Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng một số chủng nấm gây bệnh cho cây trồng bằng dịch chiết cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides)

conyzoides được tách chiết bằng hai loại dung môiethanol và methanol ở các nồng độ khác nhau đến khả năng kháng một số chủng nắmgây bệnh trên cây trồng Fusarium oxysporum, Aspergillus ni

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SÓ CHỦNG NÁM GÂY BỆNH CHO CAY TRONG BANG DỊCH CHIET CÂY CO

HOI (Ageratum conyzoides)

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện : NGUYEN BA KHÁNH TRÌNH

Mã số sinh viên : 19126202Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thu Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SÓ CHỦNG NÁM GÂY BỆNH CHO CÂY TRONG BANG DỊCH CHIET CÂY CO

HÔI (Ageratum conyzoides)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS Nguyễn Thị Như Quỳnh Nguyễn Bá Khánh Trình

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Trường đại học Nông Lâm đặcbiệt là thầy cô Khoa Khoa học Sinh học đã giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quýbáu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin tran trọng gửi lời cảm ơn đến cô TS Nguyễn Thị Như Quỳnh — Người đãhướng dẫn, góp ý, định hướng và tận tình giúp đỡ em trong quá trình làm Khóa luận tốtnghiệp dé có được thành quả như ngày hôm nay

Với lòng biết ơn sâu sắc và tình cảm chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến chịTrần Thị Thu Phương, bạn Nguyễn Đinh Thảo Ngân, bạn Trần Quốc Bình, bạn TrầnAnh Tài và các bạn trong phòng Các chất có Hoạt tính Sinh học, Viện Sinh học Nhiệtđới đã chỉ dạy và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện Khóa luận tốtnghiệp Đối với em đây là một khoảng thời gian cực kì quý báu để bản thân có cơ hộitrau đồi kiến thức chuyên môn và học tập những kinh nghiệm mới Đây là hành trang

vô cùng lớn dé em có thé vững bước trên con đường sự nghiệp của bản thân trong tương

Cuối cùng, em kính chúc quý Thay/C6/Anh/Chi có thật nhiều sức khỏe và luôntràn đầy nhiệt huyết đề tiếp tục dẫn dắt nhiều thế hệ sinh viên tiếp theo trong sự nghiệp

nghiên cứu và phát triên khoa học.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên: Nguyễn Bá Khánh Trình, MSSV: 19126202, Lớp: DHI9SHA, thuộcngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan:Đây là khóa luận do bản thân tôi trực tiếp thực hiện tại phòng Các chất có Hoạt tính Sinhhọc, Viện Sinh học Nhiệt đới, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàntrung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng và nhữngcam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 02 năm 2024

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Bá Khánh Trình

il

TÓM TẮT

Ageratum conyzoides L (A conyzoides) hay còn gọi là cây cỏ hôi, là một loại thao

mộc được ứng dụng lâu đời trong y học cô truyền ở nhiều quốc gia trên thế giới trong yhọc cô truyền ở nhiều quốc gia trên thé giới, nó được xem là loài cỏ dại phân bố khắpmoi nơi có sự phát triển mạnh mẽ và kháng sâu bệnh cao Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng

A conyzoides chữa nhiéu loai hoat chat thir cap có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nam,

kháng côn trùng nên có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp Dé tài nghiên cứu anhhưởng của dịch chiết cây cỏ hôi (4 conyzoides) được tách chiết bằng hai loại dung môiethanol và methanol ở các nồng độ khác nhau đến khả năng kháng một số chủng nắmgây bệnh trên cây trồng (Fusarium oxysporum, Aspergillus niger, Phytophthora sp.)bằng phương pháp đo đường kính tản nam tại các thời điểm 72 giờ, 120 giờ, 168 giờ saukhi cây Hoạt chất từ bột cây cỏ hôi được tách chiết bằng hai dung môi là ethanol vàmethanol ở bốn nồng độ (30%, 50%, 70% và 90%) Kết quả cho thấy ethanol 90% vàmethanol 70% là nồng độ dung môi thích hợp nhất dé tách chiết hoạt chất kháng nam.Hai loại dịch chiết được chọn tiễn hành khảo sát khả năng kháng nắm ở nồng độ 0%,1%, 2%, 4% và 8% Ngoài ra, khi phân tích ANOVA hai yếu t6 cho thay có sự tươngtác giữa thời gian và nồng độ các dịch chiết lên sự phát triển của các chủng nam Quakhảo sát đánh giá khả năng ức chế nam cho thấy cả hai loại dịch chiết đều cho hiệu quakháng nắm ở mức khá tốt, dịch chiết ethanol 90% có khả năng ức chế nam hiệu quả hơn

so với dich chiết methanol 70% Do đó, cây cỏ hôi (A conyzoides) có tiềm năng có théứng dụng trong kiểm soát một số loại nắm gây hại trên cây trồng định hướng làm thuốc

bảo vệ thực vật có nguôn gôc sinh học.

Từ khóa: Cây cỏ hôi, Ageratum conyzoides, kháng nam, dịch chiết ethanol và methanol

ill

with antibacterial, antifungal and anti-insect properties, so it has potential for application

in agriculture The research topic aims to investigate the effects of A conyzoides mushroom extract extracted with two solvents, ethanol and methanol at different concentrations, on the resistance of some fungal strains (Fusarium oxysporum,

Aspergillus niger, Phytophthora sp.) by measuring fungal diameter at 72 hours, 120 hours, and 168 hours after inoculation The active ingredient from the plant powder is extracted with two solvents, ethanol and methanol, at 4 concentrations (30%, 50%, 70%

and 90%) The results show that 90% ethanol and 70% methanol are the most suitable solvent concentrations to extract antifungal active ingredients Two types of extracts were selected to investigate their antifungal ability at concentrations of 0%, 1%, 2%, 4% and 8% In addition, two-factor ANOVA analysis showed that there was an interaction

between time and concentration of extracts on the growth of fungal species The survey

to evaluate the ability to inhibit fungi showed that both types of extracts showed quite

good antifungal effectiveness, the 90% ethanol extract had the ability to inhibit fungi more effectively than the 70% methanol extract Therefore, A conyzoides has the potential to be used in controlling some harmful fungi on crops for use as a biological pesticide.

Keywords: Ageratum conyzoides, antifungal, ethanol and methanol extracts.

iv

NI TƯ O Sena eee er Cee ee V

DÀNH BATES DI HÀ NHƯ cron cvs canine nsnannonivennensninianaunansonienieneisensnnenuentensonnoneniensios viii

2.1.1 Phan loại thực Vật - - -. 2- E22 221 11223111521111521 1112211118211 2011119211192 1 re 3

2.1.2 Đặc điểm phân bố -2 222222222E22E2221221211221211221211211221211221 21 xe 3

313 #ođiễmlbiqevllLGE seesessnmsesemseeesessemueoosleornanssoysspfttenplarsnsisgigsse 32.2 Các hợp chất sinh học có trong cây cỏ hôi -2-222222222++2z22+z2zzzz+zzze2 42.2.1 Tinh dầu 222cc22trrHHHHHHH Hư 4

DQ 2 - AlKA|DÌSssssoiaidsooadiordaobsooillOVEL06010031SG00140501312005G9EE0G33SKSSWESSSESE99090ã083 94 4

223 POIVDHEHOÌssesssssseaeeetoidtoiddondiagiEDGesEEEEGSEREEISEEEEENSSSEĐSEGSSISNHRESAATOEGGGSES3S4H9133E.2U88 4 ZQA, PFIAV ONO scseweessssnepseesesersecorvevsussnsen seasvewsawannseaayaeevsarnay evanesansensesweanaveusresmenenmnee mens 5 22:9, QSDOÑHHsisiesiesoeisieiiisstiiiisiieEDIEEELSEASLESSSVS950935489895SĐ9483929949485.20923S3SGELES1S809880589 6 22.6, DWỢG tinh GÚA GẦY CO NOL zsannssnannindiniindiidtRiidionidiotoooiisiikidiitfiblSVAKiiSOuagRJEGQdaãg9i84880 6

2.3 Các chủng nam gây bệnh phô biến ở trên cây trồng - -2z©22z55+2 72.3.1 Nam Aspergillus niger -22-2222222222222221221221221121122121211 212 Xe 72.3.2 Nam Fusarium oxysporum 166 4 ẢẢẢ 82.3.3 Nam Phytophthora Sp 2-52:©22-55222222222222E222E22212212221221 2212112212 Xe 8

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoal NUOC . - 5522 =*++*£++eexeeeeeeexerrs 9 P5 Nehién ctru trong nue 2.0 9

P VAN) ai 0u on 10

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2 2+S2+E+£E£EE+E££E£EEzEzErrxzex 133.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2 2222+2E2EE22E22E222E222+22E22ezzxee 133.2 Vật liệu và phương pháp nghiên CUU eee 5 55+ 22+ S+*++<+eeesereeereererrs 133.2.1 Nghiên cứu phương pháp tách chiết và định lượng các hợp chat sinh học có

ONS CAVCO Hồi tussesianbsbsgindinttotcttegigt0141GG031805838SSNG54E8100883E84E0DEAIGSSiG8G1GQLIESELAEBBEE3QiSiDgg440080.Si386g34 13

ee - VI er 13

3.2.1.2 Tach chiết với dung môi ethanol và methanol -2- 2552222 133.2.1.3 Phương pháp định lượng một số hợp chất sinh học có trong cây cỏ hôi 143.2.2 Khao sat kha năng ức chế của dịch chiết cỏ hôi lên một số loại nam nam gây

ĐỂHH!VÔH/GãY TEGHỮ casssxsoseosi 56 668084300695941ã83E806336.58SESS/GGSSSG9588GE8.S8S58E5I5BSSSS.12E0SESLSSSGSSGIR2DS.SĐRE5Ú51E 17

3.2.2.1 Mau thí nghiệm -¿- 2-52 522S2222222E22E22E2EE2E221212122121 21221222 173.2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 2-©2-2222222122121121121121121121121211212121 21 22C 17

S223, (MUO CHOU hon sctzoersiotdtilBtittiiitiitiitgfSENGGGiESVSE0E2GGSã38SN658BG3.05255868838668800308138660 ce 18 3.2.2.4 Phương pháp thí nghiệm . - + cece ce eeeeeeeeeeceeeeseseeenseeeeeneeees 18

3.2.2.5 Xử lý số liệu -2222222222221222127122122122121122121212 ca 18CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2 222+22+E2£E£EE+E£EzEEzEzrrrrxred 194.1 Kết quả tách chiết và định lượng các hợp chat sinh học có trong cây cỏ hôi 194.1.1 Tach chiết các hợp chất sinh học có trong cây cỏ hôi - 194.1.2 Định lượng các hợp chat sinh học có trong cây cỏ hôi -5- 194.2 Hoạt tính kháng một số chủng nam gây bệnh trên cây trồng của dịch chiết cỏ hôi

trén dia Petri eee 24

4.2.1 Hoạt tinh kháng nấm Aspergillus niger -2+©72255225+2cszcscscssres 244.2.2 Hoạt tinh kháng nắm Fusarium oxysporum .-:.-:.csc-scesseesseceeereesesseesesseesseees 294.2.3 Hoạt tinh kháng nắm Phytophthora Sp - -: 2-552©52252255z25+zcs>zcscs2 34CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, -2222-2222c+crrrrrrrrrrrrrrrrirrrrek 40

5.2 2 40TÀI LIEU THAM KHẢO 222 Aerrrrrrrrerrerreei 41

PHO baeeeeeeeeboies bận 2n hs tr BhctEt hgBluSElg8813giphĐfTxU2txgBbkdgag3ectiubpndhuobrbndtisztoisgauessiaspi 45

VI

: Dimethyl sulfoxide

: Dung môi ethanol 30%

: Dung môi ethanol 50%

: Dung môi ethanol 70%

: Dung môi ethanol 90%

: Acid gallic: Hiệu lực ức chế

: Dung môi methanol 30%

: Dung môi methanol 50%

: Dung môi methanol 70%

: Dung môi methanol 90%

: Quercetin

vii

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 3.1 Thông số pha loãng acid gallic - c c2 2c 222221222 14Bang 3.2 Quy trình pha dãy dung dịch chuẩn acid gallic - :: - 15Bảng 3.3 Quy trình thực hiện định lượng polyphenol trong mẫu 15Bang 3.4 Thông số pha loãng quercetin ¿¿ ¿c7 22c c2 ££zezssres 16Bang 3.5 Quy trình pha dãy dung dịch chuẩn quercetin - -‹ - 16Bảng 3.6 Quy trình thực hiện định lượng flavonoid trong mẫu 17Bảng 4.1 Ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng tách chiết các hoạt chất sinh học

ỨP G5 CON Ol ngghnnotodgatBHAGNG113100013001040SEBISGIA50S0IB50303 24 G3H1ĐSđ seme )SIGRNG REET TERE 23Bang 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết ethanol 90% đến sự phát trién DKTN

lðI827/72437//718/71<42 0P PPnn0n0n0807Ẽ7887Ẽ.S ene EEE ene EEE EEE 24

Bang 4.3 Anh hưởng của nồng độ dich chiết methanol 70% đến sự phát trién DKTN

©ủAa-4spoefiÐ tl luis THÍN Đ Lee tách gã tú teste sarasota G8666 yest teehee jena tla Baan ZTBảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết ethanol 90% đến sự phát triển DKTN

Của FUSATIUM OXJSJDOTMIH on HS HS HH kh và 30

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết methanol 70% đến sự phát triển ĐKTN

CUAL USATIUM OXUSPOTTH cxsias cnwmcertenenas canes Cemeenes gi GẠ 4ã ie Hoop 2300620006509 CRIESGIBM 32

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết ethanol 90% đến sự phát triển DKTN

GA PHLODNINONG SPs ¡ cnc gtehicbBBEiDE90d91814 sama seas ERAS BEES V4/40RI833-30/4041302 09088 35

Bang 4.7 Anh hưởng của nồng độ dich chiết methanol 70% đến sự phát trién DKTN

CUd PIVLODNINOFE SPs nan HgRRA AA 3N Ä 1 8HghN h3 hệ 3ã L98R3i4.43 SEES 94088i80L4ing382608866,8.4 14018 37

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang HÌNH 21; Cay CO HD hoa: sess bong tà Hưng Hút naman xaareisinnsimeuine anit aa amet 4 sialuataie Saree ee disTaee 3

Hình 2.2 Cau trúc cơ ban của phân lớp flavonoid ‹ -cc <<: 6Hình 4.1 Dịch chiết ethanol cô đặc ‹- - c¿- c2 2122112211221 srsxa 19Tình 4/3 Dịch chiết tnefhHattdi 06 Wits vvcss cssanncecivorsverews coders ve cranes H25 dew 19Hình 4.3 Anh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tong 20Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng flavonoid tổng 22

Hình 4.5 Hiệu luc ức chế ĐKTN Aspergillus niger của các nồng độ dịch chiết ethanol

1/1567 25

Hình 4.6 Hình thai nam Aspergillus niger trên môi trường PDA có bồ sung dịch chiếtE90 ở các nồng độ khác nhau ¿- 5c 2222211122221 1111115555111 xxeg 26Hình 4.7 Hiệu lực ức chế ĐKTN Aspergillus niger của các nồng độ dịch chiếtfiethafiolL 70% (Vs) is cenessee nh net hệ ghnp EEBSD SA TA Hững S3 Haase PIỜBEA et PG0 Sự pm EERE 000m egs2 28Hình 4.8 Hình thái nam Aspergillus niger trên môi trường PDA có bồ sung dich chiếtM70 ở các nồng độ khác nhau c c2 2111122221111 22 1111112511111 2x5 28Hình 4.9 Hiệu lực ức chế ĐKTN Fusarium oxysporum của các nồng độ dịch chiếtethane) 90% | Di ÌunoayecutontụrdrarawsgtsngoalietiusaftatoellngtosriilugRpr gồxnnsingirsồuiEuptalatasoihdttgxanel 31Hình 4.10 Hình thái nam Fusarium oxysporum trên môi trường PDA có bồ sung dichchiết E90 ở các nồng độ khác nhau ¿+ ¿+ ¿2222222111122 s2 31Hình 4.11 Hiệu lực ức chế DKTN Fusarium oxysporum của các nồng độ dịch chiết

methanol T0 (Uồj is náo tgg nung iB to fn giàn cgggt 68h 0 Rìatiphinÿ nha gÿXiöti8diinYSÀgBS(301)80813.315.BhGORSaSi40/406088 33

Hình 4.12 Hình thái nắm Fusarium oxysporum trên môi trường PDA có bổ sung dịchchiết M70 ở các nồng độ khác nhau ¿¿ c2 2222211111122 si 33

ix

Hình 4.13 Hiệu lực ức chế DKTN Phytophthora sp của các nồng độ dịch chiết

ethanol 90% (⁄%) c2 2n 219 9S S1 9 S1 ene Ensen ĐH nh kh net 36

Hình 4.14 Hình thái nam Phytophthora sp trên môi trường PDA có bé sung dichchiết E90 ở các nồng độ khác nhau + + + 2222222111112 36

Hình 4.15 Hiệu lực ức chế DKTN Phytophthora sp của các nồng độ dịch chiếtmethanol 70% (%) -: c2 22021020 0020202110 101110 111 11K vn nh nh ven 38Hình 4.16 Hình thái nam Phytophthora sp trên môi trường PDA có bổ sung dichchiết M70 ở các nồng độ khác nhau - c c2 2221122222 ssz 38

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam với khí hậu nhiệt đới nóng ầm, đất đai màu mỡ tạo là điều kiện thuậnlợi cho việc phát triển của nền nông nghiệp với quy mô lớn, đa dạng về các loại câytrồng và vật nuôi Tuy nhiên, đây cũng là điều kiện thuận lợi cho các loại sâu hại và nắmbệnh phát triển, gây ton thất nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng nông sản Thuốcbảo vệ thực vật hóa học đã và đang được xem là phương pháp hiệu quả nhất trong việcphòng trừ dịch hại trên cây trồng do đễ áp dụng, có hiệu quả nhanh và giá thành rẻ Tuynhiên, các biện pháp phòng trừ dịch hại hóa học đã nhanh chóng bộc lộ nhiều nhượcđiểm như làm tăng tính kháng thuốc đối với các loại sâu bệnh, dư lượng thuốc BVTVtrên nông sản, tồn dư trong đất và còn còn lưu dẫn vào mạch nước ngầm làm gây ônhiễm môi trường, gây ra các ảnh hưởng nghiêm trọng với sức khỏe người tiêu dùng,các sinh vật có ích, gây mat cân bang sinh thái Vì vậy, can tìm ra một phương phápphòng trừ dịch hại mới thân thiện với môi trường là các biện pháp có nguồn gốc hữu cơnhư: dùng thiên địch, các chủng vi sinh vật đối kháng và các loại thuốc bảo vệ thực vật

có nguồn gốc hữu cơ phổ biến là hoạt chat thứ cấp chiết xuất có nguồn gốc thực vật, visinh vật

Trên thế giới hiện nay đang có xu hướng nghiên cứu và sử dụng các hợp chấtthiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật, có tính kháng vi sinh vật gây bệnh và đặc biệt có

độ an toàn cao, từ đó tạo ra các chế phẩm sinh học có khả năng phòng trừ các loại dịchhại trên cây trồng Cây cỏ hôi (A conyzoides) là một loại thảo mộc được ứng dung lâuđời trong y học cô truyền ở nhiều quốc gia trên thế giới, nó được xem là loài cỏ dại phân

bố khắp mọi nơi nhờ có sự phát triển mạnh mẽ và kháng sâu bệnh cao Nhờ có chứa cáchoạt chất thứ cấp như alkaloid, flavonoid, polyphenol, saponin và nhiều loại hoạt chấtkhác mà A conyzoides có tiềm năng ứng dụng tạo thuốc phòng trừ các loại nam gâybệnh trên cây trồng như Aspergillus niger (gây bệnh thối gốc, chết cây con và một sốloại bệnh thối trên rau quả sau thu hoạch), Fusarium oxysporum (gây bệnh héo rũ trêncây), Phytophthora sp (gây bệnh vàng lá, thối rễ, thối trái trên cây ăn trái) Nghiên cứunày sử dụng dịch chiết từ cây cỏ hôi (A conyzoides) khảo sát tác động lên ba loại nam

trên, qua đó triển vọng ứng dụng tạo thuốc bảo vệ thực vật sinh học có khả năng khángz

A

nam.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính kháng nam (Aspergillus niger, Fusarium oxysporum,Phytophthora sp.) của dịch chiết cây cỏ hôi định hướng ứng dụng làm thuốc bảo vệ thựcvật có nguồn gốc sinh học

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Nghiên cứu phương pháp tách chiết và phân tích định lượng các hợp

chât có trong cây cỏ hôi.

Nội dung 2: Đánh giá hoạt tính kháng một số chủng nắm gây bệnh trên môi trường

thạch đĩa.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.)

2.1.1 Phân loại thực vật

Theo trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, cỏ hôi được phân loại như sau:

Tên Khoa học: Ageratum conyzoides L.

Gidi: Plantea (Thuc vat)

Cây cỏ hôi (A conyzoides), con gọi là cây hoa ngũ vi, cây cut lợn là một loại cây

thuộc họ Cúc Cỏ hôi được xem là một loài cỏ dại xâm lẫn nhưng có giá trị lớn về y học.2.1.2 Đặc điểm phân bố

Cỏ hôi phát triển nhanh, thích ứng tốt với môi trường và thường mọc thành cụm ởven đường, đầm lầy, quanh các bờ ruộng Cây có nguồn gốc ở các nước nhiệt đới châu

Mỹ, phát tán tự nhiên vào nhiều nước như Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Lào,

3

nôi rõ, mép lá có răng cưa tròn, toàn thân và lá được phủ một lớp lông mịn màu trăng.

Hoa có màu tím hoặc trang, mọc thành cụm, môi ngọn mang khoảng 4-18 dau hoa Quả

có các múi màu đen, có lông và có gai hướng lên Cây ra hoa quanh năm và có khả năng

phát tán xa, giúp cây duy trì và phát triển rộng rãi (Chahal và ctv, 2021)

2.2 Các hợp chat sinh học có trong cây cỏ hôi

Cây cỏ hôi chứa nhiều hợp chất thứ cấp như: tinh dau, alkaloid, polyphenol,flavonoid, saponin, (Chahal và ctv, 2021).

2.2.1 Tinh dau

Tinh dau là một dang chat lỏng chứa các hợp chất thơm dé bay hơi được chiết xuấtbằng cách chưng cất và lôi cuốn hơi nước từ các bộ phận của thực vật Nhiều nghiêncứu về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu đã được công bó Hoạt tính kháng khuẩn củatinh dầu là do sự hiện diện của một số phenol, terpen và aldoketones Tinh dau có chứacác thành phần kháng khuẩn tự nhiên dé bảo vệ thực vat chống lại các tác động từ côntrùng, nam, vi sinh vat, (Liêu Thùy Linh và ctv, 2017)

2.2.2 Alkaloids

Alkaloids là một nhóm hợp chất hóa học tự nhiên Chúng được sử dụng trong quátrình chuyên hóa và trao đổi chat ở một số sinh vat Các chất liên quan đến alkaloid nhưserotoin, dopamin và histamin là những chất dẫn truyền thần kinh quan trọng ở độngvật Đối với thực vật, alkaloid có tác dụng điều hòa sự phát triển của thực vật Ngoài ra,một số nghiên cứu chỉ ra rằng alkaloids thực vật có khả năng ức chế một số sinh vật gâyhại tác động lên cây Trong y học, khi những alkaloid đầu tiên được phân lập vào thé ki

19, chúng ngay lập tức được ứng dụng trong thực hành lâm sàng Từ đó đến nay, nhiềuloại thuốc tổng hợp và bán tổng hợp là những biến đổi cau trúc của alkaloid, được thiết

kế dé tăng cường hoặc thay đôi các tác dụng chính của thuốc và giảm tác dụng phụkhông mong muốn (Babbar, 2015) Hai isomeric pyrrolizidin alkaloid được phân lập từcây cỏ hôi là lycopsamin và echinatin (Nguyễn Thị Kim Liên, 2018)

2.2.3 Polyphenol

Polyphenol là một nhóm đa dạng các hợp chất xuất hiện trong tự nhiên, chúngthường được tìm thấy ở các nhóm thực vật bậc cao Các polyphenol tự nhiên được biết

là có nhiều hoạt tinh sinh học Chúng có tiềm năng dé sử dụng làm thuốc dé chữa cácbệnh như AIDS, nhiễm trùng do vi khuẩn và rối loạn thần kinh (Handique và Baruah,

2002).

Polyphenol đảm nhận rất nhiều vai trò sinh ly ở thực vật, giúp cây chống chịu trướctác động của môi trường như nhiệt độ thấp, mầm bệnh, thiếu chất dinh dưỡng Kháiniệm “phenol thực vật” bao gồm một nhóm rat đa dạng với sự đa dạng cấu trúc cực kìlớn Một số loại polyphenol được phân loại dựa trên khung cơ bản của chúng: Ce (phenolđơn giản, benzoquinones), CạC¡ (axit polyphenol), CC; (acetophenone, axit

phenylacetic), CøCs (axit hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropanes, chromones),

Ce6C4 (naphthoquinones), Ce6CiCs (xanthones), CC¿Cs¿ (stilbenes, anthraquinones), CoC3Ce (flavonoid, isoflavonoids, neoflavonoids), (CCzCs)23 (bi-, triflavonoid), (C6C3)2

(lignan, neolignan), (C6C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanins, phlorotannin) và sau cùng là (CøC3Cs )n (tannin cô đặc) (Cheynier va ctv, 2013).

Theo Mary và Giri (2016) khi xác định hàm lượng hoạt chất trong cây cỏ hôi bằngphương pháp sắc kí khối phổ đã xác định được 28 hợp chất Trong đó tìm thấypolyphenol ở dạng phenol,4,6-di(1,1-dimethylethyl)2-methyl- chiếm 5,73% trong dịchchiết ethanol từ cỏ hôi Năm 2019, Yadav và ctv đã có báo cáo về thành phần hóa học

và đặc tính của cây cỏ hôi đã tìm thay chromenes, kaempferol, precocene I và precocene

II thuộc nhóm polyphenol và xác định được hoạt tính kháng nam của những hop chấttrên qua đó góp phan khang định thêm về khả năng kháng nam của cây cỏ hôi

2.2.4 Flavonoid

Flavonoid là một nhóm các hợp chất tự nhiên được tìm thấy rộng rãi trong giớithực vật và được xem như chất chuyền hóa trung gian của thực vật Flavonoid có nhiềuhoạt tính sinh học và công dụng đa dạng như chống oxy hóa, hạ lipid máu, chống lão

hóa và ngăn ngừa xơ vữa động mach (Lin va ctv, 2020).

Dựa theo câu trúc hóa hoc, flavonoid có các phân lớp như flavonols, anthocyanins, flavan-3-ols, flavanones, flavones, isoflavones va proanthocyanidins (George và ctv, 2017).

° Flavone Flavonol Flavanone

) ~ OO OO

@ CL >

ar? ocr?

OH Flavan-3-ol Anthocyanidin Isoflavone

Hình 2.2 Cấu trúc cơ bản của phân lớp flavonoid.

Cây cỏ hôi rất giàu các flavonoid đã methoxy hóa Có tổng cộng 21 flavonoid đãđược công bó, trong đó có 14 flavon bị methoxy hóa là dẫn xuất của tricin Có 3 flavon

tự nhiên mới là ageconyflavon A (5,6,7-trimethoxy-3',4-methylenedioxyflavon),

ageconyflavon B_ (5,6,7,3’-tetramethoxy-4'-hydroxyflavon), ageconyflavon C (5,6,7,3',5'-pentamethoxy-4'-hydroxyflavon).

Ngoài ra con có các flavonoid khác như: 5'-methoxynobiletin, linderoflavon B,

hexamethoxyflavon, eupalestin, nobiletin (Nguyễn Thị Kim Liên, 2018)

2.2.5 Saponin

Saponin là một loại hợp chất có cấu trúc đa dạng có ở nhiều loài thực vật, chúngđóng vai trò quan trọng trong hệ thống phòng thủ, giúp bảo vệ, cạnh tranh và tương tácgiữa các loài với nhau Saponin có khả năng chống lại mầm bệnh, nam, sâu bệnh do cóđặc tính kháng khuẩn, kháng nắm, chống lại kí sinh trùng và diệt côn trùng (Chaieb,

2010).

Saponin được chia thành các loại chính : dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oleananes, taraxasteranes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes và steroid (Vincken va ctv, 2007).

2.2.6 Dược tính của cây cỏ hôi

A conyzoides có tác dụng đã được ghi nhận: nhuận tràng, hạ sốt, chữa viêm mắt,đau bụng, làm lành vết thương Ở các nước Nam Mỹ, châu Phi cỏ hôi được sử dụng làmthuốc kháng viêm, giảm đau (Okunade, 2002).

Tác dụng kháng khuẩn của cỏ hôi có được nhờ có hợp chất sterol và flavonoid.Tinh kháng khuẩn của dịch chiết methanol đã được khảo sát trên 11 chủng vi khuẩn chokết quả lành vết thương hơn 90%, dịch chiết lá có tác dụng ức chế các chủng nam C

falcatum, R solani và gay độc mạnh trên các loài E floccosum , T: mentagrophytes, M.

gypseum (Nguyén Thi Kim Lién, 2018)

Theo các tài liệu nghiên cứu trước, các hoạt chat sinh học như polyphenol, alkaloid,flavonoid, saponin là những hợp chất có tác dụng ức chế nâm tốt nhất nhờ có đặc tínhkháng khuẩn, kháng nắm và chống oxy hóa mạnh Do đó nghiên cứu này với mongmuốn xác định hàm lượng của các loại hợp chất trên và khả năng ức chế lên các chủng

nâm.

2.3 Các chủng nam gây bệnh pho biến ở trên cây trồng

2.3.1 Nam Aspergillus niger

Chi Aspergillus là một trong những chi nam phô biến nhất gây bệnh trên cả thựcvật và động vật (Wuyep va ctv, 2017) Aspergillus niger (A niger) là một loại namascomycete dang sợi có mau den sam, có kha năng chống chịu tốt, tăng trưởng nhanhnhờ phát tán bào tử, chúng thường được tìm thấy trong đất, nước, không khí và thực vậtthối rữa 4 niger là loài mốc đen điển hình của chi Aspergillus, phân bé rộng rãi ở nhiềuvùng địa lý khác nhau trên thế giới A niger gây thối quả thông qua các vết xước, gâymốc đen ở hành tỏi và các loại hạt ở giai đoạn sau thu hoạch, gây thiệt hại lớn về kinh

tế Ngoài ra một số chủng A niger còn có khả năng sinh độc tố ochratoxin A (Tran VănTuấn và ctv, 2020; Gautam và ctv, 2011)

Theo báo cáo của Schuster va ctv (2002) A niger được ứng dung trong trong côngnghệ sinh học dé sản xuất enzyme ngoại bào và acid citric Ngoài ra, A niger còn được

sử dụng dé biến đổi sinh học và xử lý chat thải

Tuy nhiên A niger đã được phát hiện là nguyên nhân gây nhiễm trùng ở người

Nêu hít phải với lượng vừa đủ có thê gây ra các bệnh về phôi ở người Độc tô do nâm

A niger tiệt ra không chỉ gây ra đôi màu, suy giảm chat lượng nông sản mà còn gây ra

các bệnh về thần kinh, gan, thận, cơ quan hô hấp, (Gautam và ctv, 2011)

Theo Wu và ctv (2014) nghiên cứu cho thay thành phần chứa polymethoxyflavone

có kha năng ức chế nam A niger bang cách thay đổi tính thắm của màn tế bao và làmsuy yêu tính toàn vẹn của thành tế bào thông qua ức chế sản xuất chitin

2.3.2 Nắm Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum (F oxysporum) bao gồm ca chủng gây bệnh và không gâybệnh Các dang gây bệnh thực vat gây bệnh nghẽn bó mạch, héo rũ ở các cây trồng quantrọng về mặt kinh tế trên khắp thế giới, tùy theo từng loại cây trồng mà chúng được chia

thành các loại khác nhau (Gordon va Martyn, 1997; Gordon, 2017) F oxysporum gây

bệnh héo rũ chủ yếu trên cây trồng như chuối, cà chua, dưa chuột, gây thiệt hại lớncho sản lượng và chất lượng cây trồng Đa số các loài Fusarium gây bệnh rất khó kiểmsoát hoặc điều trị vì bản chất kháng thuốc và khả năng ton tại lâu trong đất dù có hoặc

không có sự hiện diện của cây chủ (Chahal và ctv, 2021).

Hiện nay ở nước ta, F oxysporum được xem là loài phân bố rộng trong cả môitrường đất và nước, gây bệnh cho nhiều loài động thực vật Ở động vật gây ra các triệuchứng lờ đờ, lở loét ở cá và gây bệnh đen mang ở động vật giáp xác (Phạm Minh Đức

và Trần Ngọc Tuấn, 2017) Theo nghiên cứu của Trần Ngọc Hùng và ctv (2020), ở ViệtNam F oxysporum được tìm thấy thường gây bệnh trên chuối, hay còn gọi là bệnh

Panama, gây thiệt hại nghiêm trọng cho các vùng trông chuôi lớn trên cả nước.

Theo các báo cáo của Javed và Bashir (2012) n-hexane có tác dụng kháng lại cácloại nam thuộc chi Fusarium, trong đó điển hình là Fusarium solani Ngoai ra precocene

II cũng có tác động đến khả năng phát triển của các loài Fusarium trên môi trường thạchkhoai tây dextrose Các hạch nam bị ức chế hoàn toàn bởi precocene II ở nồng độ 150

2.3.3 Nam Phytophthora sp

Phytophthora sp là một loại nắm có dạng hình trứng tạo bởi các sợi nắm được tạo

ra liên tiếp từ một bào tử Đến nay đã phát hiện hơn 80 loài Phytophthora, chúng gâybệnh trên hơn 1000 loài thực vật và có mặt trên 67 quốc gia trên thế giới (Ho, 1990)

Phytophthora sp gây bệnh cháy lá, thối rễ, thối quả phổ biến ở các loài cây như

bau bi, cà chua, cà tim, sen, Bào tử của nó có thé tồn tại trong đất trong vai năm va

có thé tan công cây chủ ở bat kì giai đoạn nào Nước ngầm trong đất hoặc trên tan lá tạođiều kiện thuận lợi cho mầm bệnh sinh sản vô tính với sự hình thành bào tử và bào tửđộng làm lây lan nhanh chóng mầm bệnh, do đó rất khó khăn trong việc phòng trị bệnh

do Phytophthora sp gây ra (Islam và ctv, 2005).

Theo nghiên cứu của Del Rio va ctv (2003), Phytophthora sp bi hợp chat phenolic

ức chế, phenolic gây ảnh hưởng đến sự phát triển, hình thái va siêu cấu trúc của loạinam này, hầu hết các sợi nam bi mỏng di do tác dụng của phenolic Ngoài ra, nghiêncứu còn chỉ ra rằng hợp chat phenolic đóng vai trò tích cực trong việc bảo vệ cây chốnglại sự tấn công của mầm bệnh Mặt khác, Phytophthora sp có thé bị ức chế sự phát sinhbao tử trong đất nhờ hoạt chất 5'-methoxynobiletin và 5,6,7,3',4',5'-hexamethoxyflavone

thuộc nhóm flavon có trong cây cỏ hôi (Kong va ctv, 2004).

2.4 Tinh hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học tràn lan đã gây ra những hậu quả tolớn cho môi trường, từ đó việc sử dụng dịch chiết từ thực vật chống lại sự phát triển củanam bệnh được quan tâm và nghiên cứu, chúng đáp ứng được van đề về bảo vệ môitrường và sức khỏe con người Đến nay việc sử dụng dịch chiết từ thực vật ức chế nambệnh đã không còn là khái niệm quá xa lạ đối với chúng ta như trước

2.4.1 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, sử dụng dịch chiết từ thực vật kháng lại các loại nắm bệnh đã và đangđược nghiên cứu khá nhiều Tuy nhiên có khá ít nghiên cứu về cây cỏ hôi, trong đó nồibật như nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của Ageratum conyzoides L ức ché vikhuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây bệnh cháy bìa lá lúa Kết quả chothấy dịch trích cỏ hôi ở các nồng độ khác nhau (2%, 4%, 6%, 8% và 10%) không tácđộng tiêu diệt trực tiếp đến vi khuẩn Xoo Dịch trích cỏ hôi ở 3 nồng độ (2%, 4% và8%) không làm ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của chiều dài diệp tiêu và rễmam tới 96 giờ sau xử lí Nồng độ cỏ hôi 2% với biện pháp ngâm hat hay phun kếthợp giai đoạn 25 ngày sau khi gieo và 35 ngày sau khi gieo thể hiện quả giảm chiều

dài vết bệnh ở thời điểm 7 ngày sau khi lây bệnh (Mai Như Phương và Trần Thị Thu

Thủy, 2023).

2.4.2 Nghiên cứu nước ngoài

Theo các nghiên cứu trên thê giới, cỏ hôi có chứa nhiêu hoạt chât quý có tác dụng kháng khuân, kháng nâm, chông viêm, và được ứng dụng nhiêu trong điêu trị bệnh

trên người cũng như cây trồng

Năm 2017, Wuyep va ctv đã nghiên cứu về kha năng kháng chủng Aspergillus spp

từ chiết xuất từ cây cỏ hôi Ông và ctv sử dụng ethanol và nước làm dung môi tách chiết,thu được các hoạt chất từ cây cỏ hôi như: phenol, alkaloid, flavonoid, saponin, có tácdụng kháng khuẩn, kháng nam, chống oxy hóa, diệt côn tring, Qua khảo sát kha năng

ức chế lên các chủng Aspergillus spp cho thay mức ức chế trung bình là 20 mm

Theo báo cáo của Kotta va ctv (2020) về tác dụng chữa bệnh, hoạt tính sinh học,đánh giá được lực của cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.), cỏ hôi có chứa các thành phầnhóa học như terpenoid, alkaloid, flavonoid, saponin có dược tính như chống viêm,kháng khuẩn chống nhiễm tring, Nghién cứu này cũng chỉ ra rằng hoạt tính khángkhuẩn trong chiết xuất methanol và ethanol của A conyzoides chống lại enzyme oxydase

ở vi khuẩn, có kha năng kháng lại vi khuẩn Escherichia coli và Klebsiellapneumoniae (vi khuân gây bệnh đường tiết niệu) Hoạt tinh từ chiết xuất rễ và lá chothấy khả năng kháng lại chủng Bacillus subtilis (Gram dương), Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonellatyphi (Gram âm) và các chủng nam như Aspergillus niger, Candidaalbicans, Penicillium notatum va Rhizopus stolon Chiết xuất từ lá va thân Ageratumconyzoides L chứa các chất như flavonoid, saponin, alkaloid, tannin va phenol, cho thayhoạt tinh kháng khuẩn phụ thuộc vào nồng độ dich chiết

Năm 2021, Chahal và ctv đã nghiên cứu về Ageratum conyzoides L và các chấtchuyên hóa thứ cấp trong cây có tác dụng kháng các loại nắm bệnh khác nhau Nghiêncứu đã chỉ ra rằng trong cỏ hôi có chứa lượng lớn các chất chuyên hóa thứ cấp có đặctính kháng nam như alkaloid, flavonoid, terpenoid, nên có tac dụng ức chế hầu hếtcác chi nắm phô biến như Fusarium, Aspergillus, Pennicillium, Trong đó các chủng

nam Fusarium bị ức chê hoàn toàn bởi Precocene II ở mức 150 ppm Riêng nam

10

Fusarium oxysporum bi tác động ức chế bởi eugenol có trong cây ở mức nồng độ ức chếtối thiểu là 9-12 g/mL B-caryophyllene và eugenol có tác dụng cộng hưởng cho thấyhiệu quả kháng nam rõ rệt, nồng độ ức chế tối thiểu đối với A niger lên đến 6 + 0,8 uM.Widodo và ctv (2008) tách chiết các bộ phận khác nhau của A conyzoides với các dungmôi khác nhau và kết luận rằng khi chiết bằng ethanol cho thấy khả năng kháng cácchủng nam như A niger, C albicans, M gypseum và T mentagrophytes Năm 2000, Rai

va Acharya đã sàng loc 11 loài thực vật thuộc ho Asteraceae về kha nang khang namcủa chúng bang cách sử dụng kỹ thuật khuếch tan dia và liệt kê 4 conyzoides là mộttrong số những loài có tác dụng ức chế hiệu quả sự phát triển của sợi nam Fusarium

oxysporum.

Hazirah va ctv (2023) đã sử dụng các bộ phan khác nhau của cây cỏ hôi (lá, thân,

hoa) ngâm trong dung môi methanol trong 10 ngày sau đó cô quay chân không và khảo

sát ở các nồng độ khác nhau (4%, 6%, 8%, 10%) Kết quả cho thấy tất cả các chiết xuấtthực vật có nguồn gốc từ các bộ phận khác nhau đều có thể ức chế sự phát triển sợi nắmcủa Fusarium oxysporum Trong đó sự ức chế tối đa ở chiết xuất hoa với nồng độ 10%,tiếp theo là chiết xuất lá với nồng độ 8% và chiết xuất thân với nồng độ 10% Có khảnăng chiết xuất thật vật cỏ hôi với nồng độ cao hơn sẽ được dùng làm thuốc diệt nắm tự

nhiên chong lại Fusarium oxysporum.

Ndacnou va ctv (2020) sử dung ethanol làm dung môi tach chiết cỏ hôi và đánhgiá khả năng kháng nam Phytophthora megakarya thu được kết quả ở tất cả các nồng

độ được thử nghiệm đều có sự ức chế và làm giảm sự phát triển của sợi nắm Mức ứcchế tăng trưởng cao nhất ở nồng độ 15 mg/mL là 38,96% và thấp nhất là 13,68% ở 2mg/mL Nghiên cứu này sử dụng dịch chiết thô từ ethanol của cây cỏ hôi kháng nắmPhytophthora megakarya cho kết quả tích cực khi ở tất cả các nồng độ khảo sát sợi nắmđêu bị ức chê.

Vào năm 2012, Sidra Javed và Uzma Bashir thực hiện nghiên cứu đánh giá hiệuquả in vitro của chiết xuất methanol và n-hexane trong nước của A conyzoides chénglại nam gây bệnh Fusarium solani Mart (Sacc.) được phân lập từ rễ của cây trứng(Solanum melongena) Loại nam mục tiêu được khảo sát với các nồng độ khác nhau là2%, 4% và 6% chiết xuất nước, methanol và n-hexane của hoa, lá, thân và rễ Kết quảcho thấy tất cả các nồng độ chiết xuất được sử dụng trên bốn bộ phận của cây đều ngăn

11

chặn đáng ké sự phát triển của nắm mục tiêu Chiết xuất n-hexane của lá và hoa làmgiảm đáng ké sự tăng trưởng của E solani đến 84%, tiếp theo là chiết xuất từ thân và rễlàm giảm tăng trưởng lần lượt 80% và 72% Mô hình giảm tăng trưởng tương tự cũngđược quan sát trong chiết xuất methanol là dung dịch nước Trong bốn bộ phận cây cỏhôi được thử nghiệm, các nồng độ khác nhau của dịch chiết lá trong methanol có hiệuquả cao trong việc kiểm soát sự tăng trưởng của nam (giảm 78% sinh khối nắm so vớiđối chứng, tiếp theo là hoa (giảm 74%), thân (giảm 63%) và rễ (giảm 59%) ở nồng độcao nhất Trong chiết xuất từ nước, mức giảm tôi đa được ghi nhận ở chiết xuất lá (72%),tiếp theo là hoa, thân và rễ.

12

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

3.1 Thời gian và dia điểm nghiên cứu

Đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng một số chủng nắm gây bệnh cho cây trồngbằng dịch chiết cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides)” được thực hiện trong khoảng thờigian từ tháng 5 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023 tại phòng Các chất có hoạt tính sinhhọc - Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phó Hồ Chi Minh (ITB)

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nghiên cứu phương pháp tách chiết và định lượng các hợp chất sinh học có

trong cây cỏ hôi

3.2.1.1 Vật liệu

Cây Cỏ hôi (A conyzoides) trưởng thành được thu hái từ Lâm Đồng Cây sau khithu nhận được đưa về phòng thí nghiệm, rửa sạch và phơi khô, sau đó mang đi cắt nhỏ,xay nhuyễn bằng máy xay sinh tố cầm tay, bảo quản bột trong hộp kín ở nhiệt độ phòng.3.2.1.2 Tách chiết với dung môi ethanol và methanol

Quy trình tách chiết được tiễn hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của dung môi ethanol

và methanol đến hiệu quả chiết xuất các hợp chất Sử dụng ethanol và methanol ở 4nồng độ là 30%, 50%, 70% và 90% làm dung môi ngâm chiết

Chuẩn bị dịch chiết: Cân vào mỗi bình erlen 10g mẫu cỏ hôi (bột cỏ hôi) được kíhiệu lần lượt là E30, E50, E70, E90, M30, M50, M70, M90 (tương ứng với các dungmôi ngâm chiết) thêm vào mỗi bình dung môi tương ứng theo tỉ lệ nguyên liệu : dungmôi là 1:5 (g/ml), ngâm trong 24 giờ Sau đó, thu dịch chiết lần 1, tiếp tục thêm dungmôi vào theo tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:3, ngâm trong 24 giờ, tiếp tục lặp lại thêm

ba lần nhằm thu hết lượng hoạt chất có trong cây Mỗi lần ngâm chiết kết hợp với đánhsóng siêu âm trong bề siêu âm Elma (Đức) với công suất 700W, tần số siêu âm 37 kHz

ở nhiệt độ 40°C - 45°C trong 60 phút Sau khi hoàn thành 5 lần chiết, dịch chiết đượcloại bỏ dung môi bằng thiết bị cô quay chân không Đối với dung môi ethanol (E30,E50, E70, E90) làm bay hơi dung môi với áp suất 70 — 130 mBar, 90 rpm ở nhiệt độ60°C Đối với dung môi methanol (M30, M50, M70, M90) làm bay hơi dung môi với

13

áp suất 70 — 130 mBar, 90 rpm ở nhiệt độ 45°C Thu dịch chiết cô đặc và bảo quản trong

falcon ở 4°C sử dụng cho các thí nghiệm sau.

3.2.1.3 Phương pháp định lượng một số hợp chat sinh học có trong cây cỏ hôi

Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tông số

Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp do mật độ quang(OD) sau khi phản ứng với thuốc thử Folin — Ciocalteu (Singleton va ctv, 1999) có hiệuchỉnh cho phi hợp Phức hợp phospho — wolfarm — phosphomolybdat có trong thuốcthử Folin — Ciocalteu sẽ bị khử bởi các hợp chat polyphenol tạo thành sản phẩm phảnứng có màu xanh tham, hap thu cực đại ở bước sóng 765 nm Acid gallic được sử dụnglàm chất chuẩn

Xây dựng đường chuan :

Chuan bị hóa chất: cân chính xác 0,1 g chất chuẩn gallic acid , hòa tan trong nướccất và định mức thành 100 mL, thu được dung dịch chuẩn gốc acid gallic nồng độ 1000ug/mL Tiếp theo, hút 10 mL dung dịch chuẩn gốc acid gallic đã pha vào bình định mức,định mức lên 100 mL thu được dung dịch chuẩn 100 ug/mL Dựng đường chuẩn vớiacid gallic với các nồng độ khác nhau 10, 20, 30, 40, 50 (ug/mL) bang cách lần lượt hút

1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL từ dung dich chuẩn gallic acid 100 ug/mL và định mức

lên thành 10 mL.

Bảng 3.1 Thông số pha loãng acid gallic

Nong độ pha loãng(u„gmL) 10 20 30 40 50

“Dung dịch chuẩn (mL) II 2.3 645Nước cất (mL) 9 8 7 6 5

Tiến hành thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm 2 mL gallic acid ở các nồng độ khácnhau (tương ứng T1, T2, T3, T4, T5) với 5 mL thuốc thử Folin — Ciocalteu 10%

(HC28583601, Merck) và chờ trong 5 phút Sau đó, thêm 4 mL dung dich NazCO3 7,5%

vào ống nghiệm, lắc đều, dé yên va ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 60 phút.Tiến hành song song cùng đối chứng (ĐC), với mẫu đối chứng là nước cất Sau 60 phút

14

ủ tối, tiến hành đo mật độ quang của mẫu đối chứng và mẫu chuẩn ở bước sóng 765 nmbang máy đo quang phô UV — Vis.

Bảng 3.2 Quy trình pha dãy dung dịch chuẩn acid gallic

Công thức

ĐC Tl T2 T3 T4 TẾ Phản ứng

60 phút ủ tối, tiến hành do mật độ quang của mẫu đối chứng và mẫu dịch chiết ở bướcsóng 765 nm bang máy đo quang phổ UV — Vis

Bảng 3.3 Quy trình thực hiện định lượng polyphenol trong mẫu

Tên hóa chất Đối chứng MẫuNước cất 2 mL 0 mL

Dich chiết pha loãng 0 mL 2 mL

Folin 10% (5 phút) 5 mL 5 mL

NaaCO: 7,5% (60 phút, ủ tối) 4mL 4mL

Tính toán kết quả: dua vào phương trình hồi quy giữa nồng độ dung dịch và độhap thụ quang, xác định nồng độ của polyphenol tổng trong mẫu dịch chiết (mg/mL)

Phương pháp xác định ham lượng flavonoid tông số

Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp tạo mau với AICH(Chang và ctv, 2002), bằng cách xây dựng đường chuẩn với quercetin (QE)

15

Xây dựng đường chuẩn:

Chuẩn bị hóa chất: cân chính xác 0,1 g quercetin (BSZ106, Trung Quốc), hòa tantrong dimethyl sulfoxide (DMSO) 100% và định mức thành 100 mL thu được dung dịchchuẩn quercetin 1000 g/mL Dựng đường chuẩn quercetin với các nồng độ khác nhau

20, 40, 60, 80, 100 (ug/mL).

Bảng 3.4 Thông số pha loãng quercetin

Nong độ pha loãng (ug/mL) 20 40 60 80 100

Dung dịch chuân (mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1

DMSO (mL) 9,8 9,6 9,4 92 9

Tiến hành thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm 0,5 mL dung dich quercetin ở các nồng

độ khác nhau (tương ứng với T1, T2, T3, T4, T5) va bổ sung 1,5 mL methanol 99,5%

va chờ trong 5 phút Sau đó, thêm tiếp 0,1 mL AICI; 10% và dé phản ứng trong 6 phút.Cuối cùng, hỗn hợp được thêm vào 0,1 mL CH:COOK 1M và 2,8 mL nước cất, lắc đềurồi dé ôn định ở nhiệt độ phòng trong 45 phút Tiến hành song song cùng mẫu đối chứng(ĐC), với mẫu đối chứng là DMSO Sau 45 phút, tiến hành đo độ hap thu của mẫu đốichứng và mẫu chuẩn bằng máy đo quang phổ UV-Vis ở bước sóng 415 nm

Bảng 3.5 Quy trình pha dãy dung dịch chuan quercetin

Phân ứng Công thức

ĐC Ti 12 T3 T4 T5

Dung dich chuan (mL) 0 05 05 05 0,5 0,5

DMSO (mL) 0,5 0 0 0 0 0 Methanol 99,5% (mL) “si lễ 18 if l2 AICl 10% (mL) 01 01 01 01 01 01

CH3COOK 1M (mL) 01 01 01 01 O1 01

Nước cất (mL) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Mau dịch chiết: pha loãng các mẫu dich chiết bang dimethyl sulfoxide (DMSO)100% và chọn ra độ pha loãng phù hợp với từng loại dung môi tách chiết Cho vào ốngnghiệm 0,5 mL mẫu dịch chiết pha loãng và bổ sung 1,5 mL methanol 99,5% va chờ

16

trong 5 phút Sau đó, thêm tiếp 0,1 mL AICI; 10% va dé phản ứng trong 6 phút Cuốicùng, hỗn hợp được thêm vào 0,1 mL CH3COOK 1M va 2,8 mL nước cất, lắc đều rồi

dé ôn định ở nhiệt độ phòng trong 45 phút Tiến hành song song cùng mẫu đối chứng,các nghiệm thức với mẫu địch chiết cũng được thực hiện tương tự và được lặp lại 3 lần.Sau 45 phút, tiến hành đo độ hấp thu của mẫu đối chứng và mẫu dịch chiết bằng máy đoquang phố UV-Vis ở bước sóng 430 nm

Bảng 3.6 Quy trình thực hiện định lượng flavonoid trong mẫu

Tên hóa chất Đối chứng Mẫu

ba chủng nắm gây bệnh trên cây trồng

3.2.2 Khảo sát khả năng ức chế của dịch chiết cỏ hôi lên một số loại nắm nắm gâybệnh trên cây trồng

3.2.2.1 Mẫu thí nghiệm

Dịch chiết cỏ hôi ở các nồng độ được chọn và các loại nắm được khảo sát bao gồm:

Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Phytophthora sp được cung cấp bởi phòng Vi

sinh của viện Sinh học Nhiệt đới.

3.2.2.2 Thiết bị và dụng cụ

17

Thiết bị: tủ cấy vi sinh vô trùng, nồi hap khử trùng autoclave, tủ say.

Dụng cụ: đĩa petri, đèn côn, que cây, micropipette, ông đong va một sô dụng cụ cơ

bản của phòng thí nghiệm khác.

3.2.2.3 Môi trường

Môi trường PDA: 200 g khoai tây, 20 g agar, 20 g glucose, 1000 mL nước cất được

sử dung làm đối chứng (DC)

Môi trường PDA khảo sát: 200 g khoai tây, 20 g agar, 20 g glucose, 1000 mL, dịch

chiết (chiếm lần lượt 1%, 2%, 4%, 8% tông thé tích dung dịch)

3.2.2.4 Phương pháp thí nghiệm

Môi trường sau khi được hấp ở 121°C trong 20 phút, tiến hành cho vào đĩa petri

đã chuẩn bị Sau 1 ngày, loại bỏ những đĩa nhiễm, dùng que cấy móc và phương phápcay điểm cấy các chủng nam khảo sát vào thạch đĩa, đĩa được ủ ở 28°C, lặp lại 3 lần với

môi nông độ dịch chiét.

Chỉ tiêu ghi nhận: đo đường kính tan nắm (ĐKTN) bằng thước đo với đơn vị emtại các thời điểm 72, 120 và 168 giờ, qua đó đánh giá được khả năng ức chế sinh trưởng

và phát trién của nam Hiệu lực ức chế (HLUC) được tính theo tỷ lệ ức chế tốc độ pháttriển của DKTN sau 72, 120 và 168 giờ nuôi cay và được tính theo công thức (Al-Hetar

va ctv, 2011).

ĐKTN ở công thức đối chứng - DKTN ở công thức thí nghiệm

HLUC (%) = : 100a) DKTN ở công thức đối chứng *

3.2.2.5 Xử ly số liệu

Các số liệu thí nghiệm được nhập và xử lý sơ bộ, tính các giá trị trung bình và vẽbiểu đồ bằng phần mềm Excel, phân tích ANOVA bằng phần mềm Minitab, các giá trịtrung bình được kiểm định bằng phép thử Tukey ở mức ý nghĩa 95%

18

CHƯƠNG 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả tách chiết và định lượng các hợp chất sinh học có trong cây cỏ hôi4.1.1 Tach chiết các hợp chất sinh học có trong cây cỏ hôi

Mẫu thân lá cây sau khi thu được rửa sạch, phơi khô Tiếp theo đó cắt nhỏ, xaynhuyễn bảo quản bột trong hộp kín ở nhiệt độ phòng Mẫu cỏ hôi được ngâm chiết vớicác dung môi ethanol và methanol ở các nồng độ khác nhau, thu dịch chiết tiến hành cô

Hình 4.1 Dịch chiết ethanol cô đặc Hình 4.2 Dịch chiết methanol cô đặc

(a) E30; (b) E50; (c) E70; (d) E90 (a) M30; (b) M50; (c) M70; (d) M904.1.2 Định lượng các hợp chat sinh học có trong cây có hôi

Hàm lượng polyphenol

Hàm lượng polyphenol trong dịch chiết được tính toán thông qua đường chuẩnacid gallic (GAE) với nồng độ lần lượt từ 10 — 50 pL/mL bằng phan ứng tạo màu vớithuốc thử Folin — Ciocalteu Kết quả xây dung đường chuẩn thể hiện mối tương quangiữa nồng độ acid gallic với nồng độ hap thu quang ở bước sóng 765 nm được thé hiện

ở Hình 1 phụ lục 5.

19

Mẫu dịch chiết được pha loãng với nước cất với độ pha loãng phù hợp với từngloại dung môi tách chiết Độ phân cực của dung môi là một trong những yếu tố có tínhquyết định đến hiệu quả tách chiết polyphenol Điều chỉnh độ phân cực dung môi đãchọn sao cho phù hợp với quá trình tách chiết có thể được thực hiện dễ dàng bằng cáchthay đổi tỉ lệ phối trộn dung môi với nước cất Kết quả ảnh hưởng của nồng độ dungmôi đến hàm lượng polyphenol tổng được tách chiết được thể hiện ở Hình 4.3 cho thấymethanol 70% trích được nhiều polyphenol nhất.

Hình 4.3 Anh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tông

Các chữ cái khác nhau trên mỗi cột chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thong kê ở mức ý nghĩa 5%

20

polyphenol tổng khi tách chiết bằng các dung môi ethanol 30% và methanol 90%;methanol 30%, methanol 50% và ethanol 90% không có sự khác biệt về mặt thống kê.

Kết quả này có thể được lý giải là do các phân tử hợp chất polyphenol mang nhiềunhóm phân cực, do đó chúng hòa tan tốt trong dung môi phân cực mạnh là methanol.Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây tìm thấy methanol là dung môihiệu quả nhất dé tách chiết polyphenol Hàm lượng polyphenol đạt cao nhất khi táchchiết bằng methanol 70%, khi tăng nồng độ dung môi lên nữa thì hàm lượng polyphenoltổng giảm vì nồng độ quá cao sẽ làm các thành tế bao bị mat nước cục bộ dẫn tới hiện

tượng các tế bào bị khô và co lại ngăn cản quá trình tách chiết.

Hàm lượng flavonoid

Hàm lượng flavonoid trong dịch chiết được tính toán thông qua đường chuẩnquercetin (QE) với nông độ lần lượt từ 20 — 100 ug/mL bằng phương pháp tao màu vớiAICI3 Kết quả xây dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ quercetinVỚI nồng độ hấp thu quang ở bước sóng 430 nm được thể hiện ở Hình 2 phụ lục 5

Mẫu dịch chiết được pha loãng với dimethyl sulfoxide (DMSO) với độ pha loãngphù hợp với từng loại dung môi tách chiết Dung môi đóng vai trò rất quan trọng trongquá trình chiết xuất Dung môi hòa tan tốt hoạt chất sẽ nâng cao được hiệu suất chiết.Tùy vào độ phân cực của hợp chất mà mỗi loại dung môi sẽ chiết được hàm lượngflavonoid khác nhau Điều chỉnh độ phân cực dung môi đã chọn sao cho phù hợp vớiquá trình tách chiết có thé được thực hiện dé dang bằng cách thay đối tỉ lệ phối trộndung môi với dimethyl sulfoxide (DMSO) 100% Kết quả ảnh hưởng của nồng độ dungmôi đến hàm lượng flavonoid tổng được tách chiết được thê hiện ở Hình 4.4 cho thấyethanol 90% trích được nhiều flavonoid nhất

21

Hàm lượng flavonoid (mg QE/mL) + ren oo ° is) = a E2

i i

30% 50% 70% 90%

Nong độ dung môi trích ly

mMethanol m# Ethanol

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến ham lượng flavonoid tổng.

Các chữ cái khác nhau trên mdi cột chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thong kê ở mức ý nghĩa 5%

cụ thé hàm lượng flavonoid tách chiết được là 15,609 mg QE/mL Hàm lượng flavonoidkhi tách chiết bằng các dung môi methanol 70% va ethanol 70%; ethanol 50% vamethanol 90%; methanol 30% và ethanol 30% không có sự khác biệt về mặt thống kê

Kết quả này có thể được lý giải là do mức độ phân cực của dung môi phụ thuộcvào hằng số điện môi, giá trị liên kết hydro, mà nước có hằng số điện môi, giá trị liênkết hydro cao hơn ethanol Do đó, khi pha ethanol và nước sẽ cho các hỗn hợp ethanolnước có mức độ phân cực khác nhau, nồng độ dung môi có độ phân cực tương đươngvới hợp chất được tách chiết sẽ hòa tan chất đó tốt hơn Do vậy nồng độ ethanol 90% làthích hợp nhất dé tách chiết flavonoid tông có trong cây cỏ hôi

22

Ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng tách chiết các hoạt chất sinh học

mg GAE/mL) Kết quả nghiên cứu phù hợp với các báo cáo của Kambooj và Saluja(2008), Kaur và Dogra (2013), Adeoye và ctv (2023) khi đều tìm thấy các thành phầnphenol và flavonoidcó trong dịch trích từ cỏ hôi Tuy có sự khác biệt về hàm lượng hoạtchất ly trích được của kết quả này so với báo cáo của Adeoye và ctv (2023) nhưng điều

này có thể là do sự khác biệt về giống, điều kiện sống, sự thay đổi hàm lượng hoạt chất

theo mùa và phương pháp ly trích khác nhau.

Ở độ tin cậy 95%, hàm lượng các hoạt chất tách chiết được trong cây cỏ hôi từethanol 90% và methanol 70% đều cao hơn so với các dung môi khác Ethanol 90%trích được hàm lượng flavonoid cao nhất, methanol 70% trích được hàm lượngpolyphenol tong cao nhất Có thé thấy, nồng độ dung môi có khả năng tác động đến hàm

23

lượng hoạt chất ly trích được từ nguyên liệu Dung môi có độ phân cực phù hợp sẽ giúphợp chất được tách chiết hòa tan vào dung môi tốt hơn Vậy hai loại địch chiết là ethanol90% và methanol 70% được chọn dé khảo sát khả năng ức chế lên một số chủng namgây bệnh trên cây trồng.

4.2 Hoạt tính kháng một số chủng nắm gây bệnh trên cây trồng của dịch chiết cỏ

hôi trên đĩa petri

Khả năng ức chế các chủng nam của dịch chiết cỏ hôi trên dia petri được đánh giáthông qua khảo sát đường kính tản nam (cm) của các nghiệm thức 0%, 1%, 2%, 4%, 8%qua các thời điểm 72, 120 và 168 giờ, với mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

4.2.1 Hoạt tính kháng nắm Aspergillus niger

Kết quả đo DKTN Aspergillus niger trên môi trường PDA có bổ sung dịch chiếtethanol 90% (E90) qua các thời điểm 72, 120 và 168 giờ, với mỗi nghiệm thức được lặplai 3 lần được phân tích ANOVA 2 nhân tố bằng phần mềm Minitab gồm nhân tố 1 lànồng độ môi trường khảo sát, nhân tổ 2 là thời gian khảo sát Kết quả thí nghiệm 6 Bang4.2 cho thấy khi xét tương tác giữa nồng độ và thời gian bằng phương pháp kiểm địnhANOVA hai yếu tổ có giá trị kiểm định p (tương tác) < 0,05 nghĩa là có sự tương tácgiữa hai yếu tố trên lên sự phát triển của nam A niger và tương tác này rõ ràng khi xét

ở từng yếu tô đã nêu trên Kết quả phân tích được thể hiện trong Bảng 4.2

Bang 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết ethanol 90% đến sự phát trién DKTN củaAspergillus niger

Duong kinh tan nam (cm)

Nghiệm thức

72 giờ 120 giờ 168 giờ

ĐC (0%) 3,667 + 0,088Ì 6,633 + 0,033 9,000*

E90 1% 3,100 + 0,057 5,700 + 0,057! 8,167 + 0,088 E90 2% 2,800 + 0,057 4,933 + 0.0885 7,300 + 0,057° E90 4% 2,367 + 0,088 4,500 + 0,057" 6,300 + 0,057 E90 8% 2,033 + 0,088 3,867 + 0,088Ì 6,100 + 0,057°

P tương tác <0,05

Các chữ cái khác nhau theo sau giá trị trung bình chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thông

kê ở mức ý nghĩa 5% (P< 0,05).

24

Dịch chiết ethanol 90% khi bổ sung vào môi trường khảo sát ở các nồng độ khácnhau đều có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm trên thạch đĩa sau 72, 120, 168 giờnuôi cây Từ Bảng 4.2 cho thay khi bé sung vào môi trường dịch chiết E90 nồng độ 8%

có khả năng ức chế tốt hơn so với các nồng độ còn lại và khi so với đối chứng khác biệt

có ý nghĩa về mặt thống kê Từ Hình 4.5 cho thấy, HLUC của dịch chiết E90 cao nhất8% và HLUC sau 72, 120, 168 giờ lần lượt là 44,550%, 41,706%, 32,222% Vì thế, dịchchiết E90 ức chế nam Aspergillus niger tốt nhất ở nồng độ 8% và sau 168 giờ đạt hiệulực ức chế 32,222% Không những vậy, ở Hình 4.6 cho thấy khả năng ức chế còn théhiện ở sự kìm hãm sự phát sinh bào tử của nam, có thé thay 0 nong d6 4% va 8% namAspergillus niger bi tre chế nên hầu như không sinh bào tử Vậy môi trường PDA chứadịch chiết E90 8% ức chế tốt sự phát triển ĐKTN và kìm hãm sự phát sinh bào tử của

A niger , có tiềm năng ứng dụng trong phòng trừ bệnh do nam A niger gây ra

(%).

25

Hình 4.6 Hình thái nam Aspergillus niger trên môi trường PDA có bồ sung dịch chiết E90 ở

các nông độ khác nhau.

Kết qua đo ĐKTN Aspergillus niger ở môi trường PDA có bổ sung dịch chiếtmethanol 70% (M70) qua các thời điểm 72, 120 và 168 giờ, với mỗi nghiệm thức đượclặp lại 3 lần được phân tích ANOVA 2 nhân tố bằng phần mềm Minitab gồm nhân tổ 1

là nồng độ môi trường khảo sát, nhân tổ 2 là thời gian khảo sát Kết quả thí nghiệm ởBảng 4.3 cho thấy khi xét tương tác giữa nồng độ và thời gian bằng phương pháp kiểmđịnh ANOVA hai yếu tố có giá trị kiểm định p (tương tác) < 0,05 nghĩa là có sự tươngtác giữa hai yếu tố trên lên sự phát triển của nam A niger và tương tác này rõ ràng khixét ở từng yếu tố đã nêu trên Kết quả phân tích được thê hiện trong Bảng 4.3

26

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết methanol 70% đến sự phát triển ĐKTN

của Aspergillus niger

Duong kinh tan nam (cm)

Nghiệm thức

72 giờ 120 giờ 168 giờ

DC (0%) 3,200 + 0,0578 6,733 + 0,033" 9,000?

M70 1% 2,900 + 0,115 5,033 + 0,088° 6,967 + 0,088" M70 2% 2,667 + 0,088 4,267 + 0,033 6,100 + 0,057° M70 4% 2,167 + 0,088 3,333 + 0,0885 4,800 + 0,100° M70 8% 2,467 + 0,033* 4,067 + 0,033† 5,600 + 0,1004

A niger , có tiềm năng ứng dụng trong phòng trừ bệnh do nam A niger gây ra

27