Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Xác định thành phần và định danh một số chi nấm Arbuscular Mycorrhiza (AM) trong vùng đất trồng bưởi da xanh ở Bến Tre

TÓM TẮTNghiên cứu được tiến hành nhằm khảo sát sự xuất hiện của các chi nam Arbuscular mycorrhiza và định danh chính xác các chi nam Arbuscular mycorrhiza xuất hiện trong đất trồng bưởi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

XÁC ĐỊNH THÀNH PHAN VÀ ĐỊNH DANH MỘT SO CHI NAM ARBUSCULAR MYCORRHIZA (AM) TRONG VUNG

DAT TRONG BUOI DA XANH O BEN TRE

Nganh hoc : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : VŨ VĂN TUẦN

Mã số sinh viên : 19126216

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH THÀNH PHAN VÀ ĐỊNH DANH MOT SO CHI NÁM ARBUSCULAR MYCORRHIZA (AM) TRONG VÙNG

DAT TRONG BƯỞI DA XANH Ở BEN TRE

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG VŨ VĂN TUẦN

ThS TRÀN THỊ THU HÀ

TP Thủ Đức, 04/2024

LỜI CẢM ƠN

Đề có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp này em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ

và chỉ dạy tận tình của các Thay, Cô, các anh chi, gia đình va ban bè.

Lời cảm ơn đầu tiên em xin được gửi đến Ban Giám hiệu Trường Đại học NôngLâm TP Hồ Chí Minh, các thầy cô thuộc khoa Khoa học Sinh học, Viện nghiên cứuCông nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu,truyền đạt những kiến thức hữu ích dé làm nền tang cho sau nay

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Trương Phước Thiên Hoàng và ThS.Trần Thị Thu Hà đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luậnnày Xin cảm ơn ThS Đào Uyên Trân Đa, KS Trần Trọng Nghĩa, KS Trương QuanToản đã giúp đỡ, chỉ dạy, giải thích những thắc mắc cho em trong suốt quá trình thựchiện đề tài

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm, ủng hộ dé em yên tâm hoàn thànhkhóa luận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Vũ Van Tuấn, MSSV: 19126216, Lớp: DHI9SHD (Số di động:

0355669808, Email: 19126216(2st.hemuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh học

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: đây là khóa luận do bảnthân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trungthực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng về những camkết này

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành nhằm khảo sát sự xuất hiện của các chi nam Arbuscular mycorrhiza và định danh chính xác các chi nam Arbuscular mycorrhiza xuất hiện trong đất trồng bưởi đa xanh ở Bến Tre Mẫu dat thí nghiệm được lay ở các vùng dat trồng bưởi da xanh

ở Bến Tre, được phân lập và g1ữ nguồn bào tử nấm AM dé sử dụng thực hiện PCR để định danh chính xác các chỉ nắm AM ở mức độ sinh học phân tử Xác định tổng số bào tử các mẫu đất và định danh hình thái Thực hiện ly trích DNA các bao tử giống nhau và sử dụng phương pháp nested — PCR với 2 cặp primer là NS1/ NS4 và AMLI/AML2 đề định danh chính xác các chi

nam AM Kết quả nghiên cứu này đã xác định được sự xuất hiện của nấm AM có trong vùng

đất trồng bưởi da xanh ở Bến Tre đã tìm được 9 hình thái khác nhau thuộc 4 chi nam AM có 1 kiểu hình thuộc chi Sclerocytis, 4 kiểu hình thuộc chi Acaulospora, 3 kiểu hình thuộc chỉ Glomus và 1 kiêu hình thuộc chỉ Scutellospora và chi Glomus và Acaulospora là 2 chi có thành phần lớn Định danh được loài của 3 loài nắm AM xuất hiện trong đất trồng bưởi da xanh ở Bến Tre Trong đó, mẫu AM3 có độ tương đồng cao với loài Acaulospora mellea, mẫu AM6

có độ tương đồng cao với loài Glomus flavisporum và AM9 có độ tương đồng cao với loài Dentiscutata cerradensis Kết quả từ nghiên cứu này sẽ góp một phan cơ sỡ dữ liệu về các loại nam AM xuất hiện trong vùng dat trồng bưởi da xanh ở Bến Tre, từ đó thực hiện các nghiên cứu lâu dài về các ứng dụng mà nắm AM mang lại.

Từ khóa: Arbuscular mycorrh1za, PCR, nesed PCR, bưởi da xanh.

il

The study was conducted to survey the occurrence of Arbuscular mycorrhiza genera and accurately identify Arbuscular mycorrhiza genera appearing in Citrus maxima growing soil in Ben Tre Experimental soil samples were taken from Citrus maxima growing areas in Ben Tre, isolated and kept a source of AM fungal spores for use in PCR to accurately identify AM fungal genera at the molecular biology level Determine the total number of spores in soil samples and identify their morphology Perform DNA extraction of identical spores and use nested - PCR method with 2 primer pairs, NS1/NS4 and AMLI/AML2, to accurately identify AM fungal genera The results of this study have determined the presence of AM fungi in Daxanh pomelo growing areas in Ben Tre, identified 9 different morphologies belonging to 4 genera of AM fungi, with 1 phenotype belonging to the genus Sc/erocystis, 4 types phylotype belongs to the genus Acaulospora, 3 phylotypes belong to the genus Glomus and 1 phylotype belongs to the genus Scutellospora and the genus Glomus and Acaulospora are two large genera Among them, sample AM3 has high similarity with Acaulospora mellea species, sample AM6 has high similarity with Glomus flavisporum species and AM9 has high similarity with Dentiscutata cerradensis species Results from this study will contribute to the database of AM fungi appearing in the Citrus maxima growing area in Ben Tre, there by conducting long-term research on the applications that AM fungi bring.

Keywords: Arbuscular mycorrhiza, PCR, nesed PCR, Citrus maxima

IV

MỤC LỤC

` : Trang

LIÍN INT ON scascensscxiscnsacexscncea pions cases ia a le cg aac i

XÂC NHAN VA CAM ĐOANN 5-5222 2222235212121221212212111121212121211212121 2121 xe 1i

ABS TRAG TD sub 5g g9 RE NSIS/G2AGSBSGVIGEEESSIIAGHSIGERISSEAHESREBESESg13DSU0D3i8.000808123gE0420/sq0nui Iv

I se regia cee ose Eaters Scniieriadin stadia Sen sbdieie ẽ baat cache et Sees V

TAIT BACHE, CAC CHI) VIED TIT P000 vn viiTST SH OA BG no gannoaentdhenrotbouiasdhiodtsgtbxgEtSI0-4I800035.010001601019042186409420g2gẺ iiDANH SÂCH CÂC HINH 0 essssesssssetessssesessssessseneesssnetsessunesessneesssnteeessneesssnseessens iii

eo 1 Se TT eeceesskeedliuindokrenghdbernnrkdBLosaeiudod.iogrlfsigigngodaoczrgorfnggdissLzee 1

ee 11.2 Mục tiíu đề tai coc e.eececcecccceccccceccecsessessessessessessessessesaessessessessessessessessessessessessesseeseeseess 2

Las NOC SMOG I Ct teeecermcerrenierierer neater een ERE 2

ee eee TT LTT ere 3

2.1 Giới thiệu về cđy bưởi (Citrus /m4Yi#w4)) -22-52:52222+222222+2222222223222222x22Ezcsce 3

5.1.0 Sự phấf tiện của cñy bười la xa seueeeeesskeeiondoiiniddosossgiolerssgssberbsiobinilssiig 42.2 Sơ lược về nam rễ MycorrhiZa 2: 222222222E22E22E12EE223122122322212712221221 212222 42.2.1 Giới thiệu về nắm rễ MycorrhizZa 2- 2-52 SS2SE‡EE9EE£EE£EEEEEEEE2212212322222 2e, 4

2.2.2 Phđn loại nam rễ cộng sinh Mycorrliza 2-2 25SSx+2E22E22E2£xz£xzzxczxezed 5

2.2.3 Đặc điểm của nấm Arbuscular mycorrhiZa - 2+©22222+22222++2z2z+zzxzzz+zrzez 92.3 Phđn loại nam Arbuscular mycorrhiza dựa văo kỹ thuật sinh học phđn tử 112.4 Vai trò của nam Arbuscular mycorrhiza -2- 2+ 22 52+2s+2S+2E+2E2E+2E2222zz2ze2 122.5 Nghiín cứu về nắm Arbuscular mycorrhiza 2-2222 2222222Ez+2z++z+z£xz+zzzzxz 13

2 Dds G6 HgH1ÍT1:€ÚU/If6RE: DUOC Gseenasernatnsstnorndsateeosis0IIS04G1350356)35000995520088990749388q000088 13

5.5.7 Câo nghiín OU que 06 con HH Ha d2 g1 ng 04 S4 Qu1 kg 4036.0105 13Chương 3 VAT LIEU VĂ PHƯƠNG PHÂP 2 2 ©22S+2E22E22E22E22E222222222e2 133.1 Thời gian vă địa điểm nghiín cứu - 2-2222 22222++2E++EE+EE2EEEEE2EEzrxrrrrrrrees 15

32, Vat liu tein Ct ceeseccs a crosses are aa aera eee eS 15

3.2.1 Dĩi tuong nghim 1n 5 l53.2.2 Dụng cụ thiết bị hóa chất -©2¿ 52+ 2S2S22E22E22E23223221121121211211211212121 22e2 15

Sn PONT piiâptTi9 BIETI7GỨHbssssss6csasisgosisssdioduisosieigeuldiogcosagisoiAokursdibpbsbglGzi808043080ê: 15

35.1 Eliietir li illuni:tMiễm, esecskcsiok0 2L 0 H200 hư Tg2d006/2009g.06230600)2027000060E 15

3.3.2 PHUGHS DHấP tách DAG TÊN: nseeeeeeebioiddthiosdiEEiOg11063388809880948084E585SESBSEUEEESS.ESICGU423S2RSEE 16 3.3.3 Phương pháp định danh bao tử dựa vào hình that eee eects il,

3.3.4 Phương pháp định danh bào tử bang sinh học phân tử - - 20

Chương 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-52222222E222E22E2222221222222122222 xe 24

4.1 Thu thập các mẫu đất và xác định thành phần chi nắm AM trong dat trồng bưởi da

xanh ở xã Tân Phú huyện Châu Thanh tỉnh Bên Tre 5 55555 5< c+<c+c++ 24

4.1.1 Thu thập bào tử AM có trong vùng đất trồng bưởi da xanh tại Bến Tre 244.1.2 Thành phan, tỉ lệ các chi nam AM có trong dat trồng bưởi da xanh 254.2 Phan lap, dinh danh cac chi nam AM dựa vào đặc điểm hình thái 26

Ah De La CHÍ SCL GP GUIÍTN toc ere rc a rr a a er 26 4.2.2 Chat ACAULOS POT oo cesccececeseceeteeeeeeseeseceseesecsteesecesecsecsecseesseeaeeseceeeseeeeeeseeseesteeses V214

Ah DSi CNM OTIS sere arcana at asnanaes gianl6giiagSBASLAnhEbudgasoirdisksbdiorstiuSafHussoisgEmrrissazgsipnosnsä0fuEábtSiouais3e 29

A De Cli ad CULE OS DONG ce se creme sector scicsasete wetness alah PRR Sea eae cee 30

4.3 Kết qua tách chiết DNA o cccccccccceecsesseessessessessesssessesseessessseeseesessieesessteeneeseseneess 30

AA, Kết quả PÔR các mẫu rể ẢÌM s2 H44 HH Sư HH HE g1 00c 314.6 Kết quả:xãy dựng cây phi sinh Teal sasccccncccseacmnnncnvvenccnsinannmnnavmrnnannnee 35Chương 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ, - 2¿+222E+2E22E2E2E22E221225222222222222222e2 38

IE a axacnnsenoeeeansedaatdoorogtuoiedtifctrettntertbnkiitbfrpiDtibf0pontibidg0eBsenae 38TAI LIEU THAM KHẢO 2222¿22222EE22EE22E122E122212211223122112211221122122212221 ee 39

PHỤ LỤC

VI

: Arbuscular Mycorrhiza Fungi

: Bacsic Local Alignment Search Tool

: Chloroform: 1soamyl alcohol (24:1)

: Ethylenediaminetetraacetic acid

: Global Good Agricultural Practice

: Large subunit ribosomal ribonucleic acid

: Nested polymerase chain reaction

: Nebor Joining

: Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1)

: Polyvinyl lactoglycerol

: Random amplification of polymorphic DNA

: Restriction fragment length polymorphism

: Sodium dodecyl sulfate

: Small subunit ribosomal ribonucleic acid

: Terminal restriction fragment length polymorphism

: Tris-Acetate-EDTA

: Tiêu chuẩn Việt Nam

: Vietnamese Good Agricultural Practices

vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 3.1 Thông tin mẫu đất thu thập được ở các vườn trồng bưởi da xanh ở xã Tân

Phú huyện Châu Thanh tỉnh Bên Tre - 5 5 2S 2< *22EEkS2 vn HH nghe 16 Bang 3.2 Trinh tự primer được sử dụng trong phản ứng PCT - «= 21

Bảng 3.3 Thành phan phản ứng PCR 2- 2 ©22222222E22EE2EEE2EE22EE+2EEz22Ezzrxrr 21

Bang 3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với NS1/NS41 ò c2 22

Bang 4.1 Tổng số bao tử/50g đất trong mẫu đất tại tỉnh Bến Tre - 24

Bang 4.3 Két qua do OD NT - Ả 31

Bảng 4.4 So sánh định danh hình thái va định danh bằng sinh học phân tử 37

rey

Hình 2.4 Arbutoid mycorrhizae của C arbutoides/L monfi€oÏA - -< =+ 6

Hình 2.5 Nắm Orchid mycorrhiza - 2: 2©22+22222E+EE+2E22EE+2E22EE2EE222122122222212222222-e 7)

Hình 2.6 Sự khác biệt giữa Endomycorrhiza va Ectomycorrh1Za - 55 ss<ss5+ 8

Hình 2.7 Bào tử nấm AM ccsssseeecsssseeeeeessseeeceessneeeseessneeeceessseeseessneecsessneeeeseesseessss 9Hình 2.8 Hình ảnh của sợi nam trên rễ cây con Chengiopanax sciadophylloides 10

Einh.2.0:.TIinh ảnh DU sisezessensaeieniistseoigSDODSSEEECDGEIEEIDDSGQQESGIESSVINSNGESLSSISGSSSEESSEESSESEE 11

Hình 2.10 Hình ảnh về tế bào phụ tr o cccccccccccccccsessessessessessessessessessessessessessessesseseeeaes 11

Hinh 3.1 Bao tty 10.14./7/2722/20nnẺn85 17 Hình 3.2 Bao t chi EHHO00SDD cuc ng 661141046635g5943616605855506949561903953684014335093918504168 T7 Hình 3.3 Bào tử Chi (100 ĐƠ Ơ tia nuassnni gia D0050105356581445856380536595543EXE58L455580203819.01305845685803E 18 Hình 3.4 Bào ti Chi SGHIGl GD caaseniisidEitng Ga gi 111551616153 49580538051 3845514890131303005568 18 Hinh:35-.BAb6 tt Chil Glomus vecencereseneeuecursnensmenuneumenn 19

Hình 4.1 Thành phan, ty lệ chi nam AM trong đất trồng bưởi da xanh ở Bến Tre 25

Hnh:4.2 Hảo tử GHI (S6 6Q ÍŠ uussaiiakiiidgA0135134855E118438365356135555855E150S7NESXEESSES SES1.3448126S06 27Hình 4.3 Các dang kiêu hình bào tử thuộc chi Acaulospora -: z5z55z: 28

Hình 4.4 Một số kiểu hình bào tử thuộc chi Œ/Ø7wis 2-5252 52+52222S2+£z£2zzzzz4 29Hình 4.5 Kiểu hình bào tử thuộc chi Šcw/elÏospora -. -2 2-©2¿©2255z52z+552 30Hình 4.6 Kết qua PCR của 9 mẫu nam AM với cặp primer NS1/NS4 32Hình 4.7 Kết quả PCR của 9 mẫu nam AM với cặp primer AML1/AML2 32Hình 4.8 Kết quả so sánh trình tự đã xử lí trên NCBI của 3 mau AM3, AM6, AM9 34

Hình 4.9 Cây phát sinh lồi của mẫu AM3, AM6, AM9 trên vùng gen SSU - rRNA

(18S) với các lồi nắm AM cùng chi khác, với hệ số Boostrap là 1000 35

il

những giải pháp dé hướng tới nền nông nghiệp xanh Việc sử dụng phân bón vi sinh này

giúp cho những cây trồng chống chọi những ảnh hưởng xau từ biến đối khí hậu và sâubệnh hại tăng sức chống chịu cho cây trồng thay thế cho những loại phân bón vô cơ.Ngoài các chủng vi sinh vat được sử dụng phô biến như: Rhizobium, Azotobarter,

Pseudomonas, Bacillus, Strepromyces, Trichoderma, Penicillium, Aspergillus thì việc

ứng dung nam rễ nội cộng sinh Arbuscular mycorrhiza (AM) ngày càng được quan tâm

và phát triển Nắm rễ cộng sinh AM được nghiên cứu nhiều ở ngoài nước nhưng ở trongnước hiện có mới có các nghiên cứu trên những đối tượng như bắp, lúa, các loài raukhác nhau nhưng các nghiên cứu về cây bưởi và việc xác định định danh hình thái nắm

AM nhất là định danh bằng sinh học phân tử dé xác định chính xác loài nắm vẫn còn

chưa được nghiên cứu nhiều Việc định danh nam AM giúp cho xác định thành phan

các loài nắm AM đặc trưng trên vùng đất đó và đối tượng tìm hiểu và được sử dụng làmmột loại phân bón sinh học có tác dung tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng chống chịucủa cây trồng đối với các bat lợi từ môi trường, cải thiện cau trúc đất trồng

Bến Tre là vùng đất có diện tích trồng bưởi đa xanh lớn góp phan phát triển kinh

tế cho người nông dân, bưởi cũng là một loại trái cây có chuỗi giá trị kinh tẾ cao (HoàngVăn Việt, 2014) và có nhiều lợi ích cho sức khỏe (Tocmo và ctv, 2020) Trong nghiêncứu nay sẽ tìm hiểu về thành phan và định danh nam AM có trong đất trồng bưởi daxanh ở Bến Tre từ đó đưa ra những giải pháp sử dụng phân bón vi sinh phù hợp dé cảithiện năng xuất và chống chịu những tác động bat lợi đối với các vườn bưởi da xanh ở

Bên Tre.

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập, định danh hình thái và xác định thành phần của các chỉ nắm AM trongđất trồng bưởi da xanh ở Bến Tre

Định danh bào tử nắm AM dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử

1.3 Nội dung thực hiện

Thu thập các mẫu đất và xác định thành phần chi nấm AM trong dat trồng bưởi

da xanh ở xã Tân Phú huyện Châu Thành tỉnh Bến Tre

Phân lập, định danh các chi nam AM dựa vào đặc điểm hình thái

Định danh đến loài các chi nam AM dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về cây bưởi (Citrus maxima)

Bưởi (Citrus maxima) thuộc chi cam chanh (Citrus), họ Rutaceae, bộ Sapindales.

Bưởi (Citrus maxima) ở Việt Nam có nhiều giống khác nhau như là bưởi Tân Triều(Biên Hòa), Bưởi Năm Roi, bưởi đa xanh (Bến Tre) và nhiều giống bưởi khác

2.1.1 Đặc điểm thực vật học cây bưởi

Bưởi là cây thân gỗ, cây to, cao trung bình khoảng 3 - 4 m khi trưởng thành, vỏ

thân cây có mau vàng nhạt; cảnh có gai dài, nhọn; lá có gan hình mang, lá hình trứng,

dai 11 - 2 cm, rộng 5 dén 6 cm, hai đầu tù, nguyên, dai, cuống có dia cánh to Hoa thuộcloại hoa kép, déu, mọc thành chùm 6 - 10 bông và có mùi hương rat dé chịu Quả hìnhcầu to, vỏ day, mau sắc tùy theo giống, có múi dày, tép xốp vị có thé chua ngọt đắng tùyloại bưởi khác nhau Hoa bưởi có màu trắng nhỏ (Morton, 1987)

Bưởi da xanh có dạng hình cầu, nặng trung bình từ 1,2 - 2,5 kg/trái; vỏ có màuxanh đến xanh hơi vàng khi chín, dễ lột và khá mỏng (14 - 18 mm); tép bưởi màu hồng

đỏ, bó chặt va dé tách khỏi vách múi; mùi thơm; không hạt đến khá nhiều hạt (có thé cóđến 30 hat/trai) Tỉ lệ phần thịt qua/ trái chiếm hơn 55% (Long và ctv, 2023)

2.1.2 Sự phát triển của cây bưởi da xanh

Bưởi da xanh là một loại thực phẩm quan trọng tích hợp trong khâu phần ăn uốnghàng ngày của con người, đóng vai trò quan trọng trongviệc cung cấp năng lượng, chat

dinh dưỡng và nâng cao sức khỏe Ngoài giá trị dinh dưỡng với hàm lượng vitamin C

cao, trái cây thuộc họ cam quýt (Rutaceae) còn chứa nhiều chất dinh dưỡng đa lượngnhư đường đơn và chat xơ, đồng thời cũng là nguồn cung cấp các dưỡng chat vi lượngcần thiết cho duy trì sức khỏe và giúp duy trì sự sinh trưởng bình thường của cơ thể (Liu

và ctv 2012) Với nhiều lợi ích như vậy nên bưởi da xanh mang lại nhiều giá trị kinh tếcao cho người nông dân (Hoàng Văn Việt, 2014), Việt Nam cũng là một nước trồng bưởilớn trên thế giới Theo tạp chí Kinh tế nông thôn, các tỉnh Trung du miền núi phía Bắchiện trồng 27,7 nghìn hecta bưởi, sản lượng gần 165 nghìn tắn/năm Đến năm 2019, cáctỉnh Đông Nam Bộ và Đồng Bằng Song Cửu Long có 43.500 ha bưởi, sản lượng 37.000tắn/năm Những tỉnh có diện tích lớn là Bến Tre (8.824 ha), Vĩnh Long (8.619 ha), ĐồngNai (5.428 ha) (Dương Thanh, 2021) Bưởi da xanh ở Bến Tre có chuỗi giá trị kinh tếcao mang lại thu nhập tốt cho người nông dân (Hoàng Văn Việt, 2014) Theo Uyên Nhi(2023) hiện nay diện tích bưởi da xanh Bến Tre trên toàn tỉnh khoảng chừng 5.904 ha,chiếm tới 20% tông diện tích trồng cây ăn quả Không chỉ thé, tỉnh Bến Tre đã có khoảng55,5 ha trồng bưởi da xanh theo chuẩn VietGAP, GlobalGAP với năng suất lên tới 12tắn/ha và sản lượng hằng năm hơn 47 nghìn tấn

2.2 Sơ lược về nam rễ Mycorrhiza

2.2.1 Giới thiệu về nắm rễ Mycorrhiza

Năm 1885, Frank đã đưa ra gia thuyét cua ông VỀ sự cộng sinh của nắm và rễthực vậy trong đất với thuật ngữ là “Mycorrhiza” được hình thành từ chữ Hy Lạp

“Mykes” (Nam) và “Rhiza” (rễ) Nam AM cộng sinh với rễ cây thực hiện việc trao đốidưỡng chat bằng cách thu đường từ cây và trả lại chất dinh dưỡng khác cho cây

(Lanfranco, 2016).

2.2.2 Phân loại nắm rễ cộng sinh Mycorrhiza.

Mycorrhiza thường được chia lam 2 loại dựa theo qua trình cộng sinh có sự xâm

nhiễm của các sợi nam của nấm vào trong các tế bào rễ Với nam rễ cộng sinhEctomycorrhiza có các sợi nam không xâm nhập được vào tế bào rễ của thực vật, cònnam rễ cộng sinh Endomycorrhiza có các sợi nam của nam rễ xâm nhập vào thành tếbảo và xâm lấn màng tế bao rễ cây Endomycorrhiza bao gồm arbuscular, ericoid,

arbutoid, monotropoid, và orchid mycorrhizae Ngoài hai loại trên, Ectendomycorrhiza

mang cả hai đặc trưng của Endomycorrhiza và Ectomycorrhiza (Lanfranco, 2016).

Ectomycorrhizae Endomycorrhizae

-Arbuscular mycorrhizae

Hình 2.2 Mối liên hệ khác nhau giữa nam mycorrhizal và rễ

cây (Nguon: Ganugi và ctv ,2019).

2.2.2.1 Nắm rễ nội cộng sinh Endomycorrhiza

Nam endomycorrhizal là một nhóm cực kỳ đa dạng có khả năng thích nghỉ cao

và với nhiều loại thực vật Sợi nắm xâm nhập vào trong tế bao rễ cây tạo ra diện tích bềmặt tiếp xúc lớn hơn giữa sợi nắm và thực vật Sự tiếp xúc tăng cường này tạo điều kiệncho sự chuyên giao nhiều chất dinh dưỡng hơn giữa hai bên Endomycorrhizae tiếp tục

được phân thành năm nhóm chính: arbuscular, ericoid, arbutoid, monotropoid, va orchid mycorrhizas (Stiirmer, 2012).

a Arbuscular mycorrhiza (AM)

Arbuscular mycorrhiza là một hệ công sinh phô biến và quan trọng nhất đối vớithực vật trong hệ sinh thái đất (Schwarzott và ctv, 2001) Khi xâm nhiễm các sợi nam

xâm nhập vào vỏ rễ và thường không có vách ngăn, phân nhánh bên trong vỏ rễ tạo

thành giác mút phân nhánh phức tạp được gọi là bụi (arbuscules), và trong nhiều trường

hợp cũng tạo thành các cấu trúc lưu trữ gọi là túi (Brundrett và ctv,1996)

b Ericoid mycorrhiza

Ericoid mycorrhiza là mối quan hệ giữa các cây họ thực vật Ericaceae với một sốdòng nam Mycorrhiza Loài cây thuộc họ Ericaceae thường sống noi đất chua và nghèo

dinh dưỡng nên đây là một sự thích nghi quan trong (zhang va ctv, 2022).

Hình 2.3 Sự xâm chiếm tự nhiên của Ericoid mycorrhiza (Nguén: Vohnik, 2020)

c Arbutoid mycorrhiza

Hinh 2.4 Arbutoid mycorrhizae cua C arbutoides/L monticola (Nguồn: Osmundson và ctv, 2007).

Arbutoid mycorrhiza liên quan đến thực vật thuộc phân họ EricaceaeArbutoideae Arbutoid mycorrhiza khác với ericoid mycorrhiza và giống vớiectomycorrhiza, cả về mặt chức năng và các loại nấm liên quan Nhưng khác vớiectomycorrhiza ở chỗ một số sợi nắm thực sự xâm nhập vào các tế bào rễ, làm cho loại

mycorrhiza này trở thành ectendomycorrhiza (Brundrett, 2004).

d Orchid mycorrhiza

Orchid mycorrhiza công sinh với nhưng cây ho lan va có vai trò vô cùng quan

trong trong quá trình nảy mầm của lan bởi vì các hạt lan hầu như không có dự trữ nănglượng và từ trong quá trình cộng sinh đó dé thu được nguồn cacbon (McCormick, 2012)

2.2.2.2 Nắm rễ ngoại cộng sinh Ectomycorrhiza

La nắm thường chỉ cộng sinh với các cây thân gỗ bao gồm các cây thuộc họ

Thông (Pinaceae), họ sồi (Fagaceae), họ Bạch dương (Betulaceae), họ Đào kim nương

(Myrtaceae) bao gồm cả Bạch đàn và họ Dầu (Dipterocarpaceae) Nam Ectomycorrhiza

có khoảng 6000 loài vào cộng sinh với 20000 đến 25000 loài thực vật tương đương với2% loài thực vật Mặc dù vậy nam Ectomycorrhiza có vài quan trọng trong việc hình

7

thành cây con và sự phát triển cây trên toàn cầu (Tedersoo và ctv, 2010) Các sợi nambao phủ dày đặc xung quanh mặt rễ gọi là lớp phú và có thé day tới 2 mm và khoảng20-40% trọng lượng của nắm rễ Từ bên trong của lớp phủ đó sợi nắm phân nhánh vàxâm nhập vào giữa các tế bào của rễ tạo ra một cấu trúc gọi là mạng lưới Hartig, đó là

nơi mà nam rễ và rễ cây trao đôi chat (Smith và Read, 2010)

2.2.2.3 Nam cộng sinh trung gian Ectendomycorrhiza

Là một loại nấm ít xuất hiện và ít sự chú ý, nó mang đặc điểm của cảEndomycorrhiza và Ectomycorrhiza về hình thái (Yu và ctv 2001) Chúng thường cóvật chủ thuộc chi thông (Pinus), thông rụng lá (Larix) Vé mặt cấu trúc,

ectendomycorrhiza có một lớp phủ mỏng (đôi khi không có), mạng lưới Hartig được

hình thành bên ngoài tế bào giống như là Ectomycorrhiza và có sự xâm nhập vào trong

tế bào rễ như là Endomycorrhiza

2.2.3 Đặc điểm của nam Arbuscular mycorrhiza

2.2.3.1 Bào tử (Spore)

Hình 2.7 Bao tử nam AM (A), (B): chi Acaulospora, (C):

chi Glomus; (D) chi Gigaspora (Nguon: INVAM).

Theo Brundrett va ctv (1996) thì các bào tử được hình thành từ trong rễ hoặctrong đất và phát triển trên các sợi nắm Hầu như các bào tử của Arbuscular mycorrhiza

có hình cầu hoặc gần cầu nhưng cũng có các hình dạng khác như bau dục, thuôn dai Arbuscular mycorrhiza có màu sắc đa dang từ trong suốt, trắng đục, vàng, cam, nâu,đen Bào tử cua Arbuscular mycorrhiza có kích thước từ rất nhỏ (20 - 50 um) đến rấtlớn (200 - 1000 um) Thành bào tử day và có nhiều lớp đây là một yếu tô quan trọngtrong quá trình định danh hình thái các bảo tử Bào tử có thé tồn tại đơn hoặc tập hợpthành nhóm gọi là Sporocarps, trong đó nó có thé chứa các sợi nam chuyên biệt và cóthẻ được lớp sợi nắm bao phủ bên ngoài (peridium) Khi vào điều kiện thích hợp thì bào

tử sẽ nảy mầm tạo thành các sợi nắm xâm nhiễm vào rễ những sợi nắm này gọi là ốngmam và có thé đâm xuyên qua thành bao tử hay thông qua cuống bảo tử

2.2.3.2 Sợi nắm (Hyphae)

Soi nắm là con đường để cho nam có thể xâm nhập vào trong rễ cây Theo

Brundrett và ctv (1996) khi ở bên ngoài rễ cây thì chúng hình thành mạng lưới và sợi

9

nam day ngoài ra còn có các sợi nam nhỏ hơn được gọi là Absorptive hyphae có vai trò

dé hap thụ các chất dinh dưỡng bên ngoài rồi chuyên vào trong rễ cây Soi nắm ở trong

dé cây thì không có vách ngăn và phân nhánh, khi sợi nam vào trong thành tế bào rễ rồihình thành các sợi nam nội bào bụi và túi

2.2.3.3 Túi (Vesicles)

Các túi phát triển đề tích trữ các chất dinh dưỡng như chất béo vậy nên khi quansát qua kính chúng ta có thê thấy nhiều giọt dầu trong đó trong quá trình cộng sinh của

nam AM Ngay khi sau bui được hình thành thì túi sẽ xuất hiện va phát triển đến khi bui

gia đi và biến mất túi có thể được hình thành ở nội bào hoặc ngoài bảo (nằm giữa các

tế bào rễ) khi túi được hình thanh trong nội bao thì nó sẽ chiếm hết thé tích của tế bào

vật chủ và mang theo hình dạng đó.

2.2.3.4 Bụi (Arbuscules)

Bụi được Gallaud (1905) đặt tên là Arbuscules, là giác mút phân nhánh phức tạp

hình thành trong một tế bào vỏ rễ Day là nơi trao đổi dinh dưỡng giữa nam AM với tế

bào vật chủ Arbuscules được hình thành bởi sự phân nhánh nhị phân lặp đi lặp lại và

giảm chiều rộng của sợi nam, bat đầu từ một sợi nắm thân ban đầu (đường kính 5 - 10um) và kết thúc bằng sự tăng sinh của sợi nam nhánh min (đường kính < 1 um) Bùi

được hình thành nhanh trong khoảng 2 ngày từ khi bắt đầu xâm nhiễm nhưng nó cũng

không tồn tài được lâu va sẽ rụng sau vai ngày (Brundrett, 2008)

10

2.3 Phân loại nam Arbuscular mycorrhiza dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử

Sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử đã giải quyết một số khó khăntrong việc phát hiện, phân loại và định danh các chi nam AM và xác định những loàinam mới Vào năm 2001, Schiifler và ctv đã dựa vào vùng trình tử gen SSU-rRNA đã

đưa nam AM rời khỏi đa ngành Zygomycota và trở thành một nhóm đơn ngành mới là

Glomeromycota Vào năm 2008, Lee và ctv đã thiết kết cặp primer AMLI và AML2 cótính đặc hiệu và có độ bao phủ lớn với các loài nam AM với sản phẩm có kích thướckhoảng 800bp dựa trên vùng gen SSU-rRNA và thường được sử dụng phổ biến trongnhững nghiên cứu về nắm AM cho tới hiên tại Năm 2009, Kriiger va ctv đã thiết kế bộ

1]

primer mới là SSUmAf-LSUmAr và SSUmCf-LSUmBr dựa trên vùng gen một phan

của SSU-rRNA tới một phần vùng gen LSU-rRNA Ngoài việc thiết kế các primer đặc

hiệu dé định danh chính xác còn sử dụng các kỹ thuật liên quan như: Nested-PCR, RFLP, PCR-RAPD Năm 2020, Nuryana va ctv đã sử dụng phương pháp T-RFLP với

PCR-cặp primer AML1/AML2 đã xác định được 17 loài nam AM thuộc 9 chi xuất hiện trênvùng đất trồng khoai mỡ Năm 2020, Bazgir và ctv đã xác định được 5 loài: Viscospora

viscosa, Funneliformis mosseae, Septoglomus deserticola, Funneliformis caledonium

va Diversispora spurca xuất hiện trên vùng đất rễ cây thuốc ở tinh Kerman dựa trênphương pháp Nested-PCR sử dụng các đoạn primer SSUmaf và LSUmAr ở bước đầu

tiên, SSUmCf và LSUmBr ở bước thứ hai Năm 2023, Sariasih va ctv đã sử dụng cặp

primer AMLI và AML2 để xác định được 3 chi nấm là Acaulospora, Glomus vàGigaspora xuất hiện trong rễ các cây có múi Theo Dao và ctv vào năm 2023 đã xácđịnh được 3 loài nam AM là Acaulospora cavernata, Acaulospora spinosa vàRhizophagus intraradices bang cặp primer AML1/AML2 trên vùng đất trồng cay bau

bí trồng tại Hóc Môn, Củ Chi, huyện Bình Chánh, Thành phố Hồ Chí Minh

2.4 Vai trò của nắm Arbuscular mycorrhiza

Nam Arbuscular mycorrhiza có vai trò quan trọng cho cây trồng hấp thụ được

nhiều dinh dưỡng hơn thông qua hệ thống sợi nắm bên ngoài rễ khiến cho điện tích tiếp

xúc tăng lên một cách đáng ké điều biểu hiện rõ nhất là khả năng cộng sinh nhiều vớihầu như tất cả các loài thực vật có mạch trên thế giới Arbuscular mycorrhizas có théhap thụ phốt pho hiệu quả hơn nhiều so với rễ cây Phét pho di chuyển đến gốc hoặcthông qua khuếch tán và sợi nam làm giảm khoảng cách cần thiết dé khuếch tán, do đólàm tăng sự hấp thu các hợp chất dinh dưỡng cần thiết như là nguồn nitơ, phot pho, Nam Arbuscular mycorrhiza giúp cho cây có thé hap thu được phot pho bằng cách tiết

ra các enzym như phosphatase (Miransari, 2013).Nam AM có thể giúp tăng khả năng

hap thụ NH4+ được cải thiện 63% ở nồng độ thấp (Fu và ctv, 2021) Với sự hình thànhmang lưới sợi nắm cũng có vai trò là cho đất chắc chắn, tăng kết cấu đất hơn hạn chếhiện tượng xói mòn đất (Miller và ctv,1992) Nắm AM giúp thực vật chống lại nhữngđiều kiện khắc nghiệt như là hạn han, (Madouh va ctv, 2023; Abdalla và ctv 2023).Theo Yuan và ctv (2023), đã nghiên cứu về khả năng tăng cường sản xuất các hợp chấtcác dược liệu của cây thuốc, nghiên cứu cho thấy nắm AM làm tăng hàm lượng được

12

liệu lên 27% trong đó có thấy rằng hop chat tăng chú ý là flavonoid (68%) và terpenoids

(53%) Ngoài ra nắm AM còn giúp hấp thụ khí N2O giảm thải khí N2O (Javaid, 2009).2.5 Nghiên cứu về nắm Arbuscular mycorrhiza

2.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Năm 2017, Võ Thị Tú Trinh và ctv đã nghiên cứu về sự phân bố và xâm nhiễm

của nắm rễ AM trong mẫu rễ và đất trồng bắp trong các tỉnh thuộc đồng bằng sông CửuLong và kết quả cho thấy các dang bào tử của nam rễ thuộc ba chi: Glomus, Acaulospora

và Entrophospora Các bào tử thuộc chi Glomusva Acaulospora hiện diện ở tat cả cácmẫu đất trồng bắp thu thập từ năm tỉnh trên, chi Entrophosporachi hiện điện trong mẫuđất thuộc hai tỉnh Cần Thơ và Sóc Trăng

Năm 2017, Nguyễn Thu Trang va ctv đã nghiên cứu sự phân bố của bao tử nam

rễ nội cộng sinh Arbuscular Mycorrhiza Fungi (AME) trong đất trồng cam ở huyện Cao

Phong, tinh Hòa Binh và kết quả thu được là số lượng bao tử nam AMF trung bình là

252 bào tử/100g đất, cao nhất là 496 +309 bào tử/100g đất ở vườn cam 3 năm, chu ky 1

và thấp nhất là 145 +55 bào tử/100g đất ở vườn trồng cam V2 xen canh cam 3 năm, chu

ki hai đã trồng cam chu kỳ một 20 năm trước, đồng thời có xu hướng giảm dan theo thờigian canh tác và độ sâu tầng đất

Năm 2022, Đỗ Thị Xuân và ctv đã nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm AM vaphân bón lên sự sinh trưởng và năng xuất cây hành lá Kết quả nghiên cứu cho thấy, việckết hop chủng nam rẽ nội cộng sinh với phân hữu cơ hoặc phân vô cơ giúp gia tăng cácđặc tính nông học của hành lá, từ đó làm gia tăng năng suất thương pham của hành lá sovới nghiệm thức chỉ b6 sung phân hóa học

2.5.2 Các nghiên cứu quốc tế

Hiện nay, ở trên thế giới việc nghiên cứu về nam rễ AM rất được nhiều quan tam

và đạt được nhiều thành tựu đáng kẻ

Theo Santana và ctv (2023) đã nghiên cứu sự khả năng chống chịu khô hạn của

cây bắp với việc công sinh với AM và kết quả là AMF góp phan rất lớn vào việc phụchồi cây trồng tốt hon sau thời kỳ khô han và thời kỳ tưới tiêu mới Cay AMF hỗ trợ phục

hồi căng thắng sau thời kỳ thiếu nước ở thực vật

Theo Kameoka và ctv (2022) đã nghiên cứu về sự trao đôi dinh dưỡng giữa AMvới thực vật và mô tả nó AMF nhận carbon cố định qua quá trình quang hợp từ thực vật

và đôi lại cung cấp chất dinh dưỡng khoáng Lipid đóng vai trò quan trọng trong sự cộng

13

sinh Chúng đóng vai trò là thành phần của màng có nguồn gốc từ thực vật bao quanhcác arbuscules, với tư cách là nguồn carbon được chuyên từ thực vật sang AME, như

một dạng dự trữ carbon chính trong AMF và là tác nhân kích hoạt các phản ứng pháttriển trong AME

Theo Ma và ctv (2023), đã nêu lên mối tương quan của đất có sẵn nguyên tố phốtpho với sự đa dạng và phong phú nắm AM từ đó nâng cao sự hiểu biết và xây dựng cơ

sở cho các mô hình phân phối của sự đa dạng và phong phú của nắm mycorrhizal ở quy

mô toàn cau

Vào năm 2023, Itoo va ctv đã thực hiện đánh giá sự da dạng của nam rễ cộngsinh có liên quan đến một trong những loại gia vị đắt tiền nhất - Saffron (Crocus sativus)

ở Kashmir Himalaya Dựa trên đặc điểm hình thái và phân tử, 15 loài AMF khác nhau

đã được tìm thấy có liên quan đến nghệ tây ở Kashmir Himalaya, An Độ Loài chiếm

ưu thế nhất là Rhizophagus intraradices, tiếp theo là Funneliformis Mosseae, trong khiloài ít chiếm ưu thé nhất là Acaulospora trappei

14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 7/2023 đến tháng 12/2023

Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường,

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM.

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là nắm AM trong đất trồng bưởi xa xanh thu thập tại xã

tân Phú huyện Châu Thành của tỉnh Bến Tre Bào tử nắm AM được nhân nguồn và phânlập là đất từ các vườn trồng bưởi đa xanh ở Bến Tre

3.2.2 Dụng cụ thiết bị hóa chất

Các dụng cụ được sử dụng: bộ ray với ray kích thước: 100 um, 40 um; ống falcon

50 ml, đĩa petri, giấy lọc, micropipette, ống eppendorf và găng tay, khẩu trang

Các thiết bị được sự dụng: kính soi nồi, kính hiển vi, máy ly tâm, máy khuau từ,

cân điện tử, tủ lạnh, máy do OD, tủ an toan sinh học, máy điện di, máy PCR.

Hóa chất: sucrose, melzer, Master Mix (Cat#P-MS2X, PHUSA), primerNS1/NS4; AML1/AML2, dung dich polyvinyl lactoglycerol (PVLG): 100 ml nước cất

+ 100 ml acid lactic + 100 ml glycerols + 16,6 g polyvinyl ancohol khuấy đều ở nhiệt

độ 60°C trong 4 giờ, Lysis buffer (50 mM Tris HCI; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% mercaptoethanol) pH 8.0, hỗn hợp Phenol (Cat#108-95-2, Xilong) : Chloroform

B-(Cat#22711, Prolabo): Isoamyl alcohol (Cat#100979, Merck) PCI (25:24:1), hỗn hợp

Chloroform (Cat#22711, Prolabo): Isoamyl alcohol (Cat#100979, Merck) CI (24:1), Isopropanol (Cat#1096341000,BIMETECH), Ethanol (Cat#64-17-5, Xilong) 70%, Dung dich TE (10mM Tris HCL; ImM EDTA; pH 8.0), Agarose dạng b6ot(Cat#P-Agar,

PHUSA), dung dich TAE (Cat#P-TAE50, PHUSA) 0,5X, dung dich Loading Dye

(Cat#R0611, Invitrogen) , Gelred(Cat#DD-013), Ladders DNA 1 Kb MDNA-IK, Minh Khang).

(Cat#CSL-3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu mẫu

Thu mẫu: Các mẫu đất được thu thập ở 11 vườn bưởi ở xã Tân Phú huyện ChâuThanh tỉnh Bến Tre Tổng số mẫu là 23 mẫu Vườn bưởi được chọn ngẫu nhiên với độ

15

tuổi 2 năm, 3 năm, 5 năm, 10 năm và 12 năm (do mỗi giai đoạn phát triển khác nhau thìđiều kiện chăm sóc cây khác nhau từ đó làm thay đôi mật số và thành phan chi nam AM)

điều kiện các vườn là không có sử dụng chế phẩm nam rễ nội cộng sinh Mỗi vườn séchọn 3 cây ngẫu nhiên Tại mỗi cây, chọn vị trí xung quanh gốc được tính từ mép tán lá

chiếu xuống Loại bỏ 3cm lớp đất bề mặt, sau đó lấy khoảng 500g dat/ vị trí với độ sâu

giới han từ 0 - 20cm Các mẫu đất được trộn đều và thu lại 1000 - 2000g đất / vườn.Mau được lay, vận chuyên và bảo quản theo TCVN 7538-6:2010

Bảng 3.1 Thông tin mẫu đất thu thập được ở các vườn trồng bưởi da xanh ở xã Tân Phúhuyện Châu Thành tỉnh Bến Tre

Độ tuôivườn Sốvườn Số mẫu Dia chỉ

2 năm 2 5 Xã Tân Phú, huyện Châu Thành, tỉnh Bên Tre

3 năm 3 8 Xã Tân Phú, huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre

5 năm 1 3 Xã Tân Phú, huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre

10 năm 3 5 Xã Tân Phú, huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre

12 năm 2 2 Xã Tân Phú, huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre

Tổng số 11 23

3.3.2 Phương pháp tách bào tử

Bào tử được tách khỏi mẫu đất dựa trên kỹ thuật sàn ướt (wet siewing) kết hợp

với phương pháp ly tâm trong nồng độ dung dịch sucrose (50%) theo Bunrett và ctv

(1996) (có chỉnh sửa).

Quá trình tách bào tử được thực hiện theo các bước sau đây: Mẫu đất được cânlay 50 g, loại bỏ sỏi đá và rác trong mẫu đất sau đó cho vào cốc chưa 500ml nước, khuấyđều và dé khoảng 30 phút cho đất được hòa tan Khuấy đều dung dịch đất rồi dé yênkhoảng 1 phút rồi lọc qua một loạt ray có kích thước 1000 pm, 500 pm và 40 pm Quátrình lọc được lặp lại cho đến khi nước trong rây trong Thu phần dịch chữa lẫn đất vàbao tử trên ray 40 pm cho vào các ống ly tâm thể tích 50ml Sau đó cho dung dịchsucrose (50%) vào 2/3 ống ly tâm đã chứa mẫu đất và lắc đều Dung dịch đất được lytâm với tốc độ 2000 vòng/ phút (5 phút) Thu dich nổi va lọc qua ray 40 pum và tiến hànhrửa nước đường sucrose với nước Thu lại bao tử trên ray và quan sát dưới kính soi nổi

đê đêm mật sô.

16

3.3.3 Phương pháp định danh bào tử dựa vào hình thái

Bào tử AM sau khi được ly tâm được nhuộm bằng cách nhỏ một giọt dung dịch

nhuộm (PVLG + Melzer với tỉ lệ 1:1) lên lame dé khoảng 5 phút cho khô bề mặt sau

đó đậy lame lên giọt dịch có chứa bào tử nắm AM, quan sát đặc điểm hình thái, kích

thước, màu sắc dưới kính hiển vi và được định danh ở mức độ chi nam theo mô tả củaBrundrett va ctv (1996) và cơ sở dit liệu trên INVAM.

3.3.3.1 Bao tử chi Acaulospora và Entropospora

saccule or saccule remnants

100 nm

Hình 3.2 Bao tử chi Entropospora (Nguôn: INVAM).

Bao tử chi Acaulospora thường được sinh ra ở trên cô của túi bao tử và khi bao

tử trưởng thành túi bảo tử sẽ tiêu biến bào tử tách ra khỏi túi bào tử, nên ở đạng trưởngthành không có cuống bào tử Hình dạng của bào tử là hình cầu hay hình elip có đườngkính từ 40 - 400 um Màu sắc bảo tử trong suốt, vàng hoặc nâu đỏ Bào tử có vách day

17

khoảng 12 pm với 2 lớp riêng biệt, lớp trong có thé nhuộm màu thành hồng đỏ hoặc tím

bằng thuốc thứ Mezler Bề mặt bào tử nhẫn hoặc có nhiều chỗ héc, lỗi tạo thành hình

dạng nếp gấp, gai, mạng lưới

Bào tử chi Entropospora được hình thành và phát triển ở trong cuống túi bao tửđến giai đoạn bào tử trưởng thành thì túi bào tử sẽ vỡ ra rồi tiêu biến làm cho bào tửthoát ra ngoài còn vị trí bám của bào với bào tử tạo thành 2 cái sẹo trên bề mặt bảo tử.Hình dạng của bảo tử là hình cầu hay hình trứng đường kính khoảng 120 - 200 pm vàkhông có cuống bào tử Màu sắc bào tử nâu nhạt, vàng nhạt, màu vàng

3.3.3.2 Bào tử chỉ Gigaspora và Scutellospora

Bao tử chi Gigaspora được hình thành đơn lẻ trong đất có dạng hình cầu hoặcgần cầu một số có hình elip, có cuống và phần gắn với bên ngoài bảo tử to hơn có hìnhdáng giống như củ hành Vách bào tử thuộc nhóm vách đơn có màu sắc trắng vàng nhạt

18