Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu chiết xuất Chitin - Chitosan ở ruồi lính đen (Hermetia illucens)

TÓM TẮTNghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hàm lượng và đặc tính hóa lý củachitin thu nhận ở các giai đoạn vòng đời khác nhau của rudi lính đen RLĐ Hermetiaillucens ấu trùng, tiề

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

NGUYEN THỊ THUY DUNG

NGHIEN CUU CHIET XUAT CHITIN - CHITOSAN

Ở RUOI LINH ĐEN (Hermetia illucens)

LUAN VAN THAC Si CONG NGHE SINH HOC

Thành phố Hồ Chi Minh, Thang 11/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

NGUYEN THỊ THUY DUNG

NGHIEN CUU CHIET XUAT CHITIN - CHITOSAN O

RUOILINH ĐEN (Hermetia illucens)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CHITIN-CHITOSAN Ở

RUÔI LÍNH ĐEN (Hermetia illucens)

NGUYEN THỊ THUY DUNG

Hội đồng cham luận văn

TS HUYNH VĂN BIẾT

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

TS CAO THỊ THANH LOAN

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

TS TRỊNH THỊ PHILY

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

TS NGÔ HUỲNH PHƯƠNG THẢOTrung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCMPGS.TS NGUYÊN TIỀN THẮNG

Viện Sinh học Nhiệt đới

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Nguyễn Thị Thùy Dung sinh ngày 31 tháng 10 năm 1997 tại thị xã

Cai Lay, tinh Tiền Giang Tốt nghiệp PTTH tại Trường Trung học phố thông ĐốcBinh Kiều, tỉnh Tiền Giang Năm 2019 tốt nghiệp Dai học ngành Công nghệ Sinhhọc hệ chính quy tại trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Quá trình công tác: Nghiên cứu viên tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học

và Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ tháng 09 năm 2019

tỚI nay.

Tháng 10 năm 2020 theo học Cao học nganh Công nghệ Sinh học tại trường Đại

học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Địa chỉ liên lạc: Phường Linh Trung — Tp Thủ Đức — Tp Hồ Chí Minh

Điện thoại: 0334691287

Email: dung.nguyenthithuy(@hcmuaf.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận văn này là trung thực và là một

phan trong đề tài cấp cơ sở mã số CS-CB19-VienCNSH-01 do TS.Nguyễn Ngọc Hà làm chủ nhiệm Những số liệu trong luận văn đượcphép công bồ với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Thị Thùy Dung

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban Giám hiệu nhà Trường, phòng

đào tạo sau Đại học, ban Chủ nhiệm Khoa cùng với các thầy cô Khoa Khoa học Sinh

học — Trường Đại học Nông Lâm thành phó Hồ Chi Minh đã tạo cơ hội học tập va

truyền đạt cho em những kiến thức bồ ích trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường

— Trường Dai học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện dé em cóthé thực hiện và hoàn thành luận văn Bên cạnh đó em xin chân thành cảm ơn ViệnNghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2 và Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học đã hỗ trợ

và giúp đỡ em trong suôt quá trình làm luận văn.

Với sự biết ơn sâu sắc và lòng kính trọng em xin được gửi lời cảm ơn đến cô

TS Nguyễn Ngọc Hà và thầy TS Nguyễn Phúc Câm Tú, cô và thầy đã hết lòng giúp

đỡ, chỉ day, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học

tập và hoàn thành luận văn Chân thành cảm ơn các bạn phòng Phân tích Dat — Phân

bón thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã cùng đồng hành

và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Cuôi cùng con xin gửi lời biệt ơn chân thành, sâu sắc nhat dén cha mẹ, người

đã nuôi nâng, tao mọi điêu kiện dé con có thê học tập va rèn luyện bản thân cho đên

ngày hôm nay.

Xin chân thành cam on!

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hàm lượng và đặc tính hóa lý củachitin thu nhận ở các giai đoạn vòng đời khác nhau của rudi lính đen (RLĐ) Hermetiaillucens (ấu trùng, tiền nhộng, nhộng, ruồi chết và vỏ kén dùng hai phương pháp chiết

rút hóa học và sinh học Dùng phương pháp hóa học, hàm lượng chitin thu được daođộng từ 7,18% đến 35,5%, với hàm lượng chitin cao nhất là trong vỏ kén Với phương

pháp sinh học, chitin được chiết rút từ vỏ kén được tối ưu hóa quá trình khử protein (bằngenzyme Alcalase 2.5L) và khử khoáng (dùng axit lactic) ở các điều kiện khác nhau bang

phương pháp bề mặt đáp ứng Hàm lượng chitin thu được là 63,2 + 0,17% Đặc tính lý

hóa của chitin chiết rút từ hai phương pháp được đánh giá bằng quang phổ hồng ngoạibiến đổi Fourier (FTIR) va ảnh chụp từ kính hiền vi điện tử quét (SEM) Kết quả phantích FTIR và SEM cho thấy chitin của vỏ kén RLĐ từ hai phương pháp tương đồng về

mặt cấu trúc hóa học và đặc tính hóa lý, chitin RLĐ là một a- chitin

Chitin thu nhận từ hai phương pháp trên được chuyến hóa thành chitosan dùng

NaOH 70% ở nhiệt độ 80oC trong 8 giờ So với phương pháp xử lý sinh học, hiệu suất

thu hồi chitosan từ phương pháp hóa học hiệu quả hơn Đặc tính hóa lý của chitosan chiếtrút từ phương pháp hóa học (HH) và sinh học (SH) được đánh giá thông qua phổ FTIR,

anh SEM, khối lượng phân tử (MW), độ nhớt, độ khử acetyl (DA) và độ hòa tan Từ các

kết quả của phổ FTIR và anh SEM, chitosan từ hai phương pháp là a- chitosan So vớichitosan từ HH, chitosan từ SH có MW, độ nhớt, DA và độ hòa tan thấp hơn Ngoài ra,đặc tính kháng khuẩn của cả hai loại chitosan được xác định dùng phương pháp khuếch

tán dia Ca hai loại chitosan đều có hoạt tính kháng khuẩn kháng cả vi khuẩn gram đương

(Bacillus subtilis) và gram âm (Vibrio alginolyticus) So với chitosan từ HH, kết qua chothay chitosan từ SH có đặc tính kháng khuẩn tốt hơn.

Từ khóa: chitin, chitosan, đặc tính hóa lý, Hermetia illucens, kháng khuân, ruồilính đen.

samples to be of ơ- chitin.

Chitin obtained from both chemical and biological methods were converted into chitosan by using NaOH 70% at 80°C for 8 hours Comparing to biological treatment, the chemical method for chitosan recovery was more effective Physicochemical properties of chemically (CC) and biologically (BC) treated chitosan was done using FTIR spectroscopy, SEM images, molecular weight (MW), viscosity, degree of deacetylation (DD), and solubility From the FTIR spectroscopy and SEM results,

both obtained chitosan were a- chitosan Compared to the CC, the BC showed lower

MW, viscosity, DD, and solubility Moreover, the antimicrobial properties of both chitosan were determined using the disc diffusion method Both chitosan showed antimicrobial activity against both gram-positive (Bacillus subtilis) and gram-

negative bacteria (Vibrio alginolyticus) The results showed that the BC had better

antibacterial properties compared with that of CC.

Keywords: antimicrobial activity, black soldier fly, chitin, chitosan, Hermetia illucens, physicochemical properties.

MỤC LỤC

T HAT TEE scence sec ev Ts a ae wa i leh iTrang Chuan ng 4 1Tey He hiiea an Wan ¿sec crear are 5E53200065852070E0EBSEEBIEBSBGGI3SGBSEEBGGS270S0:80E/2E/0.GBB.G⁄2E0/2E60/81G8.30 1

161 C81) G8 Ïlissseeaseseiotidoittixisxett0SE1081100450000130511681/2000810816138935EHS1S0HSHISLTESSG12133053880000H085 11

150) ore 0801 | eee eee eee 1VTOM tẮTK 2-5222 22221221221221221221221211211211112112111111111111111111111111 2111122 1 c0 VSUMIMALY 0 vI

NI Wt cececescorpecemenencyerseecenienuperer ean eae grein ster ales ters sr ee eer i ne cr reese villDanh sach chit viét tat nh .ẻ XI

DST SAC hy OUD sss sis s ssus seman snes sassveuelt co axe ae Nasa aS AGLiS BSR a SADE RNAS ANNES XIV

Chương! TONG QUAN TÃI THỂ sscsscncnccnonscnnusnomnacnnmnnnammamannanes 51.1 Ruồi lính den (Hermetic illucens) c.cccccsscesseeseessessessessesssessesssessesseessessessees 2)1.1.1 Vong đời của Ruôi lính đen -2-©22©2222222222E22E222E22EE2EEEEEEErerxrrrrerree 61.1.2 Ứng dụng của Ruồi lính đen - 22 2 5222222E22E22EE22E22212232232221223222xe 8

2, Chitieval CHGS At orn cecncnee cs smemmenseueeaaeeuanuaeeumennnnn on aaanea Sareea 101.2.1 Cau trúc hóa học và nguồn gốc của chitin 2¿©2252+2222z2z+2zzzz>s+2 101.2.2 Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan 2 2 s+2s+Sz+Ee£z+z+zzezxcrxez 13

1.2.3 Ứng dụng của chitin va chitosan - 22 2©522222E22E+2E2E2E2EzEezxzxrzxree là)

1.3 Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) -2 5+-552 17

LA Enzyte @lCAlaS 6 wes aetsoeiSUOGBI2G0rEiloabvstbaliplllolbsllioss langlS0kgli4M200.002.G)0080g0036818.i3'a458, 191.5 Một số phương pháp trong va ngoài nước về chiết xuất chitin va chitosan 201,5„Ì„.HưØïiE PHA HOA WGC cueseeseeseesenoseboioitiueh net sgith4gEugUSGGHESG-SGGEHDELDE.GIOHSGUICLGI.G86/G0gE-380 20 1.5.2 do.) 811 281.6 Một số nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan 30

Chương 2 PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU - 2s s<ssecses 42

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2- -222++22++zsezsersrersersers 32

2.1.1 Địa điểm eC li ee) mal Wess eee ee eee eee ee 32 2.2 Vt WOU 32

PN UC) 5-5-2222 E22122121211211212112111errrerrererrerereroco.24 2.4 Hóa chất -: - 2222222222222 2 T H.Hrgrerrre 34 2.5; Phuong phap nghiễn GỮ:szsczsssecsessessc521556508390364603935n23185 5810 855.20830/866yBE84100, 858 34 2.5.1 Ứng dụng phương pháp hóa học khảo sát hàm lượng chitin của RLD 34

2.5.2 Xây dựng quy trình chiết xuất chitin bằng phương pháp sinh hoc 36

2.5.2.1 Tối ưu hóa các điều kiện khử protein bang enzyme Alcalase 2,5L 37

2.5.2.2 Tối ưu hóa các điều kiện trong trình khử khoáng bằng axit hữu cơ 41

2.5.2.3 Chuyén chitin thành chitosan 2-22 2222+2E2EE22E2EE2EE22EE2EErzrrzrrsres 44 2.5.3 Phương pháp phân tích các thành phần bên trong mẫu 2 44 2.5.4 Hiệu suất quá trình khử protein, khử khoáng và hiệu suất thu hồi chitin 44

2.5.5 Khảo sát các đặc điểm hóa lý của chitosan -2- 2-52 5222z+2zczxczzczzrsex 45 2.5.5.1 Xác định độ deacetyl (DD), độ nhớt và độ tan - -+-+-<<~s>+ 45 2.5.5.2 Độ tinh khiết và cấu trúc hóa học - 2-2 2+22+2+2++Ez2E+z++zzzzzxzzxe- 46 2.5.5.3 Cấu trúc bể mặt - ¿2+ s+++E£Ex£E2EEEEEE121212112111111212121121 1111111 xe 47 2.5.5.4 Xác định khối lượng phân tử (Mw) của mau chitosan - 2 252 47 2.5.5.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chitosan đã chiết xuất được 47

Chương 3 KET QUA VẢ THẢO LUẬN ssssissasssscssssssavensconsiasesssssavassrnvesarenscuneavoss 50 3.1 Hàm lượng chitin Rudi lính đen xác định bằng phương pháp hóa học 50

3.1.1 Thành phần hóa học của RLĐ ở các ngày tuôi 2 2-©2225252z22zscs2 50 3.1.2 Qua trinh tao 3 na 33

3.1.2.1 Khử protein bằng NaOH 5% 2-22 22222E2221221222122122122122222 xe 53 3170 ta cries lũng TT dì nreeedesnrndoddtiisansooisoySig200.880030nSiEgEnxegbssel 54 3.2 Tao chitin bằng phương pháp sinh học -2-22222222222222222z22Ezzzzzxszez 58 3.2.1 Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng phương pháp đáp ứng bề mặt 58

3.2.2 Khử khoáng bằng axit lactiC 5-55 522S22E2E12E221221212212112121211 2111 X6 64

3.3 Đánh giá tính chat vật lý của chitin được thu nhận bang 2 phương pháp 69

3.3.2 Cấu trúc hóa học và độ tính khiẾt 22+ 2+ 2++EE+E++E£EE£EEZEEE+EErEerxrrxee 6953.334 E lữ cỗ ĐH «seeeeensenasresiriohtviennhteigtsiooehoirginn0gtotentiikisyennfinsitanttrrrbitsratBrrre 72

3.4 Chuyên hóa chitin thành chitiosan 0 0 0.cccccccccsessessessessessesseeseesessessessesseeeeens 1D

3.4 Đánh giá các đặc điểm hóa lý của chitosan 0 0 ccccecceceeeseceesssessessteseeeeeeees 793.4.1 Những đặc điểm nỗi bật của 2 phương pháp tao chitosan . 793.4.2 Xác định độ deacetyl (DD), độ nhớt, độ tan và khối lượng phân tử (My) 80

3.4.3 Độ tinh khiết và cấu trúc hóa học -cc2c2cccvccrrrrrrrrrrrrrrrree 83

3.4.4 Cấu trúc bề mặt của chitosam -2- 2 s+SE+EE£EE£EE2EEEEEEEEE2E 717121212 ce 863.5 Hoạt tính kháng khuẩn 2-2-2 2 SS+SE2SE2SE2EE£EE2EE22E2EE2E22E23221 2122122 xe 903.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan với Bacillus subfilis 903.5.2 Hoạt tinh kháng khuẩn của chitosan với Vibrio alginolyfieus 9]KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 5< 5< s©©s++xe+reerxerrerserrrrserrerrsrree 95TÀI LIEU THAM KHAO .- 2 «<< ss£eEetreerserserrserserrserserr 97PHẪU LQG táng ng nhu gangg0ci01ã080681E08146113846838851650146113131348638453144811338EE181858565368 105

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

Rudi Linh Den

Độ deacetyl

Ngày tuổi

Mau xác Rudi lính đen được xử lý bằng phương pháp hóaMẫu xác Ruồi lính đen được xử lý bằng phương pháp sinh hóaMau vo Rudi lính đen được xử lý bằng phương pháp hóa

Mau vỏ Ruôi lính đen được xử ly bằng phương pháp sinh hóaKhối lượng phân tử

DANH SÁCH BANG

BANG TRANG

Bang 2.1 Khối lượng thu mẫu ban đầu -2- 22 522222scszszsezsezrsszsc-c. .- 33

Bang 2.2 Pham vi các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình khử protein 38

Bang 2.3 Quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box — Behnken đối với quá (HH DEOIE HỗsvsesssrsnittriBohitbdnGidirauDBSR9S04038i-320SNSSSGIN/0315090i1006000010B/886xcseztÐÐ) Bang 2.4 Phạm vi các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình khử khoáng 42

Bảng 2.5 Quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box — Behnken đối với quá tinh khử KO ANS sesssscsesskosesbskenlipoaeeilidigBsssăsistssoSsio meine teeters 42 Bang 3.1 Thanh phần hóa học của RLD ở các giai đoạn . - 5-52 5] Bảng 3.2 Hàm lượng protein, hàm lượng khoáng và hiệu suất khử protein sau qua 8184100040010 001057 53

Bang 3.3 Thanh phan hóa học va hiệu suất khử khoáng bang phương pháp hóa theo giai đoạn vòng đời của RLD - 5- +2 +S+xs+scssrsrrrrrrrrrrrrres 55 Bang 3.4 Thanh phan hóa học và hiệu suất thu nhận chitin của chitin bằng phương pháp hóa theo giai đoạn vòng đời của RLD . 56

Bảng 3.5 Kết qua quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box Behnken 58

Bảng 3.6 Kết qua phân tích hệ số trong phương trình hồi quy theo mô hình Box TC A steers cance sri le esc slant sent innermost 62 Bảng 3.7 Kết qua phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm đối với ham hiéu suat khtr protein 0 1 63

Bang 3.8 Hiệu suất khử protein ly thuyết và thực nghiệm ở các điều kiện 64

Bảng 3.9 Kết qua quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box Behnken 65

Bang 3.10 Kết quả phân tích ANOVA theo mô hình Box Behnken 66

Bang 3.11 Hiệu suất khử protein lý thuyết và thực nghiệm ở điều kiện tối wu 68 Bang 3.12 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm đổi với

Bảng 3.13 Thành phần hóa học bên trong chitosan tạo từ phương pháp hóa 76

Bảng 3.14 Thành phần hóa học bên trong của chitosan vỏ RLĐ và xác RLĐ được tạo ra bằng phương pháp hóa và phương pháp hóa sinh kết hợp 19

Bang 3.15 Hiệu suất thu hồi chitin và thu hồi chitosan của vỏ RLD và xác RLD được tạo ra bằng phương pháp hóa và phương pháp sinh hóa 80

Bang 3.16 Độ deacetyl, độ nhớt, độ tan và khối lượng phân tử của chitosan 81

Bang 3.17 Đường kính vòng vô khuẩn của chitosan với Bacillus subfilis 91

Bang 3.18 Đường kính vòng vô khuẩn của chitosan với Vibrio alginolyticus 92

DANH SÁCH HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu - 2: 2¿22222E+2E+2EE2EE22E222E2E2222z2xzzzxeex 4 Hình 1.1 Rudi lính đen (Black Soldier Fly) -2 2222522252222z2222+zzz+zzzze2 5 Hình 1.2 Vòng đời của Hermetia illucens .:cccceccsccssesscsseseeseeseensessessesessssesesseees 6 Hình 1.3 Cau trúc hóa học phân tử chitin - 2-2 22 5S2E2E22E2£E£E2EzEzxezxez 10

Hình 1.4 Sự sắp xếp của chuỗi chitin: ơ-chitin, B-chitin, y-chitin 11

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của chitosan .0.0 cccccccccsseesesseseesesseseseseeseseeeseeteeeeseeees 13 Hình 1.6 Phương pháp chiết xuất chitin và chitosan từ côn trùng 25

Hình 1.7 Phương pháp chiết xuất của Chitin va Chitosan từ dé nhà 26

Hình 1.8 Phương pháp chiết xuất của chitin va chitosan từ vỏ RLĐ 2]

Hình 3.1 Khu saad tuổi Tỉnh đ6n, S000 84g xEe.gnpx8.1E me te Ð Hình 2.2 Quy trình xử lý mẫu . - 2-5 252252s+zzsezsezsserserssrrrseese- 38

Hình 2.3 Quy trình tao chitin từ RLĐ theo Nguyễn Ngọc Hà và ctv (2022) 36

Hình 3.1 Biểu đồ thé hiện thành phan hóa học của RLD trong các ngày tuổi 52

Hình 3.2 Sản phẩm sau quá trình khử protein 2¿ 52552 5s2S2z2z+zz+zzzzse2 54 Hình 3.3 Sản phẩm sau qua trình khử khoáng (chitin) 222 ©525522525522 57 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng 3 yếu tố đến hiệu suất khử protein 63

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng 3 yếu tố đến hiệu suất khử khoáng 67

Ce ae E THỊ øila CL ee 70 Hình 3.7 Phé FTIR của chitin V — HH, V — SH, C — HH và C — §H 71

Hình 3.8 Hình chụp SEM của chitin từ V - SH, V —HH 555555555552 73 Hình 3.9 Hình chụp SEM của chitin từ C — SH, C — HH - 55-555: 74 Hình 3.10 Hình chụp SEM của các mẫu chitin của RLĐ (độ lớn 250) 15

Hình 3.11 Chitin va chitosan tao từ vỏ RLD bang phương pháp hóa 76

Hình 3.12 Chitin va chitosan tao từ xác RLD bang phương pháp hóa - sinh 77

Hình 3.13 Quy trình tạo chitosan từ RLD bằng phương pháp sinh hóa 78

Hình 3.14.

Hình 3.15.

Hình 3.16.

Hình 3.17.

Hình 3.18.

Hình 3.19.

Hình 3.20.

Hình 3.21.

Phé FTIR của chitosan V — HH, V — SH, C — HH và C — SH 84

Phé FTIR của chitosan C — Sigma và C — Himedia - - 85

Hình chụp SEM cua chitosan từ V — SH, V —HH - 86

Hình chụp SEM cua chitosan từ C — SH, C — HH - - - 87

Hình chụp SEM của chitosan chuẩn (C-Himedia), (C-Sigma 88

Hình SEM cua chitin va chitosan từ vỏ nhộng RLĐ 89

Vòng vô khuẩn của chitosan với Bacillus subilis -. 90

Vòng vô khuẩn của chitosan với Vibrio alginolytieus - 93

lại kinh tế to lớn bằng cách giải quyết đồng thời hai vấn đề toàn cầu: thiếu hụt protein

trong thức ăn và sử dụng chất thải hữu cơ Một số ngành công nghiệp trong lĩnh vựcchăn nuôi côn trùng có ich dang phát triển nhanh chóng Vi du, thị trường côn trùng

ăn được ước tính sẽ vượt quá 522 triệu đô la vào năm 2023 (Kim và ctv, 2019) Theo

một báo cáo được công bố vào năm 2016, trên toàn cầu, hơn 120 công ty đã đăng ký

tham gia vào hoạt động kinh doanh nuôi trồng và chế biến và tiếp thị côn trùng làmdinh dưỡng cho động vật và con người (Ortiz và, 2016) Vào năm 2019, khoảng 6nghìn tấn bột protein côn trùng đã được sản xuất ở Châu Âu được sử dụng làm dinh

dưỡng cho động vật, từ Ruồi lính đen, sâu bột vàng (Tenebrio molitor) và loài sâu

Alphitobius diaperinus Đặc biệt, ruồi lính den được khoảng 80% tổng số công ty sảnxuất côn trùng của EU chế biến (Derrien và ctv, 2018) Ruồi lính đen có thể đượcnuôi trên một loạt các dòng hữu cơ và đóng góp vào một nền kinh tế tuần hoàn Bộxương ngoài từ âu trùng chứa tới 35% chitin (Hahn và ctv, 2018), có nghĩa là nó làmột trong những hợp chất chính có thê được phân lập từ các sản pham phụ của ngànhcông nghiệp nuôi côn trùng Do đó, các sản phẩm phụ giàu chitin từ việc nuôi Rudilính đen tạo ra một nguồn chitin thương mại mới và bền vững Với khía cạnh bềnvững và sự gia tăng dự kiến trong sản xuất côn trùng Các sản phẩm phụ từ việc nuôicôn trùng là một nguồn cung cấp chitin đầy tiềm năng cho tương lai

Theo một nghiên cứu Knidriet va ctv (2018), chitin là polysaccharide phongphú thứ hai trên trái đất sau cellulose Chitosan là một dẫn xuất phô biến của chitin

được tạo ra bằng phản ứng khử oxy hóa Do đặc tính sinh học và hóa học đặc biệt của

nó, chitosan đã thu hút sự chú ý rộng rãi đến các dự án nghiên cứu trên toàn thế ĐIỚI

và có thé được sử dụng trong nhiều ứng dụng công nghiệp và y sinh, từ phân phốithuốc và mỹ phẩm đến chế biến thực phâm và nông nghiệp Ước tính mỗi năm có

khoảng 10! tan chitin và chitosan đã được sản xuất, sử dụng trên toàn thé giới nhưng

hầu hết được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghe (Lise va ctv, 2020) Dựa trên xu thế

phát triển tiềm năng này nên có nhiều nghiên cứu về quy trình nuôi ruồi lính đen vàchiết xuất chitin, chitosan Việc nghiên cứu chiết xuất, cấu trúc, tính chất hóa học củachitin và chitosan được công bố từ những năm 30 của thế ky XX Cho đến nay trênthé giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin — chitosan với nhiều nguồn nguyên liệu

khác nhau nhưng chủ yêu là vỏ tôm cua và ghẹ.

Thông thường, xử lý hóa học cung cấp chitin và chitosan tỉnh khiết, nhưng nótạo ra khối lượng lớn chất thải do nồng độ hóa chất được sử dụng cao; giá thành cao

do chi phí xử lý chất thải chứa axit và kiềm và ăn mòn thiết bị; một số hóa chất như

axit clohydric có thé có tác động bat lợi đến cấu trúc và thành phan hóa học của chitin.Chiết xuất bằng phương pháp sinh học và khử oxy hóa chitin như một giải pháp thaythế thân thiện với môi trường cho các quy trình hóa học Các phương pháp sinh họcchủ yếu dựa trên việc sử dụng các protease của vi sinh vật hoặc toàn bộ vi sinh vật déloại bỏ protein và ứng dung deacetylase dé khử men chitin

Mặc dù ở Việt Nam nhiều năm gan đây có một số nghiên cứu về Rudi lính

đen nhưng nhìn chung vẫn chưa có nghiên cứu đi sâu về đối tượng này; đặc biệt hiệnnay ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào công bồ về tạo chitin/chitosan ở Rudilính den bằng phương pháp sinh học Vì vậy “Nghiên cứu chiết xuất chitin/ chitosan

ở Rudi lính đen (Hermetia illucens)” là hướng nghiên cứu tiềm năng và cấp thiết

Mục tiêu đề tài

Đưa ra quy trình thu nhận chitin và chitosan từ Rudi lính đen Xác định một số

đặc tinh lý hóa cua chitin - chitosan; và đặc tính kháng khuẩn của chitosan thu nhậnđược Tạo cơ sở cho nghiên cứu chuyên sâu hơn về Rudi lính đen làm nguồn nghuyên

liệu cung ứng chitin/chitosan mới cho nhu cầu thị trường

Nội dung thực hiện

+ Ứng dụng phương pháp hóa học dé khảo sát hàm lượng chitin của một số

giai đoạn vòng đời của Ruôi lính đen.

Xây dựng quy trình chiết xuất chitin ở giai đoạn thích hợp của Rudi lính

đen bằng phương pháp sinh học

Đánh giá đặc tính lý hóa cua chitin chiết xuất được

Chuyên hóa các chitin thu nhận được thành chitosan bằng phương pháphọc.

Đánh giá đặc tính lý hóa và hoạt tính kháng khuan của chitosan chiết xuấtđược.

Các bước thực hiện của nghiên cứu này được tóm tắt trong hình sau:

Phuong phap tao

chitosan hóa hoc

Chiết xuất chitinphương pháp hóa:

Đánh giá tính chất hóa lý (FTIR, Mw, Độ nhớt, Độ

deacetyl, SEM) và hoạt tính kháng khuân của

chitosan thu nhận được.

Hình 1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Rudi lính đen (Hermetia illucens)

Rudi lính đen (Black Soldier Fly), tên khoa học là Hermetia illucens, thuộc họ

Stratiomyidae tộc Hermetia, loài 77 7//cens được tìm thay trên toàn thế giới, nhưng

nó được cho là có nguồn gốc từ châu Mỹ

Giới (Kingdom): Animalia

Ngành (Phylum): Arthropoda

Lớp (Class): Insecta

Bộ (Oder): Diptera

Ho (Family): Stratiomyidae

Chi (Genus): Hermetia

Loài (Species): H illucens

Hinh 1.1 Rudi linh den (Black Soldier Fly)

Nó thường được tim thấy ở các vùng nhiệt đới va ôn đới trên khắp thế giới.Mặc dù thích nghi chủ yếu ở những vùng này, nó có thể chịu được nhiệt độ cực caongoại trừ khi đẻ trứng Chúng thường được coi là một loai côn trùng có ích và khônggây hại Ruồi trưởng thành không có phần miệng hoặc cơ quan tiêu hóa; do đó, chúngkhông căn hoặc chích và không kiêm ăn trong thời gian tôn tại ngắn ngủi của nó.

1.1.1 Vòng đời của Ruồi lính đen

Vòng đời của rudi lính đen kéo dài khoảng hơn 1 tháng, bắt đầu từ trứng, au

trùng, nhộng, cuối cùng lột xác thành ruồi lính đen trưởng thành

Ở Hình 1.2 là vòng đời được nuôi và nghiên cứu trực tiếp tại khu thực nghiệm

Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trứng sẽ được nở từ 2 — 4 ngày,

chúng sẽ được cung cấp dinh dưỡng trong suốt quá trình phát triển Từ ngày 1 đến

khoảng ngày thứ 18 là giai đoạn tiền nhộng, sau đó 7 ngày chúng phát triển thànhnhộng khi đó vỏ bên ngoài của chúng có màu đen Từ nhộng phát triển thành Ruditrưởng thành mat khoảng 7 ngày, khi chúng đã tưởng thành sẽ giao phối trong giai

đoạn này chúng không cần thức ăn và sau 2 ngày chúng đẻ trứng, tiếp tục vòng đời

Với điều kiện thực hiện thí nghiệm, Ruôi lính đen trong quá trình thí nghiệm

trai qua 5 giai đoạn chính trong vòng đời: trứng (từ 5 - I0NT, au trùng (từ 10 — 14NT),

tiền nhộng (từ 15 — 28NT), nhộng (từ 29 — 40NT) va con trưởng thành Giai đoạn dài

nhất trong vòng đời của RLĐ là ở giai đoạn ấu trùng và nhộng, trong khi giai đoạn

trứng và trưởng thành lại ngắn và tùy theo nguồn thức ăn mà các giai đoạn vòng đờikhác nhau Trung bình, trứng nở trong bốn ngày và thay đôi theo mùa, vùng và nhiệt

độ Có khoảng sáu ngày tuổi trong giai đoạn au trung Au trùng nở ra từ trứng bắt đầu

ăn ngay lập tức các loại chất hữu cơ khác nhau, với mức tiêu thụ chất hữu cơ tăng

đáng ké trong giai đoạn ấu trùng Khi ấu trùng đạt đến ngày tuổi thứ 6, sẽ bắt đầu trai

qua quá trình tạo hắc tố khiến lớp biểu bì có màu sẫm hơn dé dần trở thành nhộng.Trong giai đoạn này, côn trùng làm rỗng đường tiêu hóa và ngừng ăn Sau đó, autrùng di chuyên từ nguồn thức ăn đến các kẽ hở khô dé biến thành nhộng trong 7-10ngày Giai đoạn nhộng, chúng hạn chế di chuyền và không ăn trong ít nhất 8 ngày,kết thúc khi trưởng thành Rudi trưởng thành không ăn gì ngoại trừ nước và dua vàochất béo dự trữ ở giai đoạn ấu trùng

Theo Ferrarezi và ctv năm 2016, tổng chu kỳ của BSF là 45 ngày Nó trải qua

hai giai đoạn của cuộc đời trong giá thé nuôi cay là trứng (4 ngày) và giai đoạn ấu

trùng (18 ngày) Chỉ khi chúng chuyền đổi từ giai đoạn tiền nhộng (14 ngày) sau 9

ngày là con trưởng thành.

Con trưởng thành sống được khoảng hai tuần khi chỉ được cung cấp nước.Thông thường con đực xuất hiện trước hai ngày so với con cái và giao phối diễn ra

sau đó hai ngày Rudi lính den là một loài côn trùng giao phối trong lúc bay, và do

đó cần có những khu vực rộng rãi cho chuyển bay tự do của nó (Caruso và ctv, 2013)

Chúng thường giao phối một lần và con cái sẽ đẻ một lứa trứng trong suốt cuộc đờicủa chúng, thường là hai ngày sau khi giao phối Kết quả là trứng nở trong khoảngbốn ngày với au trùng cần khoảng hai tuần dé phát triển hoàn thiện (Tomberlin vàctv, 2002) Giai đoạn tiền ấu trùng, giai đoạn sau của ấu trùng trước khi hình thànhnhộng va chúng phân tán ra khỏi nguồn thức ăn dé tìm kiếm một nơi khô ráo và đượcbảo vệ dé tạo thành nhộng Nhộng cũng cần khoảng hai tuần dé phát triển (Surendra,

2020) Ruồi trưởng thành tồn tại nhờ chất béo được lưu trữ trong giai đoạn au tring,

sau đó, chúng không ăn gi ngoại trừ nước.

Rudi lính đen trưởng thành có màu den, dài 15 - 20 mm với mau đen khói,chiathành ba phần riêng biệt là phần đầu, ngực và bụng Ruồi cái trưởng thành thườnglớn hơn con đực và có đầu bụng màu đỏ trong khi con đực có đầu bụng màu đồngbạc và thường đẻ trứng ở gần hoặc trên nền hữu cơ 4m và chat thai 4m ướt và trongtrường hợp không có môi trường như vậy, con cái không thé đẻ trứng Trứng ruồilính đen có hình bau dục và có kích thước xấp xi 1 mm (chiều dai) Trứng vừa mới

đẻ có màu trắng sau đó chuyền sang màu vàng nhạt hoặc trắng kem Âu trùng ruồi

lính đen mới nở nhỏ, màu trắng và dải khoảng 1,8 mm Theo thời gian, màu sắc ấu

trùng dan dan thay đổi từ sáng đến xám Au trùng có hình ngư lôi và det ở mặt dưới

Đầu ấu trùng chứa phần miệng nhai trong khi phần lưng được phân đoạn chứa lỗ chânlông dé thở Cơ thé ấu trùng được bao phủ bởi một làn da săn chắc, déo dai và độ déodai phụ thuộc vào độ tuôi

1.1.2 Ung dụng của Rudi lính đen

Au trùng có thé sinh trưởng rất nhanh Một ấu trùng có thé ăn 25 - 500 mg thức

ăn tươi/ngày Thức ăn của chúng khá đa dạng, đồng thời cũng là chất nền, từ phân

bón chăn nuôi, đến các loại rác thải thực phẩm, phụ pham nông nghiệp Một chu kỳ

sinh trưởng của ấu trùng ruôi lính đen kéo dài 15 ngày tới khi đạt trọng lượng trungbình 0,25 g trong điều kiện nhiệt độ tối ưu (30 °C) Au trùng này có tốc độ xử lý rácthải hữu cơ rất cao (trung bình gấp 5 lần trọng lượng cơ thê), thời gian xử lý dài (từ

2 - 3 tuần) Loài côn trùng này không chỉ có khả năng giảm ô nhiễm chất thải độngthực vật lên đến 50% mà còn làm giảm số lượng vi khuẩn có hại (Makkar, 2014).Theo Xiu (2017), ấu trùng Rudi lính đen tái chế đinh dưỡng lãng phí bang cáchchuyền đổi phân gia cam, phân lợn, phân bò sữa, phân người, chat thải thực vật, vàchat thải thực phẩm của con người Phân và chat thải cung cấp cho ruồi lính denkhoảng 40% protein và 30% chất béo Sự tích tụ lipid thay đổi tùy theo các nguyênliệu cho ăn khác nhau Chúng được sử dụng rộng rãi như một nguôn thức ăn tuyệt vờitrong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi và thủy sản Là một nguyên liệu thô sinh học

mới, cũng có thé được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học, làm cho công nghệ

xử lý chất thải thành năng lượng trở nên khả thi hơn

Ruôi lính đen được sử dụng làm thức ăn cho chăn nuôi lon, gia cầm, thủy sản

và xử lý chất thải trong nông nghiệp

Ngoài ra, ấu trùng ruồi có thé cô đặc, sấy khô phối trộn với các chất dinh dưỡngcủa Ruồi lính đen khác làm thức ăn thay thế hoàn toàn bột cá trong sản xuất thức ănchăn nuôi, thủy sản Các nguồn protein có nguồn gốc động vat, chang hạn như bộtcôn trùng, có thé được sử dụng làm nguồn thay thé cho thức ăn thủy sản (Kortner,2020) Bột ấu trùng lính đen được coi là một trong những lựa chọn thay thế tốt nhất

dé thay thế một phan hoặc hoàn toàn bột cá trong khẩu phan ăn của cá rô phi Nile makhông ảnh hưởng đến năng suất tăng trưởng, hiệu suất thức ăn và tình trạng sức khỏe

(Tippayadara, 2021).

Đây là loại mỗi sống rat thích hợp cho làm thức ăn cho các loại gia súc, gia cầm,thủy hải sản Chúng còn bổ sung canxi và phốt pho cho gia cầm như: gà, vịt, ngan,ngỗng, giúp bổ sung chất dinh dưỡng, tăng sức đề kháng, kích thích ra lông tốt, Ngoài ra, rudi lính den còn rất phù hợp với nhiều loại thú cưng khác như cá cảnh,chim cảnh, bò sát, kỳ tôm, Chúng còn là loại côn trùng có ích, chúng có thể xử lí

rác thải hữu cơ thành phân bón hữu ích cho cây cảnh Chính từ lợi ích nhiều mặt của

ruôi lính đen, trên thị trường gần đây xuất hiện nhiều mô hình nuôi ruôi lính đen làmnguồn thức ăn hữu ích cho nhiều loại vật nuôi Thành phần dinh dưỡng của au trùngRLĐ đã có nhiều công bố và phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng cũng như sé luongchat nền làm thức ăn Au trùng chứa ham lượng protein thô dao động từ 38 — 63% vachất béo thô dao động từ 7 — 42% Protein của ấu trùng ruồi lính đen chứa rất nhiềucác axit amin thiết yếu và không thiết yếu, các khoáng chất như Ca nhiều hơn so vớihầu hết các loại côn trùng khác từ 6,6 — 9,3% vật chất khô (Makkar và ctv, 2014; Paul

và ctv, 2017) Điều đó mang lại một lợi thé đáng ké về mặt dinh dưỡng trong việc

cung cấp đầy đủ các khoáng chất và vitamin thiết yếu so với các loài côn trùng khác.Bên cạnh đó còn có nghiên cứu khác về hàm lượng dinh dưỡng của RLD, giá trị dinh

dưỡng của ấu trùng RLĐ khô chứa tới 50% protein, 35% chất béo (có thành phần axit

amin tương tự bột cá), 6% canxi, 1,2% Phốt pho, 1% Magié và 0,3% natri (Lise và

ctv, 2019) Hàm lượng độ am, tro, protein, lipid, chất xơ lần lượt dao động trongkhoảng 3,21 — 7,10%, 7,26 — 8,27%, 39,38-48,20%, 25,69—38,36%, 7,41%-9,96% va

6,45—7,88% (Nor và ctv, 2022) Theo Augusta va ctv (2017), thành phan axit béo

BSF chu yếu là axit lauric (46,7 + 0,6%), tiếp theo là axit oleic (15,1 + 0,9%), axItmiristic (8,3 + 0,1%), palmitic (8,4 + 0,2%) và palmitoleic (7,6 + 0,4%) bên cạnh đólipid chiếm 37% trọng lượng, protein chiếm 32% va chitin chiếm 9% Vì vậy, ấutrùng RLĐ được công nhận và sử dụng rộng rãi làm nguồn protein thay thế cho giacam, lợn và một sô loài cá, tôm.

1.2 Chitin va Chitosan

1.2.1 Cau trúc hóa học và nguồn gốc của chitin

Chitin được cấu tạo từ các đơn vị N- acetyl-D-glucosamine (NADG) liên kétvới nhau bằng các liên kết B-1,4-glucozid

Dựa trên nguồn gốc và cấu trúc hóa học, chitin được chia làm 3 dạng: Dạng chitin đã được thương mại hóa và có nguồn thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ Trongkhi dang ÿ - chitin thu nhận từ mai mực và dạng y - chitin thu nhận từ vách tế bàonam, nam men Ba dang chitin này khác nhau về số mach chitin, sự sắp xếp các mạchnày và kích thước của chúng trong mỗi đơn vị cau trúc Cụ thé, a - chitin gồm cácmạch chitin sắp xếp song song ngược chiều nhau được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua và

ơ-vỏ ghe Còn B - chitin gồm các mach chitin sắp xếp song song cùng chiều, có tínhhydrat hóa cao Trong khi, y - chitin là sự kết hợp của 2 dạng a và và thường được

thu nhận từ vách tế bao nam và vách tế bào vi khuẩn Các cấu trúc khác nhau dẫn đếntính chất cũng khác nhau Cụ thé, a-chitin có độ rắn tinh thé (Crl) cao nhất, còn B-chitin thì có độ rắn thấp nhất.

Sự khác biệt nay ảnh hưởng đến đến tính hydrat hóa, độ rắn tinh thé của từngdạng chitin, do đó ảnh hưởng đến khả năng khử gốc acetyl và dạng cấu trúc mạchtinh thé trong dung môi hòa tan, điều này quyết định các tính chất chức năng sinh họcđặc biệt là khả năng kháng khuẩn của chúng Chitin chỉ hòa tan được trong một sốdung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO, và dimethylacetamide chứa 5% lithrum chloride.

Liên quan đến sự hình thành tinh thé của chitin, ba loại (a, B và y) thì a - Chitin

được coi là sự hình thành tinh thê nhất trong khi B - chitin là vật liệu mềm hơn, có ái

lực với dung môi cao hơn và kha năng phản ứng cao hơn Dang thứ ba, y - chitin,

được coi là hỗn hợp hoặc dạng trung gian của ơ- và B - chitin Hầu hết các dit liệu tàiliệu nói rằng chitin côn trùng có độ kết tinh ơ Bên cạnh đó, Merzendorfer và Zimoch(2003) báo cáo rằng tat cả ba dang tinh thé có thể được tìm thấy trong côn trùng

Dang a phố biến hơn nhưng f - va y - chitin có thé được tìm thay trong kén và chat

nên peritrophic của một sô loài.

on hr ANH

HN tua Pig = —¬

KẾ cm HN +

a-chitin B-chitin y-chitin

Hình 1.4 Sự sắp xếp của chuỗi chitin: o-chitin, B-chitin, y-chitin

Chitin có dẫn xuất là chitosan, nó là những polysaccharide mạch thang, chúngphổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose, chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật.Trong động vat, chitin là thành phan cau trúc quan trọng của vỏ của một số động vật

không xương sống như côn trùng, giáp xác Chitin được coi là chất tạo xương hữu cơ

chính ở động vật không xương sống Trong thực vật, chitin có trong vách tế bao củanâm và một sô loài tảo.

Chitin tổn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thé Nó có cấu trúc gồm nhiều phân tửđược nối với nhau bằng cầu nối hydro và tạo thành một hệ thống dang soi it nhiều có

tô chức Trong tự nhiên rat ít gap dạng tồn tại tự do của chitin, nó liên kết đưới dang

phức hợp chitin — protein, chitin và các hợp chất hữu cơ khi tồn tại như thé chitin

có sự đề kháng với các chất thủy phân, hóa học và enzyme Do đó nó gây khó khăncho việc tách chiết và tinh chế Tùy thuộc vào đặc tính cơ thé và sự thay đối từng giaiđoạn sinh lý mà trong cùng một loại, người ta có thể thấy sự thay đổi về hàm lượngcũng như chất lượng của chitin

Câu trúc của chitin được xác định bởi Albert Hofmann vào năm 1929 Hofmann

thủy phan chitin bằng cách sử dụng chế phẩm thô của enzyme chitinase, thu được từ

ốc sên Helix pomatia Chitin là một polysaccharide biến đổi có chứa nitơ, nó được

tổng hợp từ các đơn vi N -acetyl- D -glucosamine (chính xác là 2- (acetylamino)

-2-deoxy- D -glucose) Cac đơn vi nay tạo thành liên kết cộng hóa trị B - (1 > 4) (giống

như liên kết giữa các đơn vi glucose tạo thành cellulose) Do đó, chitin có thé được

mô tả là cellulose với một nhóm hydroxyl trên mỗi monome được thay thé bằng mộtnhóm acetyl amin Điều này cho phép tăng liên kết hydro giữa các polyme liền kẻ,

làm tăng độ bền của ma trận chitin-polyme

Ở dạng nguyên chat, không biến tính, chitin trong mờ, dẻo, đàn hồi và khá dai

Tuy nhiên, ở hầu hết các động vật chân đốt, nó thường bị biến đồi, phần lớn xuất hiện

dưới dạng thành phần của vật liệu composite, chẳng hạn như trong sclerotin, một chấtnên protein ram nắng, tạo thành phan lớn bộ xương ngoài của côn trùng Kết hợp vớicalci cacbonat, như trong vỏ của động vật giáp xác và động vật thân mềm, chitin tạo

ra một hỗn hợp mạnh hơn nhiều Vật liệu composite này cứng và cứng hơn nhiều so

với chitin nguyên chất, đồng thời cứng hơn và ít giòn hơn calci cacbonat nguyên chat.

Có thé thấy sự khác biệt khác giữa dạng tinh khiết và dạng hỗn hợp bang cách so sánhthành cơ thé mềm dẻo của sâu bướm (chủ yếu là chitin) với thành elytron cứng, nhẹ

của bọ cánh cứng (chứa một tỷ lệ lớn sclerotin).

Nam là nguồn cung cấp chitin chính thứ hai sau động vật giáp xác Một số hoạt

động nghiên cứu đã tập trung vào nắm và giá trị thương mại của chúng vì chúng đã

thu hút sự chú ý như một nguồn chitin và chitosan thay thé và thuần chay (Abdel,2017) Chitin chiếm từ 1 đến 15% khối lượng thành tế bao nam và cấu trúc của nó cóthé so sánh với cau trúc của các loài giáp xác (Abdel, 2017)

Hiện nay, nguồn chitin và chitosan thương mại chính là phụ phẩm chế biến

thủy sản - chủ yêu là bộ xương ngoài của động vật giáp xác (Arbia, 2013) Sản lượng

động vật giáp xác hang năm trên thế giới ước tính khoảng 8 triệu tan vào năm 2016

(Tacon, 2018) Thị trường toàn cầu cho chitin và chitosan dự kiến sẽ đạt 4,2 tỷ đô lavào năm 2021, với tốc độ tăng trưởng kép hàng năm là 15,4% (Jardine, 2018), từ đónhu cầu tìm kiếm các nguồn khác đề đáp ứng thị trường đang tăng nhanh

1.2.2 Cấu trúc hóa học và tính chat của chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl khỏimach chitin còn gọi là quá trình deacetyl hoá, vì vậy chitosan là polyme chứa rấtnhiều các don vị Glucosamine nên có rất nhiều nhóm amin Công thức cấu tạo của

chitosan gần giống như chitin va cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở

Chitosan là một polysacharide mach thang được cấu tao từ các D-glucosamine

(đơn vi đã deaxetyl hóa) và N-acetyl-D-Glucosamine (đơn vị chứa nhóm acetyl) liên

kết tại vị trí B-(1-4) Nó được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các loài giáp xác với dungdịch kiềm NaOH

Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốttrong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, acidcitric, acid lactic Hằng số phân li acid (pKa) của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8

nên khi hoà tan trong môi trường acid loãng chitosan tạo thành dung dịch keo dương,

đây là một điểm rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharit tự nhiên tích điện âm.Trong khi chitosan tích điện dương nên có khả năng bám dính bề mặt trên các iontích điện âm, có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với cácpolyme tích điện âm Ngoài ra, loại dung môi acid cũng ảnh hưởng đến các hoạt tínhsinh học của chitosan khi hòa tan Các đặc tính như khả năng hút nước, khả năng happhụ chat màu, hap phụ kim loại, kết dính với chất béo, tinh kháng khuẩn, kháng nam,mang DNA, phân giải chậm, của chitosan phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa.Chitosan có độ deacetyl càng cao thì có khả năng hap phụ chất mau, tạo phức với kimloại càng tốt Tương tự, khả năng kháng khuẩn, kháng nam của chitosan cao hơn ởcác mẫu chitosan có độ deacetyl cao Cụ thé, khả năng kháng khuẩn tốt đối với

chitosan có độ deacetyl trên 90%.

Chitosan được sản xuất trong công nghiệp bằng phương pháp deacetyl hóachitin, vốn là chất tạo nên cấu trúc của lớp vỏ của các loài giáp xác và thành tế baocủa loài nam Độ deacetyl hóa có thể được xác định bằng phương pháp đo pho NMR,của chitosan thương mại thường dao động trong khoảng từ 60 đến 100% Nhìn chung,phân tử lượng của chitosan thương mại nằm trong khoảng 3800 - 20,000 Daltons

Phương pháp deacetyl hóa chitosan thông dụng là sử dụng lượng dư dung dịch NaOH.

Phương pháp này cho phép thu được sản phẩm có độ deacetyl cao đến 98%

Chitosan là polysacharide có đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn.Chitosan có mau trắng hay vàng nhạt, không mùi vị Không tan trong nước, dung

dịch kiềm và axit đậm đặc nhưng tan trong axit loãng (pH 6), tạo dung dịch keo trong,

có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 — 311 °C

Trong tự nhiên, chitosan rất hiếm gặp, chỉ có trong vách ở một số lớp vi nam và

ở vài loài côn trùng Sự deacetyl bằng kiềm, chitin tạo thành chitosan và tan đượctrong dung dịch acid acetic loãng.

1.2.3 Ứng dụng của chitin và chitosan

Theo một nghiên cứu Knidriet và ctv (2018), chitin là polysaccharide phong phú

thứ hai trên trái đất sau cellulose Chitosan là một dẫn xuất phổ biến của chitin đượctạo ra bằng phản ứng khử oxy hóa Do đặc tính sinh học và hóa học đặc biệt của nó,

chitosan đã thu hút sự chú ý rộng rãi đến các dự án nghiên cứu trên toàn thế giới và

có thể được sử dụng trong nhiều ứng dụng công nghiệp và y sinh, từ phân phối thuốc

và mỹ phâm đến chế biến thực phẩm và nông nghiệp

Chitin và chitosan đều được quan tâm, chủ yếu về lĩnh vực thương mại, nhờ vap

tỷ lệ nitơ cao (6,89%) trong cau tạo, so với cellulose thay thế tông hợp (chỉ 1,25%)

Điều này khiến chitin trở thành chat chelating hữu ich Hầu hết các polyme ngày nay

là vật liệu tổng hợp, vì thế tính tương hợp sinh học và khả năng phân hủy sinh họccủa chúng bị giảm đi nhiều, so với các polyme có nguồn gốc tự nhiên như cellulose,chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng Tuy nhiên, những nguồn tự nhiên nàycũng thê hiện sự hạn chế trong khả năng phản ứng và khả năng xử lý và ứng dụng

Về mặt nay, chitin và chitosan được khuyến cáo là nguyên liệu phù hợp, bởi vì những

polyme tự nhiên này có các đặc tính tối ưu như tính tương hợp sinh học, khả năngphân hủy sinh học, không độc hại, khả năng hấp thụ,

Gần đây, người ta tập trung nhiều đến chitosan như là một nguồn polysaccharide

tiềm năng Mặc dù một số nỗ lực điều chế các dẫn xuất hữu ích của chitosan bằng

cách sửa đôi cấu trúc hóa học, nhưng lại rất ít đạt được độ hòa tan mong muốn trongdung môi hữu cơ nói chung và một số hệ dung môi hỗn hợp Trong khi đó, các điềuchỉnh trong chính cấu trúc chitin và chitosan đã giúp nâng cao khả năng hòa tan trongdung môi hữu cơ.

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan thích hợp được sử dụng không chi trongcác ứng dụng y sinh mà còn được sử dụng như một vật liệu phủ biopolymer tự nhiên

dé bảo quan chất lượng và kéo dài thời hạn sử dụng của thực phẩm tươi sống Manghoạt tính dựa trên chitosan chống lại sự ô nhiễm và hư hỏng đo vi sinh vật đã được

sử dụng thành công trong bao bì trái cây, rau, trứng và thịt (Dehnad, 2014).

Chitosan cũng cho thấy tiềm năng tuyệt vời trong việc băng bó vết thương.Trước đây, chitosan có tiềm năng làm thuốc bôi cam máu cho các mô động vật:chitosan bám vào các tế bào hồng cầu, do đó lấy tiêu cầu để ngưng kết (Stricker,2018) Trong mỹ phẩm, chitosan được ứng dụng trong sản xuất kem và nước dưỡng

da Nó được sử dụng như một chất giữ 4m va bảo vệ da khỏi tia UV (Casadidio,

2019) Một ứng dụng khác của chitosan là trong xử lý nước thai, nơi nó được sử dụng

như một chất kết tụ nhờ khả năng chelation các cation va hap thụ các phan tử chấtthai từ nước, chang hạn như kim loại nặng (Pinotti, 2001) Nó được sử dụng trong vailàm việc cho bệnh viện hoặc phòng thí nghiệm sinh học và để làm chỉ khâu, chỉ vàsợi trong hang dét y té (Hahn, 2019) Chitosan cũng được sử dung để hoàn thiệnchống tĩnh điện trong quần áo làm việc cho nhân viên trong lĩnh vực điện tử (Xiao,2018).

Ngoài động vật giáp xác và nắm, côn trùng là một nguồn chitin và chitosan đầy

hứa hẹn và bền vững, mặc dù trước đây chúng chưa được chú ý nhiều Côn trùng cómột sô ưu điểm so với động vật giáp xác, vì chúng không phải theo mùa va có thé dé

đàng sinh sản nhờ khả năng sinh sản và tỷ lệ sinh sản cao; hơn nữa, các cơ sở nuôi

côn trùng dang được ra mắt trên toàn thế giới Dang chú ý, dé quản lý chất thai hữu

cơ và sản xuất thức ăn gia súc, côn trùng có thé được khai thác như một sự thay thế

hợp lệ cho động vật giáp xác như một nguồn cung cấp chitin và chitosan đề tăng tínhbền vững về kinh tế và sinh thái

Chitosan có nhiều ứng dụng trong thương mại và y sinh Nó có thê được dùngtrong nông nghiệp với vai trò xử lý hạt giống và Thuốc trừ dịch hại sinh học, giúpcây trồng chống lại các loại bệnh do nam Trong sản xuất rượu vang, nó có thé được

sử dụng như là tác nhân lọc cặn và bảo quản Trong công nghiệp, nó có thể được sửdụng trong sơn tự làm liền vết trầy xước polyurethane Trong y học, nó có thé được

ứng dụng trong băng gạc y tế dé làm giảm chảy máu và chống nhiễm khuẩn; truyềntải thuốc qua da.

Một ứng dụng khác còn gây tranh cãi là, chitosan được xác nhận là có tác dụng

hạn chế việc hấp thu chất béo, tạo tiềm năng lớn cho các sản phẩm giảm béo tuy nhiên

cũng có những bằng chứng phủ nhận điều này

1.3 Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng là phương pháp thống kê sử dụng các dữ liệu địnhlượng từ các thí nghiệm dé xác định và giải thích nhiều biến phương trình RSM khámphá các mối quan hệ giữa các biến giải thích và một hay nhiều biến phản ứng Phương

pháp này đã được giới thiệu bởi GEP Box va KB Wilson vào năm 1951.

Ý tưởng chính là sử dụng các chuỗi các thí nghiệm được thiết kế để có một phản

ứng tôi ưu Đề làm điều này, Box va Wilson đã sử dụng một mô hình đa thức bậc hai

Mô hình này chỉ là x4p xi nhưng lại tương đối dé dang áp dụng

Nguyên tắc: Trong trường hợp chung, người ta gọi là bề mặt đáp ứng, đại diện

hình học hàm mục tiêu của một quá trình vật lý không gian — thời gian ngẫu nhiên

cho những biến kích thích Đặc tính được nghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quảcủa sự chuyên đổi bằng một chức năng đáp ứng rõ rang (hay còn gọi là chức năngchuyền đổi) Sự thay đối giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay đổi chứcnăng của hàm mục tiêu Những mô hình thí nghiệm của RSM lưu ý đến sự lựa chọncác biến kích thích, xác định các giai đoạn quan sát và tính toán sai số Những biếnđầu vào Xi (i = 1 n) cũng được gọi là những biến cơ sở chúng được đặc trưng bởimột loạt các thông tin thống kê (chức năng phân phối độc lập hoặc trương quan, cơhội chuẩn hóa ) Trong trường hợp chung, các biến Xi là những biến thay đối theokhông gian và thời gian.

Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thí nghiệm được sử dụng để tiến hành

tối ưu hóa bằng phương pháp quy hoạch mô hình Box — Behnken Số lượng thínghiệm cần thực hiện theo phương pháp đáp ứng bề mặt được tính theo công thức:N= 2 + 2k+no Trong đó, N là số thí nghiệm, k là số yếu tố ảnh hưởng và no là số

thí nghiệm ở tâm Phân tích thống kê cho thấy mô hình thống kê biểu diễn sự phụthuộc Hàm mục tiêu Y vào các điều kiện ảnh hưởng được mã hoá là một phương trình

Xi nhân tổ độc lập thứ i ảnh hưởng đến hàm mục tiêu Y

Bi : hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố Xi tới hàm mục tiêu Y

Bii: hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng của yếu tổ Xi tới Y

Bij: hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời của Xi và Xj với YSau khi thực hiện N số thí nghiệm, tiến hành xử lý thống kê với phần mềmRSM Giá trị p của mô hình với (p < 0,05) cho thay mô hình đã chọn có ý nghĩa vaphù hợp khi tién hành thực nghiệm và thông số Adeq Precision lớn hơn 4 là cần thiết.Đồng thời, đánh giá sự thiếu phù hợp của mô hình (Lack-of-fit) được xác định vớigiá trị P > 0,05, do đó có thé khang định rằng mô hình phù hợp với dit liệu được thuthập ở mức tin cậy 95 % Từ đó sẽ cho ra mô hình hồi quy đa chiều mô tả mối quan

hệ giữa các biến độc lập và hàm mục tiêu được thiết lập, bên cạnh đó Guan và Yao(2008) cho rằng mô hình tương quan được đánh giá tốt khi hệ số xác định tương quanR? lớn hơn 0,8 Đã xác định mô hình đã chọn có ý nghĩa và phù hợp thì tiến hànhthực nghiệm dé kiểm tra, nếu kết quả thực nghiệm phù hợp với dự đoán, từ đó đưa ra

điều kiện tối ưu của thí nghiệm

Công dụng của RSM như: Xác định các mức yếu té làm thỏa mãn đồng thời cácthông số kỹ thuật mong muốn; kết hợp tối ưu hóa cho các yếu tố dé cho ra kết quảmong muốn đạt được và mô tả kết quả tối ưu; cho ra các kết quả đặc trưng khi nó bịảnh hưởng bởi những thay đối của các yếu tố vượt quá mức quan tâm Các mô hình

được sử dụng nhiều của RSM là thiết kế Box-Behnken (BBD)

1.4 Enzyme alcalase

Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học do

tế bảo sống tiết ra có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh Các quátrình hóa học xảy ra trong cơ thê là những phản ứng có hiệu quả cao là nhờ tác dụngxúc tác của enzyme.

Protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide trong phân

tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin Ngoài ra, có

nhiều protease còn có khả năng phân hủy liên kết este và vận chuyển acid amin.Protease trong quá trình thủy phân sẽ cắt protein ở hai vị trí: cắt từ bên ngoài cắt vàotrong và cắt từ bên trong ra bên ngoài, do đó, protease được chia làm hai nhóm:

exopeptidase va endopeptidase Exopeptidase được chia làm hai loại dựa trên vi trí

tác động trên mạch polypeptide: Aminopeptidase liên kết peptide ở đầu N tự do củachuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino aicd, một dipeptide hoặc tripeptide

Carboxypeptidase liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra

một amino aicd hoặc một dipeptide Endopeptidase cắt protein từ trong ra ngoài Dựavào động học của cơ chế xúc tác, nhóm này được chia làm bốn nhóm nhỏ: Serinprotease là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động

và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác enzyme Nhóm này baogồm hai nhóm nhỏ là chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm cácenzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai

enzyme vi khuẩn: subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN Các serine protease thườnghoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

Cysteine protease là những protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động baogồm các protease thực vật như papain, bromelin, protease động vật và ký sinh trùng.Các cysteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính có tính đặc hiệu cơ chấtrộng Aspartic protease là những protease thuộc nhóm pepsin bao gồm các enzyme

tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Thường chứa các nhóm carboxyl

trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính Metalloprotease là những protease tìm thấy ở vi khuẩn, nam mốc và thường hoạt động vùng

pH trung tính và hoạt động giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA Ngoài ra, protease còn được phân loại thành ba nhóm dựa trên môi trường pH: Protease acid: pH đạt từ

2 —4 ; Protease trung tinh: pH đạt từ 7 — 8 ; Protease kiềm: pH đạt từ 9 — 11

Enzyme Alcalase là một loại enzyme protease hiệu qua Enzyme alcalase là mộtloại enzyme thủy phan protein được tách chiết từ Bacillus licheniformis có trọnglượng phân tử 27300 Chúng có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử

(endopeptidase) để chuyên phân tử protein thành các đoạn peptide Nhiệt độ tối ưu

cho Alcalase từ 55°C đến 70°C, pH tối ưu là 6,5 - 8,5 Nhờ khả năng thủy phânprotein và tạo ra các loại protein thủy phân Alcalase là một chế phẩm sinh học hữuích trong ngành công nghiệp thực phẩm và chế biến protein Enzyme Alcalase sẽ giúp

tôi ưu hóa quá trình sản xuât protein.

Enzyme Alcalase là một loại enzyme protease được sử dụng rộng rãi trong côngnghiệp thực phâm Một số ứng dụng chính của Enzyme Alcalase trong ngành thựcphẩm: Enzyme Alcalase có khả năng thủy phân protein trong thực phẩm Nó có théphân hủy các liên kết peptide trong protein, làm cho protein dé dang hòa tan và tạothành các hỗn hợp protein thủy phân có sự thay đổi về cấu trúc và tính chất chứcnăng Enzyme Alealase có thé được sử dụng dé tạo màu sắc và hương vị trong cácsản phẩm thực phẩm như mỳ gói, gia vị và nước mắm Enzyme này có khả năng tác

động lên các chất có sẵn trong thực phẩm đề tạo ra các hợp chất có màu sắc và hương

vị đặc biệt Enzyme Alcalase cũng được sử dụng để cải thiện sự phân giải proteintrong các sản phẩm thực pham như sữa, trứng và thịt Enzyme này có khả năng pha

vỡ protein thành các peptide nhỏ hơn, giúp cải thiện hấp thụ và tiêu hóa protein trong

cơ thé Bên cạnh đó enzyme Alcalase có thé được sử dụng trong quá trình chế biến

thực pham dé tăng cường quá trình tiêu hóa, tang cường hương vị và cau trúc của sảnphẩm, và giảm thời gian chế biến

1.5 Một số phương pháp nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết xuất chitin vàchitosan

1.5.1 Phương pháp hóa học

Mặc dù có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết xuất và ứng dụng của

chitin va chitosan Tuy nhiên cho đến nay hầu hết các nghiên cứu này chỉ tập trung

vào chiết xuất chitin và chitosan từ giáp xác Chitosan thương mại cũng được thuchính từ vỏ tôm Chỉ có một số ít các công trình nghiên cứu thu nhận chitin và chitosan

từ các nguồn khác như cua, ghe, nam và mai mực Tại Việt Nam chưa có một côngtrình nghiên cứu nao về điều kiện chiết xuất chitin va chitosan từ Rudi lính đen

Qui trình sản xuất chitin thông thường gồm các công đoạn khử protein, khửkhoáng và tây màu Đối với công đoạn tây màu ở các nước nhiệt đới như Việt Namthường thực hiện kết hợp với quá trình phơi khô trực tiếp sản phẩm chitin dưới ánh

nang mặt trời Sau đó quá trình deacetyl chitin được thực hiện nhằm tách nhóm acetyl

thu nhận sản phâm chitosan (deacetylation) Hiện nay, tat cả các công đoạn trên cóthê thực hiện thông qua 3 phương pháp: Phương pháp hóa học, phương pháp sinh học

và phương pháp kết hợp hóa học và sinh học tùy theo loại nguyên liệu, công nghệ, vàyêu cầu về chất lượng sản phẩm chitin và chitosan mà các điều kiện xử lý sẽ khácnhau Bên cạnh đó các kỹ thuật vật lý như nghiền và khuấy được sử dụng song songvới hóa chât hoặc chât xúc tác.

Các quy trình hóa học, sử dụng các dung dịch axit và kiềm, hiện đang được ápdụng nhiều nhất trên quy mô công nghiệp đề sản xuất một lượng lớn chitin và chitosan

từ vỏ giáp xác (Kim, 2005) Thông thường, xử lý hóa học cung cấp chitin va chitosantinh khiết, mặc dù nó tạo ra khối lượng lớn chất thải do nồng độ hóa chất được sửdung cao Phương pháp hóa học dé chiết xuất chitin từ bộ xương ngoài côn trùng

tương tự như phương pháp sử dụng cho các nguồn biển và bao gồm hai bước: khử

khoáng và loại bỏ protein Trong bước đầu tiên, các khoáng chất có trong lớp biểu bì

được loại bỏ bằng axit pha loãng Các axit khoáng khác nhau (ví dụ axit clohydric)

hoặc axit hữu cơ (ví dụ axit axetic) có thể được sử dụng cho mục đích này Việc loại

bỏ các protein được thực hiện với phương pháp xử lý kiềm, chủ yếu áp dụng dungdịch natri hydroxit pha loãng Xử lý thoái hóa protein đồng thời có thể chiết xuất mộtphần thuốc nhuộm và lipid hòa tan có trong bộ xương ngoài Đối với vỏ tôm, quátrình tinh chế hai bước có thé được thực hiện theo thứ tự ngược lại mà không ảnh

hưởng đến các đặc tinh của chitin (Mohammed, 2013) Một bước tay trắng bé sung

có thé được thực hiện để loại bỏ các sắc tố còn sót lại và cải thiện màu sắc của kitintỉnh khiết, sử dụng thuốc thử như natri hypoclorit, axeton và hydro peroxyt

Khử khoáng: Vỏ giáp xác chứa một lượng lớn chất khoáng, có thé lên đến 50%trong vỏ cua và tôm Ngược lai, côn trùng có hàm lượng khoáng chất thấp hơn nhiều,thường dao động từ 2 đến 10% đối với toàn bộ côn trùng Tuy nhiên, giá trị này thay

đổi tùy theo loài và giai đoạn phát triển (Finke, 2013) Quá trình khử khoáng của các

mẫu côn trùng bao gồm sự phân hủy các khoáng chất thành các muối hòa tan trongnước tương ứng của chúng Các muối hòa tan có thé được tách ra khỏi chitin bằngcách lọc và rửa pha rắn Xử lý bằng axit cũng giải phóng các hợp chất catechol vàdẫn đến sự đối màu nhẹ của sinh khối Quá trình khử khoáng có thé bị anh hưởng bởiloại và nồng độ axit được sử dụng, thời gian và nhiệt độ xử lý, kích thước hạt củamẫu và tỷ lệ chất tan trên dung môi Axit clohydric là thuốc thử được ưa thích nhất

được sử dụng dé khử khoáng các bộ xương ngoài côn trùng Axit clohydric cũng là

một trong những axit được sử dụng rộng rãi nhất dé khử khoáng cho vỏ giáp xác ởquy mô công nghiệp Do tác động môi trường cao, axit clohiđric đã được thay thếtrong nhiều trường hợp bằng axit hữu cơ Hơn nữa, axit clohydric có thể có tác độngbat lợi đến cau trúc và thành phan hóa học của chitin

Thời gian xử lý khử khoáng thường ngắn Phạm vi nhiệt độ được sử dụng dé

khử khoáng rất khác nhau từ nhiệt độ phòng đến 100°C Nhiệt độ cao được sử dungtrong thời gian rất ngắn (20 — 30 phút) theo báo cáo của Kaya và ctv (2015) Ngược

lại, thời gian xử lý dài hơn (12 — 24 giờ) được áp dụng cho các quá trình ủ được thực

hiện ở nhiệt độ phòng (Shin và ctv, 2019) Nhiệt độ cao thúc đây sự xâm nhập của

dung môi vào chất nền chitin; tuy nhiên, chúng có thé gây ra sự phân huỷ polyme

Zhou và ctv (2019) đạt được hiệu suất khử khoáng rất cao (86 — 98%) sử dụng dung

môi eutectic trên Rudi lính đen Trong số các axit hữu cơ được sử dụng, axit oxalic,được sử dụng bởi Ibitoyeet và ctv (2018) dẫn đến mức độ khử khoáng cao hơn so với

bao cáo của Kim va ctv (2017) với axit clohydric, mặc dù có sử dụng nồng độ axIt

oxalic thấp hơn Hiệu quả khử khoáng cho vỏ ấu trùng Rudi lính đen, được nghiên

cứu bởi Hahn và ctv (2020) tương tự như Ibitoye va ctv (2018) sử dụng axit fomic.Các axit hữu cơ, cụ thé là axit lactic, axit axetic và axit oxalic, có thé là một thay thếhợp lệ cho axit clohydric dé khử khoáng trong sinh khối côn trùng Việc sử dụng cácaxit hữu cơ cũng mang lại những lợi ích khác vì chúng it gây hại cho môi trường, cóthé bảo tồn các đặc tính của chitin tinh khiết, có thể được sản xuất từ sinh khối vớichi phí thấp và các muối hữu cơ chiết xuất được có thể được sử dụng cho các ứngdụng khác (Mahmoud và ctv, 2007) đó chính là ưu điểm nổi bật của phương pháp.Khi các khoáng chất đã được hòa tan và loại bỏ, sinh khối côn trùng được rửa bằng

nước cất cho đến khi độ pH của nó được phục hồi về mức trung tính Sau bước trung

hòa, các mẫu côn trùng được khử protein

Youn và cộng sự (2012, 2013) đã có những nghiên cứu khá đầy đủ về thu nhậnchitin va chitosan từ mai mực Todarodes pacifica thu tai Han Quốc Điều kiện tối ưucho quá trình thu nhận chitin: khử protein trong dung dịch NaOH 3%, thời gian 30phút, nhiệt độ 121 °C, áp suất 15 psi, ty lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10; khử khoángtrong dung dich HCI 1N, thời gian 30 phút, nhiệt độ phòng, tỷ lệ nguyên liệu/dungđịch là 1/10 Chitin thu được có hàm lượng protein (6,29% Nitơ) và khoáng thấp (0,25

%) Điều kiện deacteyl thu nhận chitosan: dung dich NaOH 35 45%, thời gian 15

-60 phút, nhiệt độ 121 °C, áp suất 15 psi, ty lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10 Độdeacetyl của chitosan thu được là 87,1 - 96,2% Mặc dù, san phẩm thu được có chấtlượng tốt nhưng do quá trình xử lý ở nhiệt độ (121 °C) va áp suất cao (15 psi), có khửkhoáng bằng HCI sẽ dé dẫn đến cắt mạch chitin va chitosan, đồng thời khó khan khi

áp dụng sản xuất ở qui mô công nghiệp Trước quá trình tinh chế chitin, các mẫu côntrùng thường được xử lý sơ bộ Tiền xử lý bao gồm làm sạch bằng cách rửa bằng

nước và chất tây rửa, làm khô trong tủ sấy hoặc ở nhiệt độ môi trường và nghiền

thành bột dé tăng kha năng tiếp cận với các tác nhân hóa học Kích thước hạt thấphơn 200 — 250 ym là thích hợp dé tinh chế chitin (Mehranian và ctv, 2017) Có théphải thực hiện bước loại bỏ chất béo, đặc biệt là đối với những mẫu côn trùng giàulipid, chang hạn như toàn bộ ấu trùng Au trùng có thé được đun sôi và đưa qua máy

din hoặc máy ép dầu dé tach chitin chưa tinh khiết ra khỏi phan chất lỏng, chứa chủ

yếu là lipid và một số protein (Huet và ctv, 2020)