Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu giống hồ tiêu (Piper nigrum L.) bằng chỉ thị Start Codon Targeted (SCoT)

Đề nghiên cứu đa dạng di truyền người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khácnhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chi thi phân tử RELP, RAPD, SCoT, ISSR,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

ĐÁNH GIA ĐA DẠNG DI TRUYEN CUA CAC MAU

GIONG HO TIEU (Piper nigrum L.) BANG CHI THI

Start Codon Targeted (SCoT)

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : THÔNG THỊ QUỲNH NHƯMSSV : 19126272

Niên khóa : 2019 - 2023

Tp Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ DA DẠNG DI TRUYEN CUA CÁC MAU GIÓNG TIỂU (Piper nigrum L.) BANG CHỈ THỊ

Start Codon Target (SCoT)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYÊN VŨ PHONG THÔNG THỊ QUỲNH NHƯ

ThS HÀ THỊ TRÚC MAI

ll

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu, quý Thầy Côgiảng viên Trường Dai học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện dé

em có cơ hội học tập và rèn luyện trong môi trường tốt nhất Và đặt biệt cảm ơn quý

Thay Cô giảng viên Khoa Khoa Học Sinh Học đã luôn tận tâm dạy dỗ, truyền dat

các kiến thức một cách đầy đủ nhất, giúp em có thể hoàn thành khóa luận một cáchtốt nhất

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Nguyễn VũPhong đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn, góp ý chỉnh sửa cho

em trong quá trình thực hiện khóa luận Cảm ơn Thầy đã cung cấp cho em các điều

kiện cơ sở vật chat và luôn động viên tinh thần, nhờ vậy em mới có thé hoàn thànhtốt khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn Ths Trần Thị Thu Hà, cố vấn học tập của lớp DH19SHB và các

bạn cùng lớp đã giúp đỡ em trong quá trình học tập.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Hà Thị Trúc Mai đã tận tình hướng

dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, chỉnh sửa cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa

luận.

Em xin gửi lời cảm ơn các anh chị, các bạn và tập thé phòng BIO 301, 303 đặcbiệt là chị Đặng Huỳnh Thúy Vy đã giúp đỡ, góp ý và động viên trong suốt khoảngthời gian em thực hiện đề tài

Lời cuối cùng em xin cảm ơn gia đình đã luôn theo doi, lo lắng, động viên và

an ủi em trong suốt thời gian qua, trở thành chỗ dựa vững chắc giúp em vượt qua

những thời gian khó khăn, áp lực.

Em xin chân thành cảm ơn!

ill

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Thông Thị Quỳnh Như, MSSV: 19126272, lớp DH19SHB thuộc ngànhCông nghệ Sinh học, Trường Dai học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Day

là khoá luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toản trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệmtrước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chi Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người việt cam đoan

IV

TÓM TẮT

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá đa dạng di truyền của các giống hồtiêu (Piper nigrum L.) sử dụng chỉ thị Start Codon Targeted (SCoT) Đầu tiên, DNA

tổng số từ các mẫu giống hồ tiêu được chiết xuất theo phương pháp CTAB Chất lượng

DNA sau đó được kiểm định thông qua điện di trên gel agarose 1% và đo mật độ quang

Tiếp theo 10 chỉ thị SCoT đã được sử dụng khuếch đại DNA của 8 giống hồ tiêu với

nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 50°C Sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di trêngel agarose 1% Các băng DNA thu được ghi nhận bởi phần mềm Ntedit, phân tích hệ

số tương đồng di truyền và xây dựng cây phát sinh loài bằng phan mềm NTSYSpe 2.1

Kết quả phân tích cho thấy, cả 10 chỉ thị SCoT đều khuếch đại thành công DNA từ 8mẫu giống hồ tiêu, phân chia chúng thành 6 nhóm với hệ số tương đồng từ 0,48 đến

0,90 Đặc biệt, chi thị SCoT - 3 và SCoT - 7 đã tạo các band đa hình có kha năng phát

triển các chỉ thị SCAR cho việc nhận diện riêng biệt các mẫu giống hồ tiêu Vĩnh Linh

và Phú Quốc Kết quả nghiên cứu này khẳng định hiệu quả của chỉ thị SCoT trong việc

đánh giá đa dạng di truyền, vượt trội hơn so với việc chỉ dựa vào đặc điềm hình thái

thực vật.

Từ khóa: Chỉ thị SCoT, độ đa dạng di truyền, hệ số tương đồng, Piper nigrum L.

This study focuses on evaluating the genetic diversity of black pepper (Piper

nigrum L.) varieties using Start Codon Targeted (SCoT) markers Initially, total DNA

from the black pepper samples was extracted using the CTAB method The DNA quality was then assessed through 1% agarose gel electrophoresis and spectrophotometric density measurement Following this, 10 SCoT markers were employed to amplify the DNA of 8 black pepper varieties, with an optimal annealing temperature of 50°C The PCR products were subsequently analyzed by electrophoresis on a 1% agarose gel DNA bands were recorded using Ntedit software, and genetic similarity coefficients were analyzed and phylogenetic trees constructed using NTSYSpc 2.1 software The analysis revealed that all 10 SCoT markers successfully amplified DNA from the 8 black pepper samples, categorizing them into 6 groups with similarity coefficients ranging from 0.48

to 0.90 Notably, SCoT - 3 and SCoT - 7 markers identified distinctive polymorphic bands, promising for the development of SCAR markers for the unique identification of

the Vinh Linh and Phi Quéc black pepper varieties The outcomes of this study affirm

the efficacy of SCoT markers in assessing genetic diversity, offering a significant

advantage over reliance solely on morphological characteristics for plant population studies.

Keywords: Genetic diversity, Piper nigrum L., similarity coefficient, SCoT markers.

VI

MỤC LỤC

Trang

09099091 iiiXÁC NHAN VA CAM ĐOAN - 52-2 ke iv

i v

IBS TRAG esescereesrseersaueeseeceenceeeenetaiie on eRe REE vi

DANH MUG TỪ VIET TAT vceereceeeneeeenemrenemensannmns! ixHINH: BA GP HỆ THỦ sưnngngneeeseetesestdethtitosnGS6001GG0S0G55-/M3005080590180202808 xDANH RACED CAS HÌNT ekeseeeeeendinhoinibieoibdoibsongltisteng2g.SE48500104300000682000000-0g80c xi

1.1 Đặt vấn đề - + s21 2212121121121 1121111 21121111 1211121111211 212111211 errra 1hiểu (nu TP ốc 2

LS INOUA URS THUS NICH saenaseansianiasessoisBediBdDSEB'phgHES3H0Si0333/00813095GG301/3SEHG.HGEESSE4I88304/18G850400S088 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆỆU 2-2 22 SS+EE£EE££E£EE£EE£EEEEEEEEEEEEcrrrred 32.1 Giới thiệu chung về hồ tiêu - 2 22 ©222222E22EE2EE2E122122112212122212212211221 21.2 xe 3

2.1.1.Đặc điểm thực vật -©5-Ss 9S 21921221221212121111111111111111112 212cc 32.1.2 Giống tiêu ở Việt Nam - 2-2 SS22122192122122121211212112112112121212121 212cc 32.2 Một số khái niệm về đa dang sinh học . - 22 2¿222222++22+2Ex2ExtzExrzrxerred 4

221 108,/dan0 SIHNH,HGlsossisdberbgilrbidbopbiuslssbsklngiliitisloblssitkionstiiurioailiiluddltrdnb 4

2.2.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bao vệ sự da dang di truyền - 52.2.4 Một số nghiên cứu nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây hồ tiêu 5

MPa Ossi ylgo) 6250 i ee ee nư3ỂgioHtoiđrú8g0giae.0oxiti-guimel 6

2.3.1 Chỉ thị phan tử SCoT (Start Codon Targeted) ccceecceecceeeceeeseeeeeeseeeeseeeeeesees 6

2.3.2 Một số nghiên cứu sử dung chi thi phân tử SCọT -2¿ 22 s2 2s+2z+zzz>xz>s2 Dị

2.3.3 Chỉ thị phân tử SCAR (Sequence Characterized Amplified Reglon§) §

23.4 Một số nghiên cứu phát triển chỉ thi SCAALR - 2 22+2s+2E2EE+£E2EE2Exezzerrxee 82.4 Các kỹ thuật tách chiết DNA thực Vate 0 c.ccccccccccccsessessessessesseesessessessessessessesseeseees 92.4.1 Phương pháp tách chiết DNA -2-©2-5225222222E22E22E2212121212212121 222 ze 9

2.4.2 Các phương pháp định tính và định lượng DNA eects 10

2.5 Phan ứng PCR (Polymerase chain reaction) - 55-55 +++£++£+zcezerereerrerree 10

2.5.1 NQUY6N BAC 1 “54 102.5.2 Thành phan cơ bản của phản ứng PCR gồm cĩ -©25-575-55c-e: 11

2:6 Gay phat tril lỖT;scssscgssssesssscssdgBEsieoogtBS861-SSE-35308ESSR:SLESSLRBSEGĐ4EE4S DRSSESSGEASGSG2ESECEH20 SE 11

2.6.1 Các phương pháp chủ yếu tao cây phát sinh loải 22 2252 55225z25255+2 12

vil

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 + +s£SE+E££E£EE+Et£E£EEzErErrxrex 13

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2- 2 2252 2S2SE22E2£E£EEEEEEEEEZErxrxrzrrrei 13

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên Cứu - - 5 522 S+* + ++evteeererrerrrrrrrrrrxre 13

SP 0ì) (vì0i ion 133.2.2 Hóa chat và dung cụ, thiết bi thi nghiệm 0 0 0.ccc ccc cecceceeeesesseeetessesenesseseeeenes 133.3 Phuong phap nghién UU 1 14

431 Tích chiết NA | ~~.~ ~~~~-~zcxEerrrrrre=rermrserrzvzrmezr=omrreroreesgree 143.3.2 Xác định điều kiện PCR - SCoT thích hợp khuếch đại DNA - 14

3.3.2.1 Xác định nhiệt độ bắp cặp chỉ thị SCoT thích hợp - -+>++ 143.3.2.2 Đánh giá đa dang di truyền và xây dựng cây phát sinh loài - 16

5515 een lll HH DI xannesgsettrstotriotiodtigitgiGSIGSEEEUDESSHS300003001401847000E 16

3.3.3.1 Tiến hành thu nhận DNA từ gel agarose sau điện di 22 2+2 =sz2z2- 163.3.3.2 Chuan bị tế bao E coli khả nap bằng phương pháp calcium chloride 173.3.3.3 Kết nối DNA mục tiêu vào vector (tao sản phẩm nối) 2 2¿52¿ 18

3.3.3.4 Biến nap plasmid tái tổ hớp vào tế bào khả nạp #.coii -2-55z 18CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-22-©22222+2222222+22E+zzz+srsrr 20

4.1 Tach chiết DNA tổng sỐ - 2-22 ©2222E122E192E122112221221122112711271122112111 21112 e6 20

4.1.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp -2-22-©2222222222222222E22E2EESrrerrree 21

4.2 Đánh giá đa dang di truyền các mẫu giống tiêu 2- 22 22222++22++2zzzzzzze 224.3 Phân tích đa dang di truyÈn 2: 22©2222222+2EE22E22EE22222212732221271221221 222 crkv 294.4 Phát triển chỉ thị SC AIR 2 2+SSE+EEEE22EEEE2E12522122121112121111121 211111 ce, 314.4.1 Biến nap plasmid tái tổ hợp -2-22-©2222+222E222E22EE2221222E222222EE22EEEErcrrree 31

5: THả NWA ong zgg22gG069902 0000520 GE0TDEGEAGRNEEGEGEE-EASĐIEEHHGEEEHEERECDIEESIEGEESRENRGESESAGES3pEA 32CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ, - 2 22 22222£E+2E£2E££E£EZEZzzzzzcree 34

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

bp: base pair

CTAB: Cetyl Trimethyl Amoni Bromide

DNA: Deoxyribonucleic acid

EB: Elution Buffer

HT: Ha Tién

ISSR: Inter-Simple Sequence Repeats

M: Mo

OD: Optical density

PCR: Polymearase chain reaction

PQ: Phu Quéc

RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

SCoT: Start Codon Targeted

SCAR : Sequence Characterized Amplified Region

SR: Srilanka

SE: Sẻ

T1: Trâu

TK: Thekken

TBE: Tris — Borate — EDTA

TE: Tris —-EDTA

UPGMA: — Unweighted Pair Group Method using arithmetic Average VL: Vinh Linh

WWE: World Wildlife Fund

IX

Bang 4.1 Kết quả OD của các mẫu giống tiêu - 2-©22222+2222EE22E22EE22Ezzxzzrxeex 20

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của 10 chỉ thi SCoT - 21

Bảng 4.3 Số band khuếch đại và band đa hình trên 10 chỉ thị SCoT 23Bang 4.4 Chỉ số đa dang di truyền của 8 mẫu giống tiêu 22+ 2222222222 23

Bang 4.5 Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu giống tiêu với 10 chỉ thị ScoT 29

Bang 4.6 Bảng tông hợp band DNA đặc trưng phát triển chỉ thị SCAR 31

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 1% - 20

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm của 10 chỉ thị SCoT ở 48°C - 2

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm của 10 chỉ thị SCoT ở 50°C . - Zã Hình 4.4 Sản phâm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCoT - 1 24

Hình 4.5 Sản phẩm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCoT - 2 24

Hình 4.6 Sản phâm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCoT - 3 25

Hình 4.7 Sản phâm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCoT - 4 25

Hình 4.8 Sản phâm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCoT - 5 26

Hình 4.9 Sản phâm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCoT - 6 26

Hình 4.10 Sản phẩm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCOT - 7 27

Hình 4.11 Sản phẩm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCoT - 8 27

Hình 4.12 Sản phẩm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCOT - 9 28

Hình 4.13 Sản phẩm khuếch đại 8 mẫu giống tiêu với chỉ thị SCoT - 10 28

Hình 4.14 Cây phat sinh loài dựa trên kết quả10 chỉ thị SCoT - 29

Hình 4.15 Kết quả biến nap plasmid tái tô hợp ghi nhận sau 16 giờ - 32

XI

CHUONG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cây hồ tiêu có tên khoa học là (Piper nigrum L.) có nguồn gốc ở An Độ, mọc hoangdại trong các rừng nhiệt đới âm phía Tây vùng Ghats và Kerala Ở đây có nhiều giốngtiêu hoang dã, mọc từ rất lâu đời Sau đó, cây tiêu được trồng phô biến sang nhiều nướckhác ở Đông Nam Á và Nam Á như Indonesia, Malaysia, Thái Lan và Srilanka Ở Đông

Dương, cây tiêu mọc hoang được tìm thấy từ thế ky XVII nhưng mãi đến thế ky XVIII

nó mới bắt đầu phát triển mạnh, khi một số người Hoa di dân vào Campuchia ở các vùng

dọc vịnh Thái Lan như Konpong, Trach, Kep, Kampot và tiêu đen vào Đồng bằng sông

Cửu Long qua ngõ Hà Tiên của tỉnh Kiên Giang, rồi từ đó lan dan ra các tỉnh khác ở miềnTrung như Thừa Thiên - Huế, Quảng Trị (Huỳnh Chan Khôn, 2006)

Hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp dài ngày, có giá trị kinh tế và giá trịxuất khẩu cao, hằng năm đem lại nguồn thu ngoại tệ lớn cho nước ta Hạt tiêu là mộtloại gia vị được yêu thích trên toàn thế giới Các số liệu thống kê cho thấy, Việt Nam làquốc gia xuất khâu tiêu hàng đầu thế giới Sự phát triển của các vùng hồ tiêu trong nhữngnăm qua đã đóng góp rất lớn vào quá trình phát triển kinh tế xã hội của khu vực nôngthôn có điện tích canh tác tiêu, cải thiện đáng kế đời sống của người dân (Hiệp hội Hồ

tiêu Việt Nam, 2020) Ở nước ta, cây hồ tiêu được trồng chủ yêu ở các tỉnh miền Trung,

Tây Nguyên và Nam Bộ Kết quả điều tra cho thấy các giống tiêu được trồng nhiều ởĐông Nam Bộ chủ yếu là giống Vĩnh Linh, một diện tích nhỏ trồng giống tiêu Sẻ, tiêuTrung, tiêu An Độ, còn sót lại một vài vườn trồng giống Lada Belangtoeng xen với cácgiống khác Ở Phú Quốc phần lớn diện tích trồng giống tiêu Phú Quốc và giống tiêu HàTiên Ở khu vực Tây Nguyên phổ biến là giống tiêu Vĩnh Linh, ở các vườn tiêu già cònmột vài vườn trồng các giống Sẻ Mỡ, Sẻ Lộc Ninh, tiêu Trung, tiêu Trâu, tiêu Tiên Sơn,

Lada Belangtoeng, giống tiêu An Độ chi mới được đưa vào trồng thử trong vài năm gầnđây Ở Quảng Trị chủ yếu giống tiêu Vĩnh Linh và giống tiêu Sẻ (tiêu Của) (NguyễnTăng Tôn và ctv,2016).

Đề nghiên cứu đa dạng di truyền người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khácnhau: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chi thi phân tử

(RELP, RAPD, SCoT, ISSR, ) Tùy vào đối tượng, điều kiện và mục đích nghiên cứu

mà người ta lựa chọn phương pháp phù hợp nhất Chỉ thị phân tử SCoT dựa trên vùngbảo tồn ngắn trong các gen thực vật xung quanh codon khởi đầu (hoặc khởi đầu) dịch

mã ATG và sử dụng một đoạn mỗi 18 - mer duy nhất trong phản ứng chuỗi polymerase(PCR) (Collard và Mackill, 2009) Trên thé giới, nhiều nước đã nghiên cứu và ứng dụngchỉ thị SCoT trong đánh giá mối quan hệ di truyền và nhận dạng loài trên cây tiêu nhưng

ở Việt Nam thì rất ít

Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các

mẫu giống hồ tiêu bằng chỉ thị phân tử SCoT

1.2 Mục tiêu đề tài

Thông qua chỉ thị SCoT để đánh giá sự đa dạng di truyền của một số giống hồtiêu và phát triển chỉ thị phân tử nhận biết một số giống hồ tiêu

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Tách chiết DNA từ mẫu lá hồ tiêu

Nội dung 2: Phân tích đa dạng di truyền các mẫu giống hồ tiêu dựa vào chỉ thị SCoTNội dung 3: Phát triển chỉ thị SCAR

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu chung về hồ tiêu

2.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây hồ tiêu thích hợp với khí hậu vùng xích đạo và nhiệt đới Môi trường sinh trưởng

tự nhiên là rừng xích đạo nóng âm quanh năm Cây ưa lặng gió, che bóng, nhiệt độ thíchhợp trung bình 22°C - 28°C Hồ tiêu yêu cầu lượng mưa cao từ 2000 - 3000 mm/năm,phân bổ đều trong 7 - 8 tháng va cần 3 - 5 tháng không mưa ở cuối giai đoạn thu hoạch

dé phân hóa mầm hoa tốt, ra hoa tập trung Hồ tiêu có thé trồng được trên nhiều vùng đấtnhưng đất thích hợp phải là đất tơi xốp, nhiều mùn, pH 5,5 - 7, đốc thoải nhiều màu,thoát nước tốt Hồ tiêu là cây công nghiệp lâu năm, thân bò, rễ móc nên cần trụ để cây

bám rễ phụ Rễ tiêu gồm hệ thống rễ dưới mặt đất (3 - 6 rễ cái và nhiều rễ phụ) dùng hút

nước và phân bón Hệ thống rễ bám moc từ đốt thân dé bám vào trụ, giúp cây hồ tiêuvươn lên và cũng có khả năng hút nước, phân bón tuy khả năng này yếu hơn so với rễ

mọc trong đất Lá đơn, mọc cách, có cuống, phiến lá hình trái xoan nhọn, màu xanh lục,

đậm ở mặt trên hơn mặt dưới, bìa phiến nguyên, dai 11 - 15 cm, rộng 5 - 9 cm Cuống

lá màu xanh, có rãnh lòng máng, hơi phình ở gốc nơi đính vào thân và có 2 đường dọcmàu đen nứt nẻ nhiều là vét tích của lá bắc, đài 1 - 1,6 cm Hoa lưỡng tính, không có baohoa nhưng được bao bởi nhiều lá bắc Hoa tiêu thường có màu vàng hoặc xanh nhạt gồm

3 cánh hoa, 2 - 4 nhụy đực, bao phan có hai ngăn Hạt phan tròn và rất nhỏ Bầu nhụygồm một bầu noãn có một ngăn và chứa một số túi noãn nhưng quả tiêu thì chỉ có mộthạt Quả hình cầu nhỏ, chừng 20 - 30 quả trên một chùm, lúc đầu màu xanh lục, sau cómàu vàng, khi chín có màu đỏ Thời gian từ lúc hoa nở đến quả chín kéo dai 7 - 10 tháng

Mùa hoa quả tháng 5 - 8 Quả có một hạt duy nhất Hat trong cứng có mùi thơm và vị

cay, cau tạo bởi hai lớp Những hạt tiêu đen được thu thập và phơi khô dưới ánh nangmặt trời (Nguyễn Thị Triên Ly, 2012)

2.1.2 Giống tiêu ở Việt Nam

Các giống tiêu hiện trồng được chia làm 2 loại hình: Tiêu lá lớn (Lampong hay

Kawur) và tiêu lá nhỏ (Muntok hay Bangka) Sự phân biệt 2 loại trên dựa vào một số

đặc điểm chính như sau: Các đặc tính phân loại trên chỉ mang tính chất tương đối, trongquá trình trồng trọt, canh tác, có rất nhiều giống mang đặc tính trung gian giữa hai loại

hình lá lớn và lá nhỏ.

Bảng 2.1 Một số đặc điểm khác nhau giữa tiêu lá lớn và tiêu lá nhỏ

Lá tiêu đen lớn Lá tiêu đen nhỏ

Lá to, chiều dài trung bình của một lá Lá nhỏ, chiều dài trung bình của một lá

trưởng thành khoảng 20 - 25 cm, chiêu trưởng thành khoảng 10 - 20 cm, chiêu rộng lá khoảng 10 - 12 em rộng lá khoảng 5 - 10 cm Hau het các

giông tiêu đen lá nhỏ đêu có lá màu xanh đậm

Cây khỏe, cành rộng Các nhánh bên nhỏ và hơi rủ xuống

Thân to, dễ gãy Thân hình nhỏ nhắn và rắn chắc

Bắt đầu ra quả sau khi trồng từ 3 năm trở Bắt đầu ra qua sau 2 năm trồng

lên

Cụm hoa mọc thành chum, gai hoa dai Cụm hoa lan rộng; gai hoa ngắn (5 - 10

trên 15 cm Quả nhỏ cm) Quả lớn.

Thời gian nhanh Thời gian dài

Rat kén đất Chỉ cho năng suất cao trong Ít kén đất Trong điều kiện quảng canhđiều kiện thâm canh thâm canh vẫn có thé cho năng suất vừa phải và ôn

Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên - WWF (World Wildlife Fund,1989), đa

dang sinh học được định nghĩa như sau: “Da dạng sinh học là sự phồn thịnh của sựsống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là các gen chứa

đựng trong các loài và là những hệ sinh thái cực kỳ phức tạp tồn tại trong môi trường”

Đa dang sinh học là tông thé các gen, loài và hệ sinh thái Đó là sự thay đổi tiến

hóa liên tục dé tạo ra loài mới trong điều kiện sinh thái mới khi những loài khác biến đi

2.2.2 Đa dạng di truyền

Các cá thể trong quan thé thường có bộ gen khác nhau Sự da dạng về gen đượcthê hiện thông qua sự khác nhau về gene giữa các cá thể Các alen khác nhau của cùngmột gen có thé gây ra sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thé khác nhau là khácnhau Những cây trồng được lai ghép hoặc động vật lai được lai tạo từ các bộ gen khácnhau có thể tạo ra cây trồng và vật nuôi có năng suất cao, có khả năng chống chịu sâubệnh tốt

Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thê sẽ tănglên do sự tái tổ hợp Các gen đa hình có trách nhiệm cho sự ton tại của các kiểu gen dihợp tử của quan thé Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thé trong quan thé cho phép các

quan thé này thích nghi hơn với những thay đổi của môi trường (Phạm Văn Bình, 2005)

2.2.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu và bảo vệ sự đa dạng di truyền

Da dang di truyền là cần thiết của bat kỳ loài nào dé dam bảo khả năng sinh sản,

khả năng chống chịu bệnh tật, khá năng thích ứng với các điều kiện môi trường luôn thayđổi Bảo tồn nguồn gen không chỉ ngăn chặn sự tuyệt chủng của một loài mà còn ngăn

chặn sự mat mát các gen, các phức hợp và kiêu genotype, ngăn chặn sự tuyệt chủng của

các giống noi địa lý mà vốn gen của chúng bị suy giảm nghiêm trọng đến mức một số gen

và một số phức hợp gen có thể bị mắt, tiềm năng di truyền của loài bị giảm đáng kể, trongnhững trường hợp cực đoan, đó là sự tuyệt chủng của loài (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2005).2.2.4 Một số nghiên cứu nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây hồ tiêu

Năm 2006, Huỳnh Chan Khôn đã khảo sát sự đa dang di truyền giữa 11 giống tiêu(Piper nigrum L.) thu thập tại Bà Rịa - Vũng Tau bằng chỉ thị RAPD Qua nghiên cứu

19 mỗi, có 4 môi cho kết quả tốt trên hầu hết 11 giống tiêu đen Hệ số tương đồng di

truyền giữa các giống này từ 0,34 đến 0,97 Trong đó, hệ số tương đồng di truyền cao

nhất là (0,97) giữa giống An Độ tím và giống An Độ lá dài, thấp nhất là 0,34 giữa giốngKamunda và giống lá dài của Ấn Độ

Năm 2011, Jiang va Liu, đã khảo sát da dang di truyền giữa 11 giống tiêu đen (Piper

nigrum L.) thu thập từ Hải Nam, Trung Quốc bằng chỉ thị ISSR Trong số 19 primer

ngẫu nhiên được sử dụng, có 18 primer cho kết quả tốt Tổng số band đa hình thu đượcởII giống tiêu đen có 247 band trong tổng số 248 band (99,6%) Dựa vào sự có mặt của

băng DNA để tính toán hệ số Jaccard cho từng band, sử dụng phương pháp Neighbor

-Joining và hiển thị kết quả với các loài sử dụng phương pháp UPGMA Kết qua phân

tích ISSR cho thấy hệ số tương đồng di truyền giữa các giống này là từ 0,54 đến 0,97.

2.3 Chỉ thị phần tử

Chỉ thị phân tử là chỉ thị thé hiện sự khác biệt giữa các cơ thé các loài khác nhau

nhờ sự sai khác trong các phân tử DNA, protein, enzyme của nó Những thay đổi trong

phân tử DNA được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau về phương pháp và kỹ

thuật xác định sự đa hình Chỉ thị được định nghĩa là phân đoạn DNA chỉ ra được nhữngđột biến hoặc những thay đồi có thé sử dụng dé xác định tính đa hình (khác nhau) giữa

các kiểu gen khác nhau hoặc các allele khác nhau của gen trong trình tự DNA nhất địnhcủa cá thé, quan thể hoặc nguồn gen

Hiện nay dé phục đánh giá đa dang di tuyén, lập bản đồ gen, đã có nhiều loại chi

thị phân tử được phát hiện va sử dụng rộng rãi như: RAPD (Randomly Amplified

Polymorphic DNA - khuếch đại đa hình ngẫu nhiên DNA), RFLP (Restriction FragmentLength Polymorohic - đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn), ISSR (Inter Simple SequenceRepeat), ngoài những chi thị phân tử trên gần đây xuất hiện một loại thi thi phân tửkhác được (Collard và ctv, 2009) phát triển từ những nghiên cứu trước đó của (Joshi vàctv, 1997) có khả năng đánh giá đa dạng di truyền và cho kết quả rất đáng tin cậy là chỉ

thị phân tử SCoT (Start Codon Targeted).

2.3.1 Chỉ thị phan tử SCoT (Start Codon Targeted)

Chi thi phân tử SCoT (Start Codon Targeted) là các đoạn oligo ngắn được thiết kếdựa trên các vùng bảo tồn ngắn trong DNA trong gen thực vật quanh bộ ba mở đầu ATG(Joshi và ctv, 1997), được phát triển bởi (Collard và Mackill, 2009) ATG là codon bắt

đầu được bảo tồn cho tất cả các gen vì vậy các phản ứng PCR sử dụng primer SCoT có

nguyên tắc, kỹ thuật như RAPD, ISSR, RFLP, Tương tự với các chỉ thị phân tử RAPD,RFLP, ISSR, SCoT là các marker quan trọng có thé sử dụng trong đánh giá da dang ditruyền, lập bản đồ gen Các marker này có liên quan trực tiếp đến chức năng gen và cóthé sử dụng trong genotyping và khám phá đa hình Các đoạn oligonucleotide được sửdụng làm cả mỗi xuôi và mỗi ngược

Trong nghiên cứu của Collard và Mackill năm 2009 có 36 SCoT được nghiên cứu

và phát triển dựa trên các kết quả có được từ các nghiên cứu (Joshi và ctv 1997) 36 chỉthị SCoT được thực hiện PCR cùng 10 mẫu DNA lúa dé tối ưu hóa điều kiện nhiệt độ

và hóa chất phản ứng của phương pháp SCoT Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ thị phân

tử SCoT chiều dai tối ưu là 18 nu và có nhiệt độ bắt cặp thích hợp 6 50°C Trong nghiên

cứu này Collard và Mackill đã chứng minh rằng chỉ thị phân tử SCoT có độ nhạy cao

và khả nang tạo ra các band đa hình tương tự như RAPD, RFLP, ISSR, khả năng tao

band đa hình của chỉ thị phân tử được cho rằng có thể ứng dụng hiệu quả trong đánh giá

đa dạng di truyền, lập bản đồ OT Ley sss

Cơ sở kỹ thuật của SCoT dựa trên nguyên tắc khuếch dai mỗi don vi trong phan ứng

PCR SCoT được sử dụng như mồi thuận và mồi nghịch, như kỹ thuật RAPD hoặc như

kỹ thuật ISSR Primer SCoT trong phản ứng PCR nhắm mục tiêu vào các vùng gen bảotồn xung quanh codon bắt đầu ATG trên cả hai sợi DNA (Collard và Mackill, 2009)SCoT là các đoạn oligo ngắn gồm 18 nu và trong phan ứng PCR nhiệt độ bắt cặp của

primer SCoT thường được sử dụng ở 50°C (Collard và Mackill, 2009).

Điểm khác biệt của kỹ thuật SCoT so với các kỹ thuật khác là nó sử dụng vùng genxung quanh bộ ba ATG có tính bảo tỒn cao trong hệ gen thực vật để khuếch đại các đoạnDNA khuôn, chính điều này khiến chỉ thị SCoT có độ nhạy cao cho việc khuếch đại gen

thực vật, cũng như chúng có khả năng liên quan với các gen chức năng và tính đặc trưngcủa vùng gen thực vật Đồng thời, có thé sử dung chi thi SCoT dé xác định tính đa

hình ở mức độ cá thể mà không cần thông tin bộ gen của loài Chính điều này khiến

SCoT có chi phí thấp hơn hắn các loại chỉ thị đa hình cùng loại khác, bên cạnh việc dễdàng thực hiện thì độ chính xác cao cũng là một trong những ưu điểm nữa khiến kỹ thuật

chỉ thị SCoT có ưu thé hon han khi cần xác định các allele đa hình trên thực vật

2.3.2 Một số nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử SCoT

Các ứng dụng của chỉ thị SCoT trong nghiên cứu đa dạng di truyền ngày càng được

sử dụng nhiều ở Việt Nam và trên thế giới Việc sử dụng chỉ thị phân tử SCoT đề đánh

giá da dạng di truyền, lập bản đồ gen đã ngày càng trở nên phổ biến

Vào năm 2015, Satya và ctv đã nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của 155 loạigen từ năm quan thé cỏ Ramie (Boehmeria nivea L.) bằng 24 chỉ thị SCoT Kết quanghiên cứu cho thấy có 20/24 chỉ thị SCoT cho sản phẩm khuếch đại 20 chỉ thị SCoT

khuếch đại được 136 band dao động từ 4 đến 10 band với mỗi SCoT, trong đó có 136

(87,5%) band đa hình Nghiên cứu đa dang di truyền, xác định tô tiên va phân tích cấutrúc quan thé của B nivea Những phát hiện này sẽ hữu ích cho việc đề ra các chiến lượcbảo tồn và lựa chọn một nguồn gen phù hợp dé giúp cải thiện di truyền của loài câytrồng quan trọng trong công nghiệp này

Vào năm 2021, Lê Thị Thanh Nga đã ứng dung chỉ thị SCo T đánh giá da dạng một

số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) ở Việt Nam Kết quả ghi nhận 9 chi thị SCoT

có khả năng khuếch đại các band đa hình trên vú sữa với tổng số band khuếch đại được

là 98 band với 96 band đa hình Trong đó SCoT - 10 là chỉ thị cho số band và band đahình thấp nhất và ngược lại chỉ thị SCoT - 6 ghi nhận số band/band đa hình nhiều nhất.Kết quả này được cho là phù hợp với các đặc điểm hình thái và là cơ sở cho việc xácđịnh từng cá thể vú sữa nhờ đặc tính đặc trung cho từng cá thé của chi thị SCoT

2.3.3 Chi thị phan tử SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)

Kỹ thuật chi thị phân tử SCAR là các vùng đặc trưng nhân ban chuỗi được mô tả(Sequence Characterized Amplified Regions - SCAR) Dé có thé sử dụng các chỉ thị xácđịnh được bằng các mồi ngẫu nhiên (như RAPD, AFLP, ) và khắc phục nhược điểm

man cảm với điều kiện phản ứng của các phan ứng với mỗi ngẫu nhiên, kỹ thuật chi thị

SCAR được phát triển và sử dụng Kỹ thuật SCAR là kỹ thuật chỉ thị dựa vào PCR tạo

ra các phân đoạn DNA tại các locus xác định bằng sử dụng các môi nucleotide đặc thù

SCAR được tiến hành bằng cách tách dong sản phẩm PCR với các môi ngẫu nhiên sau đó

đọc trình tự hai đầu đoạn tách dòng Dựa vào trình tự hai đầu này để thiết kế cặp mỗivới độ dài 15 bp đến 30 bp để nhân band đơn với kích thước tương tự như phân đoạn

được nhân dòng Sự đa hình được xác định bằng sự có mặt hay vắng mặt của băng được

nhân bản hoặc sự suất hiện đa hình về chiều dài đồng thời chuyên chỉ thị trội thành chỉthị SCAR đồng trội Kỹ thuật SCAR được dùng dé phân tích thư viện genome, xác địnhcác locus đặc thù, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Nguyễn Đức Thành, 2014)

2.3.4 Một số nghiên cứu phát triển chỉ thị SCAR

Vào năm 2015, Fujunjiang và ctv đã phát triển chỉ thị RAPD - SCAR để xác thựccác loài nắm linh chi khác nhau Trong nghiên cứu này họ đã thu thập DNA từ 10 loàinam linh chi và khuếch đại DNA bang kỹ thuật RAPD cải tiến Sau đó, các đoạn khuếch

dai được sao chép vào T - vector và các dòng vô tính dương được sang lọc, xác định va

giải trình tự để phát triển các dấu hiệu SCAR Sau khi thiết kế mỗi PCR và tối ưu hóacác điều kiện PCR, 4 chỉ thị SCAR có tên là LZ1-4, LZ2-2, LZ8-2 và LZ9-15 đã đượcphát triển, đặc hiệu cho Ganoderma gibbosum (LZ1-4 và LZ8-2), Ganoderma sinense

(LZ2-2 và LZ8-2), Ganoderma tropicum (LZ8-2), va Ganoderma lucidum HG (LZ9-15).

Vào năm 2021, Hoang Tan Quang và ctv, đã sử dung 20 mỗi ngẫu nhiên cho phan

ứng PCR - RAPD dé phát hiện đa hình DNA giữa các loài Vibrio Trong đó, chỉ thị

OPA-09 tạo ra một sản phẩm khuếch đại đặc hiệu cho loài V.vulnificus với chiều dài

1356 bp Trình tự này được thiết kế môi đặc hiệu và chuyên thành chỉ thị SCAR vớichiều dai 938 bp (A9 - 938) Cặp môi đặc hiệu (Vvul - 1F/Vvul - 938R) khuếch đại mộtbăng duy nhất ở tat cả các chủng V vulnificus nhưng không xuất hiện ở các loài Vibrio

khác Đây là chỉ thị có độ đặc hiệu cao và có thể sử dụng để nhận điện V vulnificus

trong các mau hải sản

2.4 Các kỹ thuật tách chiết DNA thực vật

2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA

DNA chứa thông tin di truyền của sinh vật Do đó mọi nghiên cứu và ứng dụngsinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid (NA) đủ lớn và

đủ tinh sạch dé tiến hành các thí nghiệm kế tiếp DNA gồm các loại: DNA bộ gen, DNA

ty thể, DNA lục lạp, DNA plasmid, DNA phage Một quy trình ly trích DNA ở tế bào

thực vật gồm 3 bước cơ bản:

Bước 1: phá vỡ màng tế bào Thông thường tế bào hoặc mô được nghiên trong một

hỗn hợp dung dịch đệm chiết Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào màng nhân, giải

phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết DNA

Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn, chủ yếu là các protein Có thể

sử dụng dung dịch CTAB (CTAB:cetyltrimethylammonium bromide) tạo phức hợp vớipolysaccharide và protein rồi kết tủa chung Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung

dịch chloroform-isoamy alcolhol (24:1) Dung dịch này có tác dụng làm biến tínhprotein, đồng thời không hòa tan nucleic acid Ngoài ra chloroform còn làm cho pha

nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau Isoamyl alcohol hạn chế sự nổi bot trong suốt quá

trình ly trích Protein bị biến tinh sẽ không hòa tan trong nước có chứa nucleic acid Saukhi ly tâm protein sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ Pha nước có

chứa nucleic acid được thu nhận lại.

Bước 3: tủa DNA Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng

cô đặc, một mặt bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác dé có thé hòatan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

Tua trong ethanol: việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao

(nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 thể tích ethanol/L thé tích mẫu), nhiệt

độ thấp tạo thuận lợi cho việc kết tủa Hầu như các loại nucleic acid đều tủa trong các

điều kiện trên

Tủa trong isopropanol: điểm khác biệt so với phương pháp tủa trong ethanol là

không cần sự hiện diện của muối (1 thể tích isopropanol/L thé tích mẫu) Các DNA cótrọng lượng phân tử thấp không bị tủa nên có thé loại bỏ chúng trong isopropanl Sau đócặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% đề loại bỏ các muối và dấu vết isopropanol còn

sót lại.

2.4.2 Các phương pháp định tính và định lượng DNA

DNA thu thập được phân tích định tính và định lượng bằng một số phương phápnhư đo mật độ quang học, đo quang phô

Định lượng bằng máy đo quang phổ: phương pháp này cho phép ước tính nồng

độ tương đối của acid nucleic có trong mẫu sau khi chiết Giá trị mật độ quang ở bướcsóng 260 nm của mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa trên mối

tương quan: 1 đơn vi OD 260 nm tương ứng với nồng độ 0 ng/ul đối với dung dịchchứa DNA sợi kép và 50 ng/ul cho dung dịch chứa DNA va RNA sợi đơn Dé kiểm tra

độ tinh khiết của dung dich, giá trị bổ sung của OD 280 nm đã được đo Tỷ lệ OD 260

nm/OD 280 nm = 1,8 đối với DNA tinh khiết và ty lệ OD 260 nm/OD 280 nm = 2 đối

với RNA tỉnh khiết

Định lượng DNA bằng máy quang phổ: máy quang phố UVS - 99 cho phép kiêmtra chính xác các mẫu cực nhỏ Máy quang phổ UVS - 99 cho phép do ở cả hai daiUV/VIS Có phạm vi quan phổ rộng

2.5 Phan ứng PCR (Polymerase chain reaction)

Phan tng PCR do K., B Mullis (Nobel hóa học 1993) phat minh ra nam 1985 Day

phương pháp in vitro dé nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó mà chỉ cần một khối

lượng mẫu ban đầu rất nhỏ Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao và được ứng dụng trong

nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, chuẩn đoán bệnh, di truyền quan thé và phân tích

pháp y

2.5.1 Nguyên tắc

Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn đều

cần sự hiện diện của những moi chuyên biệt Môi là những đoạn oligonucleotide có khả

năng bắt cặp bổ sung dau 3’ của khuôn DNA polymerase sẽ kéo dài môi dé hình thành

sol MỚI.

Hiện tượng trên chính là cơ sở của phản ứng PCR Nếu được cung cấp hai môi(mồi xuôi và mỗi ngược) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu của trình tự DNA,

10

phan ứng PCR sẽ nhân bản trình tự nằm giữa hai mdi nay.

Phản ứng PCR gồm 3 bước:

Bước 1: biến tính

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 - 95°C) trong vòng 30 giây

đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạchđơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tong hợp 2 mạch bồ sung mới

Bước 2: nhiệt độ phản ứng giảm xuống đề primer bắt cặp với các mạch của DNAkhuôn theo nguyên tắc bé sung

Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với khuôn,nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 -70°C, kéo dai trong khoảng 30 giây đến 1

phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng Tm (melting temperature) của các primer sử dụng.

Bước 3: kéo dai

Nhiệt độ được tăng lên 72°C giúp cho DNA polimerase hoạt động tốt nhất Thờigian của giai đoạn nay tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo

dài từ 30 giây đến vài phút

Một chu kì gồm 3 bước trên lặp đi lặp lại nhiều lần Kết quả sau cùng có thê thunhận số lượng lớn bản sao trình tự DNA Tổng số DNA khuếch đại sau phản ứng PCR

được tính theo công thức:

Tổng DNA khuếch đại = m*2"

Trong đó: m: số bản sao ban đầu của DNA mẫu

n: số chu kỳ2.5.2 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm có

2.6 Cây phát sinh loài

Tất cả các phương pháp nghiên cứu sự đa dạng quân thể đều cho kết quả cuối cùng

là các dữ liệu phân tử thê hiện bằng các băng vạch trên bảng điện di rất phức tạp Đề lấy

11

được các thông tin sinh học từ đữ liệu thô này, các nhà khoa học cần đến sự hỗ trợ của

máy tính với các phần mềm phân tích dữ liệu thực nghiệm Các thông số về đa dạngkiểu gen, đa dạng kiểu hình và khoảng cách gen giữa các quan thé được tính toán theophương trình Nei (1987) Trước khi tìm hiểu phải lựa chọn phương pháp và phần mềmphù hợp, cần tìm hiểu một số thuật ngữ về cây phát sinh loài nhằm cung cấp những thôngtin cơ bản dé hiểu và diễn giải cây phát sinh loài

2.6.1 Các phương pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài

Tất cả các phương pháp phân tích di truyền quần thể đều xây dựng một cây phátsinh loài mô tả mối quan hệ giữa các cá thé trong quan thé Hiện nay, có hai phươngpháp được sử dụng phô biến nhất là UPGMA và Neighbor - Joining, cả hai phương pháp

đều tạo cây tiến hóa từ ma trận khoảng cách gen và sự tương đồng về hệ gen giữa các

quan thé

UPGMA: với một ma trận cho trước, thuật toán sé nhóm một cặp don vi tiễn hóa

có khoảng cách nhỏ nhất với giá trị bằng nửa khoảng cách giữa hai OTU Sau đó, cặp

đơn vị tiến hóa này được xem là một OTU mới, trong đó khoảng cách giữa OTU mới

này với một OTU khác là trung bình khoảng cách giữa OTU đó với OTU còn lại trong

nhóm Thuật toán tiếp tục nhóm các OUT có khoảng cách nhỏ nhất cho đến khi chỉ cònhai có hai OTU Cuối cùng, UPGMA sẽ tạo ra cây tiến hóa có gốc

Neighbor - Joining: đây là một trong những phương pháp xây dựng cây tiễn hóavới ít nhánh nhất Nguyên tắc của phương pháp này là tìm ra thứ tự các cặp hàng xóm(neighbor) hợp lý nhất làm giảm tổng chiều đài của cây tiến hóa

12

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2023 đến tháng 12/2023

Địa điểm thực hiện: Phòng Sinh học Tích hợp thực vật, Khoa Khoa học Sinh học,

Trường Dai học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu giống hồ tiêu thu thập và lưu giữ tại phòng thí nghiệm Sinh học tích hợp

thực vật, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu giống hồ tiêu sử dụng trong nghiên cứu

Thứ tự Tên giống Nguồn gốc

| Vĩnh Linh Phú Quốc

2 Tiêu Trâu Bà Rịa - Vũng Tàu

3 Tiêu Mỡ Bà Rịa - Vũng Tàu

3.2.2 Hóa chất và dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

Thiết bị và dụng cụ: tủ cay vô trùng, cân điện tử, máy luân nhiệt PCR, bộ điện di,

máy ly tâm, máy chụp gel, máy đo quang phổ, micropipet, eppendorf và dau tip

Hóa chất tách chiết DNA tổng số: dung dịch đệm huyền phù, dung dịchchloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, ethanol, dung dịch đệm CTAB, dung dịchdém chiét CTAB, dung dịch đệm kết tủa CTAB, dung dịch NaCl, dung dịch đệm NaCl

Hoa chất sử dụng trong phản ứng PCR: Buffer Mytaq Mix2X, primers và free water Hóa chất sử dụng trong điện di: dung dịch đệm TBE 0,5X, gel agarose, gelred, HyperLadderTM 1kb (Thermo Scientific) Hóa chất sử dụng trong thu hồi DNA từ

nuclease-gel agarose: Gene JET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).

13

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Bromide) sau đó votex.

Bước 2: ủ mẫu trong 60°C - 65°C, sau đó ly tâm 13000 vòng/15 phút và hút 300 uldịch nổi sang một eppendorf 1,5 mL mới

Bước 3: cho 300 pl CI (Cloroform:Isoamyl) vào dung dịch mẫu vừa thu ở bước 2đảo đều và ly tâm 13000 vòng/15 phút

Bước 4: mẫu ly tâm sẽ phân thành ba pha, tiến hành hút 300 ul pha trên cùng vàoeppendorf 1,5 mL mới, sau đó thêm 300 ul Isopropanol vào Tiến hành ủ mẫu ở 4°C

trong 60 phút, lâu hơn càng tốt

Bước 5: ly tâm 13000 vòng trong 15 phút dé thu tủa DNA, sau đó tiếp tục rửa tủavới 300 pl ethanol 70% Tron đều và ly tâm 13000 vong/10 phút (lặp lại 2 lần)

Bước 6: loại bỏ dịch nồi, thu cặn DNA Ethanol còn sót lại trong DNA được làm

khô ở nhiệt độ phòng Sau đó sẽ trữ DNA trong 50 pl nước khử ion và giữ ở -20°C.

DNA sau ly trích sẽ được định lượng và kiểm tra độ tinh sạch bằng cách đo mật

độ quang (OD) bang máy quang phô (Biodrop uLITE, Anh) kết hợp với điện di DNA

tong số bang bộ điện di (BioRad, Mỹ) trên gel agarose (Thermo Scientific) 1%, hiệu điện

thế 100V, thời gian 15 phút DNA được soi dưới tia UV và kết quả được hiền thị trên hệ

thông chụp gel (MultiDoc - It Imaging symstems UVP)

3.3.2 Xac dinh diéu kién PCR - SCoT thich hop khuéch dai DNA

3.3.2.1 Xác định nhiệt độ bap cặp chỉ thi SCoT thích hợp

Thực hiện sàng lọc nhiệt độ bắt cặp của 10 chỉ thị SCoT tham khảo từ các nghiên

cứu của Lou, GaJera, Yan và Yong (2010), (2013) Sàng lọc thử nghiệm với 2 mức nhiệt

độ 48°C và 50°C, lặp lại 2 lần

14

Bang 3.2 Danh sách 10 chỉ thị SCo T sử dụng

Tho ty Chỉithị Trinh tự (5' - 3) Tham khảo

| SCoT - 1 5’ CAACAATGGCTACCACCA 3? Lou (2010)

2 SCoT -2 5° CAACAATGGCTACCACCC 3? Gajera (2013)

3 SCoT - 3 5° CAACAATGGCTACCACCG 3" Lou (2010)

4 SCoT - 4 5° CAACAATGGCTACCACCT 3" Yan (2010)

5 SCeT - 5 5° CAACAATGGCTACCACGA 3? Gajera (2013)

6 SCoT - 6 5° CAACAATGGCTACCACGC 3? Gajera (2013)

7 SCoT -7 5° CAACAATGGCTACCACGG 3” Yan (2010)

8 SCoT - 8 5’ CAACAATGGCTACCACGT 3’ Yong (2013)

9 SCoT - 9 5’ CAACAATGGCTACCAGCA 3’ Lou (2010)

10 SCoT-10 5’ CAACAATGGCTACCAGCC 3" Yan (2010)

Bang 3.4 Chu trình nhiệt tham gia phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kì

Tiền biến tính 94 5 phút |

Biến tính 94 1 phút 40

Bắt cặp 48; 50 1 phút 40

Kéo dài T2 90 giây 40

Hậu kéo dài T8 10 phút |

Tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp (Ta) với các mức nhiệt độ 48°C và 50°C, từ kết

quả thu được sẽ đánh giá và lựa chọn nhiệt độ bắt cặp tốt nhất đối với từng primer dé

thực hiện các bước tối ưu hóa tiếp theo Trộn đều các thành phan của hỗn hợp gồmbuffer, primer DNA mẫu, nuclease-free water với thé tích mô tả (Bảng 3.3.) roi chuyén

15

vào máy PCR (Applied BiosystemsTM 2720 Thermal Cycler, Mỹ), sau đó chạy theo

chương trình nhiệt mô tả ở Bảng 3.4 đã cài đặt san gồm các bước: (1) 94°C trong 5 phút;

(2) 94°C trong 1 phút; (3) Tm°C trong 1 phút; (4) 72°C trong 90 giây lặp lại từ bước 2

đến 4 với 40 chu kỳ; (5) 72°C trong 10 phút; (6) Giữ nhiệt độ 15°C Các sản phẩm PCRđược hién thị trên gel điện di 1% và sử dung thang 1 kb (Bioline, UK) để xác định độ

dài khuếch đại

3.3.2.2 Đánh giá đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinh loài

Sự hiện diện (mã hóa 1) hoặc vắng mặt (mã hóa 0) của các band đa hình được ghilại cho từng cá thé được sử dụng dé phân tích bằng phan mềm NTSYS Dữ liệu nàyđược sử dụng dé xây dung ma trận tương tự hoặc ma trận khoảng cach Cac ma trận này

thé hiện mối quan hệ chặt chế về mặt di truyền giữa các mẫu được phân tích và dựa trên

công thức toán hoc của Nei và Li (1978).

ae

Sxy - x+y

Trong đó: xy: Số lượng dải giữa hai mẫu

x: Số băng của mẫu x

y: Số băng của mau y

Sxy: Hệ số tương tự giữa hai mẫu x và y

Từ Sxy chúng ta có thé tính được khoảng cách di truyền giữa x và y

Dxy = 1 — Sxy

Nhập dữ liệu: Dữ liệu thu được từ san phẩm PCR sẽ được nhập vào excell theoquy định chung Nếu sản phẩm có band hiện diện thì sẽ nhập 1 và 0 nếu không hiện diệnband Sau khi nhập dữ liệu, ở hàng đầu tiên ký hiệu là 1 (đối với ma trận hình chữ nhật),cột thứ hai là số hàng, cột thứ ba là số cột, cột thứ tư là số 0 nếu không thiếu dữ liệu.Sau đó, dữ liệu được sử dụng để xây dung ma trận tương tự va cây phát sinh loài trênphần mềm NTSYSpc phiên bản 2.1

Sơ đồ cây phát sinh loài sẽ được tạo ra khi sử dụng phương pháp UPGMA trongphần mềm NTSYS

3.3.3 Phát triển chị thị SCAR

3.3.3.1 Tiến hành thu nhận DNA từ gel agarose sau điện di

Mục đích: Nhằm thu nhận và tinh sạch đoạn DNA đã được phân tách trên gel agarose

để làm nguyên liệu cho các bước tiếp theo trong quy trình tạo dòng DNA mục tiêu

16

Phương pháp này thích hợp với các đoạn DNA có kích thước từ 0,2 - 5,0 kb Tiến hành

thu nhận DNA từ gel agarose thông qua sử dung Gene JET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).

Phương pháp thực hiện: chuẩn bị 1 eppendorf 1,5 mL, cân và ghi nhận trọng lượng.Đặt miếng gel đã điện di vào buồng chiếu tia UV, dưới ánh sáng tia UV dùng dao cắt và

thu mảnh gel chứa đoạn DNA Cho mảnh gel vào eppendorf, cân eppendorf và tính trọng

lượng mảnh gel Cho vào eppendorf lượng dung dich Binding Bufer theo tỷ lệ 1:1 vào

mảnh gel Ủ ở 60°C cho đến khi mảnh gel tan hoàn toàn (khoảng 15 phút), thỉnh thoảngđảo ống eppendorf Bồ sung isopropanol 100% theo tỉ lệ 1:1 vào eppendorf, vortex kỹ.Chuyên tối đa 800 yl dung dich gel đã hòa tan sang cột tinh sạch Gene JET Tiến hành lytâm ở 10000 vòng trong 3 phút dé loại bỏ dich chạy qua và đặt trở lại ống thu mẫu cũ

Thêm 700 pl WashBuffer vào cột loc Gene JET, ly tâm 10000 vòng trong 3 phút loại bỏdịch chạy qua và đặt trở lại ống thu mẫu cũ Chuyển cột loc Gene JET vào eppendorfmới 1,5 mL, thêm 50 pl Elution Buffer vào giữa cột lọc (giữ nguyên trong vòng 1 phút),

ly tâm ở 10000 vòng trong | phút Thu được DNA đã tinh sạch và bảo quản ở -20°C.3.3.3.2 Chuan bị tế bào E coli khả nạp bằng phương pháp calcium chloride

Mục đích: tạo ra tế bào có khả năng dung nạp DNA ngoại lai bằng cách xử lý tếbào vi khuẩn trong dung dịch muối lạnh của kim loại hoá trị II như CaCh, MegCh,

Vật liệu:

Vi khuẩn E.Coli DH5-oœ

Môi trường LB

Dung dich CaCl: 0,1M (lạnh)

Đĩa môi trường LB với kháng sinh phù hợp.

Dung dịch CaC]l› 0,1M chứa glycerol 15% (lạnh)

Phương pháp tiến hành: trước 1 ngày khi chuẩn bị tế bào E coli khả nạp

Đặt dung dịch CaC]› 0,1 M và CaCl; 0,1 M chứa glycerol 15% ở 4°C Tăng sinh

một khuẩn lạc đơn E.coli trong 5 mL môi trường LB Lắc qua đêm ở 37°C

Chuẩn bị tế bào khả nap, đặt ít nhất 30 ống eppendorf 1,5 mL ở -80°C Cho 1 mL

dich vi khuẩn nuôi cấy qua đêm vào 100 ml môi trường LB chứa trong bình tam giác

500 mL Tăng sinh ở 37°C, lắc 200 vòng/phút cho đến khi OD 600 nm đạt ~ 0,25 - 0,3(khoảng 2 giờ) Làm lạnh dich vi khuẩn trên đá 15 phút Đặt 2 ống falcon trên đá dé làmlạnh Chia 100 mL dịch khuẩn sang 2 ống falcon 50 mL và ly tâm 4000 vòng, ở 4°C

17