Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá một số đặc điểm liên quan đến khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của ba chủng vi khuẩn Pseudomonas spp

Các thí nghiệm in vitro cho thấy bachủng vi khuẩn này có khả năng hòa tan phosphate, sản xuất siderophore, tổng hợpphytohormones IAA, GAs, hình thành màng sinh học và tăng cường cấu trúc

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO ~

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ MOT SO ĐẶC DIEM LIEN QUAN DEN KHA NANG THUC DAY TANG TRUONG THUC VAT CUA BA CHUNG VI KHUAN Pseudomonas spp.

: 19126129 : 2019 — 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

ĐÁNH GIÁ MOT SO ĐẶC DIEM LIÊN QUAN DEN KHA NANG THUC DAY TANG TRUONG THUC VAT CUA BA CHUNG VI KHUAN Pseudomonas spp.

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS TS NGUYÊN VŨ PHONG TRAN THỊ NGỌC NHƯThS TRAN THỊ THANH HƯƠNG

TP Thủ Đức, 03/2024

LOI CAM ON

Tôi xin chân thành cam on PGS TS Nguyễn Vũ Phong, Khoa Khoa học Sinh

học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã trực tiếp hướng dẫn và tậntình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Trần Thị Thanh Hương, ThS Hà Thị Trúc Mai,

KS Dang Huynh Thuý Vy và các anh, chi, bạn va em phòng Sinh học tích hợp thực vật

- Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗtrợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, cùng các Thầy, Cô Khoa Khoa họcSinh học đã tạo điều kiện, góp ý, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khoá luận của mình

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình, bạn bèvẫn luôn đồng hành, cổ vũ, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gianhọc tập và thực hiện tốt đề tài này

Xin trân trọng cảm on!

Sinh viên thực hiện

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên Trần Thi Ngoc Như, MSSV: 19126129, lớp DHI9SHD (email:

19126129@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh học, Trường Dai Học Nông

Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trựctiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và kháchquan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này

Tp Ho Chi Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người viet cam đoan

ll

TÓM TẮTPseudomonas spp là chi vi khuân sống trong đất được biết đến với kha năng tổng

hợp các chất chuyển hóa có giá tri, kiểm soát bệnh thực vật và thúc đây tăng trưởng thực

vật Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá khả năng thúc day tăng trưởng thực vậtcủa ba chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas Các thí nghiệm in vitro cho thấy bachủng vi khuẩn này có khả năng hòa tan phosphate, sản xuất siderophore, tổng hợpphytohormones (IAA, GAs), hình thành màng sinh học và tăng cường cấu trúc rễ và sựphát triển của cây ớt Trong điều kiện nhà kính, cây ớt được xử lý bằng những vi khuẩnnay cho thấy sự cải thiện đáng kế về tốc độ tăng trưởng thông qua các thông số nhưchiều cao cây, chiều dài rễ, số lá và trọng lượng tươi so với cây đối chứng không được

xử lý Cụ thể, chiều cao cây ở nghiệm thức PN04 cao nhất đạt 14,39 cm Trọng lượngtươi của nghiệm thức xử lý với chủng PN04 (1190 mg) gấp 3 lần so với nghiệm thứcđối chứng (376 mg) Những kết quả này chứng minh khả năng thúc đây tăng trưởng thựcvật của ba chủng vi khuẩn được nghiên cứu Các nghiên cứu về đặc tính kháng sinh, cáchợp chất dễ bay hơi và các đặc tính gây kháng stress của các chủng này cũng như mức

độ an toàn sinh học của chúng đang được tiễn hành

Từ khoá: hoà tan phosphate, Pseudomonas spp., thúc day tăng trưởng thực vật,

sản sinh phytohormones.

Pseudomonas spp are soil-dwelling bacteria known for their ability to synthesize valuable metabolites, control plant diseases, and promote plant growth The objective of

this study was to evaluate the plant growth-promoting potential of six bacterial strains

belonging to the genus Pseudomonas, which have previously demonstrated the ability

to inhibit the fungus-causing plant disease Jn vitro experiments revealed that the six bacterial strains were capable of phosphate solubilization, producing siderophores, synthesizing phytohormones (IAA, GAs), forming biofilms and enhancing the root structure and growth of tomato seedlings Under greenhouse conditions, tomato plants treated with these bacteria exhibited significant improvements in growth through parameters such as plant height, root length, number of leaves and fresh weight,

compared to the untreated control plants Specifically, in the treatment treated with

PN04, the highest plant height reached 14.39 cm The fresh weight of the treatment treated with strain PN04 (1190 mg) was 3 times that of the control treatment (376 mg) These results demonstrate the plant growth-promoting capabilities of the six investigated bacterial strains Ongoing research is focused on studying the antibiotic properties, volatile compounds, and stress resistance-inducing properties of these strains, as well as assessing their biosafety level.

Keywwords: Phosphate solubilization, phytohormones production, plant growth promoting, Pseudomonas spp.

IV

MỤC LỤC

Trang

090990900 iXÁC NHẬN VA CAM DOAN u ccccssssscscssesseescsessessssesucessaveacensaesseescaseseesesnssesesaseaeeess ii

Se i ae <a se sae SV nc eee eee 3

2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Pseudomons ccccsccscssesessesesssesessesessesesessesessssescseseeeeseeees 42.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá -. -2- 2+ ©2222+2222E++2z2z++zxrzzrzrxee 42.2.2 Cơ chế thúc đây tăng trưởng thực vật của sewẢO1owás -2-55255z552 5

2.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước -. cet cee ¿52+ 5+5<++<<+x+ecsxss 9

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ EHUUNG PHAR soseoeeeeineendnnndnindiiddidinnndtoasuarszi, 123,1 Thời gian vã địa điềm meebo caccsancsencensscorveennvanseronionsens tovenanunntsesbarcininion 12

3.2; Vat liệu v4:0hườơng phap Hehicn: CW vcs sxsscessesmsacsvomensemnausssavanemcenmemensnees 12 c2 À4.) 0017 12 3.2.2 Phương phap HghiÊH.CỨU s:csxcscsizcccs621225315315214353553665256356345835583EE-SMEE4GEESASELS8EE45S8 12

SER ge gs eeeeeeeekskkiognnSigegenhi ueictoherudistEvtkeEctHi000001010789930010/0x600/20/6/8753 16CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUAN -. - 2222222222E22E2222E2222222222 22x ze, 174.1 Các đặc điểm liên quan đến khả năng thúc day tăng trưởng thực vật của ba chủng

Vi khudin 41272/21///27//2280)0 01280008 iY 4,1,1 Khả năng hòa tan phosp h8 sesssesrbeasia642556103429160339539539303E80038E300118595890348E 17 4.1.2 Khả năng sinh phytohormones: Acid Indole Acetic (IAA) va Acid Gibberellic

4.1.3 Kha năng hình thành màng sinh học và sinh siderophores - - 19 4.1.4 Kha nang phan giai cellulose 20

4.1.5 Kha năng cố định đạm 2 2 ®+SE+SESE+EE+EE2EEEEEEEEEEEE2E212121221221222222.2Xe2 20

4.2 Hiệu quả kích thích tăng trưởng của vi khuẩn Pseudomonas spp trên cây ớt trong

điều kiỆn 1H! VŨ TÚ to nangg Dán GIA GI1 1663514551185 SESRAđ33SĐSSIEE4SE4G1G3ĐSSSESSĐISESESSESSSESSREESSEESSSEISGSSS4S8 214.2.1 Ảnh hưởng của vi khuân lên sự nay mam hạt ớt trong điều kiện in vi/ro 214.2.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự phát triển của cây ớt trong điều kiện in vitro 224.3 Hiệu quả kích thích tăng trưởng của vi khuẩn Pseudomonas spp trên cây ớt trongđiều kiện nhà lưới - 2-52 s2S£EE£EEEEEEEEE21211112121111111111111111111111 1e 23CHƯNG &, KẾT LILIỆN VÀ ĐỂ NGHĨ ~.eSexkeinni.nikehsvuer dgLeDdiaeildg000g 0x60 1.2L 26ca 26

| aẽẽaaeegguatrrtrrrrotrroydltatiligifryttoiripcggauearguawaei 26TÀI LIEU THAM KH auensaeeeentantriatisiriibioginighiERSIG00301040050100 3904000000008 006 17

VI

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

ACC: 1 - amino — cyclopropane — 1 — carbocylate

CAS: Chrome Azurol S

CMC: Carboxy methyl cellulose

Ctv: Cộng tac viên

EPS: Extracellular polymeric substances

GAs: Acid Gibberellic

ePGPR: extracellular plant growth promoting rhizobacteria

IAA: Indole-3-acetic acid

iPGPR: intracellular plant growth promoting rhizobacteria ISR: Induced Systemic Resistance

NB: Nutrient Broth

PGPR: Plant growth promoting rhizobacteria

TSB: Tryptone Soya Broth

VOCs: Volatile organic compounds

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bảng 4.1 Chỉ số hòa tan phosphate của 3 chủng vi khuẩn sau 5 ngày 17Bang 4.2 Hàm lượng IAA và GAs sinh ra bởi 3 chủng vi khuan sau 5 ngày 18Bảng 4.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn đến tỉ lệ nảy mầm hạt ớt - 21Bang 4.4 Anh hưởng của vi khuẩn lên chiều dài rễ và chiều cao chdi cây ớt sau 5 ngàytrong điều kiện i7 vi/rO -2-5252 22 22221221221221221221221221221221221212121221212122 xe 22Bang 4 5 Trọng lượng tươi (mg) va chiều dài rễ (cm) cây ớt 7 ngày sau lần tưới 4 23Bảng 4.6 Chiều cao cây ớt (€m) -©2+©2+2s+2S22E22E2123221221121121212122112122121 2xe2 23Bãng ä.7 R lí 0) CÊY le nuuà bà go À Ho HÀ ah 0A Chb ant 00A1214138.44116550304141601A80883682 23

Vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tran

Hình 4.1 Khả năng hoà tan phosphate của 3 chủng vi khuân - i"

Hình 4.2 Kha năng sinh phytohormones của 3 chủng vi khuẩn sau 5 ngày 19

Hình 4 3 Kết quả khả năng sinh siderophore và hình thành màng sinh hoc 20

Hình 4.4 Kết quả phân giải cellulose của 3 chủng vi khuẩn - 20

Hình 4 5 Kết quả khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn 21

Hình 4.6 Ảnh hưởng của vi khuẩn lên tỉ lệ nảy mầm hạt ớt trên môi trường WA sau 5 ¡0 22

Hình 4 7 Hình cây ớt con sau 5 ngày trong điều kiện i vi/ro - 23

Hình 4.8 Anh hưởng của vi khuẩn lên cây ớt 7 ngày sau lần tưới 4 - 24

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, sản xuất nông nghiệp bền vững ở Việt Nam đang được đây mạnh vớiviệc giảm dần các sản phẩm phân bón hoá học và sử dụng nổi bật hơn các san phâm cónguồn gốc sinh học thân thiện với môi trường và sức khỏe con người Phân bón sinh họcchứa một hoặc nhiều vi khuân vùng rễ kích thích tăng trưởng và tăng hiệu suất của câytrồng dẫn đến gia tăng năng suất Vi khuẩn PGPR (Plant growth promotingrhizobacteria) tương tác trực tiếp với thực vật bằng cách tăng khả năng cung cấp cácchất dinh dưỡng thiết yếu, sản xuất các phytohormones và giảm trạng thái căng thắng

do môi trường như kiểm soát nồng độ ethylene bởi ACC — deaminase Các vi khuẩn nàycũng có thé gián tiếp ảnh hưởng đến thực vật bằng cách bảo vệ thực vật chống lại mambệnh thông qua cạnh tranh dinh dưỡng, kiểm soát sinh học các tác nhân gây bệnh thôngqua việc sản xuất các hợp chất ức chế, tổng hợp enzyme phân giải vách tế bào nắm và

gây ra các phản ứng kháng toàn thân ở cây Bên cạnh đó, PGPR còn giúp tăng cường

khả năng hap thụ nước và chất đỉnh dưỡng

Nhiều nghiên cứu đã xác định nhóm PGPR là công cụ tiềm năng cho nền nôngnghiệp bền vững và là xu thế trong tương lai (Basu và ctv, 2021) Một số chủng PGPR

đã được xác định là các tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả trong điều kiện môi trườngđược kiểm soát Trong đó, Pseudomonas spp là một trong những chỉ vi khuẩn tiềm năngthuộc nhóm vi khuẩn thúc day tăng trưởng thực vật phân bố rộng rãi trong đất nôngnghiệp có khả năng xâm chiếm vùng rễ thực vật và là tác nhân kiểm soát sinh học Sửdụng Pseudomonas spp trong các chế phẩm phân bón sinh học dé nâng cao năng suấtcây trồng bằng cơ chế trực tiếp hoặc gián tiếp (Walsh và ctv, 2001) Một số nghiên cứu

đã chỉ ra rằng Pseudomonas fluorescens có mặt trong nhiều vùng rễ cây trồng và tạo ranhiều loại hoạt chất sinh học trong đó có các hợp chất thúc đây tăng trưởng thực vật(Rodriguez, 2006) Pseudomonas fluorescens từ rễ, chồi và vùng rễ của cây mia làmtăng đáng ké trọng lượng tươi và khô của cây (Mehnaz va ctv, 2009) Các thử nghiệmtrên đồng ruộng đối với chủng Pseudomonas dẫn đến sự gia tăng lớn về năng suất cây(Johri, 2001) Ngoài ra, Pseudomonas stutzeri nằm trong số những vi khuân được chứngminh thành công trong việc xâm lấn rễ cũng như ngăn ngừa mam bệnh Phytophthora

capsici trên dưa chuột (Islam va ctv, 2016).

1

Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu này tập trung khảo sát khả năng thúc đây tăngtrưởng thực vật của ba chủng vi khuân seuđomonas spp.

1.2 Mục tiêu đề tài

Đánh giá khả năng thúc đây tăng trưởng thực vật của ba chủng Pseudomonasspp trên đối tượng cây ớt trong điều kiện in vitro và trong điều kiện nhà lưới

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khao sát các đặc điểm liên quan đến khả năng thúc day tăng trưởngthực vật của ba chủng vi khuẩn Pseudomonas spp

Nội dung 2: Thử nghiệm hiệu quả kích thích tăng trưởng của vi khuẩn

Pseudomonas spp trên cây ớt trong điều kiện in vitro

Nội dung 3: Thử nghiệm hiệu quả thúc day tăng trưởng của vi khuẩn

Pseudomonas spp trên cây ớt trong nhà lưới.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Sơ lược về vi khuẩn vùng rễ (rhizobacteria) thúc day tăng trưởng thực vật(PGPR)

Đất là một hệ sinh thái phức tạp chứa nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như vikhuẩn, nam, sinh vật nguyên sinh và động vat (Miller va ctv, 2016) Vi sinh vật vùng

rễ kích thích tăng trưởng thực vật đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của câytrồng, điều hòa chất dinh dưỡng và các hoạt động kiểm soát sinh học Chúng định cưtrong vùng rễ thực vật, nơi chúng sử dụng nhiều quá trình trực tiếp và gián tiếp dé hỗtrợ sự phát triển của thực vật Những vi khuẩn này được gọi là những vi khuân thúc daytăng trưởng thực vật (PGPR) Đồng thời, chúng giúp kiểm soát các tác nhân gây bệnh

và nâng cao hàm lượng các chất dinh dưỡng trong dat dé cung cấp cho cây trồng

Theo Basu và ctv (2021), một PGPR lý tưởng là một PGPR có các đặc điểm thúcđây tăng trưởng thực vật cụ thể như: (1) có khả năng xâm chiếm vùng rễ cao và thânthiện với môi trường; (2) có khả năng xâm chiếm vùng rễ thực vật với số lượng lớn; (3)nâng cao khả năng sinh trưởng của cây; (4) có phô tác dụng rộng; (5) có kha năng tươngthích với các vi khuân vùng rễ khác; (6) có khả năng chịu được các yếu tô như: nhiệt độ,bức xa, tác nhân oxy hóa Các vi khuẩn này được chia thành vi khuẩn thúc day tăngtrưởng thực vật ngoại bao (extracellular plant growth promoting rhizobacteria - ePGPR),tồn tại trong vùng rễ, trên vùng rễ hoặc trong khoảng trống giữa các tế bào của vỏ rễ và

vi khuẩn thúc day tăng trưởng thực vật nội bao (intracellular plant growth promoting

rhizobacteria - iPGPR), tồn tại bên trong các tế bào rễ, thường là trong các cau trúc nốt

san (Gupta va ctv, 2015) Một số ví dụ về ePGPR như Agrobacterium, Arthrobacter,

Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Caulobacter, Chromobacterium,Erwinia, Flavobacterium, Micrococcous, Pseudomonas va Serratia Tương tự, một sé

vi du về iPGPR là Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium vaRhizobium thuộc ho Rhizobiaceae Bên cạnh đó, nhiều xa khuẩn cũng là một trongnhững thành phan chính của cộng đồng vi sinh vật vùng rễ thé hiện những đặc điểm cólợi cho sự phát triển của cây trồng Trong số đó, Micromonospora sp., Streptomycesspp., Streptosporangium sp., và Thermobifida sp., cho thay tiềm năng như là tác nhânkiểm soát sinh hoc chống lại các mầm bệnh thực vật (Bhattacharyya và Jha, 2012)

Nhóm vi khuẩn này đại diện cho thành phần quan trong của hệ vi sinh vật đất,sản xuất và tiết ra các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau trong vùng rễ của cây, kíchthích tăng trưởng và hiệu suất của cây trồng, đồng thời tăng năng suất Chúng tham giavào hệ sinh thái đất bằng nhiều cơ chế liên quan đến sự hình thành cấu trúc đất, phânhuỷ các chất hữu cơ Dựa trên sự tương tác với thực vật, cơ chế tác động của PGPR cóthể được chia thành cơ chế trực tiếp và cơ chế gián tiếp Cơ chế trực tiếp tạo điều kiệnthuận lợi cho sự hấp thu chất dinh dưỡng hoặc tăng khả năng cung cấp chất dinh dưỡngbằng cách cố định đạm, hòa tan các chất dinh dưỡng khoáng, sản xuất phytohormones.Mặt khác, cơ chế gián tiếp tác động bằng cách giảm tác động của mầm bệnh, bao gồmsản xuất kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng, ký sinh, ức chế độc tố mầm bệnh và tínhkháng cảm ứng ở thực vật (Elnahal và ctv, 2022) PGPR trong việc tạo ra kích thích tốthực vật, các phân tử của chất chuyền hóa tín hiệu và các chất liên quan mô tả cách thựcvật tự bảo vệ mình khỏi hạn hán như một ví dụ về căng thắng phi sinh học và độ mặn(Jochum và ctv, 2019) Theo Abbas và ctv (2019), PGPR cũng có thể thay đôi hình dạngcủa rễ, dẫn đến tăng bề mặt rễ và cải thiện hiệu suất của rễ Ngoài ra, PGPR có thé cạnhtranh với các vi khuân khác bằng cách xâm chiếm nhanh chóng và tích lũy nguồn cungcấp chất đinh dưỡng lớn hơn, ngăn chặn các sinh vật khác phát triển (Salomon và ctv,2017; Abd El-Mageed và ctv, 2020) Hơn nữa, sử dụng các vi khuẩn này góp phan hanchế sử dụng phân bón hoá học, mang lại lợi ích về mặt kinh tế, môi trường với chỉ phísản xuất thấp, cải thiện độ phì nhiêu của đất, giảm ô nhiễm môi trường và hướng đếnnền nông nghiệp bền vững Gần đây, các nhà khoa học đã xem xét kỹ lưỡng việc sửdụng PGPR có lợi để ức chế mầm bệnh thực vật và thúc đây tăng trưởng thực vật(Alwahshi va ctv, 2022) Một phan quan trọng của điều này có thé là do việc tăng cường

tính đặc hiệu của mục tiêu giữa PGPR và các loài thực vật (Lommen và ctv, 2019).

Trong nhiều thập kỷ, các loại PGPR đã được nghiên cứu và một số trong số chúng đãđược thương mại hóa, bao gồm các loài Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter,

Klebsiella, Azobacter, Variovorax Azosprillum và Serratia (Glick và ctv, 2012).

2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Pseudomonas

2.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá

Chi Pseudomonas là một trong những chi vi khuan phức tạp nhất và hiện là chi

vi khuân gram âm có số lượng loài lớn nhất; trên thực tế, số lượng loài trong chỉ đã tăng

lên hang năm Pseudomonas fluorescens và Pseudomonas putida thuộc chi này là những

loài rất nổi tiếng và được nghiên cứu kỹ lưỡng và đã được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy

dé thúc day tăng trưởng thực vật Vi khuẩn Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadaceae,gram âm, thắng hoặc hơi cong, hai đầu tròn, có chiều dai 1,5 — 3,0 um, chiều rộng

0,5 — 0,8 pm Hầu như tất cả các chủng đều di động nhờ một roi đơn cực, và một sỐchủng có hai hoặc ba roi, không sinh nha bảo, có pili ở cực (rộng 6 nm) Các loàiPseudomonas là vi khuân hiếu khí, phát triển tốt ở 25°C đến 37°C, pH 4 — 10, có khảnăng phát huỳnh quang đưới tia UV Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của

Pseudomonas là 28°C.

Pseudomonas còn có kha năng tiết các sắc tố Các sắc tố này có kha năng tan

hoặc khuếch tán vào môi trường nuôi cay Một số sắc tố màu được biết đến nhiều nhất

là: pyoverdine (màu vàng xanh) là các siderophore được sản xuất bởi các loàiPseudomonas fluorescens có vai trò sinh lý quan trọng trong việc hap thu Fe ở vi khuẩn,

pyocyamn (P aeruginosa, màu xanh da trời), pyorubin (mau đỏ — nâu), pyomelanin

(màu nâu hoặc đen) Pseudomonas aeruginosa có khả năng tiết ra nhiều sắc tổ(fluorescent), siderophores, các chất dé bay hơi như hydrocyanic acid (HCN), các chấtkhang sinh và các enzyme phân giải (chitinase, 1,3 glucanase, protease) (Gupta va ctv,

2015).

2.2.2 Cơ chế thúc day tăng trưởng thực vat của Pseudomonas

Pseudomonas được đánh giá cao vì mang lại lợi ích cho cây trồng bằng cách cảithiện năng suất và khả năng miễn dịch của cây Thúc đây tăng trưởng và kiểm soát bệnhcủa Pseudomonas là các quá trình phức tạp có liên quan với nhau bao gồm các cơ chếtrực tiếp tạo điều kiện cho sự hấp thu chất dinh đưỡng hoặc tăng khả năng cung cấp chấtdinh dưỡng bằng cách cố định đạm, hòa tan các chất dinh dưỡng khoáng, khoáng hóacác hợp chất hữu cơ và sản xuất phytohormones (auxin, cytokinin và gibberellin) vàgián tiếp tạo ra 1 — amino — cyclopropane — 1 — carbocylate (ACC) deaminase kích thíchtính kháng stress của cây trồng, sản xuất siderophore, kháng sinh, hydro xyanua (HCN)

và các hợp chat dé bay hơi (Volatile organic compounds — VOCs) VOCs được tao rabởi vi khuẩn thúc day tăng trưởng thực vật (PGPR) đóng vai trò quan trọng trong việcthúc đây tăng trưởng thực vật và tạo ra sức đề kháng hệ thống (ISR) đối với mầm bệnh(Kai va Piechulla, 2009) Một số loài vi khuẩn, từ các chi khác nhau bao gồm Bacillus,

Pseudomonas, Serratia, Arthrobacter và Stenotrophomonas, tạo ra VOCs ảnh hưởng

đến sự phát triển của thực vật (F arag va ctv, 2013) Acetoin và 2,3-butanediol từ Bacillus

5

là những hợp chất được biết đến nhiều nhất và cải thiện đáng ké sự phát triển của thựcvật (Kai và Piechulla, 2009) Ngoài việc thúc day tăng trưởng, VOCs do trực khuẩn tạo

ra có thể tạo ra ISR (Farag và ctv, 2006), cho thấy một số vai trò tiềm năng cua VOCstrong thực vat Những yếu tố khác bao gồm cạnh tranh và gây ra phan ứng hệ thốngkháng toàn thân (Induced Systemic Resistance — ISR) với mầm bệnh (Abbasdokht và

Gholami, 2010).

2.2.2.1 Cố định đạm

Đạm là chất dinh dưỡng quan trọng với sinh trưởng và năng suất của cây, chiếmkhoảng 78% trong không khí Cây hap thụ đạm ở dạng ammonium NH¿Ÿ va nitrate NOcây trồng không có khả năng hấp thụ trực tiếp dam trong không khí Vi khuẩn cô địnhdam là nhóm vi khuẩn có khả năng biến nito trong khí quyên thành nito có định (cáchợp chất vô cơ mà thực vật có thể sử dụng được) sử dụng phức hợp enzyme nitrogenasegọi là quá trình cố định đạm sinh học Một số nhóm như Rhizobium, Azotobacter,Azospirillum, Clostridium, Beijerinckia, có khả năng cô định đạm giúp chuyên đổi Natrong khí quyên thành ammonium mà cây trồng hấp thu

Trong quá trình cô định đạm sinh học, khí Na chỉ được đồng hóa và biến đổi bởimột nhóm vi sinh vật chon lọc, có thé là sinh vật cộng sinh hoặc nhóm sinh vật sống tự

do Chung Pseudomonas cô định nito trong điều kiện vi hiếu khí ở trạng thái sống tự do

theo phương thức nội sinh (Desnoues va ctv, 2003) Nam 1987, Krotzky và Werner đã

phân lập được chủng vi khuan Pseudomonas stutzeri từ rễ cây cao lương có khả năng

cố định đạm Hau hết Pseudomonas cỗ định N2 được báo cáo là P stutzeri P stutzeriA15 thúc day tăng trưởng đáng kể so với cây lúa không được bổ sung vi khuẩn Hơnnữa, việc bồ sung P stutzeri A15 cho kết quả tốt hon đáng kể so với bón phân bằng nitơhóa học, cho thấy rõ tiềm năng của vi khuẩn này trong vai trò phân bón sinh học (Pham

va ctv, 2017).

2.2.2.2 Hoa tan phosphate

Phospho (P) là nguyên tổ cần thiết với sinh trưởng va phát triển của cây trồng,đóng vai trò quan trọng trong tat cả các quá trình trao đổi chất chính trong thực vật baogồm quang hợp, hô hấp và truyền năng lượng Hầu hết phospho tồn tại trong đất ở dạng

vô cơ và hữu cơ không tan Mặc dù P có nhiều trong đất ở cả dạng vô cơ và hữu cơ,nhưng thực vật không thể hấp thụ các dạng kết tủa, không hòa tan này Do đó, vi sinh

vật hòa tan phosphate đóng vai trò quan trọng trong quá trình giải phóng phosphate từ

các phân tử hữu cơ hoặc hoa tan các hợp chat phosphate vô cơ khó tan dé thực vật déhấp thụ Thực vật hấp thu phosphate ở dang ion HPO,” và HaPOxr Trong dat, cac PGPR

có khả năng hòa tan phospho ở hai dang: hòa tan phospho vô cơ (khoáng chất), khoánghóa phospho hữu cơ Các chủng Pseudomonas có khả năng hòa tan phospho trong đất

và tăng khả năng cung cấp phospho cho cây trồng (Sundara và ctv, 2002) Rất nhiều loàithuộc chi này như P fluorescens NJ-101, P fluorescens EMSS, P aeruginosa,

Pseudomonas sp., P chlororaphis, P savastanoi, P pickettii, P lutea OK2, P rhizophaerae LMG21640, P graminis DSM11363, P striata va P corrugate da được báo cáo là các chung phân giải phosphate khó tan (Narayanan va ctv, 2009) Cac hop

chat phospho vô cơ được tông hợp bởi nhiều vi sinh vat đất nhờ tác động của các acidhữu cơ có khối lượng phân tử thấp Khoáng hoá các hợp chất hữu cơ diễn ra thông quaquá trình tông hợp các enzyme phosphatase khác nhau xúc tác bằng phản ứng thuỷ phâncầu nói phospho — ester Do đó, Pseudomonas trở thành vi sinh vật hứa hẹn để cải thiệnkhả năng hấp thụ phospho của thực vật

2.2.2.3 Khả năng sinh siderophore

Sat là hợp chất quan trọng cho sự chuyên hóa thực vật và là yếu tố tăng trưởngthiết yếu cho tất cả các sinh vật sống Trong điều kiện hiếu khí, sắt tồn tại chủ yếu ởdạng Fe?” và dé tạo dang hydroxide không tan khiến thực vật và vi sinh vật khó hap thụ(Rajkumar va ctv, 2010) Do đó các vi khuẩn PGPR khử Fe** thành Fe?” giúp cây trồng

dễ hap thụ Hau hết siderophore được sản xuất bởi các chi Pseudomonas, Enterobacter,

các chi Bacillus và Rhodococcus Pseudomonas aeruginosa được bao cáo là có khả năng

tiết ra pyoverdine và pyochelin dé hoà tan Fe** va vận chuyền vào tế bao vi khuẩn thôngqua các thụ thể đặc hiệu Những vi khuẩn này rất hữu ích trong nông nghiệp vìsiderophore của chúng thúc đây tăng trưởng thực vật tốt trong điều kiện hạn chế sắt,kiểm soát bệnh cây trồng và giúp cây trồng thoát khỏi tình trạng nhiễm độc kim loạinặng (Naik và ctv, 2011) Siderophore của vi sinh vật có thé tăng cường sự phát triểncủa thực vật thông qua việc tăng khả năng hòa tan sắt trong vùng rễ của thực vật Nhữngsản phâm như vậy cũng có thé làm giảm bớt tác động bat lợi của mầm bệnh đối với sựphát triển của cây trồng

2.2.2.4 Sản xuất hormone sinh trưởng thực vật

Theo Vedamurthy và ctv (2021), các chất điều hòa sinh trưởng thực vật này, cònđược gọi là kích thích tố ngoại sinh thực vật, là những chất tổng hợp tương tự như kích

thích tố thực vật tự nhiên Chúng được sử dụng dé điều chỉnh sự phát triển của cây trồng

và là biện pháp quan trọng đề thúc đây sản xuất nông nghiệp Phytohormones là các chấthữu cơ được tìm thấy với số lượng cực thấp có ảnh hưởng đến các quá trình sinh hóa,sinh lý và hình thái ở thực vật; quá trình tổng hợp của chúng được điều chỉnh trơn tru.Một trong những thuật ngữ mô tả phương thức hoạt động nổi bật nhằm thúc day tăngtrưởng của PGPR là chất kích thích thực vật hoặc chất điều hòa sinh trưởng thực vật.Đây được định nghĩa là các vi sinh vật có khả năng sản xuất hoặc làm thay đổi nồng độcác chất điều hòa sinh trưởng như auxin (IAA), acid gibberellic (GAs), cytokinin và

ethylene (Vejan và ctv, 2016).

Indole-3-acetic acid (IAA) là phân tử quan trọng nhất trong nhóm hormone thựcvat IAA là auxin chính của thực vật bậc cao, trong đó L-tryptophan - tiền chất sinh tổnghợp IAA là hợp chất làm thay đổi nồng độ IAA Ngược lại anthranilate synthase - tiềnchất tông hợp tryptophan lại giảm tông hợp IAA Sự tổng hợp IAA từ vi sinh vật đãđược biết đến từ lâu Đặc tính này được ghi nhận tốt nhất đối với vi khuẩn tương tác vớithực vật Sản xuất IAA bằng PGPR là một trong những cơ chế được nghiên cứu nhiềunhất và có lẽ là cơ chế thúc đây tăng trưởng hiệu quả nhất (Patten va Glick, 1996) Rễcây tiết ra các chất truyền tín hiệu (L — tryptophan, các acid amin và các phân tử nhỏkhác) vào đất vùng rễ, thúc đây sự liên kết của vi khuan với bề mặt rễ (Simons và ctv,1997) Vi khuan bám vào rễ có thé sử dụng L — tryptophan dé tạo ra IAA (Patten vaGlick, 1996) IAA được tiết ra từ PGPR và hoạt động như một phân tử tín hiệu quantrọng trong việc điều hòa sự phát triển của cây trồng bao gồm: điều khiến sự ra hoa,phản ứng hướng động, phản ứng tế bào như gia tăng kích thước và phân chia tế bào, biệthóa và điều hòa gen, gia tăng hô hấp và hình thành rễ Hầu hết các loài PGPR đượcnghiên cứu thường xuyên tạo ra IAA đều thuộc chi Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter,

Azospirrulam va Rhizobia (Aeron va ctv, 2011).

Theo Bottini va ctv (2004), các quá trình nảy mam và phát triển của hat, quá trình

ra hoa, phát triển hoa và quả cũng như sự phát triển của hơi nước và lá bao gồm sự thamgia của gibberellin, một trong những phytohormones Tuy nhiên, tác dụng sinh lý nổibật nhất của gibberellin là kéo dài chồi Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây cà chua được cấychủng Sphingomonas sp sản xuất gibberellin có sự gia tăng đáng ké về các đặc điểmsinh trưởng khác nhau (Khan và ctv, 2014) Cytokinin kích thích sự phân chia tế bàocủa thực vật, độ nhạy phat sinh mach, sự biệt hóa mạch và gây ra sự phát triển của lông

rễ, nhưng ức chế sự hình thành rễ bên và kéo dai rễ sơ cấp (Riefler và ctv, 2006) Câygiống Platycladus orientalis (trắc bách) được cấy chủng Bacillus subtilis sản xuấtcytokinin có khả năng chống chịu stress do hạn hán tốt hơn (Liu và ctv, 2013).

2.2.2.5 Khả năng chống chịu stress ở thực vật

Theo Naveed và ctv (2014), một tac dụng chính khác của PGPR đối với thực vậttrong điều kiện stress phi sinh học là cải thiện tình trạng nước trong lá, đặc biệt là dưới

áp lực về độ mặn và hạn hán Ching Pseudomonas aeruginosa đã cải thiện sự phát triểncủa cây đậu xanh trong điều kiện khô hạn (Sarma và Saikia, 2014)

Pseudomonas spp có khả năng biến dưỡng vô cùng linh hoạt và khả năng tồn tạitrong những điều kiện stress đa dạng Màng sinh học là các cộng đồng vi khuẩn dày đặcbao bọc các tập hợp vi khuẩn trong một ma trận phức tạp gồm các polysaccharide ngoại

bao (extracellular polymeric substances — EPS), DNA ngoại bao và protein Sự hìnhthành màng sinh học và sản sinh EPS không chi giúp chúng có thé chống chịu với stress

hạn, stress mặn, nhiệt độ cực đoan, nồng độ cao của các chất ô nhiễm mà còn có thể bảo

vệ thực vật duy trì được sự tăng trưởng ồn định dưới những điều kiện stress này Khảnăng vi khuẩn chịu được áp lực thấm thấu thường là do khả năng hình thành màng sinhhọc, ngăn ngừa hiện tượng hút âm trong điều kiện áp lực thấm thấu Theo Ueda va ctv

(2015), Pseudomonas có kha năng hình thành hai loại màng sinh học là màng sinh học

bám trên bề mặt và màng sinh học nồi — được hình thành tại bề mặt tiếp xúc không khí

— chất lỏng của môi trường nuôi cấy lỏng tĩnh Nghiên cứu cũng chi ra rang mỗi chủngPseudomonas sở hữu những đặc tính hình thành mang sinh học khác nhau tùy thuộc vào

thời gian, dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, Ngoài ra, đặc tính bề mặt tế bao ảnh hưởng đến sựhình thành mang sinh học, vì vi khuẩn có đặc tính ky nước có khả năng bám dính vàhình thành màng sinh học tốt hơn Sự sản sinh ACC — deaminase là một cơ chế quantrọng giúp thực vật chống chịu với stress

2.2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.2.3.1 Nghiên cứu trong nước

Cao Ngọc Điệp (2005) đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của chủng vi khuẩnPseudomonas trên cây lúa cao sản Kết quả cho thấy bón vi khuẩn nốt rễ và vi khuânPseudomonas giúp gia tăng năng suất lúa cao sản, hạn chế lượng phân đạm hoá học, tiết

kiệm 70 kg N/ha/vụ.

Theo Đặng Thị Ngọc Thanh và ctv (2016) đã tiến hành phân lập thành công 5Šdong vi khuẩn liên hiệp thực vật có khả năng làm tăng chiều cao, khối lượng thân lá và

rễ tươi, khối lượng chất khô của cây một tháng tuổi so với đối chứng

Chu Nguyên Thanh và ctv (2018) đã thành công chọn lọc và đánh giá khả năng

thúc đây tăng trưởng của hai chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas Cả hai chủng vikhuẩn đều thé hiện những đặc điểm có lợi cho sự sinh trưởng của thực vật trong điềukiện in vitro và điều kiện nhà lưới

Chu Nguyên Thanh và ctv (2020) đã sàng lọc được 3 chủng vi khuẩnPseudomonas tiềm năng đều thé hiện các đặc điểm thúc đây tăng trưởng thực vật in vitronhư sinh IAA, cố định đạm và hòa tan phosphate Chủng vi khuân BT00P03 (phân lập

từ bề mặt rễ cây bắp) có khả năng kích thích tăng trưởng cây đậu phộng cả trong điềukiện bình thường và điều kiện stress mặn

2.2.3.2 Nghiên cứu nước ngoài

Theo Ramette và ctv (2006), Pseudomonas có đặc tính thúc đây tăng trưởng thựcvật Các chủng phân lập cho thay khả năng sản xuất IAA, hòa tan phosphate và sản xuấtsiderophore cao, trong khi phân tích kiểu gen cho thay Pseudomonas phân lập từ vùng

rễ của cây lúa rất đa dạng về mặt di truyền Tuy nhiên, các chủng được phân bố thành

11 kiểu gen, bao gồm năm nhóm Pseudomonas fluorescens

Egamberdieva (2010) đã phân tích các vi khuẩn thúc đây tăng trưởng thực vật vềtác dụng kích thích tăng trưởng của chúng đối với hai giống lúa mì Các cuộc điều trađược thực hiện trong các thí nghiệm trong chậu sử dụng đất đá vôi Kết quả cho thấychúng vi khuẩn Pseudomonas sp và P fluorescens có thê xâm chiếm vùng rễ của cả haigiống lúa mì Các chủng vi khuân Pseudomonas sp và P fluorescens đã kích thích đáng

kê chiều dài chồi và rễ cũng như trọng lượng khô của lúa mì

Theo Shinde và ctv (2017), cây dương được trồng trong điều kiện hạn chế chấtdinh dưỡng và được xử ly bằng các chủng Pseudomonas fluorescens Pf0-1, SBW25,WH6 và P protegens Pf-5 đã tăng khả năng hap thu chất dinh dưỡng, chiều dài rễ vàsinh khối

Theo Chandra và ctv (2018), vi khuẩn Pseudomonas cải thiện đáng kể hiệu suấttăng trưởng của cây kê chân vịt và làm tăng hàm lượng dinh dưỡng trên lá trong cả điềukiện bình thường và hạn hán Ngoài ra, việc xử lý với vi khuẩn làm gia tăng đáng kể

hoạt tính chống oxy hóa, cải thiện sức khỏe của cây bang cách bảo vệ cây khỏi tonthương do hạn hán gây ra.

Nghiên cứu của Adoko và ctv (2021) cho thay vi khuẩn Pseudomonas syringaeT15 giúp tăng đường kính thân bắp trồng trong chậu 44,57%, trong khi dòng vi khuânPseudomonas putida T19 làm tăng 66,10% điện tích lá Kết quả các chủng vi khuẩn đềugiúp kích thích tăng trưởng cây bắp và sự gia tăng sinh khối rễ, thân, lá của bắp là cơ sởchứng minh cây hút thu day đủ chất dinh dưỡng đảm bảo năng suất tốt hon so với cácnghiệm thức không chủng vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới

lãi

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ 01/03/2023 - 05/01/2024

Địa điểm nghiên cứu: phòng Sinh học tích hợp thực vật — Khoa Khoa học Sinhhọc — Nhà Al — Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Ba chủng Pseudomonas spp (PN02, PN04, PN06) được phân lập và lưu trữ tại phòng Sinh học tích hợp thực vật - Khoa Khoa học Sinh học — Trường Dai học NôngLâm TP Hồ Chí Minh

Hạt giống ớt chỉ thiên siêu cay F1 Phú Nông, Việt Nam

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Nội dung 1: Khảo sát các đặc điểm liên quan đến khả năng thúc day tăngtrưởng thực vật của ba chủng vi khuẩn Pseudomonas spp

Chuan bị: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Tryptone Soya Broth (TSB) (hãngHiMedia gồm tryptone 17 g/l, soya peptone 3 g/l, NaCl 5 g/l, K2HPOs 2,5 g/l, glucose2,5 g/l), trong 24 gid, 30°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút

Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên,gồm 3 nghiệm thức (mỗi chủng vi khuẩn là một nghiệm thức) và 1 nghiệm thức đốichứng Tổng thí nghiệm có 4 nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 4 đĩa

Kha năng phân giải cellulose

Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn, pha loãng tới giá trị ODsoom = 0,1 (khoảng10° CFU/ml) Cay chấm điểm huyền phù vi khuẩn trên môi trường CMC (carboxylmethyl cellulose) agar (gồm CMC 5 g/l, NazHPO¿ 6,8 g/l, KHzPO¿ 3 g/l, NaCl 0,5 g/l,

(NH¿z;SO¿ 1,3 g/l, MgSO4.7H20 0,5 g/l, agar 20 g/l) Vi khuẩn được ủ ở 30°C trong

48h Cho thuốc thử Lugol (KI 2 g, Iodua 1 g, nước cất 2 ml, lắc đều rồi định mức lên

300 ml) vào đĩa môi trường, để yên trong 5 phút rồi gạn bỏ phần thuốc thử dư thừa.CMC trong môi trường sẽ phản ứng với thuốc nhuộm cho màu nâu sam Vòng sáng mauvàng xung quanh khuẩn lạc chỉ ra khả năng phân giải cellulose

Xác định khả năng hòa tan phosphate

Chuan bị dịch huyền phù vi khuẩn, pha loãng tới giá trị ODøoom = 0,1 (khoảng10° CFU/ml) Lay dich vi khuẩn nuôi cấy chấm điểm trên môi trường thạch Pikovskaya(gồm glucose 10 g/l, (NH4)2SOx 0,5 g/1, NaCl 0,2 g/1,MgSOx.7H›O 0,1 g/l, KCI 0,2 g/l,

Yeast extract 0,5 g/l, MnSOx.H›O 0,002 g/l, FeSO4.7H20 0,002 g/l, CasPOa 5 g/l, agar

20 g/l) Vi khuẩn được ủ ở 30°C trong 5 ngày Chỉ tiêu theo dõi: Sự hiện diện của vòngtan xung quanh khuẩn lạc chỉ ra khả năng hòa tan phosphate Chỉ số hòa tan phosphatesau 5 ngày được tính bằng cách lấy tông đường kính vòng phân giải (khuẩn lạc + vòngtan) chia cho đường kính khuẩn lạc

Xác định khả năng cố định đạm

Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn, pha loãng tới giá trị ODsoom = 0,1 (khoảng10° CFU/ml) Lay dich vi khuẩn cấy ria trên môi trường Burk’s vô đạm (gồm sucrose

10 g/l, KH:PO¿ 0,41 g/l, KzHPO¿ 0,52 g/1, NaSO¿ 0,05 g/l, CaC]a 0,2g/1, MgSO4.7H20

0,1g/1, FeSO4.7H20 0,005 g/l, NaMoO4.2H20 0,0025 g/l (Park va ctv, 2005), agar 20

g/l), 30°C, 72 giờ Chi tiêu theo đối: Quan sát sự hình thành khuẩn lạc Khả năng cốđịnh đạm thê hiện qua sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường Burk’s vô đạm

Xác định khả năng hình thành màng sinh học

Chuẩn bị dich huyền phù vi khuẩn, pha loãng tới giá trị ODsoom = 0,1 (khoảng10° CFU/ml) Hút 100 pL dịch huyền phù vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 10 mLmôi trường TSB Nuôi cấy ở 30°C trong 5 ngày rồi nhẹ nhàng đồ bỏ dịch nuôi cay Rửaống nghiệm với nước cất, để khô rồi nhuộm với dung dịch Crystal Violet 0,1% (0,2 g

Crystal Violet, 100 ml CH30H, 20 ml CH:COOH, 80 ml H20) trong 30 phút ở nhiệt độ

phòng Đồ bỏ thuốc nhuộm và rửa lại bằng nước cat 3 lần Chỉ tiêu theo đõi: Sự hìnhthành màng sinh học trên thành ống được phát hiện khi có một vạch hoặc các mảng bắtmàu thuốc nhuộm bám trên thành hoặc đáy ống nghiệm

Xác định khả năng sinh IAA

Nuôi cay vi khuẩn trên môi trường TSB bồ sung tryptophan 0,1 g/L ở 30°C, tốc

độ lắc 150 vòng/phút trong 5 ngày Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút đề loại bỏ sinhkhối Hút 2 ml dịch nổi phía trên cho vào ống nghiệm mới Thêm 4 ml thuốc thửSalkowski (FeCl; 0,5M 15 ml, H2SO 98% 300 ml, nước cất 500 ml) U hỗn hợp ở nhiệt

độ phòng, tránh ánh sáng trong 25 phút Do độ hấp thu của hỗn hợp ở bước sóng 530

nm Chỉ tiêu theo dõi: Hỗn hợp chuyên sang màu hồng nhạt đến đỏ chỉ ra sự hiện diện

13

của IAA trong dịch nuôi cay Hàm lượng IAA được xác định dựa vào đường tương quangiữa nồng độ IAA chuẩn với giá trị OD 530 nm.

Xác định khả năng sinh acid gibberellic (GAs)

Gibberellin được ước tính theo tiêu chuẩn (Holbrook và ctv, 1961) với một sốsửa đôi nhỏ Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Nutrient Broth ((NB) gồm peptone 10

g, beef extract 1 g, yeast extract 2 g, NaCl 5 g, nước cất 1000 ml) 6 30°C, tốc độ lắc 150

vòng/phút trong 5 ngày Hút 20 ml dich huyền phù vi khuẩn, ly tâm 2000 vòng/phút

trong 15 phút dé loại bỏ sinh khối Hút 15 ml dịch nổi phía trên cho vào ống nghiệmmới, thêm 2 ml thuốc thử kẽm acetate (21,9 g kẽm acetate, | ml acid acetic và định mứcđến 100 ml bang nước cất) Sau 2 phút, thêm 2 ml kali ferrocyanide (10,6% trong nướccat), ly tâm 2000 vòng/phút trong 15 phút Hut 5 ml dịch nỗi phía trên, thêm 5 ml HCl30% và ủ hỗn hợp ở 20°C trong 75 phút (đối với mẫu trang, sử dụng 5 ml HCI 5%, do

độ hấp thụ ở bước sóng 254 nm Hàm lượng acid gibberellic được xác định dựa vàođường tương quan giữa hàm lượng acid gibberellic chuẩn với giá trị OD254 nm

Xác định khả năng sinh siderophore

Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn, pha loãng tới giá trị ODsoom = 0,1 (khoảng10° CFU/ml) Lấy dịch vi khuẩn nuôi cấy cham điểm huyền phù vi khuẩn trên môitrường thạch Chrome Azurol S (CAS) (Dung dịch Chrome Azurol S (CAS): trộn 60,5

mg Chrome Azurol S hòa tan trong 50 ml nước cất với 10 ml FeCl3.6H2O 1 mM trongHCI 10 mM sau đó trộn với 72,9 mg CTAB hòa tan trong 40 ml nước cất Môi trườngChrome Azurol S (CAS) agar gồm 100 ml dung dịch CAS, 900 ml King’s B (peptone

20 g, glycerol 10 ml, KzHPO¿ 1,5 g, MgSO 7H20 1,5 g), agar 20 g và pH 6,8) trong 5

ngày ở 30°C Chỉ tiêu theo dõi: sự sản sinh siderophore được phát hiện bang cách quansát quầng sáng màu cam xung quanh khuẩn lạc trên đĩa thạch CAS

3.2.2.2 Nội dung 2: Thử nghiệm hiệu quả kích thích tăng trưởng của vi khuẩnPseudomonas spp trên cây ớt trong điều kiện in vitro

Thử nghiệm hiệu quả kích thích nảy mầm của vi khuẩn Pseudomonas lên hạt ớttrong điều kiện in vitro

Vi khuẩn được tăng sinh 24 giờ trong môi trường TSB lỏng, tốc độ lắc 150vòng/phút, 30°C Pha loãng dịch huyền phù vi khuân tới giá trị OD øoonm = 0,1 (khoảng10° CFU/ml) Hạt ớt được khử trùng bề mặt bằng javel 5% trong 5 phút, sau đó rửa lại

5 lần với nước cất khử trùng Sau đó ngâm hạt trong dịch huyền phù vi khuẩn trong 2

giờ Ở nghiệm thức đối chứng, hạt sau khi khử trùng được xử lý với nước cất và môitrường TSB không bồ sung vi khuẩn Ở mỗi nghiệm thức, 30 hạt được gieo lên dia petrichứa bông âm đã tâm nước cất U các đĩa ở 25 + 1°C Theo dõi sự nay mam của hạt sau

5 ngày và tính tỉ lệ nảy mầm Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên,gồm 3 nghiệm thức (mỗi chủng vi khuẩn là 1 nghiệm thức) và 2 nghiệm thức đối chứng.Thí nghiệm được thực hiện 3 lần

Thử nghiệm khả năng kích thích tăng trưởng của vi khuẩn Pseudomonas trên cây

ớt trong điều kiện in vitro

Vi khuẩn được tăng sinh 24 giờ trong môi trường TSB lỏng, tốc độ lắc 150

vòng/phút, 30°C Pha loãng dịch huyền phù vi khuẩn tới giá trị ODøoonm = 0,1 (khoảng

10° CFU/ml) Hạt ớt được khử trùng bề mặt bằng javel 5% trong 5 phút, sau đó rửa lại

5 lần với nước cất khử trùng Hạt được gieo trên môi trường khoáng MS1⁄4 (1,25%sucrose, 1% agar, pH 5,8) Sau khi nảy mầm 5 ngày, các cây con đồng nhất về kíchthước được chuyên sang đĩa môi trường khoáng mới Trên mỗi đĩa môi trường, cấy 3cây con và các đĩa giấy được đặt cách đầu mút rễ 2,5 cm, 20 uL dịch nuôi cay được cholên các đĩa giấy Ở nghiệm thức đối chứng, lần lượt 20 uL môi trường TSB và nước cất

vô trùng được cho lên các đĩa giấy Các đĩa môi trường được đặt dựng đứng trong buồngtăng trưởng 6 25°C với quang ky là 16 giờ sáng/ 8 giờ tối, trong 5 ngày Chỉ tiêu theodõi: chiều cao chéi và chiều dài rễ sau 5 ngày Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàntoàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức (mỗi chủng vi khuẩn là 1 nghiệm thức) và 2 nghiệmthức đối chứng Thí nghiệm được thực hiện 3 lần

3.2.2.3 Nội dung 3: Thử nghiệm hiệu quả kích thích tăng trưởng của vi khuẩnPseudomonas spp trên cây 6t trong điều kiện nhà lưới

Vi khuẩn được tăng sinh 24 giờ trong môi trường TSB lỏng, tốc độ lắc 150vòng/phút, 30°C Pha loãng dịch huyền phù vi khuẩn tới giá trị ODøoosm = 0,1 (khoảng10° CFU/ml) Hạt ớt được khử trùng bề mặt bằng javel 5% trong 5 phút, sau đó rửa lại

5 lần với nước cất khử trùng và ngâm trong nước cất ấm với tỉ lệ 2 sôi 3 lạnh (45 — 50°C)trong 2 — 3 giờ, sau đó ủ hạt giống ở 25 — 30°C trên khăn giấy thắm nước cất vô trùngđến khi hạt nứt nanh thì đem gieo vào khay ươm Khi cây được 3 lá thật (từ 7 — 10 ngàytuổi) chọn các cây con phát triển đồng đều, sau đó trồng các cây vào chậu Tưới nướchang ngày với liều lượng 200 mI/chậu Tưới 4 ml dich nuôi cấy vi khuẩn ( 10° CFU/ml)vào mỗi gốc cây Tưới | tuần/lần, liên tục trong 4 tuần Thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn

15

ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức (mỗi chủng vi khuẩn là 1 nghiệm thức), ở nghiệm thứcđối chứng lần lượt là nước cất và môi trường TSB Năm nghiệm thức được thiết lập như

sau: NT1 (nước); NT2 (môi trường TSB); NT3 (xử lý với dịch vi khuẩn PN02); NT4

(xử lý với dich vi khuẩn PN04); NTS (xử lý với dịch vi khuan PN06) Mỗi nghiệm thứclặp lại 3 lần, mỗi lần 3 cây

Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây (cm): Do chiều cao cây từ đo từ bề mặt giá théđến đỉnh sinh trưởng của cây; Số lá/cây (lá/cây): Đếm tổng số lá trên cây; Chiều dài rễ(cm): Do chiều dài rễ từ cô rễ đến chop rễ; Trọng lượng tươi của cây (mg): cân khối

lượng của cây.

3.3 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu thí nghiệm được phân tích ANOVA 1 yếu tố bằng phần mềmMinitab.16 Các số liệu được chuyên đôi dé đảm bảo tuân thủ phân phối chuẩn (nếu cầnthiếp)

CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Các đặc điểm liên quan đến kha năng thúc day tăng trưởng thực vật của bachủng vi khuẩn Pseudomonas spp

4.1.1 Khả năng hòa tan phosphate

Bang 4.1 Chỉ số hòa tan phosphate của 3 chủng vi khuan sau 5 ngày

Chủng vi khuẩn Chỉ số hòa tan phosphate

PN02 5,21ˆ+0,16 PN04 5,52ˆ+ 0,31

PN06 2,65P+ 0,24

Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặtthông kê (P < 0,05) So liệu trung bình + SD.

Vi khuẩn PGPR chuyền đổi P từ dạng khó tan thành dạng hòa tan là ion HaPOx

và HPO,” giúp thực vật dé hấp thụ Khả năng hòa tan phosphate được nhận biết nhờ sự

hình thành vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường thạch Pikovskaya(Hình 4.1) Kết qua ở Bang 4.1 cho thay chỉ số hòa tan phosphate của ba chủng dao động

từ 2,65 (PN06) đến 5,52 (PN04) Chủng PN04 có khả năng hoà tan phosphate cao — gấpđôi so với chủng PN06 Tương đồng với nghiên cứu của Suleman và ctv (2018) với chỉ

số hoa tan P dao động từ 2,2 — 5,8 Theo Chu Nguyên Thanh va ctv (2020), khả nănghòa tan phosphate của chủng vi khuẩn Pseudomonas phân lập ở Bến Tre dao động từ

1,108 — 1,882 Theo Sharma và ctv (2013), các cơ chế hoà tan P chính được các vi khuẩn

sử dụng bao gồm: giải phóng các hợp chất tạo phức như anion acid hữu cơ, siderophore;

giải phóng các enzyme ngoại bao; khoáng hoá P sinh hoc.

Hình 4.1 Khả năng hoà tan phosphate của 3 chủng vi khuẩn DC: đối chứng (-)

17

4.1.2 Khả năng sinh phytohormones: Acid Indole Acetic (IAA) và Acid Gibberellic (GAs)

Bảng 4.2 Ham lượng IAA va GAs sinh ra bởi 3 chủng vi khuẩn sau 5 ngày

Chủng vi khuẩn Hàm lượng IAA (ug/ml) Hàm lượng GAs (ug/ml)

Acid Indole Acetic (IAA) và Acid Gibberellic (GAs) là các phytohormones quan

trọng được san sinh bởi các vi khuẩn PGPR Kết quả ở Bảng 4.2 cho thay tat cả cácchủng vi khuẩn đều cho khả năng sinh tổng hợp IAA và GAs ở các nồng độ khác nhau.Trong đó chủng PN04 sinh tổng hợp IAA với hàm lượng cao nhất là 15,04 pg/ml sau 5ngày nuôi cấy trong môi trường TSB bồ sung 0,1 g/l L — tryptophan — tiền chất sinh tổnghop IAA Ching PN06 có kha năng sinh tổng hợp IAA ở hàm lượng thấp nhất là

3,07 ug/ml Kumar va ctv (2015) đã khảo sát trên 75 chủng Pseudomonas, hàm lượng

IAA trong dich nuôi cay vào khoảng 8,90 — 35,4 pg/ml sau 48h Gần đây, Chu NguyênThanh va ctv (2020) đã bao cáo rằng hàm lượng IAA sinh tổng hợp bởi các chủng vikhuan Pseudomonas sau 7 ngày nuôi cây nằm trong khoảng 1,168 — 4,423 pg/ml TheoBùi Trang Việt (2016), nồng độ IAA chi cần từ 0,1 — 1 g/ml có thé tác động đến sựphát triển của cây theo hướng có lợi Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩnkhác nhau thì sự sinh tổng hợp IAA cũng khác nhau và bị ảnh hưởng bởi điều kiện nuôicấy, giai đoạn tăng trưởng và tiền chất tổng hợp (Mirza và ctv, 2001)

Bên cạnh IAA, nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh Pseudomonas có khảnăng sản sinh GAs Kết quả Bảng 4.2 cho thấy, 3 chủng vi khuẩn thử nghiệm đều cókhả năng sinh GAs Trong đó, chủng PN02 sản sinh GAs với hàm lượng cao nhất285,05 ug/ml Chung sinh GAs tốt tiếp theo là PN04 (265,35 ug/ml) Ching PN06 cókhả năng tao GAs thấp nhất là 88,47 g/ml Trước đó, Kumar va ctv (2015) đã khảo sáttrên 75 chủng Pseudomonas, hàm lượng GAs trong dịch nuôi cấy vào khoảng14,60 — 47,30 ug/ml Glick (1995) cũng cho rang sự thúc đây tăng trưởng của vi sinhvật vùng rễ là do các cơ chế như sản xuất hormone thúc đây tăng trưởng thực vật trongvùng rễ và các hoạt động thúc đây tăng trưởng khác