Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu truy xuất phả hệ quần đàn cá tra (Pangasianodon hyphophthalmus) chọn giống bằng chỉ thị phân tử microsatellite

Đến nay, sử dụng các chỉ thị phân tử cho truy xuất phả hệ đang gia tăng trong các chương trình chọn giống thủy sảnVandeputte và ctv, 2011 vì khắc phục được các nhược điểm của dấu từ PIT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM TP HO CHÍ MINH

LÊ THỊ TRINH

NGHIÊN CỨU TRUY XUẤT PHA HE QUAN ĐÀN

CÁ TRA (Pangasianodon hyphophthalmus) CHỌN GIONG

BANG CHỈ THI PHAN TU MICROSATELLITE

LUAN VAN THAC SI CONG NGHE SINH HOC

TP Hồ Chi Minh, tháng 10 năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM TP HO CHÍ MINH

LÊ THỊ TRINH

NGHIÊN CỨU TRUY XUẤT PHA HE QUAN ĐÀN

CA TRA (Pangasianodon hyphophthalmus) CHỌN GIONG

BANG CHỈ THI PHAN TU MICROSATELLITE

Chuyén nganh: Céng nghé Sinh hoc

Hội dong cham luận văn:

1.

NGHIÊN CỨU TRUY XUẤT PHA HE QUAN ĐÀN CÁ TRA

(Pangasianodon hyphophthalmus) CHỌN GIONG BANG

TS NGUYÊN NGỌC TAN

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

TS NGÔ HUỲNH PHƯƠNG THẢO

Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM

TS NGUYÊN THỊ NGỌC TĨNHViện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

Dai học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.

Địa chỉ liên lạc: 71/3/12 đường Phú Thọ Hòa, phường Phú Thọ Hòa, quậnTân Phú, Thành phó Hồ Chí Minh

Điện thoại: 0963 817 022

Email: letrinhhcmue@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong nghiên cứu này là trung thực và mộtphần kết quả trong nghiên cứu thuộc dé tài ‘Ung dụng công nghệ sinh học chọn

giống cá tra kháng bệnh gan thận mủ", thuộc Dé án “Phát triển và ứng dụng Công

nghệ Sinh học trong lĩnh vực thủy sản đến năm 2020 - Bộ Nông Nghiệp và Pháttriển Nông thôn” va dé tài “Cung cấp cá tra chọn giống cho người dân đồng bằngsông Cửu Long”, thuộc chương trình VLIR - OUS, mã số đề tài SI - 2019 - 01 - 26.Những số liệu trong luận án được phép công bố với sự đồng ý của các chủ nhiệm

đề tài Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn này chưa từng được tác giả

khác công bồ trong bat kì công trình nào khác

(Ký tên và ghi rõ họ và tên HV)

LỜI CẢM ƠN

Con xin chân thành cảm ơn gia đình vì luôn là nguồn động lực lớn lao giúpcon có thé vượt qua được những khó khăn trong học tập và cuộc sống Con sẽ tiếptục có gắng nhiều hon dé cống hiến cho gia đình và đất nước

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc từ tận đáy lòng đến thay Nguyễn Văn Sáng người thầy kính yêu đã tận tâm hướng dẫn từng bước, từng chi tiết, truyền đạtnhững kiến thức, kinh nghiệm và không ngừng động viên em trong suốt thời gianthực hiện và hoàn chỉnh đề tài này Kính chúc thầy sức khỏe và đạt nhiều thành tựu

-trong sự nghiệp nghiên cứu và giảng dạy.

Tiếp theo, em sẽ không thể hoàn thành luận văn này nếu không có sự hướng

dẫn, hỗ trợ và động viên của cô Trần Thị Phương Dung và anh Nguyễn Hoàng

Thông Chúc cô va anh sức khỏe và thành công trong công việc, cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, cùng toàn thé quý thầy cô trong khoaKhoa học Sinh học, Phòng Sau Đại học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí

Minh và toàn thé cán bộ công nhân viên nhà trường Thầy Cô đã nhiệt huyết va tận

tình trong giảng dạy giúp cho em có được nhiều những kiến thức quý báu trong suốt

"Research on pedigree tracing of striped catfish populations (Pangasianodon

hypophthalmus) selected based on microsatellite DNA markers" were carried out

and achieved main following results:

(i) Evaluation of genetic diversity involved the use of 08 microsatellite loci

on 50 families of full - sib and half - sib (9 - 10 juveniles/family), totaling 40 fathers, 50 mothers and 495 juveniles Fin samples from broodstock, muscle in juveniles were collected for the analysis The samples were subjected to multiplex PCR with fluorescent primers, and allele data were analyzed using the 3500 Genetic Analyzer system The results demonstrated an optimized PCR efficiency of 98.4%

to 100% The number of alleles at each locus ranged from 8 to 21, with an average number of alleles per locus reaching 13.88 The average values of He, Ho, and PIC index were 0.780, 0.741, and 0.756, respectively Consequently, all 08 microsatellite markers in this study were found to be polymorphic, fulfilling the

requirements for pedigree retrieval.

(1) Pedigree retrieval was conducted using the set of 08 microsatellites combined into 01 set of multiplex PCR primers The study explored the removal of some markers, namely Pahy - 05 and Pahy - 14, which exhibited reduced retrieval efficiency based on null - allele, PIC, Ho, and He parameters The results indicated

that the set consisting of all 08 microsatellites remained the optimal choice, with a

high accurate retrieval rate of both parents in all families (93.53%) This accuracy

was particularly noteworthy in the group of father-son families with half - sib,

where the accurate retrieval of both father and mother fish stood at 92.42% Consequently, these 08 microsatellite indicators can be effectively applied to trace the pedigree of juveniles according to their parents, replacing the marker method from PIT and serving as a valuable tool for trait assessment in striped catfish breeding.

TÓM TAT

Đề tài “Nghiên cứu truy xuất phả hệ quần đàn cá tra (Pangasianodonhyphophthalmus) chọn giỗng bang chỉ thi phân tử microsatellite” đã thực hiện vàđạt được những kết quả như sau:

() Đánh giá đa dạng di truyền bằng bộ 08 chỉ thi microsatellite trên 50 gia

đình cá tra full - sib va half - sib với 9 đến 10 cá con mỗi gia đình, tổng cộng 40 cá

bó, 50 cá mẹ và 495 cá con Các mau cá tra được thu nhận (mau vây ở cá bố mẹ, cơthịt với cá con), sau đó được li trích và thực hiện multiplex PCR với các môi có gắn

huỳnh quang và phân tích dữ liệu kiêu alen bằng phương pháp phân tích đoạn trên

hệ thống máy 3500 Genetic Analyzer Kết quả cho thấy, hiệu suất PCR sau khi tối

ưu các thành phần phản ứng PCR của bộ 08 chỉ thị microsatellite đạt yêu cầu là 98,4

- 100%, số lượng alen của từng chỉ thị dao động từ 8 - 21 alen, số alen trungbinh/chi thị đạt 13,88 Chi số He, Ho va PIC trung bình lần lượt là 0,780, 0,741 và0,756 Vi vậy, bộ 08 chỉ thi microsatellite trong nghiên cứu này đều đa hình đápứng được các yêu cầu dé được sử dụng trong truy xuất pha hệ

(ii) Truy xuất pha hệ với 08 microsatellite kết hợp thành 01 bộ mỗi multiplexPCR Nghiên cứu có thử nghiệm loại bỏ một số chỉ thị là Pahy - 05 và Pahy - 14 cókha năng làm giảm hiệu quả truy xuất dựa trên các thông số null - alen, PIC, He và

Ho Kết qua cho thấy, bộ chỉ thị gồm 08 microsatellite van là lựa chọn tối ưu với tỉ

lệ truy xuất chính xác cả bố và mẹ trong tất cả các gia đình cao (93,53%), đặc biệt ởnhóm gia đình con bố có half - sib, kết quả truy xuất chính xác cả cá bố và mẹ van ởmức cao (92,42%) Do đó, 08 chỉ thị microsatellite trên có thể ứng dụng vào truyxuất phả hệ các cá thể cá con theo bố mẹ nhằm hỗ trợ đánh gia tính trạng cho chọngiông cá tra.

MỤC LỤC

TRANG Trang tựa

TTPAHE:CHUH TŸ' sannsseonessgosotioostci993SBEESSESSMS.IS.SRSNSHPTIBSGSEEDSRSSEUDBESBĐBSJESE'IBSPBIVGESNSHSISE280010G0238123848 1 JD/01101)NG211111g115.5,556.G08.02/5.E6002uZE00090uEbEb2tS:2Löl05.08003.2000,jLl.b.8s6.Eio.jeffa.EuESBEE.jsfi/SE2.0usjuffBBjo.S4 1

GG CR ĐỂ Hi san gánh con season arava cn ssa consid 2h ln38hSb2823068338138588ù308.4830.0888888.081g626064018g338083u.800n88 11 POCA Ole ee ee 1V

¿2777/07/0000 gggg11111 meneame seracenuaarerammssercersrimnencin 1Chương 1 TONG QUUANN - 5< 5< 5< 5s£Ss+EeeEeEeEerxerserkerserserserserserserssrsee 31.1 Tổng quan về cá tra (Pangasianodon hypophthaliwas) -5 52©-2e-sz 31.1.1 Đặc điểm sinh học và giá trị của cá tra -2 2ccscssrxerserserserserceecc Ö1.1.1.1 Đặc điểm sinh học và môi trường sống -2 2252252z5czzcszsc-~31.1.1.2 Đặc điểm dinh đưỡng - 2-2 SSS+SE22E£2E2EEE2E221221221221212212212121 2e 31.1.1.3 Dac 0n oo 234 4

1.1.]1:5 Giá trí đỉnh:dưỡng:G Wal C8 WseeessetsebebisgdLSEHUAGDEOREELEGISSyfteSiooahsigosstsesaasl 4

1.2 Tình hình nuôi và chất lượng giống cá tra tại Việt Nam -5 51.3 Tổng quan chương trình chọn giống thủy sản -2- 2252222zz22+2zzzex 3

1.3.1 Chương trình chọn giống thủy sản trên thế giới - 2222 25525522 5

1.3.2 Chương trình chọn giống thủy sản ở Việt Nam 2 2252222222222 61.3.3 Chương trình chọn giống cá tra của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản

| ee eee 7

1.4 Tổng quan về truy xuất pha hệ trong nuôi trồng thuỷ sản . - §

1.4.1 Nguyên tắc cơ bản của truy xuất pla hệ - 2-22 2222222222E22E222xczzzzzxez 8

1.4.2 Ý nghĩa của truy xuất pha hệ bằng chi thị phân tử -. -2-=5- 91.4.3 Cáo bước chính trong truy xuất nhà hỆ cacsscccncoansasnooneraannnnenesnvennnnnamnerccnnanes 101.4.4 Chỉ thị phân tử sử dụng trong truy xuất pha hệ trên thủy sản 10

1.4.5 Chi thị phân tử MicrosatelÏite cesses cee S2 2222 2e 11

1.4.5.1 Ưu điểm và hạn chế của phương pháp microsatellite -5 5- 13

1.4.5.2 Phân tích thống kê dir liệu microsatellite 2 2- 22222z22z++2szz2zzzex 141.4.6 Kĩ thuật Multiplex PCR trong truy xuất pha hệ 2-22 225222222: 15

1.4.7 Điện di mao quản và đánh dấu huỳnh quang 2 22©2z+2+22z222z£‡ 18

1.4.7.1 Dig oi na 18

1.4.7.2 Đánh dâu huỳnh quang - 2-22 222222SE22E2EE22E22EE22E22212212222221 22222 21

1.4.8 Một số phương pháp tính toán sử dung trong truy xuất pha hệ 211.4.9 Một số phan mềm dùng cho truy xuất pha hệ -2 2-©22222222222z+222 231.4.9.1 Phần mềm CERVUS -22222¿¿222222++ttEEEErrrtrrtrrrrrrrrrrrrrrrrre 241.452 Phần nưềm TOI cc-e.cL2A.EEZ2 227223202CcgE3g-2re2g4g22.c2: 251.4.10 Đánh giá năng lực truy xuất pha hệ 2-22 222222+22zz2E+2Exzzxzzzcree 351.4.11 Một số van đề lưu ý khi truy xuất pha hệ bang chỉ thị phân tử 251.4.12 Một số nghiên cứu về truy xuất phả hệ sử dụng chỉ thị microsatellite trên

2.3) Vat Lien THHIỆTCỮN sec ony S2095612322354185855001GH8503525580ix9815g9298S09Sg1.08.5.00008000880/238:98803 30

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 222222222 222z22EzEerrrrrerrrrrrrrrrrrrre 30

"9000: 0i91 2/000 Ả 30

2.3.3 Cách lựa chọn loại màu huỳnh quang đánh dấu cho mồii - 31

2.3.4 Hóa chat, thiết bị và dụng cụ 22- 2 ©2222222222E222122122E1221211221 21.22 cze 33

15, 1/215 (PC: rongrpottspneitigdsbsioptpotrbgicp'tiioi0gfS0195000033/31002003E-H108ginSESSSBMigo3iliidisttSlLCHGEDESMDHUIEGHDEMERĐĐUO0EEĐS 33 2.3.4.3 Dién di mao Quan nh ố cece 33

2A Phitons phap NSHEH CW TƯ“ 34

2.4.1 Phuong pháp đánh giá da dạng di truyền quan thé chọn giống bang chi thị

2.4.1.1 Phuong phap thu mau, tach chiét DNA tong số, PCR, điện di mao quan va

ghi nhầu sẵn A as enmnc sa omnnnconinnncntnronme snares onsinen ecomanincdononionans 34

2.4.1.2 Đánh giá da dang di truyền quan thé chon giống và đánh giá các

microsatellite phù hợp cho truy xuất pha hệ 2-22 225522522522 382.4.2.3 Phương pháp phân tích dữ liệu alen, đánh giá đa dang di truyền quan thé

chọn giống a) Phương pháp phân tích dữ liệu alen bằng phần mềm

CEHGINISDIEE - << HH HH0 0 0000100000000 40

2.4.2 Phương pháp phân tích truy xuất phả hệ và mô phỏng khả năng truy xuất 432.4.2.1 Phương pháp truy xuất phả hệ sử dụng bộ chỉ thị microsatellite bằng phần

Le), ongoaeooeohnggpgedtooeotdinipsttdipttddtĐN0.010053292060387800:02360060000/0080:800gn:0i 432.4.2.2 Mô phỏng kha năng truy xuất pha hệ sử dụng bộ chỉ thị phân tử

microsatellite bằng phần mềm CERVUS -2- 2-22 52222222z2zzz>5+2 47

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -5-cs<©s<ccecsecsersrs 49

3.1 Đánh giá đa dang di truyền qua thé chọn giống bằng bộ chi thi microsatellite.493.1.1 Đánh giá tính ôn định của bộ mierosatellite - 2 2 2+z2s+zz+zzzzzcxzz 493.1.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng 86 2- 2-22222222E22E22EE22E22EE2E222zcze2 493.1.1.2 Kết quả ghi nhận dữ liệu alen 2- 2 52222222E2EE2EE2EE+EErzzrzrrrree 503.1.1.3 Kết quả khảo sát tinh ổn định của các microsatellite -2 5- 533.1.2 Kết quả đánh giá da dang di truyền và xác định tính đa hình của bộ

microsatellite trên quan thé nghiên cứu -2- 222++22+222++2z++2z+z 543.1.2.1 Số lượng alen và kiểm tra cân bang Hardy-Weinberg 2-5- 54

3.1.2.2 Hệ số Ho, He, PIC, tần số mull - alen 2-22 2+2£2+££E+2+E++E+£zz+zzzzez 573.1.2.3 Khảo sát sự phân bồ tần số alen của 08 chi thị microsatellite trong quần

Ki 0E] TNÏ Errgaaaarrrrraggrrortteaootoiyntyouyprnyyngrpgigeetogg0iS9800 ydgg 59

3.2 Kết quả truy xuất phả hệ trên quần thể chọn giống sử dụng bộ chỉ thị

microsatellite bằng phần mềm COLONY 2 22©222©2222++2xz2z+zzzzex 633.2.1 Kết quả truy xuất pha hệ sử dụng bộ 08 microsatellite và 07 microsatellite 633.2.2 Kết quả truy xuất pha hệ theo cau trúc gia đình -. 2- 22222522 65

3.2.3 Mô phỏng kha năng truy xuất pha hệ sử dụng bộ chỉ thị phân tử

microsatellite bằng phần mềm CERVUS 2-2¿ 22222+2+z2zz22zz<2 66

3.2.4 Đánh giá năng lực truy xuất của từng chi thị trong bộ 08 microsatellite 67KẾT T.UẬN VÀ BH GIT scssnsserecsnaxasensonaxanvsansnsccesnnssasnesoncannnnaanansneanonansnnmasaxaesnscene 69

TẤT T.IỆU THÊM BA eeeeeeeeeeesdenininoisongtiaiiisgtisiasiggig40040036660.1201921005E 70

PHU Long csngg6n0610146556503683655553E5ESSEXEENSEESXESGESSXGEXHEGGEERSESSESSIEEGSE60313486E 80

DANH MUC CHU VIET TAT

Polymorphic Information Content - Thông tin da hình

Passive Integrated Transponder - Đánh dau từNumber of observed alleles - Số lượng alen quan sátAllele Frequency - Tan sé alen

Alen ao Expected heterozygosity - DỊ hop tử mong đợi Observed heterozygosity - Di hop tu quan sat Basepair - Cap bazo

Kilobase - Ki 16 bazo

Cong tac vién

Polymerase Chain Reaction - Phan tng nhan ban DNA

Simple sequence repeat - Doan có trình tự đơn lap lại

National Center for Biotechnology Information, US.

National Library of Medicine - Trung tém quéc gia vé théng

tin công nghệ sinh hoc, Mỹ Viet Nam Association of Seafood Exporters and Producers -

Hiệp hội Chế biến và Xuất khâu Thủy sản Việt Nam

Estimated Breeding Value - Giá trị chọn giống ước tínhLeast Square Means - Trung bình bình phương tối thiểuAmplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiềudài đoạn khuếch đại

Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều

dài đoạn cắt giới hạn

Deoxyribonucleic acid Deoxynucleotide triphosphate Ethylenediaminetetraacetic acid

Số lỗi sai khi thực hiện truy xuất

DANH SÁCH CAC BANG

BANG TRANGBảng 1.1 Các bộ microsatellite được phát trién trong phản ứng multiplex PCR

được sử dụng trên thủy sản c5 2c s 2s ri re 16Bảng 1.2 Tóm tắt một số phần mềm phù hợp đề truy xuất phả hệ trên các loài

thủy sản (trích dẫn bởi Yue va Xia, 2014) 2-2 2522sz2z2zzzzs+2 23

Bảng 2.1 Danh sách các microsatellite được sử dụng trong nghiên cứu 32 Bảng 2.2 Đại diện thông tin mã hóa cho cá bô, cá mẹ và cá con của gia đình

full -sib và gia đình half - s1Ö - eee cee eeeeeeeeeeeeeeeeeeeseeneeeeeeeeees 35

Bang 2.3 Thành phan thể tích trong phản ứng multiplex PCR 37Bang 2.4 Chu trình phản ứng multiplex PCT -5+-<+<<<+eczeezxeseeexeee2 7

Bảng 3.1 Hiệu suất PCR của 08 microsatellite - 22 52552 2s+2z2z2zzzzzzzzse2 53

Bang 3.2 Thông tin da dang di truyền chung của 8 microsatellite trên 50 gia

đình tong nghiÊH.GỨU e.eeiiiiidkkeikAlkesiedlkeiiEdkioiikiilbDideciil ii 56

Bang 3.3 Kết qua xác định pha hệ 50 gia đình cá tra chon giống bang 08

microsatellite và 07 microsateÏÏIfe - -+-+++<=++<++ecezeezerrzeexee 63Bảng 3.4 Kết quả truy xuất chia theo hai nhóm gia đình - 222552552 65Bang 3.5 Khả năng truy xuất pha hệ mô phỏng 2222©2225222+2z2222Sz>22 66

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANGHình 1.1 Nguyên tắc trong truy xuất phả hệ Cá thể con thứ hai có hai alen

108 và 116 kế thừa từ alen của bố mẹ nên là con của cặp bố mẹ 8

Hình 1.2 Cac trình tự lặp đoạn của các alen thuộc một microsatellite 12

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả các bước phân tách và phát hiện các alen microsatellite

với hệ thống máy điện di mao quản của hãng Applied Biosystems 20Hình 1.4 Phố phát xạ của năm loại thuốc nhuộm huỳnh quang hang Applied

Hình 2.1 Quy trình thực hiện đề tai eee ccc ecsessessessessesseseessessessessessesseeseees 29Hình 2.2 Thang chuan GenScan TM 500 LIZ® -2 25s+2sezsezsezsezss-s. .- 38

Hình 2.3 Biéu đồ hình ảnh của tất cả chỉ thị sau khi phân tích bằng phần mềm

Get Map TẾT ái ongesbinbiintilineSDEEnISRDINOLEIHEGBEGIRRNESOANESDTHEERSRdzSlisiliesisssaani 40

Hình 2.4 Biểu đồ hình anh tín hiệu của chỉ thị Pahy - 01 (mô tip lặp là 3

TÚE lGG(TUỂ TnooentngtitotdtitidDtVGĐlBGUS38G0E582083110830n86865014080836E1038880HE04022i5888930800388030sgol 41

Hình 2.5 Biéu đồ hình ảnh tín hiệu của chi thị Pahy - 06 (mô tip lặp là 2

TUG ICO TOE sac ssisnconncgi5-BiES0GLEDNGGHGEEECMGSSRBEGEELGGEBLENS: RAKGESSUEEESRHUoSoDUCiSkggfepoosisd 4l

Hình 2.6 Khai báo dữ liệu ban đầu cho phép phân tich -5 45Hình 2.7 Khai báo thông tin các chi thị microsatelÏite - - -<+-<+<+<<++ 45Hình 2.8 Khai báo dit liệu alen của các cá thể con - 2-22 5222s+2z+2zzzzz>s2 45Hình 2.9 Khai báo dữ liệu alen của các cá thé bố -2 2¿©2222sz2zz2czze: 45Hình 2.10 Khai bao dữ liệu aleñ của GÁG¡seasecaseesareiroianoattiagDidftdititOgitrsgtrgtissptaaaai 45Hình 2.11 Kết quả truy xuất xác định chỉ cá Đố -2- 22 22222Ez+E+£zz£zzzzzzez 46Hình 2.12 Kết quả truy xuất xác định cả cá bố và mẹ, 2 2 s+2z+zzcz+cx+2 46Hình 2.13 Khai báo dữ liệu chạy mô phỏng khả năng truy xuắt - 48Hình 3.1 Hình đại điện điện đi một số mẫu DNA tổng số 252552 49Hình 3.2 Biéu đồ hình anh của tất cả các chỉ thị sau khi phân tích bằng phần

mềm GeneMapper 5.( ¿ 2-©222222222E22EE22E12212232221271 211221222 re 50

Hình 3.3 Biểu đồ hình ảnh tín hiệu của chỉ thị Pahy - 20 (mô típ lặp là 2

nucleotide) của mẫu cá con 596 - Ú6 ¿2 +2+222+E2E+E+Ez£zzzzzzzzzezHình 3.4 Biểu đồ hình ảnh tín hiệu của chỉ thị Pahy — 14 (mô tip lặp là 2

nucleotide) của mẫu cá con 530 - 1( + 2 2+2+2+£z£z£z£zzzxrceeHình 3.5 Biéu đồ hình ảnh trường hợp tín hiệu vượt quá mức ghi nhận của

mẫu cá con 528 - 06 Tín hiệu cho thấy ở vị trí kích thước alen là 160

bp có tín hiệu vượt quá mức ghi nhận, không thé hiện được đỉnh

Hình 3.6 Biéu đồ hình ảnh tín hiệu trường hợp tín hiệu yếu của mẫu cá con

751 - 08 Tín hiệu ở vị trí kích thước alen 157 bp có tín hiệu yếu khi

Hình 3.7 Biéu đồ hình ảnh tín hiệu trường hợp không ghi nhận được tín hiệu

của mẫu cá con 751 - 08 Kết qua hiển thị dau Hình 3.8 Biểu đồ hình ảnh tín hiệu trường hợp xuất hiện đỉnh lặp lại (stutter

““?” peak) của mẫu cá con 530 — 10 ¿- ¿222 ++2+22z2+22+2Ezxezxzzzxerxes

Hình 3.9 Biểu đồ hình ảnh tín hiệu trường hợp xuất hiện 2 đỉnh chênh lệch

nhau 1 bp do hiện tượng thêm 1 Adenin và đầu 3’ của mẫu cá con

SE 09) .xccuasnmweaneencaazeu recente tare T RES

Hình 3.10 Đồ thi so sánh sự phân bố TSAL chỉ thị Pahy - 05, giữa nhóm cá

bô mẹ với nhóm cá con trong 50 gia đình cá tra

-Hình 3.11 Đồ thị so sánh sự phân bố TSAL chỉ thị Pahy - 07, giữa nhóm cá

bô mẹ với nhóm cá con trong 50 gia đình cá tra Hình 3.12 Đồ thị so sánh sự phân bố TSAL chỉ thị Pahy - 08, giữa nhóm ca

-+-bô mẹ với nhóm cá con trong 50 gia đình cá tra

-Hình 3.13 Đồ thị tỉ lệ truy xuất chính xác của từng chỉ thị với 50 gia đình cá

wl

53

sản xuất và cung ứng cá giống có chất lượng cao thông qua chọn giống là công việc

rất quan trọng và cần được ưu tiên hàng đầu Các chương trình chọn giống cá tra ởViệt Nam cũng đã được phát triển, cụ thể như chọn giống về tính tăng trưởng, tỉ lệphi lê, khả năng kháng bệnh gan thận mủ (Nguyen và ctv, 2012; Pham và ctv,2020), kết quả ban đầu đã đạt được những thành công nhất định Mặc dù, chấtlượng con giống đã được cải thiện đáng kế nhưng việc tăng trưởng về sản lượng cátra làm tăng nhu cầu con giống, tiềm ân nguy cơ lạm dụng, sử dụng con giống kémchất lượng Bên cạnh đó, việc sản xuất và cung ứng giống cá tra tại khu vực đồngbằng sông Cửu Long phần lớn vẫn mang tính tự phát, thiếu sự phù hợp giữa sốlượng và chất lượng con giống (Tổng Cục Thủy Sản, 2022) Trên thế giới và ViệtNam, phương pháp phổ biến giúp phân biệt các cá thể thuộc các gia đình và quanthé chọn giống là đánh dau từ PIT (Passive Integrated Transponder) Tuy nhiên, dau

từ PIT được sử dụng khi cá đạt kích thước từ 15 - 25g trong chương trình chon

giống (Gjedrem và ctv, 2009) Ngoài ra, dấu từ PIT có nhiều hạn chế và có khả

năng bi mat dấu (Nguyen va ctv, 2019) Đến nay, sử dụng các chỉ thị phân tử cho

truy xuất phả hệ đang gia tăng trong các chương trình chọn giống thủy sản(Vandeputte và ctv, 2011) vì khắc phục được các nhược điểm của dấu từ PIT nêutrên Cụ thể, đánh dau ngay khi cá còn nhỏ nên hạn chế sự ảnh hưởng môi trườngkhi cho ương riêng rẽ đến kích cỡ đánh dấu và thông tin phả hệ truy xuất được bằng

chỉ thị phân tử giúp việc ước tính các thông số di truyền chính xác trong chọn giốngcác loài thủy sản (Gjedrem va ctv, 2009) Nhiều nghiên cứu đã sử dụng

microsatellite trên cá tra trước đây (Na - Nakorn và Moeikum, 2009; Bùi Thị Liên

Ha và ctv, 2017) và các dé tài phát triển bộ chỉ thi microsatellite nhằm truy xuất pha

hệ trên cá tra chọn giống cũng đã được tiến hành với tỉ lệ truy xuất cao nhất đạt90,7% khi thực hiện trên 50 và 5 gia đình tương ứng với 10 và 15 cá con/gia đình

(Bùi Thị Liên Hà và ctv, 2017; Nguyen và ctv, 2019) Ngoài ra, năm 2018, Kim và

các cộng sự đã công bồ thông tin hệ gen của cá tra với công nghệ giải trình tự thế hệ

mới Nhờ vào các thông tin trên, đề tài này sử dụng bộ microsatellite đã được pháttriển và sàng lọc nhằm thử nghiệm khả năng truy xuất phả hệ phục vụ cho chọngiống

Xuất phát từ những lí do trên, đề tài “Nghiên cứu truy xuất phả hệ quần đàn cátra (Pangasianodon hyphophthalmus) chọn giống bằng chỉ thị phân tửmicrosatellite” được thực hiện.

Mục tiêu của đề tài

Thử nghiệm bộ 08 microsatellite đã sàng lọc dé truy xuất pha hệ 50 gia đình

cá tra chọn giống với tỉ lệ thành công trên 92% nhằm phục vụ cho chọn giống

Yêu cầu thực hiện

Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền quần thể chọn giống bằng bộ chỉ thị

microsatellite

- Qui mô 50 gia đình gồm 40 cá bố, 50 cá mẹ và 500 cá thé con

- Thông qua đánh giá các thông số di truyền

Nội dung 2: Đánh giá khả năng truy xuất phả hệ trên quần thể chọn giốngbằng bộ chi thị microsatellite

- Qui mô 50 gia đình gồm 40 cá bố, 50 cá mẹ và 500 cá thé con

- Thông qua tính ôn định, đa hình và tỉ lệ truy xuất thành công

Chương 1

TONG QUAN

1.1 Tống quan về cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

1.1.1 Đặc điểm sinh học và giá trị của cá tra

1.1.1.1 Đặc điểm sinh học và môi trường sống

Vi trí phân loại cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) như sau:

Giới: Animalia (Động vật)

Ngành: Chrodata (Động vật có dây sống)

Lớp: Actinopterygii (Cá vây tia)

Bộ: Siluriformes (Ca da tron)

Ho: Pangasiidae (Cá tra)

Chi: Pangasianodon

Loai: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) có nguồn gốc từ Campuchia, Lao,Thái Lan và Việt Nam (Nguyễn Văn Thường va ctv, 2008) và phân bố tự nhiên ởhai lưu vực sông Mekong và sông Chao Phraya Loài này có cơ thé dep theo chiềuhông, vi lưng ngắn có một đến hai gai cứng, vi hậu môn dài, gai vi ngực cứng và cóhai đôi râu hàm (một đôi râu mép và một đôi râu cằm) Thân màu xám, hơi có màuxanh trên lưng, hai bên hông và bụng nhạt (Nguyễn Bạch Loan, 1998)

1.1.1.2 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá tra có miệng rộng, răng sắc nhọn trên các xương hàm, xương lá mía vàxương khẩu cái, gai trên cung mang thưa và ngắn Dạ dày hình chữ U, ruột ngắn vàkhông gấp khúc Trong tự nhiên, cá tra là loài ăn tạp, tuy nhiên thức ăn của chúngthiên về động vật như tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá Ngoài ra, loài này ăn được

ca mun bã hữu cơ, rê cây thủy sinh, rau quả Cá tra nuôi trong ao sử dụng được các

loại thức ăn khác nhau như thức ăn viên, cám, tam, rau muống Thức ăn có nguồngốc động vật sẽ giúp cá lớn nhanh (Nguyễn Văn Kiểm, 2004).

1.1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu

cơ, oxy hòa tan thấp, nuôi được với mật độ cao và có thể sống được ở vùng nước lợ(nồng độ muối 7 - 10%o); cá tra có thé chịu đựng được nước phèn với pH > 5, dễ

chết ở nhiệt độ đưới 15°C nhưng chịu được nhiệt độ cao lên tới 39°C (Phạm Văn

Khánh, 1996).

Cá tra có tốc độ sinh trưởng tương đối nhanh cả về chiều dài và khối lượng

Khi được 9 ngày tuôi khối lượng đã tăng gấp 10 lần, chiều dài tăng 1,85 lần Saumột năm, ca đạt trọng lượng từ 0,7 - 1,5 kg, từ 3 - 4 tuổi đạt trọng lượng là 3 - 5 kg(Phạm Văn Khánh, 1996) Khi cá đạt 2,5 kg là bước vào thời kỳ tích lũy mỡ nên

cần có chế độ nuôi dưỡng thích hop dé phát dục tốt

1.1.1.4 Đặc điểm sinh sản

Cá tra không sinh sản trong ao nuôi và có tập tính di cư sinh sản trên những

khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp Trong tự nhiên, cá tra thành thục đượctìm thấy trên sông ở địa phận của Campuchia và Thái Lan Ở Việt Nam, cá tra

không có bãi sinh sản tự nhiên mà được sinh sản ở Campuchia sau đó cá bột theo

dòng nước về Việt Nam (Phạm Văn Khánh, 1996)

Tuổi thành thục của cá tra đực ở năm thứ hai và cá tra cái ở năm thứ ba Cátra không có cơ quan sinh dục phụ, nếu chỉ nhìn hình dáng bên ngoài thì khó phânbiệt được cá đực và cá cái Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triểnlớn gọi là buồng tinh hay tinh sào va ở cá cái gọi là buồng trứng hay noãn sào Mùa

vụ sinh sản của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 7 âm lịch Trọnglượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 - 3,0 kg (Nguyễn Văn Kiểm, 2004)

1.1.1.5 Giá trị dinh dưỡng của cá tra

Cá tra là loài có giá trị dinh dưỡng cao vì thịt cá chứa nhiều chất đạm, một sốloại axit béo không bão hòa (axit eicosapentaenoic - EPA và axit docosahexaenoic -DHA) ít béo, ít cholesterol Theo Ho và ctv (2009), phi lê cá tra là một nguồn tiềm

năng của axit béo omega - 3 và thức ăn ít chất béo, hàm lượng chất béo thô trong

phi lê cá tra là 2,55g/100g, EPA là 0,76 mg/100g và DHA là 10 mg/100g (trọng lượng ướt).

1.2 Tình hình nuôi và chất lượng giống cá tra tại Việt Nam

Ở Việt Nam, cá tra đã được nuôi và phát trién chủ yêu ở đồng bằng sông CửuLong, tổng diện tích thả nuôi lớn nhất ước đạt 5.700 ha (Hiệp hội chế biến và xuấtkhẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), 2020) Trong đó, Cần Thơ, An Giang và ĐồngTháp là những vùng nuôi lớn nhất Cả nước có 103 cơ sở sản xuất giống cá tra, tậptrung tại tỉnh An Giang, Đồng Tháp và có hơn 1.900 cơ sở ương dưỡng giống cá tra(Tổng cục Thủy sản, 2022)

Việc phát triển sản xuất giống thủy sản và chuyên giao công nghệ trong sảnxuất, ương dưỡng giống và nuôi trồng thủy sản là mục tiêu hàng đầu trong chươngtrình Quốc gia phát triển nuôi trồng thủy sản giai đoạn 2020 - 2030 (Tổng cục Thủy

san, 2022) Tuy nhiên, số lượng cơ sở ương dưỡng giống thủy sản chưa được kiểm

tra và cấp giây chứng nhận còn thấp; cá mắc nhiều bệnh Tỉ lệ sống khi ương dưỡng

từ giai đoạn cá bột lên cá giống còn thấp (khoảng 15%), giá thành sản xuất cao, cá

bố mẹ chưa rõ nguồn gốc, chất lượng kém, (Tổng cục Thủy sản, 2022)

1.3 Tổng quan chương trình chọn giống thủy sản

1.3.1 Chương trình chọn giống thủy sản trên thế giới

Có hơn 101 chương trình chọn giống thủy sản từ năm 1983, trong đó nhiều

nhất là chọn lọc cá rô phi, tiếp theo là cá hồi Đại Tây Dương, cá hồi vân và cá rohu(Neira và ctv, 2010) Các tính trạng mục tiêu phố biến trong chọn giống ở thủy sản

là tăng trưởng, kháng bệnh, tuổi thành thục, hệ số chuyên đổi thức ăn, tỉ lệ phi lê,mùi vị, số lượng trứng và kích thước trứng (Gjedrem và Baranski, 2009)

Một số chương trình chọn giống đã được triển khai trên thế giới: chương trìnhchọn giống cá rô phi ở Philippines (1993), Malaysia (2005) và Hà Lan (2005); cá

nheo Mĩ (1995); cá rohu ở An Độ (1996), Bangladesh (2012) và An Độ (2015); cá

mè vinh ở Bangladesh (2002); tôm thẻ chân trắng ở Mĩ (2002) và Columbia (2006);

cá chép (2003); cá hồi Coho ở Mĩ (2004); cá hồi vân ở Phần Lan (2002) và Đan

Mạch (2002); cá hồi Đại Tây Dương và cá hồi vân ở Na Uy (2005); cá tuyết ở Na

Uy (2006), Malawi (2006) và Bangladesh (2013); hàu Thái Bình Dương ở Úc(2007); cá chém ở Châu Âu (2009)

Trong giai đoạn 2002 - 2010, trên thế giới sử dụng con giống đã qua chọn lọctăng từ 5,0% đến 8,2% Tuy nhiên, nghề nuôi thủy sản phần lớn (khoảng hơn 88%)vẫn dựa vào con giống tự nhiên hoặc con giống chưa qua chon loc (Gjedrem, 2012)

Mặc dù các tính trạng mục tiêu trên đối tượng thủy sản tương tự với vật nuôi khác

nhưng số lượng các chương trình chọn giống vẫn còn khiêm tốn Nguyên nhân là do

sự khó khăn về mặt kĩ thuật và điều kiện dé tiến hành Đến nay, nhờ sự phát triển

của khoa học công nghệ giúp số lượng và chất lượng của các chương trình chọngiống được nâng lên rõ rệt

1.3.2 Chương trình chọn giống thủy sản ở Việt Nam

Trong những năm 1960, công trình nghiên cứu nồi bật về di truyền trên cá là

nghiên cứu về biến dị hình thái của các nhóm cá chép khác nhau ở miền Bắc Việt

Nam Tiếp đến những năm 1970, nghiên cứu về lai giữa các dòng cá chép củaNguyễn Mạnh Tưởng và Trần Mai Thiên (1979) Sau đó, vào những năm 1990,

nghiên cứu về di truyền phát triển rõ nét hơn, trong các dự án nghiên cứu trong và

ngoài nước như: DEGITA, GIFT do ICLARM thực hiện, toàn cai cá mè vinh, cá rô

phi toàn đực và siêu đực YY do DFID tài trợ, chọn lọc gia đình cá rô phi trong dự

án NORAD.

Giai đoạn năm 2000 - 2010, một số chương trình chọn giống đã được thực

hiện và cho kết quả khả quan: (i) chương trình chọn giống cá rô phi Oreochromisniloticus (dòng GIFT) nhằm nâng cao sức sinh trưởng và khả năng chịu lạnh theophương pháp chọn lọc gia đình đã chọn được dòng rô phi có sức sinh trưởng tăng16,6% so với vật liệu chọn giống ban đầu (Nguyễn Công Dân và ctv, 2000); (ii)Nghiên cứu chọn giống cá chép ở đồng bằng sông Cửu Long của Nguyễn VănKiểm (2005), thực hiện thí nghiệm chọn giống trên 3 loại cá chép - vàng, trắng vàhung Qua hai thế hệ chọn giống, hệ số di truyền thực tế tính được là 0,22; 0,22 -0,23 và 0,18 - 0,20 tương ứng cho cá chép vàng, trắng và hung, hiệu quả của chọn

lọc về tăng trưởng nhanh hơn thế hệ trước tương ứng từ 7,0 - 7,2%; 4,3 - 6,0% và

G - 2001, G - 2002 và G - 2003 (đặt tên theo năm thành lập quần đàn) Hệ số di

truyền thực tế (h’) của tính trạng tăng trưởng của các quan đàn ở mức cao, dao động

từ 0,24 đến 0,38 tủy theo quan dan va thế hệ chọn giống

Tiếp nối là đề tài thuộc Chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệpThủy sản “Ứng dụng di truyền phân tử và di truyền số lượng chọn giống nâng cao

tốc độ sinh trưởng cá tra” (2013 - 2016) và tập trung vào tính trạng tăng trưởng Kết

quả đã chọn lọc được quan thê chọn giống G3 - cộng gộp có hệ số di truyền ước

tính tính trạng trọng lượng thu hoạch cao (0,51), hiệu quả chọn lọc thực hiện so với

(i) đàn cá đối chứng của chương trình chọn giống đạt trung bình 7,0%/thé hệ (tính

theo EBV) và 10,6%/thé hệ (tính theo LSM) và (ii) cao hon so với đàn có nguồngốc từ tự nhiên là 20,4% Đến nay, chương trình chọn giống đã chọn lọc được thế

hệ G4 - tăng trưởng thông qua đề tài nghiên cứu cấp Bộ, thực hiện trong giai đoạn

2021 - 2022 (đã phân tích và chọn lọc G4 trong năm 2020) Hệ số di truyền thực tếcủa tính trạng tăng trưởng ở G4 đạt 0,49 + 0,14, hiệu quả chọn lọc thực tế của thế

hệ G4 so với đàn tự nhiên là 31,2% và đạt cao hơn 11,3% so với thế hệ G3

Dựa trên nhóm cá chọn giống theo tính trạng tăng trưởng đã được thực hiệnsan dé làm nguồn vật liệu ban đầu và kết hợp với ba nhóm cá tự nhiên có nguồn gốc

từ Campuchia Đề tài “Nghiên cứu chọn giống cá tra kháng bệnh gan thận mủ”

(2012 - 2015) được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng quần đàn ban đầu có tínhbiến di di truyền cao phục vụ chọn giống dai hạn cá tra kháng bệnh gan thận mủ Đề

tài đã chọn lọc 830 cá thé GO - kháng bệnh (710 cá thé chọn lọc thuộc 120 gia đình

và 120 cá thê đối chứng thuộc 25 gia đình) Đàn G0 - kháng bệnh này sẽ được sử

dụng làm cá bố me dé sản xuất quan thé cá tra kháng bệnh gan thận mủ tiếp theo và

có hiệu quả chọn lọc ước tính đạt 8,3% Tương quan di truyền của tính trạng khángbệnh gan thận mủ và tăng trưởng của đàn cá G0 - kháng bệnh này được ước tính là

0,26 (Trịnh Quốc Trọng va ctv, 2016) Ứng dụng kết quả chọn lọc GO dé sản xuấtG1 và thực hiện cảm nhiễm cá trên 8,207 cá thể thuộc 147 gia đình đã chon lọc 521

cá thé GI, trong đó nhóm GI - chọn lọc 419 cá thé thuộc 63 gia đình và 102 cá thé

nhóm GI - đối chứng thuộc 20 gia đình Hiệu quả chọn lọc ước tính trong thế hệ đầutiên (G1) được ước tính đạt từ 7,2 - 12,0% (Trần Thị Phương Dung và ctv, 2021)

1.4 Tổng quan về truy xuất pha hệ trong nuôi trồng thuỷ sản

1.4.1 Nguyên tắc cơ bản của truy xuất phả hệ

Truy xuất phả hệ bằng chỉ thị phân tử dựa trên nguyên tắc cha mẹ truyền mộttrong hai alen ở mỗi locus (vị trí xác định của gen trên nhiễm sắc thể) cho con cái,

do đó con cái mang một alen từ bố và một alen khác từ mẹ (Herbinger và ctv,

1995) Việc xác định quan hệ huyết thống có thé được tiễn hành trên cơ sở so sánhkiểu gen tại các locus của cá thể con với kiểu gen của bố mẹ giả định của chúng.Nếu khi so sánh, các alen ở các locus của chi thị (vi dụ, microsatellites hoặc SNPs)được tìm thay trong kiểu gen của con cái mà không có ở cá thé bố mẹ giả định thìquan hệ huyết thống bị loại trừ với độ chính xác 100% Nếu kiểu gen của con cái và

bố mẹ giả định tại một số locus của chỉ thị cho thấy sự trùng khớp thì quan hệ huyếtthống sẽ được xác nhận Càng nhiều chỉ thị được sử dụng trong cùng một lần truyxuất phả hệ thì độ chính xác càng đạt tới 100% (Hình 1.1) (Yue và Xia, 2014)

Hình 1.1 Nguyên tắc trong truy xuất pha hệ Cá thé con thứ hai có hai alen 108 và

116 kế thừa từ alen của bố mẹ nên là con của cặp bố mẹ (Yue và Xia, 2014)

1.4.2 Ý nghĩa của truy xuất phả hệ bằng chỉ thị phân tử

Trong nuôi trồng thủy sản, thông tin phả hệ là rất cần thiết cho việc ước tínhcác thông số di truyền trong chọn giống và quản lý trại giống (Gjerdem và Baranski,2009) Nhiều năm trước đây, khi chưa sử dụng truy xuất bằng chỉ thị phân tử, có haiphương pháp dé thực hiện một chương trình chọn giống Phương pháp thứ nhất làchọn lọc hàng loạt không sử dụng thông tin phả hệ Trong phương pháp này, chọn

lọc trực tiếp cá thé dua trên đặc điểm kiểu hình nên đơn giản và dễ thực hiện Tuy

nhiên có nhiều hạn chế: (1) chỉ mang lại hiệu quả sau tối thiểu hai thế hệ: (2) yêucầu duy trì ít nhất hai nhóm cá (chọn lọc/đối chứng) hoặc các nhóm khác nhau; (3)

việc đánh giá phương sai đi truyền chỉ trên một tính trạng Phương pháp tiếp theo là

sử dụng đánh dấu vật lí (physical tag), ở các loài gia súc, gia cầm và thực vật, việc

đánh dấu vật lý cho các cá thé là có khả thi, tuy nhiên, ở hầu hết các loài cá, việcgắn thẻ vật lý cho cá con là rất khó khăn và tốn thời gian (Liu và Cordes, 2004) Cụ

thể, sử dụng dấu PIT có nhiều hạn chế như: (1) hạn chế nghiên cứu di truyền ở giai

đoạn non vi ở hầu hết các loài cá, việc đánh dau này trên cá con gặp khó khăn vàtốn nhiều thời gian, gây ton thương mô và tao stress cho cá; (2) trong quá trình nuôiriêng rẽ các gia đình yêu cầu nhiều đơn vị nuôi (ao, lồng, bể nuôi) và số lượng đơn

vị nuôi riêng rẽ các gia đình có giới hạn trong các chương trình chọn giống nên gâyảnh hưởng đến thiết kế giao phối (Vandeputte và ctv, 2011; 2014); (3) đánh dấu vật

lí có khả năng mắt dấu (Nguyen và ctv, 2019)

Đến nay, truy xuất phả hệ bằng các chỉ thị phân tử giúp cho việc truy xuất phả

hệ ở các loài nuôi trồng thủy sản trở nên khả thi (Liu và ctv, 2004) vì có nhiều ưuđiểm nổi bật như sau: (1) phương pháp xác định pha hệ bằng chi thi phân tử có théđánh dấu ngay khi các cá thé ở giai đoạn âu trùng Từ đó, các cá thé từ nhiều giađình có thể được nuôi chung trong một môi trường đồng nhất từ giai đoạn nhỏ màkhông cần chờ đến khi cá đạt kích cỡ để có thé đánh dấu vật lí Việc này làm giảmthiểu các tác động của môi trường khi nuôi riêng rẽ giúp việc ước lượng các thông

số di truyền chính xác hơn; (2) truy xuất phả hệ bằng chỉ thị phân tử thường không

gây stress và tôn thương mô cho cá như đánh dau vật lí, vì vậy sẽ làm giảm tỉ lệ hao

hụt trong quá trình đánh dấu cá; (3) lợi ích chính của việc truy xuất phả hệ bằng chỉ

thị phân tử là cho phép cường độ chọn lọc (<3%) được áp dụng trong các điều kiệnthương mại, trong khi vẫn kiểm soát giao phối cận huyết (Vandeputte và ctv, 2014)

Vì vậy, theo Gjedrem và Baranski (2009), việc truy xuất phả hệ bằng chỉ thị phân tử

rất cần thiết trong việc ước tính chính xác các thông số di truyền trong chọn giốngcác loài thủy sản.

1.4.3 Các bước chính trong truy xuất phả hệ

Truy xuất pha hệ bằng chi thị phân tử thường bao gồm 4 bước (Jones và ctv,2003): (1) li trích DNA của cá thé bố mẹ, cá thé con và lựa chọn các chỉ thi phân tử;(2) thực hiện phan ứng PCR; (3) điện di và ghi nhận các sản phẩm PCR: (4) xử lí dữ

liệu kiêu gen thông qua các phương pháp tính toán và phần mềm chuyên dụng

1.4.4 Chỉ thị phân tử sử dụng trong truy xuất phả hệ trên thủy sản

Các nghiên cứu về đa dạng di truyền, xác định phả hệ hoặc đánh giá chất

lượng các quan đàn bố mẹ trong các chương trình chọn giống, chỉ thị phân tử đã thé

hiện nhiều tính ưu việt (Chauhan và ctv, 2010) Việc lựa chọn chỉ thị sử dụng trongtruy xuất cần có tính đa hình, 6n định và có thé truyền từ bố me sang con cái Tuy

nhiên, theo Jones va ctv (2010), truy xuất phả hệ chỉ đạt kết quả chính xác cao khi

sử dụng một số chỉ thị phân tử có sự đa hình cao hoặc nhiều chỉ thị phân tử với mức

độ đa hình từ thấp đến trung bình Tiếp theo, chọn lựa các chỉ thị phân tử cho phân

tích phả hệ còn phụ thuộc vào kết quả sàng lọc của bộ chỉ thị tham khảo từ cácnghiên cứu trước và thông tin bộ gen của sinh vật vì những yếu tố này quyết định

chi phí của dự án (Abdul - Muneer và ctv, 2014) Ngoài ra, các chỉ thị cần đáp ứng

về chỉ phí thấp, dễ phân tích Mặc dù vậy, hiện tại không có loại chỉ thị nào đáp ứngtất cả các yêu cầu trên, mà dựa trên loại nghiên cứu cụ thé dé chọn ra loại chi thịphù hợp nhất với mục tiêu nghiên cứu

Hiện nay, một số loại chỉ thị rất phổ biến trong nghiên cứu di truyền trên đốitượng thủy sản như: (i) RFLP (Restriction fragment length polymorphism) là sự

khác biệt về kích thước các đoạn trình tự nucleotide được tạo ra khi sử dụng

enzyme cat giới hạn trên bộ gen của các đôi tượng được nghiên cứu RFLP có ưu

điểm là một chỉ thị đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp.

Tuy nhiên, do quy trình thực hiện phức tạp, cần lượng DNA lớn và yêu cầu có chấtlượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kĩ thuật nay; (ii) AFLP (Amplified fragment

length polymorphism) là sự đa hình các đoạn nucleotide, sau khi bộ gen được xử líqua enzyme cắt giới hạn và được khuếch đại, kĩ thuật này được kết hợp giữa RFLP

và PCR Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay

đổi của các nucleotide trong vùng trình tự môi hoặc thêm, mất đoạn giữa hai vi trícắt AFLP có ưu điểm là dé sử dụng dé phát hiện sự biến di Tuy nhiên, chi thị này

không hữu hiệu trong đánh giá biến dị của các cá thể trong cùng quần đàn vì AFLP

có kiêu đi truyền tính trội, không thể phân biệt được giữa cá thể dị hợp và đồng hợp

(Abdul - Muneer và ctv, 2014); (1) SNP (Single nucleotide polymorphism) là sự

khác biệt một nucleotide trên các đoạn DNA tương đồng và xuất hiện trong bộ genvới tần suất cao, có khoảng 10 triệu SNP trong bộ gen người với tần số là 1SNP/300

nucleotide Tuy nhiên, SNP chỉ có tối đa hai alen tại một vi trí, điều đó dẫn đến phải

sử dụng nhiều SNP hơn các chỉ thị phân tử khác chang hạn như microsatellite để có

được cùng một lượng thông tin đi truyền (Trong và ctv, 2013)

60 Ngoài ra, SSR có tỉ lệ đột biến được ước tinh là từ 10” đến 10' mỗi thế hệ

(Gous va ctv, 2013) va được tìm thấy ở trình tự DNA không lặp lại và lặp lại(DeWoody và Avise, 2005) Cụ thể, sự lặp lại của cặp nucleotide CA xảy ra rất

thường xuyên trong bộ gen người cũng như các loài khác và hiện diện trong khoảng vài ngàn nucleotide (Hình 1.2).

actgattcagtccagtcga jaclacaciac; atcagatcactggtacgtcca

Primer xuôi Alen 1 Primer ngược

7 đoạn lap

actgat teagtccagtega Hace qacagacgecacsatcagatcac tggtacgtcca

Primer xuôi Alen 2 Primer ngược

Hình 1.2 Các trình tự lặp đoạn của các alen thuộc một microsatellite

(DeWoody, 2005)

Theo Gous và ctv (2013), microsatellite có thé được phân loại theo ba cách

như sau: (1) dựa vào sự sắp xếp các nucleotide trong trình tự lặp lại, có thé chia ra

thành trình tự đơn giản hoàn hao (“simple perfect”) là các microsatellite có một mô

tip lặp lại duy nhất ((CA)n); trình tự đơn giản không hoàn hao (“simple imperfect”)

có một mô tip lặp lại đôi khi bị gián đoạn bởi đoạn không lặp lại (AAC)n ACT(AAC)n + 1); dạng hỗn hợp đơn giản (simple compound) là trình tự lặp lại của

nhiều mô típ đơn giản ((CA)n (GA)n) và trình tự hỗn hợp bị gián đoạn (compoundimperfect) là kiêu nhiều loại mô típ lặp lại đôi khi bị gián đoạn bởi đoạn không lặplại (CCA)n TT (CGA)n + 1); (2) Dựa vào số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp

lai, microsatellite được chia thành các loại: mononucleotide [A]6 (AAAAAA);

dinucleotide [GT]4 (GTGTGTGT); trinucleotide [CTG]4 (CTGCTGCTGCTG) và tetranucleotide [ACTC]3 (ACTCACTCACTC) Trong đó, ở động vật có xương

song, dinucleotide - GT va CA - la phô biến nhất (Zardoya, 1996), loại trinucleotide

xuất hiện ít hon dinucleotide khoảng 10 lần và tetranucleotide là loại hiếm gặp nhất,

sử dụng trong xác định quan hệ cha con và pháp y ở người (Abdul - Muneer, 2014)

và (3) Dựa vao vi trí của chúng trong bộ gen, trong nhân (Nuclear Simple sequence repeats - nuSSRs), lục lap (Chloroplastic Simple sequence repeats - cpSSRs) hoặc ti

thé (Mitochondrial Simple sequence repeats - mtSSRs) Su xuất hiện cácmicrosatellite có nhiều cơ chế, tuy nhiên hai cơ chế chính là (1) trong giảm phân

xuất hiện sự trao đôi chéo của các nhiễm sắc thé tương đồng: (2) do lỗi của enzyme

DNA polymerase trong quá trình sao chép và cơ chế này được coi là nguyên nhân

chủ yếu trong việc hình thành các microsatellite Cụ thể, trên phân tử DNA mới

tong hợp, enzyme DNA polymerase tạo ra một cau trúc dang vòng có thê bị loại bỏtrong quá trình sửa lỗi hoặc có thể được kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một

đoạn lặp lại dài hơn.

1.4.5.1 Ưu điểm và hạn chế của phương pháp mierosatellite

Hiện nay, microsatellite là chỉ thị được lựa chọn trong hầu hết các lĩnh vực của

di truyền học phân tử (Gous và ctv, 2013) vì có nhiều ưu điểm như sau: (i)

microsatellite có mức độ đa hình cao (Powell và ctv, 1996); (ii) kiểu di truyền đồngtính trội, có thể phân biệt được dị hợp tử với đồng hợp tử (Abdul - Muneer, 2014;Liu va Cordes, 2004); (11) tuân theo quy luật cua Mendel (Litt và Luty, 1989); (iv)phan tich don gian va chi cần một lượng nhỏ DNA đã có thể được khuếch đại bằng

kĩ thuật PCR (Abdul - Muneer, 2014); (v) các alen riêng tại một chỉ thị khác nhau

về số lượng lần lặp lại nên có thể được phân biệt chính xác bằng phương pháp điện

di (Abdul - Muneer, 2014) và (vi) có thé sử dung trong các kĩ thuật huỳnh quang,

multiplex PCR (Gous và ctv, 2013).

Khả năng truy xuất pha hệ của microsatellite có thé hon 90% với tôi thiểu 4

microsatellite (Norris va ctv, 2000) Ngoài ra, từ 8 - 15 microsatellite thì khả năng

truy xuất pha hệ có thé hơn 99% (Vandeputte va ctv, 2014) So với microsatellite,cần 6 SNPs dé có được năng lực truy xuất pha hệ tương đương 01 microsatellite(Glaubitz va ctv, 2003) Chính vì có rất nhiều ưu điểm vượt trội nên microsatellite

đã được ứng dụng rộng rãi (Abdul - Muneer, 2014) như sau: () Sử dụng cácmicrosatellite một vài alen phù hợp để nghiên cứu di truyền quan thé, các chỉ thịnhiều alen lại lý tưởng cho việc lập bản đồ gen, phân tích pha hệ và các chỉ thị côđịnh hay ít đa hình được sử dung dé phân loại các loài; (ii) Ứng dụng trong phântích các quần thé có độ đa dang cao; (iii) Ứng dụng dé phân biệt nguồn gốc và ditruyền quan thé do mức độ đa hình cao so với các chỉ thị allozyme thông thường và

(v) Sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền của quan thé và nhận dạng nguồn

goc.

Mặc dù chi thi microsatellite có nhiều ưu điểm hơn so với các chỉ thị khác

nhưng vẫn có một số hạn chế (Abdul - Muneer, 2014) như sau: thứ nhất, chỉ phí chohóa chất phân tích cao hơn so với phương pháp đánh dấu vật lí và thời gian có đượckết quả lâu hơn Tuy nhiên, việc truy xuất bang microsatellite sử dụng ít công laođộng hơn quá trình đánh dấu vật lí và chủ động được thời gian thực hiện; Thứ hai,thông tin hệ gen phải đảm bảo độ tin cậy sẽ giúp dễ tìm ra được các microsatellite

mang hiệu quả cao, vì vậy khó áp dụng cho các nhóm đối tượng chưa được nghiêncứu; Thứ ba, các bước như thiết kế mồi, thực hiện phản ứng PCR và ghi nhận dữ

liệu alen cũng ảnh hưởng tới phân tích dữ liệu của chỉ thị nên cần phải được tối ưunhằm giảm thiểu sai số trong phân tích; Thứ tư, xảy ra các đột biến do sự trượt lỗicủa enzyme DNA polymerase không tìm thấy vị trí cắt của nó và cắt bớt đơn vị lặplại hay thêm vào nhiều đơn vị lặp lại, kết quả là sợi mới có số lần lặp lại khác vớisợi bố mẹ dẫn đến sự xuất hiện của các sản pham lỗi hoặc null - alen, điều này có

thé dẫn đến lỗi khi xác định kiểu gen Ngoài ra, các null - alen còn có thé dẫn đến

ước tính sai lệch về tần số alen, tần số kiểu gen và cho giá trị dị hợp tử thấp, trongtrường hợp khác, do đột biến ở vùng liên kết mỗi làm xuất hiện các alen câm (silentallele) (Cruz và ctv, 2004; Chen và ctv, 2015).

1.4.5.2 Phân tích thống kê dữ liệu microsatellite

- (1) Số lượng alen (Na) là số lượng alen có thể thu nhận được từ kết quả điện

di.

(2) Tan số di hop tử (H Heterozygosity) gồm tan số di hợp tử quan sát (Ho Observe Heterozygosity) va tan số di hợp tử mong doi (He - ExpectedHeterozygosity) giúp đánh giá mức độ da dang di truyền của quan thé va tính đahình của microsatellite;

(3) Thông tin đa hình (PIC Polymorphic Information Content), chỉ số PIC

va He có thé được sử dụng dé đánh giá mức biến đổi gen: khi PIC > 0,5 và He > 0,6chỉ thị có sự đa dạng cao, khi PIC < 0,25 chỉ thị có sự đa dạng thấp và khi 0,25 <PIC < 0,5 chi thị có sự đa dạng trung bình (Botstein và ctv, 1980) Hệ số PIC được

tính theo công thức sau: PIC=1-SP¿ (trong đó P; là tan số xuất hiện của allele thứ i);

- (4) Tan số null - alen (Null allele frequency) cũng cần được đánh giá vì theotác giả Dakin và Avise (2004) các microsatellite có tần số null - alen trên 0,2 có théảnh hưởng đến khả năng truy xuất;

- (5) Tan số alen (TSAL - Allele frequency) là một thuật ngữ được áp dụngcho tần số tương đối của một alen tại một locus trong quan thé Nó được tính bangcách chia số lần quan sát thay một alen nhất định cho tổng số alen tại một locus cụthể trong quần thé Tần số alen có thé được biểu thị đưới dạng tỷ lệ, phần trăm hoặc

số thập phân Những thay đôi về tan số alen và kiểu gen cho thấy sự hiện diện củacác nhân tố tiến hóa, đó là chon lọc tự nhiên, trôi dat di truyền, đột biến và dònggen, tác động lên một nhóm gen cụ thể theo thời gian (Rezaei và Hedayat, 2013)

Đã có nhiều tác giả sử dụng tan số alen dé nghiên cứu di truyền quan thể, giám địnhDNA (Tran Ngọc Hồi, 2012; Butler, 2015; Lê Thị Bích Trâm va ctv, 2015; Park và

ctv, 2021).

- (6) Kiểm tra cân bang Hardy-Weinberg (HWE) để đánh giá quan thé giaophối ngẫu nhiên hay giao phối có chọn lọc

1.4.6 Kĩ thuật Multiplex PCR trong truy xuất pha hệ

Trong truy xuất phả hệ sử dụng chỉ thị phân tử có bản chất là DNA, kĩ thuậtPCR và phân tích kích thước đoạn DNA được dùng để xác định kiểu alen của cáthé Tuy nhiên, PCR cho từng microsatellite va phân tích kích thước các sản phẩm

PCR của các microsatellite đơn dé kết hợp tạo kiểu alen cho một số lượng lớn các

cá thể làm chi phí tăng cao Đồng thời, khi tiến hành nhiều phản ứng PCR khuếch

đại số lượng lớn các chỉ thị microsatellite thì sai số khi phân tích cũng tăng lên.Hiện nay, multiplex PCR (kết hợp khuếch đại sản phẩm của các microsatellite đồngthời trong một lần thực hiện phản ứng PCR) được sử dụng để giảm chỉ phí cho việcxác định kiểu gen và tối đa hóa việc khuếch đại sản phẩm PCR của các

microsatellite Trong nghiên cứu của Nguyen va ctv (2019), phản ứng multiplex

PCR làm giảm thao tác PCR với số lượng mẫu lớn dẫn đến giúp giảm nguy cơ lỗithao tác Chính vì vậy, multiplex PCR được sử dụng trong nhiều đề tài truy xuất phả

hệ trên thủy sản (Bảng 1.1) (Borrell và ctv, 2011) Chi phí chính trong phan ứng

multiplex PCR dùng để phát triển và sàng lọc các chỉ thị phân tử cụ thể trong mỗi

bộ multiplex PCR Trong kĩ thuật này, yêu cầu các microsatellite có sự phù hợptrong cùng một điều kiện phản ứng (Norris và ctv, 2000); các cặp môi phải có dảinhiệt độ bắt cặp tương tự nhau Đối với các nghiên cứu sử dụng lại các đoạn moi đãđược phát triển trước đó nhưng có nhiệt độ bắt cặp khác nhau thì cần thiết phải xácđịnh lại nhiệt độ bắt cặp tối ưu hoặc thiết kế lại các cặp mỗi của microsatellite để

xây dựng quy trình multiplex PCR thành công Khả năng ứng dụng của kĩ thuật

multiplex PCR trong truy xuất phả hệ được gia tăng nhờ vào sự phát triển các kĩthuật phân tích đoạn sử dụng môi có đánh dau huỳnh quang, kĩ thuật này giúp làm

tăng số lượng mỗi nhưng van đảm bảo độ chính xác khi phân tích dữ liệu trong một

Cá hồi van Fishback và ctv,

Oncorhynchus mykiss 5 Bee : 1298; Johnsen và

"; SO microsatellite; ˆ: Khả năng trong truy xuất pha hệ; *: Trích từ Yue va Xia (2014)

Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Sáng và ctv (2020) đã xác định được

47.499 chỉ thị microsatellite và lựa chọn ngẫu nhiên 145 chỉ thị (5 chỉ thị/scaffold)

dé phat triển các mỗi Các mô típ trên 10 lần lặp lại được lựa chọn dé phat triển môi

và được thiết kế bằng thông số mặc định trên phần mềm Genious Prime 2020.0.5với nhiệt độ bắt cặp tối ưu ở 55°C và độ dài môi từ 18 đến 24 bp Độ dai sản phẩm

PCR mong muốn nằm trong khoảng từ 100 đến 400 bp Các bộ mỗi cho sản phẩmPCR đặc hiệu (sản phẩm nam trong khoảng thiết kế từ 100 đến 400 bp, có tối đa 2

vạch thể hiện cá thể dị hợp) và đa hình (ít nhất 1 trong 3 mau cá thé có dị hợp tử tại

chỉ thị tương ứng) được lựa chọn.

Những mỗi xuôi của các microsatellite cho kết quả đặc hiệu và đa hình trên

gel agarose được đánh dấu huỳnh quang ở đuôi 5’ và phải cho sản phẩm PCR có

kích thước phù hợp: khoảng cách giữa hai sản phẩm PCR có cùng màu huỳnhquang cách nhau 50 bp, trong mỗi khoảng kích thước của sản phẩm khuếch đại cótối đa 4 môi; 4 mồi này sẽ được đánh dấu với 4 loại màu huỳnh quang khác nhau,

cụ thé là 6FAM (xanh da trời), VIC (xanh lá cây), PET (đỏ) và NED (vàng) dékhông bị trùng lặp khi phân tích đoạn DNA trong phản ứng multiplex Các môi saukhi được tối ưu bằng các phản ứng singleplex PCR, được nhóm lại thành một bộmultiplex PCR Các thông số di truyền như số lượng alen (Na), hệ số đa dạng di

truyền (PIC), Ti lệ di hợp tử thực tế (Ho), Ti lệ di hợp tử lí thuyết (He) va mức độ

sai khác so với cân bằng Hardy-Weinberg (HWE) để đánh giá bộ chỉ thị multiplexPCR mới phát triển trên 30 cá thé cá tra (10 cá thé/quan đàn) Kết quả kiểm địnhmồi trên 3 cá thé cho thay 63 chỉ thị (43,5%) cho sản pham đặc hiệu va đa hình.Trong số 10 chỉ thị microsatellite mới được phát triển, lựa chọn được 09 chỉ thị cómức độ đa hình cao (PIC > 0,5) (vì không chọn 01 chỉ thị (Pahy - 10) có mức độ đa

hình trung bình (0,25 < PIC < 0,5)) Ngoài ra, 87 alen đã được phát hiện trên 10 chỉ

thị với số lượng alen dao động từ 5 - 11 alen mỗi chỉ thị, trung bình 8,7 + 2,1 alenmỗi chỉ thị Tất cả các microsatellite được phát triển không cho thấy sự sai lệch

đáng ké so với cân bằng Hardy-Weinberg sau khi hiệu chỉnh Bonferroni (PHWE >

0,05) (Nguyễn Văn Sáng và ctv, 2020).

1.4.7 Điện di mao quản và đánh dấu huỳnh quang

1.4.7.1 Điện di mao quản

Trong truy xuất phả hệ bằng chỉ thị phân tử, sau khi khuếch đại bằng phản

ứng PCR, bước tiếp theo là xác định kích thước sản phẩm PCR bằng kĩ thuật phântách đoạn DNA (Yue và ctv, 1999) Dé dam bảo tỉ lệ truy xuất thành công cao thi

cần xác định chính xác kích thước các alen đồng thời duy trì tính nhất quán khi xác

định kích thước của các alen trong kiểu gen trên toàn bộ mẫu

Có nhiều phương pháp để xác định kích thước alen như: điện di trên gelagarose, điện di trên gel polyacrylamide, điện di mao quản và giải trình tự Kĩ thuậtđiện di trên gel agarose và polyacrylamide có ưu điểm là chi phí không quá cao và

dễ thực hiện, điện di trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách các alen tốt hơn

so VỚI gel agarose Tuy nhiên, kĩ thuật điện di trên gel agarose và gel

polyacrylamide có nhược điểm là gặp khó khăn trong việc phân tách chính xác kíchthước của các alen cách nhau từ một đến vài cặp nucleotide Vì vậy, dé ghi nhankích thước của các alen chính xác hơn, cần sử dụng kĩ thuật điện di mao quản hoặcgiải trình tự sản phẩm PCR trên các hệ thống máy phân tích hiện đại Mặc dù, kĩthuật giải trình tự cho kết quả chính xác hơn nhưng chi phí cao hơn điện di mao

quản Đôi với các nghiên cứu về truy xuât phả hệ, do sô mâu lớn nên kĩ thuật giải

trình tự thường không phù hợp Các nghiên cứu sử dụng chi thị microsatellite cần

độ chính xác về kích thước alen cao Hiện nay hầu hết đều sử dụng phương phápđiện di mao quan vi chi phí và độ chính xác phù hợp.

Điện di mao quan (Capillary Electropherosis - CE) là phương pháp phân tachcác chất dựa vào sự khác nhau về tốc độ chuyển động của chúng dưới tác dụng củalực điện trường và dòng điện di thâm thấu trong một mao quản hẹp, các phân tử(đoạn DNA) sẽ di chuyền với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vì điện tích,kích thước chúng khác nhau Trong một điện trường nhất định, với chất mang điện

có cùng điện tích thì chất nào có kích thước nhỏ sẽ đi chuyên nhanh hơn; với cácchất mang điện có cùng bán kính, chất nào có điện tích lớn sẽ đi chuyên nhanh hơn(Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2016).

Hệ thống điện di mao quản bao gồm các phần cơ bản như sau: hệ thống maoquản giúp phân tách đoạn DNA, dung dịch đệm điện di, nguồn điện thế, bộ phận

điều khiến và bộ phận cảm biến ghi nhận tín hiệu phân tích sau quá trình phân tách

(Hình 1.3) Trong đó, bộ phận cảm biến ghi nhận tín hiệu quyết định khả năng phântách, các hệ thống điện di mao quản hiện đại ngày nay (cụ thé như 3500 - 3500XLGenetic Analyzer) có thé ghi nhận được tin hiệu của 2 đoạn DNA có độ dài cachbiệt 1 - 2 bp Ở các hệ thống cũ hơn, độ phân tách ở mức 3 - 5 bp Vì khả năng ghinhận tín hiệu ở mức phân giải cao nên yêu cầu chính xác cao về các điều kiện nhưnhiệt độ của môi trường xung quanh khi tiến hành điện di, độ tinh sạch của sảnphẩm PCR được phân tích, độ chính xác về liều lượng của các hóa chất hỗ trợ đượcthêm vào mẫu phân tích Với các nghiên cứu có số mẫu phân tích lớn, cần điện dinhiều đợt và phải đảm bảo các điều kiện tương đồng giữa các lần phân tích để giảmthiểu sai số, độ lệch của kết quả kích thước DNA ghi nhận

Phân tach theo kích thước spectrographABI Prism

Phân tách các màu Huỳnh SS

3 Phan tach mau quang VN

n |NNEEIKS

quản (€3 CCD Panel (với các kính lọc)

dung dịch polymer) 4 Phát hiện mẫu

2 Nạp mẫu vào |S

MLoivdi: (all Phân tích bằng phan mềm

* x - 4 98 GeneMapper ID

Hon hợp các sản pham an

PCR đã được đánh dấu one I tt | | |

huỳnh quang từ phan ứng ì | | i) Ỉ ih Ì | | | ilPCR đa mỗi : : ————

1 Chuẩn bị [ 5 Phân tích kết quả |

mau

Hình 1.3 So đồ mô tả các bước phân tách và phát hiện các alen microsatellite với

hệ thông máy điện di mao quan của hang Applied Biosystems (Trích dẫn bởi Tran

Trọng Hội, 2017)

Hiện nay, GeneMapper là phần mềm chuyên dụng dùng để xác định kíchthước cặp nucleotide của alen và xác định kiểu gen bang cách so sánh kích thướcthu được ở mẫu chưa biết với kích thước thu được của các alen trong bậc thangalen Khi xác định kích thước alen, cần xem xét hai số liệu: (1) Độ lặp lại là thước

đo khả năng tạo ra kích thước giống nhau cho một đoạn nhất định thu được trong

cùng điều kiện; (2) Độ chính xác là thước đo khả năng tạo ra các kích thước gần vớikích thước thực được xác định bằng trình tự (Applied Biosystems, 2014)

Một số yếu tố ảnh hưởng đến xác định kích thước DNA trong quá trình điện dimao quản như sau: (1) Thuốc nhuộm có thé ảnh hưởng đến việc xác định kích thướcDNA vì mỗi loại thuốc nhuộm có kích thước khác nhau Mặc dù kích thước này cóthé không “chính xác” khi so sánh với kích thước thực, nhưng nó sẽ chính xác khi

so sánh với các đoạn DNA khác chạy trong cùng điều kiện; (2) Kích thước của một

đoạn được tính toán dựa trên kích thước tiêu chuẩn mà nó cùng di chuyền Các đoạn DNA được đánh dấu bằng thuốc nhuộm có thể tạo ra các kích thước khác nhau khi

chạy bằng dụng cụ khác nhau, độ dài mảng mao quản hoặc tiêu chuẩn kích thướckhác nhau (Applied Biosystems, 2014).

1.4.7.2 Danh dau huynh quang

Phuong pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng đánh dấu cho các chi thịmicrosatellite là sử dụng một loại thuốc nhuộm huỳnh quang đánh dấu ở đầu 5' củamột mỗi PCR (mỗi xuôi hoặc mỗi ngược) Các sản phẩm PCR này được điện diphân tách trên hệ thống điện di mao quản, trong đó chỉ có sợi DNA được đánh dấuhuỳnh quang được phát hiện bằng thiết bị phát hiện huỳnh quang chuyên dụng

Đến nay, công nghệ thuốc nhuộm đa màu huỳnh quang của Life Technologies

cho phép phân tích nhiều chỉ thị, bao gồm cả những chỉ thị có alen với phạm vi kích

thước trùng nhau, phân biệt bằng cách đánh dấu các môi đặc hiệu cho chỉ thị bằngcác thuốc nhuộm có màu khác nhau Năm loại màu huỳnh quang của hãng AppliedBiosystems (Hình 1.4) là 6-FAM phát ra ở bước sóng ngắn nhất và được hiển thị

dưới dạng màu xanh lam, tiếp theo là thuốc nhuộm VIC (xanh lục), NED (vàng),

PET (đỏ) va LIZ (cam).

Hình 1.4 Phổ phát xạ của năm loại thuốc nhuộm huỳnh quang hang Applied

Biosystems (Applied Biosystems, 2014)

1.4.8 Một số phương pháp tính toán sử dung trong truy xuất pha hệ

Trong truy xuất phả hệ, cần sử dụng mô hình tính toán phù hợp dựa trênnguyên tắc chính của truy xuất là tuân theo quy luật Mendel (Yue và Xia, 2014) Đó

là mỗi cá thể con thừa hưởng alen từ bố và mẹ, trong đó có các chỉ thị chứa chỉ thị

phân tử Chính vi vậy, có thé truy xuất được chính xác bố mẹ khi biết kiểu gen củacác cá thể cần phân tích Trong nhiều năm qua đã có nhiều phương pháp được sửdụng trong truy xuất phả hệ là: (1) phương pháp loại trừ (exclusion-based methods)đây là phương pháp đơn giản nhất va được dùng phô biến trong thủy sản dé phân

tích phả hệ bằng chỉ thị phân tử (Yue và Xia, 2014) Phương pháp này so sánh mộtkiểu gen cá thé con với kiểu gen của một con bố và một con mẹ dé xác định cá thé

con có thực sự là con của bố mẹ đó hay không (dựa theo quy luật Mendel là bố mẹ

chia sẻ ít nhất một alen tại bất kỳ vị trí trên nhiễm sắc thể cho cá thể con), tuy nhiên,dựa trên quy luật Mendel nên rất nhạy cảm với các lỗi kiểu gen và không cho phép

có đột biến nên cần sử dụng thận trọng và xử lí tỉ lệ lỗi kiểu gen bằng cách giới hạn

một số lượng không phù hợp (mismatch) giữa alen con cái và các alen bố mẹ của nó(Vandeputte và ctv, 2006); (2) phương pháp xác định bố mẹ dựa trên khả năng

(likelihood-based method), theo Chakraborty và ctv (1988) phương pháp này được

phat triển dé giải quyết các trường hợp khi sử dung phương pháp loại trừ không

thành công Đây là phương pháp dùng thuật toán khả năng hóa tối đa và sử dụngmột cách tiếp cận là thông qua xác suất của cá thể con khi gán với bố, mẹ giả định.Trong phương pháp nay chia ra hai loại là phương pháp phân bổ phân định(categorical allocation) (phân b6 hoàn toàn từng con con cho bố mẹ có khả năngxảy ra cao nhất phụ thuộc vào việc tính toán và so sánh các giả thuyết khác nhau về

các mối quan hệ giữa bố mẹ giả định - con con) va phân bổ một phan (fractional

allocation) (chỉ định một số con con cho cùng một cặp bố mẹ hay một con con chonhiều cặp bố mẹ theo xác suất tương ứng và khác không) Theo Yue và Xia (2014),trên đôi tượng thủy sản thì phương pháp xác định bố me bằng phương pháp phân bổphân định được sử dụng phổ biến hơn các phương pháp khác; (3) phương pháp xácsuất đầy đủ (Full Probability Parentage Analysis) là phương pháp có khả năng ướctính đồng thời các mô hình truy xuất pha hệ với các biến quan tâm với các thông tin

di truyền của quan thé; (4) phương pháp tái cấu trúc lại bố me (ParentalReconstruction) là tái tạo kiểu gen bố mẹ dựa trên kiểu gen của cá thé con thông

qua nguyên tac mỗi con cái được thừa hưởng ít nhất một alen của cặp b6 mẹ Các

kiểu gen của các cặp bố mẹ chưa biết có thé xác định được bằng cách kiểm tra mốiliên kết các alen Khi các kiểu gen được tái tạo lại, chúng có thể được so sánh vớicác kiều gen của bố mẹ tiềm năng dé chỉ định huyết thống và (5) truy xuất dựa trêntái tạo quan hệ anh em (Jones và ctv, 2010) Mặc du có nhiều phương pháp nhưngchưa có một phương pháp truy xuất nguồn gốc nao là tốt nhất cho tat cả các trườnghợp nên việc lựa chọn phương pháp tính toán dựa trên bộ dữ liệu di truyền của đề

tài (Jones và ctv, 2003).

1.4.9 Một số phần mềm dùng cho truy xuất phả hệ

Nhiều phần mềm đã được phát triển và sử dụng rộng rãi trong truy xuất phả hệ

trên động vật thủy sản (Bang 1.2) như PAPA, COLONY, CERVUS, FAMOZ, FAP, PASOS, FAMSPHER, PROBMAX, PARENTE, NewPatXL, PARFEX (Yue và

Xia, 2014) Phần mềm được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu truy xuất phả hệchủ yếu được thiết lập dựa trên hai phương pháp chính là phương pháp loại trừ vàphương pháp dựa trên các khả năng.

Bảng 1.2 Tóm tắt một số phần mềm phù hợp dé truy xuất pha hệ trên các loài thủysản (trích dẫn bởi Yue và Xia, 2014)

Chức năng chính Xác định lỗi Phân bố : À

Phần mềm theo cặp Ti bu TÚC a nh Tầnsố Lỗi/đột Nước

"` chi em (Sibling We tham khao (patent pair ° : null-alen biên

h reconstruction) allocation)

` h Duchesne và

PAPA 2.0 x X Không Tôt ctv, 2000

: j Jones va

: ot Tô COLONY 2.0 xX xX Tô ôt Wang, 2010

Vừa , Kalinowski CERVUS 3.0 xX x : Tôt

phải ° va ctv, 2007

: # Gerber và FAMOZ X xX Kém Tot ctv, 2003

` Vừa Taggart, FAP 3.6 x X Kh ‘

ons nhải 2007

Chức năng chính Xác định lỗi Phân bo

Ñ : re OK r ` - N x

Phan mém theo cap lon ue " = Tan sé Lỗi/đột EU

, Chị em (Sibling Sử tham khảo (patent pair , null -alen biên

i ctv, 1999

: Sekino va

£ Vừa ; PARFEX x x Tot hai Kakehi,

và kiêm tra cân bang Hardy-Weinberg (HWE) được kiểm định Bonferroni