mau
Hình 1.3. So đồ mô tả các bước phân tách và phát hiện các alen microsatellite với hệ thông máy điện di mao quan của hang Applied Biosystems (Trích dẫn bởi Tran
Trọng Hội, 2017)
Hiện nay, GeneMapper là phần mềm chuyên dụng dùng để xác định kích thước cặp nucleotide của alen và xác định kiểu gen bang cách so sánh kích thước thu được ở mẫu chưa biết với kích thước thu được của các alen trong bậc thang alen. Khi xác định kích thước alen, cần xem xét hai số liệu: (1) Độ lặp lại là thước đo khả năng tạo ra kích thước giống nhau cho một đoạn nhất định thu được trong cùng điều kiện; (2) Độ chính xác là thước đo khả năng tạo ra các kích thước gần với kích thước thực được xác định bằng trình tự (Applied Biosystems, 2014).
Một số yếu tố ảnh hưởng đến xác định kích thước DNA trong quá trình điện di mao quản như sau: (1) Thuốc nhuộm có thé ảnh hưởng đến việc xác định kích thước DNA vì mỗi loại thuốc nhuộm có kích thước khác nhau. Mặc dù kích thước này có thé không “chính xác” khi so sánh với kích thước thực, nhưng nó sẽ chính xác khi so sánh với các đoạn DNA khác chạy trong cùng điều kiện; (2) Kích thước của một đoạn được tính toán dựa trên kích thước tiêu chuẩn mà nó cùng di chuyền. Các đoạn DNA được đánh dấu bằng thuốc nhuộm có thể tạo ra các kích thước khác nhau khi
chạy bằng dụng cụ khác nhau, độ dài mảng mao quản hoặc tiêu chuẩn kích thước
khác nhau (Applied Biosystems, 2014).
1.4.7.2. Danh dau huynh quang
Phuong pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng đánh dấu cho các chi thị microsatellite là sử dụng một loại thuốc nhuộm huỳnh quang đánh dấu ở đầu 5' của một mỗi PCR (mỗi xuôi hoặc mỗi ngược). Các sản phẩm PCR này được điện di phân tách trên hệ thống điện di mao quản, trong đó chỉ có sợi DNA được đánh dấu huỳnh quang được phát hiện bằng thiết bị phát hiện huỳnh quang chuyên dụng.
Đến nay, công nghệ thuốc nhuộm đa màu huỳnh quang của Life Technologies cho phép phân tích nhiều chỉ thị, bao gồm cả những chỉ thị có alen với phạm vi kích thước trùng nhau, phân biệt bằng cách đánh dấu các môi đặc hiệu cho chỉ thị bằng các thuốc nhuộm có màu khác nhau. Năm loại màu huỳnh quang của hãng Applied Biosystems (Hình 1.4) là 6-FAM phát ra ở bước sóng ngắn nhất và được hiển thị dưới dạng màu xanh lam, tiếp theo là thuốc nhuộm VIC (xanh lục), NED (vàng),
PET (đỏ) va LIZ (cam).
Dyes
6-FAM VIC NED PET LIZ.
c 100 I 1 1 1 1
©
@ 80
€ LÍ 60
sN 40
®
E 20
©
= 0
500 550 600 650 700
Wavelength (nm)
Hình 1.4. Phổ phát xạ của năm loại thuốc nhuộm huỳnh quang hang Applied
Biosystems (Applied Biosystems, 2014)
1.4.8. Một số phương pháp tính toán sử dung trong truy xuất pha hệ
Trong truy xuất phả hệ, cần sử dụng mô hình tính toán phù hợp dựa trên nguyên tắc chính của truy xuất là tuân theo quy luật Mendel (Yue và Xia, 2014). Đó là mỗi cá thể con thừa hưởng alen từ bố và mẹ, trong đó có các chỉ thị chứa chỉ thị
phân tử. Chính vi vậy, có thé truy xuất được chính xác bố mẹ khi biết kiểu gen của các cá thể cần phân tích. Trong nhiều năm qua đã có nhiều phương pháp được sử dụng trong truy xuất phả hệ là: (1) phương pháp loại trừ (exclusion-based methods) đây là phương pháp đơn giản nhất va được dùng phô biến trong thủy sản dé phân tích phả hệ bằng chỉ thị phân tử (Yue và Xia, 2014). Phương pháp này so sánh một kiểu gen cá thé con với kiểu gen của một con bố và một con mẹ dé xác định cá thé con có thực sự là con của bố mẹ đó hay không (dựa theo quy luật Mendel là bố mẹ chia sẻ ít nhất một alen tại bất kỳ vị trí trên nhiễm sắc thể cho cá thể con), tuy nhiên, dựa trên quy luật Mendel nên rất nhạy cảm với các lỗi kiểu gen và không cho phép có đột biến nên cần sử dụng thận trọng và xử lí tỉ lệ lỗi kiểu gen bằng cách giới hạn một số lượng không phù hợp (mismatch) giữa alen con cái và các alen bố mẹ của nó (Vandeputte và ctv, 2006); (2) phương pháp xác định bố mẹ dựa trên khả năng
(likelihood-based method), theo Chakraborty và ctv (1988) phương pháp này được
phat triển dé giải quyết các trường hợp khi sử dung phương pháp loại trừ không thành công. Đây là phương pháp dùng thuật toán khả năng hóa tối đa và sử dụng một cách tiếp cận là thông qua xác suất của cá thể con khi gán với bố, mẹ giả định.
Trong phương pháp nay chia ra hai loại là phương pháp phân bổ phân định (categorical allocation) (phân b6 hoàn toàn từng con con cho bố mẹ có khả năng xảy ra cao nhất phụ thuộc vào việc tính toán và so sánh các giả thuyết khác nhau về các mối quan hệ giữa bố mẹ giả định - con con) va phân bổ một phan (fractional allocation) (chỉ định một số con con cho cùng một cặp bố mẹ hay một con con cho nhiều cặp bố mẹ theo xác suất tương ứng và khác không). Theo Yue và Xia (2014), trên đôi tượng thủy sản thì phương pháp xác định bố me bằng phương pháp phân bổ phân định được sử dụng phổ biến hơn các phương pháp khác; (3) phương pháp xác suất đầy đủ (Full Probability Parentage Analysis) là phương pháp có khả năng ước tính đồng thời các mô hình truy xuất pha hệ với các biến quan tâm với các thông tin di truyền của quan thé; (4) phương pháp tái cấu trúc lại bố me (Parental Reconstruction) là tái tạo kiểu gen bố mẹ dựa trên kiểu gen của cá thé con thông qua nguyên tac mỗi con cái được thừa hưởng ít nhất một alen của cặp b6 mẹ. Các
kiểu gen của các cặp bố mẹ chưa biết có thé xác định được bằng cách kiểm tra mối liên kết các alen. Khi các kiểu gen được tái tạo lại, chúng có thể được so sánh với các kiều gen của bố mẹ tiềm năng dé chỉ định huyết thống và (5) truy xuất dựa trên tái tạo quan hệ anh em (Jones và ctv, 2010). Mặc du có nhiều phương pháp nhưng chưa có một phương pháp truy xuất nguồn gốc nao là tốt nhất cho tat cả các trường hợp nên việc lựa chọn phương pháp tính toán dựa trên bộ dữ liệu di truyền của đề
tài (Jones và ctv, 2003).
1.4.9. Một số phần mềm dùng cho truy xuất phả hệ
Nhiều phần mềm đã được phát triển và sử dụng rộng rãi trong truy xuất phả hệ
trên động vật thủy sản (Bang 1.2) như PAPA, COLONY, CERVUS, FAMOZ, FAP, PASOS, FAMSPHER, PROBMAX, PARENTE, NewPatXL, PARFEX (Yue và
Xia, 2014). Phần mềm được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu truy xuất phả hệ chủ yếu được thiết lập dựa trên hai phương pháp chính là phương pháp loại trừ và
phương pháp dựa trên các khả năng.
Bảng 1.2. Tóm tắt một số phần mềm phù hợp dé truy xuất pha hệ trên các loài thủy sản (trích dẫn bởi Yue và Xia, 2014)
Chức năng chính Xác định lỗi
Phân bố : À
Phần mềm theo cặp Ti bu TÚC a nh Tầnsố Lỗi/đột Nước
"`. chi em (Sibling We tham khao (patent pair ° : null-alen biên
h reconstruction) allocation)
` h Duchesne và PAPA 2.0 x X Không Tôt ctv, 2000
: j Jones va : ot Tô
COLONY 2.0 xX xX Tô ôt Wang, 2010
Vừa , Kalinowski CERVUS 3.0 xX x : Tôt
phải ° va ctv, 2007
: # Gerber và FAMOZ X xX Kém Tot ctv, 2003
` Vừa Taggart, FAP 3.6 x X Kh ‘
ons nhải 2007
Chức năng chính Xác định lỗi Phân bo
ẹ : re OK r ` - N x
Phan mém theo cap lon ue " = Tan sé Lỗi/đột EU
, Chị em (Sibling Sử tham khảo (patent pair , null -alen biên
h reconsfrucfion) allocation)
` # Duchesne và PASOS 1.0 X X Không Tôt ctv, 2005
Rodri