ 50 ng/ul đối với dung dịch chứa DNA sợi đôi và 40 ng/ul đối với dung dichchứa DNA và RNA sợi đơn Dé kiểm tra độ tinh khiết của dung dịch, người ta bỗ sungthêm giá trị OD 280 nm được đo với tỉ lệ OD 260 nm /OD 280 nm nằm trong khoảng1,8 đến 2.0

Định tính bằng phương pháp điện di:

Nguyên lý của phương pháp này dựa trên đặc tính cấu trúc của nucleic acid Đó làcác đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của điện trường nó sẽ chuyên động

về cực dương Độ linh động của các phân tử này được phân tích trên bảng gel và phụthuộc vao 2 tiêu chí: khối lượng phân tử và nồng độ các thành phan gel Việc lựa chọncác loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc kích thước trung bìnhcủa các đoạn phân tử nucleic acid cần phân tách

Gel agarose: loại gel thông dụng nhất, ding dé phân tách những đoạn DNA có kích

thước từ 0,5 - 200 kb.

Gel polyacrylamide: được dùng dé phân tách những đoạn có kích thước nhỏ, dưới

1000 bp.

2.6 Kỹ thuật PCR

2.6.1 Khái niệm và nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR về bản chất là phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm không cần

sự hiện diện của tế bào Phương pháp PCR sẽ khuếch đại đoạn DNA nằm giữa cặpprimer Theo nguyên tắc trên thì yêu cầu của phản ứng PCR phải biết trình tự đoạnDNA, đặc biệt là trình tự 2 đầu của đoạn DNA cần khuếch đại

PCR được thực hiện dựa trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo chiều chu kỳ nối tiếpnhau, mỗi chu kì gồm 3 bước sau:

Bước 1: biến tính

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 - 95°C) trong vòng 30 giây

đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch

đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bồ sung mới

Bước 2: bắt cặp

Giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với khuôn,nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 - 70°C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút

Bước 3: kéo dải

Đây là giai đoạn tông hợp sợi đơn bé sung đọc theo chiều 5’ - 3° của 2 primer nhờ

hoạt động của enzyme polymerase Nhiệt độ được tăng lên 72°C giúp cho DNApolymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này tuỳ thuộc vào độ dài củatrình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến 1 phút

10

Nguyên tắc cơ bản của phản ứng là khuếch đại 1 đoạn gen quan tâm bằng primerchuyên biệt kết hợp với hoạt động của enzyme chịu nhiệt polymerase trong một chutrình nhiệt hợp lý Tác động của primer xem như yếu tố đánh dấu cho hoạt động củapolymerase khi nó được gắn kết vào DNA mạch đơn làm khuôn cho giai đoạn bắt cặp.

Primer bên trái tác động lên dây DNA 3’ - 5’ được gọi là primer F, primer bên phải tác động lên dây 5’ - 3’ còn gọi là primer R.

2.7 Cây phát sinh loài

Tất cả các phương pháp được sử dụng dé nghiên cứu sự đa dang của quan thể cuốicùng đều dẫn đến dữ liệu phân tử rất phức tạp được biểu thị bằng các dải trên bảng điện

di Đề trích xuất thông tin sinh học từ dữ liệu thô này, các nhà khoa học cần có sự hỗ trợcủa máy tính bằng phần mềm phân tích dữ liệu thực nghiệm Các thông số như đa dạngkiểu gen, da dạng kiểu hình, khoảng cách di truyền giữa quan thé được tính toán theocông thức cua Nei (1978) Trước khi tìm hiểu phải lựa chọnphương pháp và phần mềm phù hợp, chúng ta cần tìm hiểu một số thuật ngữ về câyphát sinh loài nhằm cung cấp những thông tin cơ bản đề hiểu và giải thích cây phátsinh loài Một số thuật ngữ: điểm cùng (đại diện cho các cá thể, còn được gọi là đơn vitiến hóa OTU- Operational Taxonomic Units), điểm giữa (dung dé phân loại hay thể hiện

tổ tiên của cá thể), nhánh (xác định các mối quan hệ của cá thể ở hiện tại với tổ tiên của

chúng), chiều đài nhánh (thể hiện thời gian tiến hóa của loài), gốc (là một tô tiên chungcủa các cá thé được biéu diễn trên cây phát sinh loài)

Cây phát sinh loài có thể được vẽ bằng nhiều cách Có thể vẽ cây phát sinh loàitrong đó chiều dai của cành biéu thị thời gian tiến hóa Cũng có thé vẽ một cái cây cóthời gian tiến hóa hiển thị trên các nhánh Cây phát sinh loài có thể vẽ có hoặc không cósốc Hiện nay, có hai phương pháp đang được sử dụng phổ biến nhất là UPGMA và

11

Neighbor - Joining, cả hai phương pháp đều tạo cây tiến hóa từ ma trận khoảng cách

gen và độ tương đồng gen giữa các quan thé

UPGMA: đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất dé xây dựng cây phát

sinh loài và phản ánh mức độ giống nhau về kiểu hình giữa các OTU Với một ma trậncho trước, thuật toán sẽ nhóm một cặp đơn vi tiến hóa có khoảng cách nhỏ nhất (có

mức tương đồng gen cao nhất) với giá trị bằng nửa khoảng cách giữa hai OTU Sau

đó, cặp đơn vi tiễn hóa này được xem như một OTU mới

Neighbor - Joining: đây là một trong những phương pháp xây dựng cây tiếnhóa với ít nhánh nhất Nguyên tắc của phương pháp này là tìm ra thứ tự các cặp hàngxóm (neighbor) hợp lý nhất làm giảm tổng chiều dai của cây tiến hóa

12

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian: tháng 7/2023 đến tháng 12/2023

Địa điểm: phòng thí nghiệm Sinh học Tích hợp Thực vật, khoa Khoa học Sinh học,

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu sinh học

Lá cây xáo tam phân (Paramignya trimera) năm năm tuôi và một năm tuổi trồng

từ hạt; chín mẫu phôi vô tính xáo tam phân và mẫu phôi vô tính bưởi làm đối chứngđược nuôi cay tại phòng Phòng thí nghiệm Sinh học tích hợp thực vật, Khoa Khoa hocSinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2.2 Hoá chất

Hoá chất dùng trong ly trích và kiểm tra DNA:

Dung dịch nito lỏng

Phương pháp 1: GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo

Scientific) gồm RNase A, lysis buffer A, lysis buffer B, precipitation solution, plant

gDNA binding solution, wash buffer I, wash buffer I, elution buffer (10 mM Tris-HCl,

pH 9.0, 0.5 mM EDTA).

Phương pháp 2: CTAB của Doyle va Doyle (1987) gồm dung dich CTAB 2% (2%

w/v CTAB, 1,4M NaCl, 100 mM Tris- HCl pH8, 20 mM EDTA, 1% PVP), dung dich chloroform /isoamyl alcohol (24:1), dung dich isopropanol lạnh, ethanol 70°C lạnh, RNase A, dung dich TE.

Hoá chat dùng trong kỹ thuật PCR — SCoT: DreamTaq PCR Master Mix (2X)

(Thermo Scientific), primer (IDT, Vietnam) (Bang 3.1).

Hoa chat dung trong dién di: agarose, TBE buffer 10X, 6X gel red loading buffer,ladder 1kb.

Thiết bi và dụng cụ thí nghiệm: cân điện tử, máy Vortex, may ly tâm, may doquang phô, máy PCR, b6n điện di, lò viba, dau tip các loại, đầu tip các loại, eppendorf1,5 mL; 0,2 mL, ống đong

13

Bang 3.1 Danh sách các primer sử dụng trong nghiên cứu

Primer Trinh tự primer (5’ - 3”) Tham khảo

SCoT - 1 CAACAATGGCTACCACCA Lou (2010)

SCoT - 2 CAACAATGGCTACCACCC Gajera (2013)

SCoT - 3 CAACAATGGCTACCACCG Lou (2010)

SCoT - 4 CAACAATGGCTACCACCT Yan (2010)

SCoT - 5 CAACAATGGCTACCACGA Gajera (2013)

SCoT - 6 CAACAATGGCTACCACGC Gajera (2013)

SCoT - 7 CAACAATGGCTACCACGG Yan (2010)

SCoT - 8 CAACAATGGCTACCACGT Yong (2013)

SCoT - 9 CAACAATGGCTACCAGCA Lou (2010)

SCoT - 10 CAACAATGGCTACCAGCC Yan (2010)

SCoT - 11 AAGCAATGGCTACCACCA Yong (2013)

SCoT - 12 ACGACATGGCGACCAACG Yong (2013)

SCoT - 13 ACGACATGGCGACCATCG Yan (2010)

3.3 Phương pháp thực hiện

3.3.1 Ly trích và kiểm tra độ tinh sạch DNA

3.3.1.1 Ly trích DNA

Phương pháp 1: GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit.

Nghién 0,1 g mẫu trong nito lỏng, cho vào eppendorf 1,5 mL chứa 350 ul LysisBuffer A, vortex trong 10 - 20 giây dé trộn đều

Thêm 50 pl Lysis Buffer B và 20 ul RNase A.