Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát tác động của một số chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành protocorm like bodies cây trầu bà lá nhỏ (Anubias barteri var. nana)

Do đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học - nuôi cấy mô tế bào thực vật sẽ khắc phục những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống tạo ra nguồn cây giống có chất lượng tốt phục vụ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO >

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHAO SAT TÁC ĐỘNG CUA MỘT SO CHAT DIEU HOA SINH TRUONG DEN SU HINH THANH PROTOCORM LIKE BODIES CAY TRAU BA LA NHO

(Anubias barteri var nana)

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : NGUYÊN VĂN TÍNH

Mã số sinh viên : 19126185

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thu Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CUA MOT SO CHÁT ĐIÊU HÒA SINH TRƯỞNG ĐÉN SỰ HÌNH THÀNH

PROTOCORM LIKE BODIES CAY TRAU BÀ LA NHỎ

(Anubias barteri var nana)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYÊN VŨ PHONG NGUYÊN VĂN TÍNH

ThS HÀ THỊ TRÚC MAI

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Dé có thé hoàn thành khóa luận tốt nghiệp như ngày hôm nay, là một chặng đườngkhá dài và vất vả Bên cạnh những nỗ lực và cố gắng của bản thân, em xin chân thành cam

ơn quý thầy cô giáo — giảng viên trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tận tình

giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ich cho em trong suốt quá trình học tập vừa qua

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến thay PGS.TS Nguyễn VũPhong đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu; truyền đạt cho

em kiến thức, kinh nghiệm chuyên môn quý giá, góp ý chỉnh sửa cho em trong quá trìnhthực hiện khóa luận Cảm ơn thầy đã cung cấp cho em các điều kiện cơ sở vật chất và luônđộng viên tinh thần, nhờ vậy em mới có thé hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn các anh chị, các bạn và tập thé phong PIB Cam on chi Ha

Thị Trúc Mai, chi Dang Huỳnh Thúy Vy, chi Trần Thị Kim Ngân đã nhiệt tình hướng

dẫn, giúp đỡ, góp ý trong suốt khoảng thời gian em thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, cha mẹ vì đã luôn theo

dõi, lo lắng, động viên và an ủi con trong suốt thời gian qua, trở thành chỗ dựa vững chắcgiúp con vượt qua thời gian khó khăn, thử thách và là động lực to lớn đề con tiếp tục phấnđâu và nỗ lực

Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người vì những điều tốtđẹp nhất mà mọi người đã dành cho em

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Nguyễn Van Tinh, MSSV: 19126185, lớp: DH19SHD thuộc ngành Công

nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây làkhóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

trước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hô Chi Minh, ngày 28 tháng 03 năm 2024

Người viet cam đoan

Nguyễn Văn Tính

1

TÓM TẮT

Anubias barteri var nana, một loài cây cảnh thủy sinh có giá trị cao thuộc họ ráy.

Nghiên cứu này nhằm thiết lập một quy trình vi nhân giống cây A barteri var nanathông qua sự hình thành protocorm like bodies (PLBs) để nhân giống nhanh chóng vàhiệu quả Trong thí nghiệm cảm ứng sự hình thành PLBs, chéi in vitro được tách bỏ lá

và cắt lát theo chiều ngang được nuôi cấy trên môi trường bổ sung kết hợp benzyl

adenine (BA) và Naphthaleneacetic acid (NAA) Sau 8 tuần nuôi cấy, kết qua cho thấy

sự hình thành PLBs tốt nhất trên môi trường bồ sung 1,5 mg/L BA va 0,5 mg/L NAA

với tỉ lệ hình thành PLBs là 100% va số lượng PLBs/mẫu là 7,78 Nghiên cứu cũng tiến

hành bổ sung dịch nghiền khoai tây ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy

dé theo dõi sự tái sinh chồi từ PLBs Trên môi trường bé sung 50 g/L dịch nghiền khoaitây cho chất lượng chéi và hiệu quả tái sinh chồi từ PLBs tốt nhất Trong giai đoạn ra

rễ, chồi A barteri var nana được chuyên sang môi trường có bé sung IBA ở các nồng

độ từ 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L dé theo dõi khả năng hình thành rễ và tạo cây hoàn chỉnh.Kết quả cho thấy, trên môi trường bồ sung 0,5 mg/L IBA cho hiệu quả tốt nhất tao ra 6,19

rễ với chiều dải rễ là 2,5 cm, chiều cao cây đạt 4,72 cm và mỗi cây có 6,81 lá Cay conđược chuyên ra môi trường ex vitro có khả năng sống, sinh trưởng và phát triển tốt

Từ khóa: Anubias barteri var nana, nhan giống in vitro, protocorm like bodies (PLBs)

il

Anubias barteri var nana, a highly valued ornamental aquatic plant in the Araceae family This study established a micropropagation process for A barteri var nana through the formation of protocorm like bodies (PLBs) for an efficient propagation protocol In the PLBs formation experiment, in vitro shoots were seperated and sliced horizontally, that were then cultured on a medium supplemented with benzyl adenine (BA) combined with Naphthaleneacetic acid (NAA) After 8 weeks of culture, the best PLBs formation was seen on medium supplemented with 1.5 mg/L BA and 0.5 mg/L NAA with a PLBs formation rate of 100% and 7.78 PLBs/explant This study also added potato extract at different concentrations to the culture medium to monitor shoot regeneration from PLBs On medium supplemented with 50 g/L potato extract, the best shoot quality and shoot regeneration efficiency from PLBs were obtained During the rooting stage, shoots of Anubias barteri var nana was transferred to a medium supplemented with IBA at concentrations ranging from 0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 mg/L to monitor the ability to form roots and create complete plants The results showed that on the medium supplemented with 0.5 mg/L IBA had the best effect, creating 6.19 roots with a root length of 2.5 cm, plant height reaching 4.72 cm and each plant having 6.81 leaves The in vitro plantlets accumualated well in the ex vitro condition.

Keywords: Anubias barteri var nana, in vitro propagation, protocorm like bodies (PLBs).

IV

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM 0) 5-5222 2S22122122121111111111111111111212111121212111 1e iXÁC NHAN VA CAM DOAN 0 sscsssssssessesessessesecsesscssssesecsessessesecsessessatseceneseseeees ii

6 | HE] ——=ằằ——— iii

SC ` ŸằằăằnằẽằẽẼẽễẽẽằằễễằ= iv MỤC LUG oececcccsesessessessessesssesvceesssssssesavssecsssvssssesssssussssessssaesecsussussseesesscsecaseseeeseeees Vv

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TAT ssssscssssssssssssssssssssssssvsssesssssssssssssssseessseeees vii

Oi See SN Ả viii

DANH SÁCH CAC HÌNH 2 22+S+E2E2EEE2E125122121121122122121121122121 21.2 ix

CHƯƠNG 1 MO DAU o.oo cccccsscsscsessessessesssesecsesesucsscsesussucsesuesssseseessseseeetsseeseensaeeeees 1

1.1 Đặt vấn đề 2-5-2122 1221211212112112121121121112112111221121012221212222121 2 re |

ee CL Tỉ luaenaraeeboornaggotisrigoaGE-0tt0nI0000E51000G00000298000G0G008400800 2

15 NOT đi thười HIỂT.¡s-sceesasassiaioEELSLG20A2G4082á2010e000e88u000.8L01385 guilE.cuiuSg0M85 eee 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU 2 2 2+222E+EE2E2E£EE2E2EzEE2EzZEzzzzrx 3

2.1 Tổng quan về cây Anubias barteri Var H4H4 22-522-552225+22cz+cs+csszxsrea 3

2.1.1 Phân loại - 2 +s+S2S12ESEE2E21221212111121111111111111112111111111101121 01a 3

2.1.2 Đặc điểm hình thất c-cecceeenininiioenioideilsgA0611000048161011001300101121105616110700146 3

0 oo 4

DN Ae MGC (GÍGH SU AUIS ss ccwenssnnsusticenst.astatsn snnsiddnannintnsn dducttihsheun vase chevn stesennsbdeaxatnnatied 4

2.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật - 2 2 2222z2zzzzz2zzzzzzzz+2 4

2.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cây Tổ lễ bảo thực vẬ eeeaesieiidiikeiaraseoses 42.2.2 Ý nghĩa của nuôi cay mô tế bào thực vật - 2 2+2+22222zzzzxzzxzzzzzez 52.3 Tổng quan về protocorm like bodies -222+22222222+z2+z+zzz2E2Ezzzzzzzzzzze2 5

2.3.1 Khái niệm và cơ sở hình thành PLBs - 2 - 22 E23 2 +22 vreeeezzzrree 5

2.3.2 Các yêu tố chính ảnh hưởng đến sự phát sinh PLBs 2 - 255: 72.4 Tình hình nghiên cứu về cây họ ráy -2 -22-222++22+222+22EE+22EEerErrrrkrcrrev 9

2.5 Tình hình nghiên cứu về PLBs cây họ ry -c.scccsccccsscssesescsrsccssessceseesnssessennees 10

2.6 Tình hình nghiên cứu cây A barteri Var /!đH - 555 <+<<+<£+<c+c+ecsesee 12

CHƯƠNG3 VAT LIỆU Và PHƯƠNG BEAD cu eieieeeisieeadiobonee 14

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2- 22 2 +2222xt2E2Exerxrrrrrrkerree 14

3.2 Wat Ie Winig 1 Ci CU ices ee a en en eee ee ee si 143.2.1 Nguồn Mau eccceccccccccseesseesssesssesssessseseesessesssssitsssssiseessssussesiseseesissesseseeeees 14

3.2.2 MOi trudng NUGI CAY a3 14

3.3; PHƯớñG phap NSNICH GỬ wsscesencasnsasnsnsmncaeema nna hung ES544503855 353180830 S:6u 15

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hop NAA đến sự hình thành PLBs cây trau bà

CHƯƠNG 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN -. - 22 2+22+2+2E+Ez2E2E+£zzzzzcrez 19

4.1 Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến sự hình thành PLBs cây trầu bà

4.2 Khảo sát ảnh hưởng dịch nghiền khoai tây đến sự tạo chéi từ PLBs 24

4.3 Khảo sát ảnh hưởng IBA đến khả năng hình thành rễ và tạo cây trầu bà lá nhỏ

reorient cemeteries teehee tre odin peer te drs temo toe tect 25

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ, - 2-22 222z+22£2EE+2E222EzZEzzzzzzzcex 29

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

2-IP : N6 -(2-isopentenyl) adenine

ABA : Abscisic acid

GA3 : Gibberellic acid

IAA : Indole-3-acetic acid

IBA : Indole-3-butyric acid

KI : Kinetin

MS : Murashige and Skoog, 1962

NAA : œNaphthalene acetic acid

PLBs : Protocorm like bodies

TDZ : Thidiazuron

vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 3.1 Nong độ BA va NAA sử dụng ở các nghiệm thức tao PLBs 15

Bang 3.1.(tt) Nong độ BA va NAA sử dụng ở các nghiệm thức tạo PLBs 16

Bảng 3.2 Khối lượng dịch nghiền khoai tây sử dụng ở các nghiệm thức tạo chồi từ PLL BS seesesavesasessesessmnrvensas eer smeenacnice centee mea teases eanaene morn emus 17 Bang 3.3 Nong độ IBA sử dung ở các nghiệm thức ra rễ va tao cây hoàn chỉnh 17

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của BA kết hop NAA đến sự hình thành PLBs 19

Bảng 4.1.(tt) Ảnh hưởng của BA kết hop NAA đến sự hình thành PLBs 20

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây đến sự tạo chồi từ PLBs 24

Bảng 4.3 Ảnh hưởng IBA đến khả năng hình thành rễ và tạo cây hoàn chinh 26

Vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 3:1: Cay.d barteri VAT: MONG coi bsgg25E1232gE6356830230180.05:2EASQĐ2023183gS3GHiDSSuS005030080 14

Hình 4.1 Hình thái mẫu quan sát dưới kính hiển vi soi nổi sau 8 tuần nuôi cấy 22

Hình 4.2 Hình thái PLBs cây A barteri var MAN - 225555 <+S<£<+sc++svxssez 23

Hình 4.3 Chỗi hình thành từ PLBs ở các nghiệm thức bổ sung dịch nghiền khoai tây 25Hình 4.4 Cây hoàn chỉnh ở các nghiệm thức b6 sung IBA - 27

1X

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chi Anubias thuộc họ Araceae được coi là một trong những loại thực vật thường

được sử dụng nhất trong số các loài thực vật thủy sinh khác Trong số đó, cây Anubiasbarteri var nana rat được ưa chuộng - nồi bật hơn hết vì tinh thâm mĩ cao, bên cạnh đócây còn có khả năng lọc nước giúp cải tạo môi trường tạo điều kiện thuận lợi cho sự pháttriển của hệ sinh thái trong hồ cá cảnh

Nhằm duy trì, bảo tồn và phát triển nguồn giống cũng như tạo ra số lượng lớn cung

cấp cho thị trường với mục tiêu thương mai Cây A barteri var nana được nhân giốngtruyền thống bang cách thông qua sự phân chia chồi, thân rễ (Rataj va ctv 1977;Kanchanapoom và ctv, 2012) Tuy nhiên, phương pháp này phải cần một số lượng câygiống lớn; mặt khác, cây thường bị nhiễm bệnh; sinh trưởng, phát triển kém; cây dé bịthoái hóa và không có sự đồng nhất về mặt di truyền dẫn đến có thé phát sinh kiểu hìnhkhông mong muốn Do đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học - nuôi cấy mô tế bào thực

vật sẽ khắc phục những hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống tạo ra nguồn

cây giống có chất lượng tốt phục vụ nhu cầu thị trường

Hiện nay, trên thế giới đã công bố một số nghiên cứu nhân giống in vitro câyAnubias barteri var nana Tuy nhiên, với sự sinh trưởng và phát triển chậm của cây thìcác phương pháp nhân giống in vitro thông thường vẫn chưa mang lại hiệu quả cao sovới nhu cầu thị trường; dé giải quyết van dé này, phương pháp nhân giống in vitro thôngqua trung gian là phát sinh PLBs là một phương pháp nỗi bật và mang lại nhiều ý nghĩa

về mặt bảo tồn, khoa học và kinh tế Hiệu quả và hệ số nhân giống của phương pháp này

mang lại là rất tiềm năng, thích hợp đề nhân nhanh các giống cây trồng và tạo ra cây trồng

đồng nhất về kiểu gen, giúp sản xuất ra hàng loạt cây có nguồn gốc, chất lượng tốt vàđồng đều Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu nhân giống thông qua PLBs trên đối

tượng A barteri var nana vẫn chưa được dé cập Song, phương pháp này đã được tiếnhành trên một số cây họ ray như: Syngonium podophyllum “White Butterfly”,

Philodendron micans K Koch, Anthurium Andreanum,

Dựa vào những tiền đề trên đề tài “ Khảo sát tác động của một số chất điều hòa

sinh trưởng đến sự hình thành protocorm like bodies cây trau bà lá nhỏ (Anubias barteri

var nana)” được thực hiện với mong muốn nhân giống tạo cây hoàn chỉnh thông qua sự

phát sinh PLBs để đảm bảo nhân nhanh nguồn cây giống chất lượng cao cung cấp chonhu cầu về cây cảnh thủy sinh.

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định nồng độ một số chất điều hòa sinh trưởng và thành phần dinh dưỡng hữu

cơ thích hợp cho sự cảm ứng PLBs va tao cây trầu bà lá nhỏ in vitro hoàn chỉnh

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến sự hình thành PLBs

cây trầu bà lá nhỏ (Anubias barteri var nana)

Nội dung 2: Khao sát ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây đến sự tạo chồi từ PLBscây trầu bà lá nhỏ (Anubias barteri var nana)

Nội dung 3: Khảo sát nồng độ IBA đến khả năng hình thành rễ và tạo cây hoànchỉnh trên cây trầu bà lá nhỏ (Anubias barteri var nana)

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Téng quan về cây Anubias barteri var nana

Bộ (ordo) : Alismatales

Họ (familia) : Araceae Chi (genus) - Anubias Loai (species) : Anubias barteri Schott

Phân loại cây ho ray (Araceae) vẫn được các nhà khoa học nghiên cứu va cập nhật

liên tục Trước đây, theo Williams va ctv (1981) cho rằng ho ray có khoảng 110 chi, hon

2000 loài Đến năm 2014, Henriquez va ctv đã báo cáo ho ray bao gồm 118 chi, 3800 loài

Gần đây, họ ray lại được công bố có 144 chi và 3645 loài, xếp thứ ba về số mức độ đadạng trong số các loài cây một lá mầm (Croat và Ortiz, 2020)

Chi Anubias được thành lập vào năm 1857 bởi Schott dựa vào loài Anubias afzelli

Schott Có 8 loài trong chi Anubias được công nhận gồm: Anubias afzelli Schott, Anubias

barteri Schott, Anubias gigantea Hutchinson, Anubias gracilis Hutchinson, Anubias gilletii de Wildeman va Durand, Anubias pynaertii de Wildeman, Anubias hastifolia Engler va Anubias heterophylla Engler (Crusio, 1979).

2.1.2 Dac diém hinh thai

Cây A barteri var nana được mô tả là cây thân thảo, sống thuỷ sinh và thường mocthành cụm Có kích thước từ 3 — 8 em, cuốn lá dai khoảng 1,5 em Các phiến lá nhỏ và

có hình trứng, mặt trên lá có màu xanh đậm, mặt dưới có màu nhạt hơn và hiện rõ đường

gân lá Thân rễ dai từ 3 — 15 cm, có màu xanh đậm, chóp rễ có màu trang; từ thân rễ lá sẽphát triển, phân nhánh và tạo ra các khóm dày đặc Các phiến lá trong chỉ Anubias thường

có hình thái rất déo Mặc dù, các loài trong chỉ Anubias thường được xác định thông quađặc điểm cụm hoa (Li va ctv, 2022) A barteri var nana hiểm khi ra hoa do tốc độ phát

triên chậm và hiện vẫn chưa có mô tả cụ thê nào về hoa của loài này.

2.1.3 Phân bố

Chi Anubias có nguồn gốc từ Châu Phi và phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới phíaTay Châu Phi (Sholichah và ctv, 2020) Anubias thưởng mọc ở những nơi 4m ướt, ram

mát trong rừng va ven các bờ sông, sudi, Ching có thé phat triển tốt trong điều kiện ngập

nước một phan hay hoàn toàn ngập nước (Rataj và ctv, 1977)

2.1.4 Mục đích sử dụng

Thực vật thủy sinh trong chỉ Anubias rất phô biến đối với những người đam mê

cây cảnh thủy sinh Chúng được sử dụng rộng rãi dé trang trí bể cá và làm cho cá cảnh

khỏe mạnh hơn trong môi trường nhân tạo A barteri var nana với vẻ đẹp tự nhiên, sức

sống mãnh liệt, dễ chăm sóc; lá đẹp, đều, mặt 14 xanh mướt nên được nhiều người chơi

thủy sinh yêu thích và săn đón Là loài cây có giá trị cao trên thị trường và nhu cầu đốivới loại cây này cũng rất lớn (Syahrani, 2019)

2.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhân giống vô tinh cây trồng in vitro hay vi nhân giống là một lĩnh vực ứng dụnghiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bảo thực vật Được xem là một ngành khoahọc nhiều triển vọng, ứng dụng thực tiễn nhiều trong đời sống

2.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bảo (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vôtính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân

hoá (Vũ Quang Sáng và ctv, 2007).

2.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Năm 1902, Gottlieb Haberlandt đã tiến hành thí nghiệm nuôi cấy tế bào thực vậtđầu tiên và chỉ ra rằng bất kỳ tế bào nào của sinh vật đa bào đều có khả năng phát triển

thành một sinh vật hoàn chỉnh Từ góc độ sinh học hiện đại, lượng thông tin di truyền

(DNA) chứa trong mỗi tế bào đã chuyên hóa tương đương với lượng thông tin di truyềntrong một cơ thê trưởng thành Do đó, bất kỳ tế bao nào cũng có thé phát triển thành một

sinh vật hoàn chỉnh trong những điều kiện nhất định Tính chất này của tế bào được gọi

là tính toàn năng của tế bào (Ngô Xuân Bình, 2010)

Vì vậy, khi một tế bào thực vật được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có

đủ điều kiện thích hợp, tế bào có thể tạo ra những cá thé mới có cùng đặc điểm, kiểugene và kiêu hình.

2.2.1.2 Tính phân hóa và phản phần hóa

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả củaquá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào, trong đó:

Tính phân hoá của tế bao là sự biến đối của các tế bào phôi sinh thành các tế bao

của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chức năng khác nhau.

Tính phản phân hoá của tế bào: Khi đã được phân hoá thành các tế bao, mô riêng

biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong môi trường và điều kiện thích hợp chúng

vẫn có thé quay trở về trạng thái phôi sinh và phân chia mạnh mẽ

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gene, tại một

thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể thì một số gene được hoạt hoá và một

số gene khác bị ức chế Khi nằm trong một cơ thé hoàn chỉnh giữa các tế bảo có sự ức chếlẫn nhau, nhưng khi được tách rời và ở điều kiện nhất định thì các gene được hoạt hoá dé

dàng hơn nên chúng có khả năng mở tat cả các gene dé hình thành một cá thé mới Đó

chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bảo

2.2.2 Ý nghĩa của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Công nghệ nuôi cay mô tế bao thực vật được sử dụng như một công cụ nghiên cứu,

ứng dụng rộng rãi để nhân giống cây trồng trên quy mô lớn với tỉ lệ nhân giống cao, thời

gian ngắn trong điều kiện được kiểm soát, bất kế mùa vụ và thời tiết, loại bỏ bệnh tat, cảithiện cây trồng va sản xuất các chất chuyền hóa thứ cấp Ngoài ra, nuôi cấy mô tế bàothực vật được coi là công nghệ hiệu quả nhất dé cải tiến cây trồng bang cách tạo ra cácgiống cây có chất lượng vượt trội, phân lập các biến thể hữu ích trong các kiểu gene năngsuất cao, thích nghi tốt, khả năng kháng bệnh tốt hon (Hussain và ctv, 2012)

Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bao thực vật cung cấp một lựa chọn thay thé và có giátrị dé nhân giống và bảo tồn nhiều loài thực vật, đặc biệt là cây nhân giống sinh dưỡng,cây có hạt khó nảy mam và các loài thực vật có nguy cơ bị tuyệt chủng Kỹ thuật nuôi cay

mô tế bào thực vật cho phép nhân giống các loài thực vật này với ty lệ nhân giống cao vàbảo tồn trong thời gian ngắn đến trung và dài hạn (Rai, 2022)

2.3 Tổng quan về protocorm like bodies

2.3.1 Khái niệm và cơ sở hình thành PLBs

Protocorm like bodies (PLBs) được sử dụng để chỉ loại nay mầm tương tựprotocorm (sự nảy mầm bắt cộng sinh trong ống nghiệm của hoa lan), sự khác nhau cơbản giữa protocorm và PLBs là protocorm phát sinh từ phôi hợp tử còn PLBs có nguồn

gốc từ các mô phôi soma Do đó, nhân giống thông qua PLBs được coi là một kiểu nhângiống sinh dưỡng (Cardoso và ctv, 2020).

Theo Teixeira và Silva (2014), thuật ngữ PLBs theo truyền thống được sử dụng đề

mô tả một cơ quan phát triển trong môi trường nuôi cấy in vitro của phong lan Tuy nhiên,PLBs còn được sử dụng để mô tả cho ít nhất 11 loài thực vật không thuộc họ lan chủ yếu là

cây cảnh: Anthurium andraeanum (Araceae), chi Brodiaea (Asparagaceae), Colocasia esculenta (Araceae), Heliconia psittacorum (Heliconiaceae), Hippeastrum hybridum (Amaryllidaceae), Lilium longiflorum (Liliaceae), chi Musa (Musaceae), Philodendron micans (Araceae), Pinellia ternata (Araceae), Rosa va Syngonium podophyllum (Araceae).

Theo Lee va ctv (2013), PLBs có thể được tao ra trực tiếp từ nhiều mẫu cay khacnhau, chang hạn như đỉnh chồi, cuống hoa, chóp rễ và các đoạn lá Sự tai sinh gián tiếpPLBs từ nuôi cấy mô sẹo tạo phôi cũng đã được ghi nhận bằng cách sử dụng nuôi cấy thérắn và nuôi cấy huyền phù lỏng Tuy nhiên, việc tạo ra PLBs từ cơ quan trực tiếp có giá

trị hơn so với việc tạo PLBs thông qua mô sẹo.

Năm 2002, Park và ctv đã báo cáo PLBs cũng có thể hình thành trực tiếp từ bề mặtcủa mẫu cấy thông qua sự biệt hóa của các tế bào biểu bì Các tế bào đưới biểu bì cũng cóthé làm phát sinh PLBs Trường hợp nay, có khả năng PLBs cũng có nguồn gốc từ một tếbảo Đến năm 2003, Park và ctv tiếp tục báo cáo, các tế bảo riêng lẻ phát sinh mô phânsinh đầu tiên và tiếp tục phân chia, hợp nhất và tạo thành PLBs Trường hợp này PLBsnguồn gốc đa bảo Điều này chỉ ra có nhiều kiểu hình thành PLBs khác nhau

PLBs bao gồm nhiều trung tâm phát sinh có khả năng biệt hóa thành chồi và rễ,giống như phôi soma Tuy nhiên, chồi và rễ của cây con tái sinh từ PLBs không nằm trêncùng một trục (Da Silva và ctv, 2000) Từ đó, có nhiều tranh luận liên quan đến sự nhận

định của PLBs: Theo Lee và ctv (2013), cho rằng sự hình thành PLBs tương đương với

sự hình thành protocorm từ phôi hợp tử và sự hình thành phôi soma là bước đầu tiên trongquá trình hình thành PLBs Ngoài ra, PLBs có khả năng tạo ra cây con có cả chồi và rễgiống với các đặc điểm của quá trình phát sinh phôi soma nên tác giả kết luận PLBs làphôi soma Tuy nhiên, Xiong (2009) đã nghiên cứu và kết luận rằng: Quá trình khởi đầu

và phát triển của PLBs không tuân theo chương trình phát sinh phôi soma mà nó có mộtchu trình tái sinh riêng biệt PLBs có thé là một con đường độc lập trong quá trình tái sinhthực vật và PLBs hoàn toàn khác biệt với phôi soma bởi thiếu một trục phôi duy nhất

2.3.2 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phát sinh PLBs

2.3.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

2.3.2.1.1 Auxin

Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng được sản xuất nhiều nhất ở mô phânsinh ngọn của hầu hết các loài thực vật và sau đó được vận chuyên hữu cực nghiêm ngặtdọc theo hướng rễ đến các cơ quan bên dưới Vì vậy, càng xa ngọn thì hàm lượng auxin

càng thấp Ngoài chồi ngọn, các cơ quan khác như lá non, quả non cũng tong hợp được

một lượng auxin rất nhỏ (Vũ Văn Vụ, 2008)

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý và hoạt động tùy thuộc vào nồng độhay sự kết hợp của chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác Ngoài ra còn tác dụnglên quá trình giãn của các tế bào gây nên sự tăng trưởng theo đường kính của cơ quan vàtoàn cây, kích thích sự phân chia tế bào tạo ra mô sẹo, hoạt hóa các vùng tế bào xuất hiện

rễ dé tạo mam rễ bat định, ức chế sự phát triển của chỗồi nách và sự hình thành phôi soma

trong môi trường nuôi cấy mô seo (Hoàng Minh Tấn va ctv, 2006)

Các chất thuộc nhóm auxin thường dùng như: NAA, IAA, 2,4-D, IBA

2.3.2.1.2 Cytokinin

Cytokinin là một loại hormone đặc hiệu của thực vật đóng vai trò trung tâm trong

chu kỳ tế bào và ảnh hưởng đến nhiều chu trình phát triển của thực vật Cytokinin là dẫnxuất của adenine, có chức năng thúc đây quá trình phân chia và biệt hóa tế bào, duy trì sựtrẻ hoá của các cơ quan, làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hoá chỗi từ

mô sẹo nuôi cấy Do đó, cytokinin là một chất đối kháng với auxin và được sử dụng dékích thích sự hình thành và tăng hệ số nhân chéi (Vũ Văn Vu, 2008)

Cơ quan tông hop cytokinin là hệ thống rễ Cytokinin được vận chuyền từ rễ lên các

bộ phận trên mặt đất theo hướng ngược chiều với auxin, nhưng không phân cực rõ ràng như

auxin Ngoài rễ, một số cơ quan đang phát triển còn non cũng có khả năng tổng hợp mộtlượng nhỏ cytokinin dé bố sung nguồn cytokinin của rễ (Hoàng Minh Tan va ctv, 2006)

Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất như: BAP, BA, 2-iP, KI, Zeatin,TDZ Trong đó, Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên; con BAP, BA va KI là các cytokinin nhân tạo.

2.3.2.1.3 Sự kết hợp auxin và cytokinin trong quá trình phat sinh cơ quan

Sự kết hợp giữa auxin va cytokinin rất quan trọng đối với phát sinh hình thái trongcác hệ thống nuôi cấy, giúp tăng trưởng chổi ngọn và tạo mô phân sinh ngọn từ nhu mô.Đối với sự phát sinh phôi, để tạo sẹo và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở

trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chéi và chồi nách (Bùi Trang Việt, 2000)

Cytokinin và auxin hỗ trợ lẫn nhau trong sự tăng trưởng nhưng cũng có đối lập

giữa giúp tạo chỗồi (cytokinin) và giúp tạo rễ (auxin) Theo Kurepa va ctv (2019), cytokinin

va auxin hoạt động đối kháng nhau khi cả hai ở nồng độ thấp đến trung bình va chỉ ở nồng

độ cao thì chúng mới hoạt động cộng hưởng Năm 201 1, Su và ctv cho rằng sự tương tác

giữa auxin va cytokinin đặc biệt quan trong dé kiểm soát một số quá trình phát triển, chang

hạn như sự hình thành và duy trì mô phân sinh cần thiết đề thiết lập toàn bộ cơ thé thực vật

2.3.2.2 Thành phần dinh dưỡng hữu cơ

2.3.2.2.1 Nước dừa

Nước dừa được sử dụng rộng rãi như một thành phần hỗ trợ tăng trưởng trong môi

trường nuôi cấy mô Theo George và ctv (2008), nước dừa thường chứa axit amin, protein,

hợp chất vô cơ, các axit hữu cơ, nguồn carbon, vitamin và có khả năng làm tăng quá trình

sinh trưởng va phat triển của nuôi cấy thực vật in vitro do có sự liên quan đến sự hiện diện

của một số loại cytokinin tự nhiên Vào năm 2012, Kaur va Bhutani phát hiện ra rằng VIỆC

làm b6 sung 10% nước dừa đã thúc day sự nhân nhanh PLBs và hình thành chdi

2.3.2.2.2 Dịch nghiền khoai tây

Theo Ouyang và ctv (2004), dịch nghiền khoai tây được tận dụng hợp lý để nâng

cao hiệu quả của môi trường cảm ứng Bồ sung dịch nghiền khoai tây môi trường có thể

tạo ra nhiều mô sẹo (hoặc phôi) và mô sẹo này sẽ sở hữu khả năng tái sinh chồi tốt hơn

Dịch nghiền khoai tây là chất hữu cơ tự nhiên được bổ sung vào môi trường nuôicay nham dam bao hiéu qua cho nay mam của hạt, sự tái sinh chéi va sự phát triển củacây con trong nuôi cay in vitro Việc bổ sung dịch nghiền xuất khoai tây giúp tăng cường

có chọn lọc sự nảy mầm của hạt và sản xuất protocorm (Rohmah và Taratima, 2022)

2.3.2.2.3 Peptone

Pepton thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy của nhiều đối tượng thực

vật, chúng đóng vai trò như nguồn carbon và nitơ trong nuôi cấy mô thực vật và thúc đây

sự tăng trưởng, phát triển của mẫu cấy

Peptone là nhân tố thúc đây sự tăng trưởng và phát triển của các mô thực vật Khiđược sử dụng trong môi trường ban đầu, peptone có chức năng như một chất kích thích

sự hình thành rễ tơ của nhân sâm va quá trình tạo phôi của Oncidium Peptone thích hợp

cho sự phân hóa và nảy mầm (Duong Tan Nhut và ctv, 2008)

2.3.2.3 Than hoạt tính

Than hoạt tinh (Activated carbon - AC) là dạng vô định hình của carbon, có khả

năng hap thụ khí, hơi nước và chat lỏng dạng keo Việc bổ sung AC vào môi trường nuôicấy có thê thúc day hay ức chế sự tăng trưởng của thực vật trong điều kiện in vitro; cáctác động của AC bao gồm: Tạo điều kiện tối và hấp thu các chất ức chế trong môi trườngnuôi cấy, hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các hợp chất hữu cơ khác đồngthời phóng thích các cơ chất có lợi cho sự sinh trưởng của thực vật nuôi cấy in vitro B6sung AC vào môi trường nuôi cay có thé ảnh hưởng đến sự ra rễ, kéo đài chéi và phát sinhphôi Ngoài ra, AC còn giúp hap phụ các chất độc như: Phenolic hay dịch rỉ nâu tiết ra từmẫu hoặc môi trường nuôi cấy (Nguyễn Thị Kim Yến và ctv, 2013)

2.4 Tình hình nghiên cứu về cây họ ráy

Năm 2013, Nguyễn Thanh Hải và ctv thực hiện nghiên cứu quy trình nhân nhanh

in vitro cây trầu bà cánh phượng (Philodendron xanadu) Nghiên cứu đã cho kết quả nuôicấy chồi đỉnh trên môi trường MS bổ sung 4,0 mg/L BA là môi trường tối ưu cho phát

sinh chéi với 5,01 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy Trên môi trường MS có chứa 4,0 mg/L

BA thì bé sung thêm IAA hay IBA không làm tăng hệ số nhân nhanh NAA hay than hoạttính đều có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành rễ của chồi in vitro Môi trường MS có

bồ sung 1 g/L than hoạt tính là môi trường ra rễ thích hợp nhất sau 4 tuần nuôi cấy với tỉ

lệ chỗi ra rễ là 100%, chiều dài rễ trung bình là 6,77 cm và số rễ trung bình là 9,22 rễ/mẫu

Năm 2021, tại Thái Lan, Rittirat và ctv đã nghiên cứu quy trình vi nhân giống câyAnubias heterophylla Nghiên cứu thực hiện lây các mẫu chồi ngọn khử trùng bề mặt vanuôi cấy trên môi trường MS chứa 0,1% AC và bé sung BAP ở các nồng độ khác nhau(0, 1,0, 3,0 và 5,0 mg/L) sử dung đơn lẻ hoặc kết hợp với NAA hoặc 2,4-D (0,5 và 1,0mg/L) Ở các nồng độ khác nhau, số lượng tăng sinh chồi khác nhau đáng ké ở các

nghiệm thức có sự kết hợp auxin và cytokinin Số lượng chéi trên mỗi mẫu cao nhất(3,60 + 0,24) được hình thành trong môi trường nuôi cấy chứa 1,0 mg/L NAA kết hợpvới 1,0 mg/L BAP, tiếp theo là trong môi trường nuôi cấy với 3,0 mg/L BAP (2,4 +0,24) Trong môi trường nuôi cay có 1,0 mg/L NAA va 1,0 mg/L BAP, 100 % mẫu cấytái sinh chi mới trong vòng 60 ngày Số lượng rễ tối đa (19,80 + 0,2 rễ) trên mỗi mẫucấy được quan sát thấy sau 60 ngày nuôi cấy trên môi trường MS chứa 0,1% AC và

được bồ sung 1,0 mg/L NAA và 1,0 mg/L BAP Với ty lệ sống sót 100%, các cây contái sinh đã thích nghi hiệu quả với môi trường ngập nước.

Năm 2022, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây trầu bà cung dan(Philodendron ‘Jungle boogie’) được Lê Thị Thúy va ctv thực hiện dé đánh giá tác độngcủa nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh chồi, ra rễ và ảnh hưởngcủa các hợp chất hữu cơ không xác định lên sự sinh trưởng cây trầu bà cung dan in vitro.Trong thí nghiệm tạo chồi, chồi đỉnh được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sungriêng lẻ benzyl adenine (BA), kinetin và thiđiazuron (TDZ) ở những nồng độ khác nhau.Sau 12 tuần nuôi cấy, kết qua cho thay khả năng tạo chồi mới tốt nhất trên môi trường

bồ sung 1,0 mg/L BA với 59 chồi/mẫu Nghiên cứu cũng đã tiến hành bồ sung nước dừa

và dịch nghiền khoai tây ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy dé theo dõi

sự sinh trưởng của chéi cây trầu bà cung đàn Trên môi trường bồ sung 100 mL/L nướcdừa, sự sinh trưởng của chéi là tốt nhất Đối với giai đoạn ra rễ, môi trường thích hợpcho tạo rễ là môi trường MS, trong khi đó, môi trường MS và MS bồ sung naphthaleneacetic acid (NAA) ở các nồng độ khác nhau đều không thích hợp đến sự hình thành rễcủa chéi in vitro

2.5 Tình hình nghiên cứu về PLBs cây ho ray

Năm 2008, Cui và ctv đã thực hiện nghiên cứu tái sinh thực vật thông qua PLBs

được tạo ra từ các mau thân đốt cây Syngonium podophyllum “White Butterfly” bằng cách

các mau lá và cuống lá được vô trùng, nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ sungcác chất nhóm cytokinin như: CPPU, TDZ, BA hoặc 2-iP với các chất nhóm auxin như:NAA và 2,4-D Kết quả cho thấy: Mô sẹo hình thành từ các mẫu lá được nuôi cấy trênmôi trường cơ bản có bổ sung CPPU hoặc TDZ với 2,4-D hoặc NAA Tương tự, mô sẹohình thành từ các mẫu cuống lá được nuôi cấy trên môi trường bé sung BA, CPPU hoặc

TDZ với 2,4-D hoặc NAA Tuy nhiên, mô sẹo không phân hóa được và quá trình hình

thành cơ quan chồi không xảy ra Nuôi cấy các mẫu đốt trên môi trường cơ bản MS được

10

bồ sung 9,84 uM 2-iP, 8,88 uM BA, 8,07 uM CPPU hoặc 9,08 1M TDZ với 2,26 1M

2,4-D dẫn đến sự hình thành PLBs, các chồi bat định va sau đó cây có khả năng ra rễ tốt Môi

trường cơ ban MS bồ sung 19,68 uM 2-iP và 1,07 uM NAA được tỷ lệ tạo PLBs cao nhất

(92,9%) và trung bình 16,9 cây con ra rễ tốt trên mỗi mẫu cấy Các chdi bat định có thé

ra rễ trong môi trường cảm ứng ban đầu, nhưng sự phát triển rễ tốt hơn xảy ra sau khi cácchồi có thân PLBs được chuyển vào môi trường cơ bản MS có bồ sung 9,84 1M 2-iP và

2,69 uM NAA Cây tái sinh ôn định và phát triển mạnh mẽ với tỷ lệ sống 100% sau khi

trồng vào giá thể trong nhà kính

Trong nghiên cứu tái sinh Philodendron micans K Koch thông qua PLBs va cải

thiện hình thái thực vật bằng cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng của Xiong (2009),các mẫu chdi, lá, cuống lá và lóng được nuôi cấy trên môi trường MS được bồ sung BA,CPPU hoặc TDZ với NAA Các mẫu chồi cho thấy tiềm năng tái sinh lớn nhất bang cáchtạo ra cả mô seo và PLBs Các thí nghiệm tiếp theo cho thay 75% mẫu chồi của P micansđược nuôi cấy trên môi trường MS bồ sung 1,0 mg/L TDZ và 0,5 mg/L NAA đã tạo raPLBs trong vòng 8 tuần Mỗi mẫu cấy tạo ra hơn 50 chổi và sau đó ra rễ Ty lệ sống sót

của cây con tái sinh là 98%.

Theo Gantait và ctv (2012) nghiên cứu về cảm ứng trực tiếp PLBs từ đỉnh chỗi, sựhình thành cây con và phân tích độ trung thực của nhân giống vô tính cây Anthuriumandreanum cv CanCan Dé thu được PLBs trực tiếp từ đỉnh chổi, các nghiệm thức xâydựng trên ảnh hưởng của các chất BA, TDZ và 2-iP ở các nồng độ 5 uM, 10 uM, 15 uM,

20 uM và 25 uM được bồ sung vào môi trường MS cơ bản Giữa các các nghiệm thức thìnồng độ 15 uM 2-iP có hiệu quả nhất trong việc tạo ra PLBs với tỉ lệ 97,8%, trung bình

120 PLBs trên mỗi mẫu cấy đỉnh chồi trong vòng 50 ngày nuôi cấy PLBs trưởng thànhcho thấy sự tăng sinh chồi đáng kể (98,4 %) trong môi trường chứa 10 M KI hình thành

17 chồi trên mỗi PLBs trong vòng 30 ngày Sau đó khảo sát ra rễ trên môi trường MS cơbản bồ sung 500 uM AC va IAA hoặc IBA ở các nồng độ 5 uM, 10 uM, 15 uM Kết quả

là tác giả nhận thấy: Việc đưa than hoạt tính AC vào môi trường chứa auxin có tác dụngthúc đây sự ra rễ do ở nghiệm thức 5 uM IBA + 500 uM AC dẫn đến số lượng và chiềudài rễ cao nhất

Theo Tung và ctv (2022), sự tái sinh chồi cây hồng môn (Anthurium Andreanum

‘Tropical’) thông qua nuôi cấy PLBs Theo đó, đối với việc tái sinh chồi, hiệu quả vi nhângiống thông qua hình thành PLBs cao gấp 4 lần so với trực tiếp từ mô seo sau 12 tuần

11

nuôi cây Kết quả ghi nhận được cho thấy, tỷ lệ phát sinh PLBs và số PLBs/mẫu cao nhất

(91,25% và 42,67 PLBs; tương ứng) trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/L BA, 0,08mg/L 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/L KI sau 8 tuần nuôi cay Tiếp theo, các chồi được nhânnhanh ở điều kiện dưới các tỷ lệ đèn LED xanh lam và đỏ khác nhau Nghiên cứu này chothấy chiều cao chỗồi cao hơn (4,77 cm), trọng lượng tươi (327,33 mg), số lá trên mỗi chi(6,33) và số lượng nút thân trên mỗi chồi (5,67 nút thân) đạt được ở mức 70R:30B so với

ở điều kiện ánh sáng và đèn huỳnh quang khác sau 8 tuần nuôi cấy Các chồi hồng môn

in vitro nuôi cay trên môi trường bồ sung 7 ppm nano bạc với mật độ 10 chồi/bình sau 12tuần sinh trưởng tốt hơn và có tỷ lệ sống cao (92,00%) khi chuyên ra vườn ươm 8 tuần so

với các nghiệm thức khác.

2.6 Tình hình nghiền cứu cay A barteri var nana

Năm 2012, Kanchanapoom va ctv đã nghiên cứu vi nhân giống A barteri var nana

từ chéi ngọn va phân tích tính ồn định của bộ nhiễm sắc thé Nghiên cứu tiến hành khửtrùng chéi ngọn và nuôi cấy trên môi trường MS có bồ sung đồng thời hoặc riêng lẻ BA

và KI ở các nồng độ 0 mg/L, 1 mg/L, 3 mg/L, 5 mg/L Kết quả là số chồi xanh tối đa thu

được tốt nhất trên môi trường MS chứa 3 mg/L BA với 5 chi Sự ra rễ ở tất cả các chồi

tái sinh được thúc đầy trên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trưởng Khả năngthích nghi và tỷ lệ sống sót là 100% ở cây tái sinh Các phân tích tế bao học cho thấykhông có sự khác biệt về mức độ di truyền và cây con tái sinh không có khuynh hướngtạo biến dị đi truyền

Năm 2019, Surendra và ctv đã khảo sát ảnh hưởng của axit gibberellic đến sự rahoa in vitro từ mẫu đốt thân của Anubias barteri var nana Các mẫu đốt gốc được nuôi

cay trên nền môi trường 1⁄2 MS và MS; bé sung BAP (0,1 mg/L), NAA (0,1 mg/L), 2 g/L

AC và kết hợp GA3 (0,1 — 1 mg/L) dé đánh giá các chỉ tiêu theo dõi Kết qua là số chồinách tối đa (4,25 + 0,38), chiều dài chồi (2,63 + 0,21) và tỉ lệ ra hoa 100% với 4 hoa trênmẫu cấy thu được trên môi trường MS bồ sung 1,00 mg/L GA3 Ngoài ra, cảm ứng ré tối

đa (91,66%) được ghi nhận trên môi trường MS chứa 0,25 mg/L GAs Tất cả cây con táisinh đã được di thực thành công ở điều kiện ngập nước Kết quả này cho thấy tầm quan

trọng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật kiểm soát quá trình sinh trưởng, phát sinhhình thái và vi nhân giống cây Anubias barteri var nana

Theo Syahrani (2019), trong báo cáo về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

và cường độ ánh sang đôi với sự sinh trưởng của Anubias barteri var nana Nghiên cứu

12

được khảo sát gồm 3 yếu tố là cường độ ánh sáng (750 lux, 1500 lux và 2250 lux), nồng độBAP (0 mg/L, 3 mg/L, 5 mg/L) và nồng độ NAA (0 mg/L, 3 mg/L, 5 mg/L) Kết quả củanghiên cứu này chỉ ra rằng việc sử dung cường độ ánh sáng 2250 lux, BAP 5 mg/L và NAA0,5 mg/L là nghiệm thức các chồi tái sinh nhanh nhất là 7,33 ngày Sau đó, nếu không sửdụng BAP trên các mẫu cấy, thì sẽ không ảnh hưởng đến sự xuất hiện của các chồi mới Ởnghiệm thức áp dụng cường độ ánh sáng 750 lux, BAP 5,0 mg/L và NAA 0,0 mg/L cho sốchéi cao nhất với 5 chéi trên mẫu cấy.

Năm 2021, Rittirat va ctv đã nghiên cứu về Thidiazuron tạo ra sự tái sinh thực vật với

tần số cao từ các mẫu chồi cây Anubias barteri var nana đã được thực hiện bằng cách sử

dụng mau chồi ngọn được cắt từ cây con 90 ngày tuổi và nuôi cấy trên môi trường MS bổsung các chất điều hòa sinh trưởng BAP, KI, TDZ ở các nồng độ 5 mg/L, 7 mg/L và 9 mg/L.Kết quả là 100% chồi mới được hình thành với số chéi tối đa (4,5 chéi/mau ), chiều dai chéi

là 9,5 mm và có 16,75 lá/mẫu, chiều dai lá là 13,22 mm, chiều rộng lá 6,58 mm, hiệu suất ra

rễ 100% và số lượng rễ là 25,25 rễ/mẫu đạt được trên môi trường MS bồ sung 7,0 mg/LTDZ Các cây con tái sinh hoàn chỉnh đã được di thực thanh công vào các chậu đất sét nhỏ

có chứa bông đá trong điều kiện nhà kính với tỷ lệ sống sót 100% và phát triển mạnh mẽ màkhông có bất kỳ bất thường nào về hình thái trong quá trình di thực

13

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 03/2023 đến tháng 03/2024 tại Phòng Sinh học Tích hợpthực vật, khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Nguồn mẫu

Mau cây trầu bà lá nhỏ (Anubias barteri var nana) in vitro được nuôi cấy tại phòng

Sinh học Tích hợp Thực vật (PIB), khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

cm || b) lcm

a)

Hình 3.1 Cay A barteri var nana (a) Cây in

vitro dùng làm vật liệu nghiên cứu; (b) Choi được

tách từ cụm chối cây A barteri var nana.

3.2.2 Môi trường nuôi cay

Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu là ôi trường Murashige và Skoog (MS)

bổ sung 20 g/L sucrose Tùy vào mục đích của từng thí nghiệm mà môi trường sẽ được

bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trưởng và các hợp chất ở nồng độ khác nhau

Môi trường sau khi pha được điều chỉnh pH 5,7 + 0,01, bố sung 7 g/L agar và khửtrùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1 atm, trong 20 phút Các mẫu được nuôi trong phòng tăng

trưởng thực vật, ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ 25 + 2°C, ẩm độ 60 - 659%

Trong giai đoạn tạo PLBs, các mẫu được nuôi cấy trong phòng tăng trưởng thực vật với

điêu kiện tôi.

14

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát ảnh hướng của BA kết hợp NAA đến sự hình thành PLBs câytrầu bà lá nhỏ

Mục tiêu thí nghiệm: Xác định được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA kết hợpNAA phù hợp bồ sung vào môi trường nuôi cay dé cảm ứng tao protocorm like bodies từ

lát cắt thân cây trầu bà lá nhỏ in vitro

Cách tiến hành: Chọn các chéi trầu bà lá nhỏ in vitro được nuôi cấy trên môitrường MS có chiều cao 1 - 2 em Sau đó, tách bỏ lá và cắt thành những lát mỏng theochiều ngang có độ dày khoảng 1,0 - 1,5 mm Lat mỏng thân này được cấy lên môi trường

cơ bản MS + 20 g/L sucrose + 10% nước dừa + 7 g/L agar, b6 sung BA (0,5 - 3 mg/L),NAA (0,5 - 2,0 mg/L), pH 5,7 + 0,01 để khảo sát khả năng phát sinh PLBs từ lát mỏngthân Thí nghiệm so với đối chứng là mẫu cấy trên môi trường cơ bản không bổ sung chatđiều hòa sinh trưởng Các nghiệm thức được trình bày như Bảng 3.1

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 25 nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoàn toànngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 mẫu

Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận ở các mốc thời gian 8 tuần gồm tỉ lệ mẫu hìnhthành PLBs, số PLBs/mẫu

Bảng 3.1 Nồng độ BA và NAA sử dụng ở các nghiệm thức tạo PLBs

Nghiệm thức BA (mg/L) NAA (mg/L)

A0 0,0 0,0

AI 0,5 A2 1,0

A3 1ã 0.5

A4 2,0

AS 35 A6 3,0 A7 0,5 A8 1,0

A9 L5 os

AI0 20

15

Bảng 3.1.(tt) Nong độ BA va NAA sử dụng ở các nghiệm thức tao PLBs

Nghiệm thức BA (mg/L) NAA (mg/L)

All 2,5 Lũ Al2 3,0

Al3 0,5 Al4 1,0 Al5 1,5

Al6 2.0 he

Al7 25 Al8 3,0 Al9 0,5 A20 1 A21 1,5 Si

A22 2,0

A23 45 A24 3,0

3.3.2 Khao sát ảnh hưởng dịch nghiền khoai tây đến sự tao chỗồi từ PLBs

Mục tiêu thí nghiệm: Xác định được nồng độ dịch nghiền khoai tây phù hợp bổsung vào môi trường nuôi cấy dé cảm ứng tạo chồi từ PLBs cây trau bà lá nhỏ

Cách tiến hành: Các PLBs thu được từ thí nghiệm | được tách thành cụm nhỏ chứakhoảng 2 PLBs, sau đó cấy lên môi trường cơ bản MS + 20 g/L sucrose + 10% nước dừa

+7 g/L agar + 1,0 g/L AC + 2 g/L peptone; b6 sung BA + NAA (nghiệm thức tốt nhất

thí nghiệm 1) và dịch nghiền khoai tây ở các nồng độ khảo sát từ 0 - 50 g/L Các nghiệmthức bồ trí như Bảng 3.2

Dịch nghiền khoai tây được dùng trong thí nghiệm được lay như sau: Củ khoai tây

được rửa sạch, gọt bỏ vỏ, cắt nhỏ và cân đủ khối lượng cần thiết cho từng nghiệm thức

Sau đó, đem chưng cách thủy khoảng 20 phút và nghiền mịn trước khi b6 sung vào môitrường nuôi cay

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức được bé trí theo kiểu hoàn toàn

ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 9 mẫu

16