2.1. Quy trình thực hiện đề tài
Thu thập mẫu vây cá bố mẹ và mẫu cơ cá con của 50 gia đình full - sib và half - sib (90 mẫu vây cá bố mẹ GO và 495 mẫu cơ cá con)
¢ Tach chiét DNA
* Multiplex PCR với 8 cặp mồi
* Dién di mao quản
* Phan tích kiểu alen bằng GeneMapper
Kiêu alen của cá bô mẹ và cá con (90 kiêu alen cá bô mẹ G0 và 495
kiêu alen cá con)
CERVUS COLONY
¥
Xác định các thông
_ : M6 phồng Khả
số hiệu suất PCR, 7 ee Truy xuat pha hé năng truy xuất ° í 5
Ho, He, Na, PIC. ae a trên a0 gin dinh
tần số alen, tan số 10.000 cá nd Bối tia ĐANG bộ 08
null alen của các ‘ chi thi
microsate]lite
` k. ~ “
" a
` ~ aA
Danh gia da dang di truyén Đánh gia nang lực truy xuất cua
cua 50 gia đỡnh ca tra chọn ơơ - oi cac microsatellite
giong
Hinh 2.1. Quy trinh thuc hién dé tai
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Từ tháng 02/2022 đến tháng 10/2022.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Di truyền phân tử, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy san II.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu cá tra gồm 50 gia đình, 90 mẫu cá bố mẹ (G0) và 495 cá con (G1) với
10 cá con/gia đình. Trong đó, có 20 gia đình là gia đình half - sib (một cá đực ghép
phối với hai cá cái) và 30 gia đình full - sib (một cá đực ghép phối với một cá cái).
Quần thể GI là cá con của quần thể G0 (quần thê G0 nuôi vỗ và cho sinh sản nhân tạo theo 4 đợt từ 22/08 - 09/10/2019 tại Trung tâm Quốc gia Giống Thủy sản Nước ngọt Nam Bộ thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II; thuộc đề tài
“Ứng dụng Công nghệ Sinh học chọn giống cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) kháng bệnh gan thận mủ, 2019 - 2020”, trong đề án “Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong lĩnh vực thủy sản đến năm 2020. Các nhóm cá bố mẹ G0, cá con G1 được lưu trữ pha hệ và được đánh dấu từ PIT (Passive Integrated Transponder) theo dõi từng cá thê.
2.3.2. Chỉ thị microsatellite
Các chỉ thị microsatellite sử dụng cho nghiên cứu này là một phần kết quả của dự án nghiên cứu “Hỗ trợ người nuôi cá tra tại đồng bằng sông Cửu Long” thuộc chương trình VLIR - UOS, Vương Quốc Bi, 2019 - 2022. Cụ thé, bộ 08 chi thị là một trong ba bộ đã được sàng lọc trong đề tài của Nguyễn Văn Sáng và ctv (2021) như sau: (1) Thu mẫu và li trích DNA tổng số của 63 mẫu cá tra; (2) Khuếch dai đoạn chỉ thị bang multiplex PCR và phân tích đoạn DNA; (3) Phân tích số liệu từng microsatellite bằng phần mềm GeneMapper 5 (Applied Biosystems), tính toán các alen ảo (null allele) theo tần số của Chakraborty và ctv (1992) và kiểm tra sai khác với cân bằng Hardy-Weinberg (HWE) bằng phần mềm MICROCHECKER 2.2.3,
đánh giá các tiêu chí hệ số đa hình (PIC), Ti lệ di hợp tử quan sát (Ho), Tỉ lệ di hợp tử mong đợi (He) được tính toán trên phần mềm CERVUS 3.0.7. Kết quả sàng lọc cho thấy kích thước sản phẩm từ 101 đến 404 bp và tỷ lệ đọc kết quả khuếch đại thành công đạt 99,88%; Số lượng alen trung bình 12,75 + 3,97 alen trên chỉ thị, tất cả các chỉ thị đều có hệ số đa hình và tỉ lệ đị hợp tử mong đợi cao (PIC>0,5,
He>0,6), tỷ lệ di hợp trung bình Ho và He trên các chỉ thị không có sự sai khác đáng
kể về mặt thống kê.
Các cặp môi microsatellite được thiết kế bằng công cụ Phobos trên phần mềm Genious Prime 2020.0.5. Nguồn dữ liệu đầu vào dé thiết kế mồi dựa trên trình
tự nucleotide của 29 scaffold được chọn định vi riêng lẻ trên 29 NST giả định trong
trình tự hệ gen cá tra (VN_pangasius) được công bồ tại cơ sở dữ liệu NCBI (Kim và ctv, 2018, https://www.geneious.com/). Các cặp môi khuếch đại các microsatellite đều được thiết kế bằng cùng thông số mặc định trên phần mềm Geneious Prime 2020.0.5 với nhiệt độ bắt cặp ở 55°C va độ dài môi từ 18 đến 24 bp. Các cặp mỗi có kích thước sản phẩm PCR phù hợp và phân bố trên các scaffold khác nhau (tương ứng với các nhiễm sắc thể khác nhau) được lựa chọn dé phat triển thành một multiplex PCR gồm 08 chỉ thị (Bảng 2.1).
Các cặp môi được khuếch đại với phản ứng PCR đơn và kiểm tra sản phẩm trên gel agarose. Cặp mỗi được chọn khi có kích thước sản pham PCR phù hợp với kích thước tham khảo; số lượng band khuếch đại < 2, sau đó phát triển thành một multiplex PCR gồm 08 cặp môi.
2.3.3. Cách lựa chọn loại màu huỳnh quang đánh dấu cho mồi
Bộ 08 mỗi được sử dụng trong một multiplex PCR, các cặp môi tạo ra sản phẩm khuếch đại trong cùng một kích thước được đánh dấu màu huỳnh quang khác
nhau tại dau 5’ của môi xuôi.
Bảng 2.1. Danh sách các microsatellite được sử dụng trong nghiên cứu
Loại màu huỳnh quang Khoảng kích thước alen
Chỉ thị NST Mô típ Trình tự mồi (5' - 3')
sử dụng tham khao* (bp) , F: GCACGTTTCACCTCCATCCA
Pahy - 05 Sô7 (CT)21 200 - 259
R: GTTGCAGGAAAACACCACGG , F: AGCGTTTCTTATCCCGCCTC
Pahy - 07 S69 (AC)20 139 - 199
R: CAGACAGTTTCCCTGGTGGT : E: AGGTGAAAATCCCCGAGCAG
Pahy - 08 Sô 11 (CA)17 139 - 199
R: TCCCGATGCCAGAGAACCTA l F: TCAGTGCACGTCTTACCCAC
Pahy - 09 Sô 12 (AC)20 > 260 R: CGTTGTGTGCCCTCAAAGTG
: F; TCTTGAACACGTGGAGGAGC
Pahy - 14 Sô 20 (CT)15 >260 R: TATGGCTATGGCTGCTGAGC
, B) CACGCTGAGTGTGAAATGCC
Pahy - 16 So 22 (CA)25 200 - 259 R: TGCTTTCCCATGATGCACCT
, F: ACCCTCTGTGGTGTCCTTCA
Pahy - 19 Sô 26 (AC)15 > 260 R: GGGACTCTGTGGAGCGTAAC
, ti GCGCTGATGTGCTTTTATACTGA
Pahy - 20 S627 (AG)20 119-159 GATGCTGCCAGACACTGAGT
* Là kích thước microsatellite ghi nhận khi thiết kế môi dua trên dữ liệu bộ gen toàn phan cá tra, da được công bô bởi Nguyễn Văn Sáng
Các môi được đánh dau bằng 4 loại màu huỳnh quang là PET (đỏ), VIC (Xanh lá), 6FAM (xanh dương), NED (vàng) (Nguyễn Văn Sáng và ctv, 2020) (Bảng 2.1). Việc chọn loại màu huỳnh quang dé đánh dấu môi tiễn hành cụ thé theo
các bước sau:
(1) Chon cặp môi có kích thước sản phẩm PCR tham khảo nhỏ nhất (kích thước tham khảo là kích thước sản phẩm có được khi tiến hành thiết kế mồi trên phần mềm Genious Prime 2020.0.5) làm chuẩn.
(2) Từ chuẩn có được, trong khoảng kích thước + 50 bp với chuẩn là trung tâm, các cặp môi khác nếu có kích thước sản phẩm tham khảo nằm trong khoảng nay sẽ được lựa chọn loại màu đánh dấu khác nhau. Nếu số lượng mỗi có kích thước tham khảo trong khoảng kích thước này lớn hơn 4, cần điều chỉnh khoảng kích thước nhỏ lại sao cho số môi tối đa trong 1 khoảng là 4 mồi.
(3) Tiếp tục thực hiện lại các bước trên với các mồi còn lại đến khi toàn bộ mồi đều chọn được màu huỳnh quang phù hợp.
2.3.4. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 2.3.4.1. Tách chiết DNA
Hóa chat: dung dich 1 (li giải tế bào) gồm Tris HCI 50 mM (pH 8,0); EDTA 20 mM (pH 8,0); SDS 2%, dung dich 2 (Tua các thành phần khác DNA) gồm NaCl
(6M); Proteinase K (20 mg/ml), Ethanol.
Thiết bị: máy li tâm lạnh, cân phân tích 4 số lẻ, máy ủ nhiệt khô.
2.3.4.2. PCR
Hóa chat: QIAGEN multiplex PCR Kit, hỗn hợp môi có đánh dau huỳnh quang, nước cất khử ion.
Thiết bị: may PCR Bio - Rad S1000 96 - well.
2.3.4.3. Điện di mao quản
Hóa chat: Hi - Di TM Formamide; thang chuan GenScan TM 500 LIZ®.
Thiết bị: hệ thống 3500 Genetic Analyzer tại công ty Nam Khoa (793/58 Tran Xuân Soạn, Quận 7, thành phó Hồ Chí Minh).
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền quần thể chọn giống bằng chỉ
thị microsatellite
2.4.1.1. Phương pháp thu mẫu, tách chiết DNA tổng số, PCR, điện di mao quản và ghi nhận sản phẩm
a) Phương pháp thu mẫu và quản lí mẫu vây các quần đàn Phương pháp thu mẫu cá tra
Trong nghiên cứu này, cá bố mẹ và các cá thể con đều đã được đánh dấu từ PIT từ trước dé xác định chính xác gia đình.
Mẫu vây ngực của nhóm cá bố mẹ (3,5 - 8kg) và mẫu cơ thịt của nhóm cá con (20 - 25g) được thu tại Trung tâm Quốc gia Giống Thủy sản Nước ngọt Nam Bộ (xã An Thái Trung, Cái Bè, Tiền Giang) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy san II. Tiếp theo, các nhóm mẫu được đựng trong ống eppendoft 1,5 ml; ngập trong cồn 70°, có dán nhãn riêng biệt mã hóa theo từng gia đình (Bang 2.2). Sau đó, mẫu được đặt trên đá ướt để vận chuyên và bảo quản lạnh ở 4°C cho đến khi thực hiện li trích DNA (Fishback, 1999) tại phòng thí nghiệm Di truyền phân tử thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy san II tại số 116 Nguyễn Đình Chiêu, Da Kao, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh.
Phương pháp quản lí các quan đàn
Đề quản lí các cá thể trong quần đàn, tất cả cá bố, cá mẹ và cá con được mã
hóa như sau:
(i) Đối với gia đình full - sib thì cá bố mã: “D” (+) “số thứ tự gia đình”; cá mẹ mã: “C” (+) “số thứ tự gia đình”; cá con mã: “số thứ tự gia đình” (+) “ - ” (+)
“số thứ tự trong gia đình”.
(ii) Đối với gia đình half - sib thì cá bố mã: “D” (+) “số thứ tự gia đình 1” (+)
“-” (+) “số thứ tự gia đình 2”; cá mẹ mã: “C” (+) “số thứ tự gia đình”; cá con mã:
“số thứ tự gia đình” (+) “ - ” (+) “số thứ tự trong gia đình”. Đại diện thông tin mã hóa một số gia đình được trình bày ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Đại diện thông tin mã hóa cho cá bố, cá mẹ và cá con của gia đình full -
sib va gia đình half - sib.
Magia Kiểugia Mã cábốvàcámẹ Số lượng và mã cá con trong
đình đình cá bố cá mẹ gia đình 510-01 510 - 02 510 - 03 510 - 04 510 - 05 510 - 06 510 - 07 510 - 08 510 - 09 510 - 10 741- 01 741 - 02 741 - 03 741 - 04 741 - 05 741 - 06 741 - 07 741 - 08 741 - 09 741 - 10 743 - 01 743 - 02 743 - 03 743 - 04 743 - 05 743 - 06 743 - 07 743 - 08 743 - 09 743 - 10
b) Phương pháp tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số
STT
1 510 full - sib D510 C510
49 741 half - sib C741
D743-741
50 743 half - sib C743
Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Mẫu vây ngực cá tra được lấy trong ống eppendoft bảo quản trong cồn 70°, thấm khô cồn bằng giấy thấm, sau đó tiến hành tách chiết DNA theo phương pháp
kết tủa bằng muối (Miller và ctv, 1988) có hiệu chỉnh theo điều kiện của phòng thí nghiệm. Mẫu vây ngực cá tra được cắt thành một lượng mẫu có kích thước khoảng 5 mm” và được cho vào tube 1,5 ml. Thêm vào ống chứa mẫu 500 pl dung dich li giải (50 mM Tris HCI (pH 8,0); 20 mM EDTA (pH 8,0); 2% SDS) và bổ sung 5 ul proteinase K (20 mg/ml), vortex nhanh. Mau được ủ ở 55°C trong 2 giờ. Tiếp theo thêm 250 pl dung dich NaCl 6M, vortex mạnh. Mẫu được li tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch nổi cho vào ống 1,5 ml mới, thêm 1.000 ul ethanol 100% lạnh và ủ ở nhiệt độ 4°C trong 2 giờ. Sau đó li tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ địch nổi và rửa DNA bang 500 pl ethanol 70%. Li tâm mẫu với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và làm khô DNA bằng máy gia nhiệt ở 55°C hoặc để ở nhiệt độ phòng. DNA được hòa tan
trong dung địch TE và bảo quản ở nhiệt độ - 20°C.
Phương pháp kiểm tra chất lượng DNA tổng số
DNA tông số sau khi tách chiết được điện di trên gel agarose 1% để xác định sự hiện diện của DNA. Xác định kích thước alen dựa trên thang DNA chuẩn HyperLadderTM (100 bp) của Bioline (Anh) dé đọc và phân tích kết quả. Các mẫu cho vạch DNA tổng số sỏng, rừ, ớt bi đứt gay sẽ được do chi số ODằso;2so dộ kiểm tra độ tinh sạch. Những mẫu có nồng độ và độ tinh sạch cao (1,7 < ODz¿oz§o < 2) là mau li trích thành công và được dùng cho phản ứng PCR.
c) Phương pháp multiplex PCR
Quá trình PCR sử dụng Master mix QIAGEN Multiplex PCR Kit (bao gồm Taq DNA Polimerase, đệm phản ứng, MgCl, và hỗn hợp dNTP). Mỗi phản ứng
multiplex PCR sử dung (Bang 2.3) 1 wl DNA khuôn, 5 pl PCR Master Mix, 0,2 pl
hỗn hợp mồi, 3,8 ul nước cất, tổng thé tích phan ứng là 10 pl. Chu trình nhiệt và
nhiệt độ của phản ứng PCR (Bảng 2.4) như sau: 95°C trong 900 giây, 30 chu kì bao
gồm 95°C trong 30 giây, 55°C trong 90 giây, 72°C trong 60 giây và giai đoạn kéo đài cuối cùng ở 60°C trong 1.800 giây (Nguyễn Văn Sáng, 2016; Bùi Thị Liên Hà,
2017).
Bang 2.3. Thành phan thê tích trong phản ứng multiplex PCR
Thành phần Nồng độ đầu Thể tích sử dụng (ml)
caine multiplex sự s0 PCR mix
Primer xuôi 10uM 0,1 Primer ngược 10uM 0,1 DNA 50 ng/H]. 1,0
Nước cất - 3,8
Bang 2.4. Chu trình phan ứng multiplex PCR
Chu trinh Nhiệt độ (°C) Thi gian (s) Số chu ki Biến tính khởi đầu 95 900 |
Biến tính 95 30
Bắt cặp 55 90 30
Kéo dài 72 60
Kéo dài cuối cùng 60 1800 1
Lam mat 10 |
d) Phương pháp điện di mao quản
Hỗn hợp phân tích bằng điện di mao quản bao gồm: 1 yl sản phẩm PCR, 11,8 ul Hi - Di TM Formamide (chống đứt gãy DNA) và 0,2 wl thang chuẩn GenScan TM 500 LIZ® (Hình 2.2) tổng thé tích hỗn hợp cho là 13 wl. Sản phẩm PCR được đọc kết quả bằng máy điện di mao quản 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), xuất ra đưới dạng biéu đồ hình ảnh và kích thước sản phẩm PCR bằng phần mềm GeneMapper 5.0 (Applied Biosystems) phiên bản 1.2.0.
20 2499 By seo ơ
Hình 2.2. Thang chuẩn GenScan TM 500 LIZ®
Ký hiệu dấu “*” trong hình sử dụng như một chi báo về độ chính xác trong một lan chạy mà không sử dụng dé xác định kích thước alen, các đỉnh có phạm vi từ 35 đến 500 bp.
Tiêu chuẩn kích thước này được khuyến nghị để phân tích các chỉ thị vi vệ tỉnh tri- và tetranucleotide, thường có chiều dài vượt quá 400 bp (Applied Biosystems, 2014).
2.4.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền quần thể chọn giống và đánh giá các microsatellite phù hợp cho truy xuất pha hệ
Tính phù hợp cho truy xuất phả hệ của các microsatellite được đánh giá thông qua hai đặc tính là tính ôn định và tính đa hình:
s* Tính 6n định của bộ 08 microsatellite
Theo khuyến cáo của Yue và Xia (2014) nên sàng lọc các microsatellite ôn định và có hiệu suất PCR trên 90%, missing data < 5%. Vì vậy, cần đánh giá tính ổn định của các chỉ thị trên 50 cá thể bố me GO và 495 cá thé G1. Đánh giá tính ổn định của microsatellite qua hiệu suất PCR theo tính theo công thức:
" k Số mau có sản phầm PCR
Hiệu suất PCR (%) = =———— x 100
Tong số miu thực hiện PCR s* Tinh đa hình bộ 08 microsatellite
Theo Botstein va ctv (1980), các microsatellite được sử dung cho truy xuất
pha hé cần dam bảo các thông số đa dạng di truyền như Na > 5; PIC > 0,5; He > 0,6
và tan số null - alen < 0,2. Mỗi thông số có ý nghĩa và cách xác định như sau:
- (1) Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) đề cập đến giá trị của một chi thị dé phát hiện tính đa hình trong quan thé. Theo Botstein va ctv (1980) tính hữu ích của các chỉ thị phân tử có thê được đo lường dựa trên thông tin đa hình PIC.
Giá trị này phụ thuộc vào sé lượng alen có thể phát hiện được và sự phân bồ tần số của chúng, được tính theo công thức sau: PIC =1 - DPi2 (trong đó Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i). Chang hạn, PIC của một chỉ thi microsatellite có hai alen với tan số 0,5 là 1 - [(0,5)2+(0,5)2] = 0,5, trong khi PIC của chỉ thị có hai alen với tần số là 0,9 và 0,1 là 0,18. Như vay, số lượng alen càng nhiều thì giá trị PIC càng lớn.
- (2) Giá tri di hợp tử H (gồm có giá tri di hợp tử mong đợi He - Expected
Heterozygosity và giá tri dị hợp tử quan sát Ho - Observe Heterozygosity): tỉ lệ di
hop tử là chỉ số đánh giá mức độ đa dang di truyền của quan thé, phản ánh tiềm năng di truyền và khả năng thích ứng của nguồn gen. Nếu giá trị Ho < He thì quần thể có khả năng giao phối cận huyết, ngược lại nếu Ho = He thì quần thê giao phối ngẫu nhiên. Tỉ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức:
k
HN ứ ằ“SNC1( HÁN
J=
Trong đó: Pj là tần số alen thứ j tại chi thị thứ i với k số alen trong quan thé va N là số lượng cá thể, giả sử rằng dân số là ở trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg.
- (3) Số lượng alen (Na) là số lượng alen có thé ghi nhận được từ kết quả điện
di mao quản.
- (4) Tan số null - alen (alen ảo): theo Dakin và Avise (2004), các chỉ thi microsatellite có tần số null - alen lớn hơn 0,2 có thé anh hưởng nhiều đến kha năng truy xuất phả hệ. Vì vậy, cần lưu ý các chỉ thị có tần số null - alen cao nếu xuất hiện trong bộ chỉ thị. Sau khi tiến hành truy xuất với bộ chỉ thị ban đầu sẽ tiến hành loại các chỉ thị có tần số null - alen cao dé tiến hành truy xuất lặp lại nhằm đánh giá tác động của chỉ thị đến hiệu quả truy xuất.
- (5) Cân bằng Hardy-Weinberg (HWE): Đối với một quần thể giao phối ngẫu nhiên, nếu kích thước lớn và không có áp lực của các nhân tổ tiến hóa thì tần số alen sẽ được duy trì ôn định từ thế hệ này sang thế hệ khác và tần số các kiểu gen (của
một gen gồm hai alen khác nhau) được biéu diễn bằng công thức (p+q) =p’ +2pq + q =1. Dua vào mức độ chênh lệch từ phan phối cân bằng HWE của một quần thé cho thấy trang thái di truyền liên quan đến sự ghép đôi giao phối các cá thé có thé ở trạng thái giao phối ngẫu nhiên hay xu thé giao phối cận huyết.
2.4.2.3. Phương pháp phân tích dir liệu alen, đánh giá đa dang di truyền quan thể chọn giống
a) Phương pháp phân tích dữ liệu alen bằng phan mềm GeneMapper
Trong nghiên cứu này, đã sử dụng phén mềm GeneMapper 5.0 dé phân tích kiểu gen, các bước được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Applied Biosystems, 2012). Kết quả cho phép xác định được kiểu alen 08 chi thi
nghiên cứu (Pahy - 05, Pahy - 07, Pahy - 08, Pahy - 09, Pahy - 14, Pahy - 16, Pahy -
19 và Pahy - 20) của mỗi mẫu phân tích. Dữ liệu điện di thé hiện dưới dạng biéu đồ hình ảnh, được phân tích qua chiều cao của đỉnh (peak), kích thước của sản pham khuéch dai (Hinh 2.3, Hinh 2.4, Hinh 2.5).
Size [bp]
Intensity (RFU) BERET ERTE ESD
X Ðè 3
L
Hình 2.3. Biểu đồ hình ảnh của tat cả chi thị sau khi phân tích bằng phần mềm
GeneMapper (Applied Biosystems, 2014)
Các mẫu được ghi nhận kết quả alen phải dam bao yêu cầu như sau: (1) các
đỉnh có dạng đỉnh nhọn, chân đỉnh rõ rang; (2) cường độ tín hiệu của alen ghi nhận
không vượt quá mức ghi nhận tối đa của hệ thống 3500 Genetic Analyzer (400 - 32.000 đơn vị đo); (3) số lượng đỉnh tối đa là 2 (trường hợp kiểu gen đị hợp) và gần
tương đương nhau, tín hiệu của alen có kích thước nhỏ cao hơn alen có kích thước
lớn (do đoạn DNA có kích thước ngắn được khuếch dai dé hơn khi thực hiện phan