Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát điều kiện tách chiết, một số thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết hạt cà phê nhân robusta phế phẩm

Đề tài này được thựchiện nhằm khảo sát các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, định lượng các thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của hạt cà phê nhân Rosbuta phế phẩm, n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

cit

KHAO SAT DIEU KIEN TACH CHIET, MOT SO THANH PHAN HOA HOC VA HOAT TINH KHANG OXY HOA CUA CAO CHIET HAT CA PHE NHAN ROBUSTA PHE PHAM

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện =: TRAN VAN HOAI NHUT

Mã số sinh viên : 19126130

Niên khóa : 2019 — 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SAT DIEU KIỆN TÁCH CHIET, MOT SO THÀNH PHAN HOA HOC VA HOAT TINH KHANG OXY HOA CUA CAO CHIET HAT CA PHE NHAN ROBUSTA PHE PHAM

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

ThS NGUYEN THỊ DUNG TRÀN VĂN HOÀI NHỰT

TP Thu Đức, 3/2024

LỜI CẢM ƠNLời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành

phó Hồ Chí Minh đã hỗ trợ toàn bộ kinh phí, máy móc, trang bị và cơ sở vật chất đề tôi

có thé hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Dung, Phó trưởng phòng Công nghệsinh học Thực phẩm đã tạo điều kiện để tôi được học tập và làm việc tại phòng Công

nghệ sinh học Thực phẩm Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin chân thành cảm ơn

ThS Nguyễn Thị Dung, người thầy cũng như người chị đã hướng dẫn tận tình cho tôitrong suốt quá trình thực tập tại Trung tâm Những điều chị truyền đạt đã giúp tôi học

hỏi nhiều kiến thức bổ ích, nâng cao năng lực thực hành va hiểu biết thêm về chuyên

ngành, thực tế công việc Đặc biệt, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến KS PhạmHải Sơn là cán bộ đồng hướng dẫn cũng như người anh đã hỗ trợ, hướng dẫn tôi tận tìnhtrong suốt thời gian thực hiện đề tài, đưa ra lời khuyên, giúp tôi định hướng công việcsau thực tập, góp phần giúp tôi có nhiều kinh nghiệm sau quá trình thực tập Xin cảm

ơn các anh, chị tại Phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm — Trung tâm Công nghệ Sinhhọc Thành phó Hồ Chí Minh Nhờ sự giúp đỡ nhiệt tình từ các anh, chị đã giúp tôi nhanh

chóng hòa nhập với công việc kê từ ngày đầu thực hiện khóa luận

Xin gửi lời cảm ơn tới Thầy Cô khoa Khoa học Sinh học trường Đại học NôngLâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi học tập, hoàn thành tốt khóa luận

tốt nghiệp

Tôi cũng xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, khích lệ tinh than,

đặc biệt là những người bạn cùng thực tập tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM

trong thời gian qua đã quan tâm, động viên, hỗ trợ hết mình và là chỗ dựa tinh thần đểtôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin kính chúc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ ChíMinh ngày càng phát triển và thành công Chúc các anh, chị đang làm việc tại PhòngCông nghệ Sinh học Thực phẩm luôn mạnh khỏe và thành công trong cuộc sống

XÁC NHAN VA CAM DOANTôi tên: Trần Van Hoài Nhựt, MSSV: 19126130, Lớp: DH19SHA (Số di động:

0983556264, Email: 19126130(@st.hecmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh hocTrường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luận tốt nghiệp

do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàntrung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng về những

cam kết này

Tp Hô Chi Minh, ngày 31 tháng 03 năm 2024

Người viết cam đoan

(Ki và ghi rõ họ tên)

Trần Văn Hoài Nhựt

il

TÓM TAT

Cà phê là một trong những loại thức uống phố biến không chỉ tại Việt Nam matrên toàn thế giới, với nhiều hợp chất sinh học quý giá như polyphenol, flavonoid,CGA, caffein, và nhiều hợp chất khác Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất cà phê,lượng lớn hạt cà phê kém chất lượng và phế phẩm được tạo ra Đề tài này được thựchiện nhằm khảo sát các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, định lượng các thành

phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của hạt cà phê nhân Rosbuta phế phẩm, nhằm

tận dụng tiềm năng của các hợp chất trong hạt cà phê này Thí nghiệm chiết, thu nhậncao tổng được thực hiện hiện bằng phương pháp chiết rắn — lỏng Khảo sát các yếu tốảnh hưởng đến quá trính chiết xuất tối ưu nhất dựa vào hàm lượng polyphenol được xác

định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu Định lượng thành phần hóa học có trong hạt ca

phê nhân phế phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Đánh giá hoạt tính khángoxy hóa bằng phương pháp DPPH và ABTS' Kết quả của nghiên cứu đã xác định đượccác yếu tô tối ưu cho quá trình chiết xuất, bao gồm kích thước mẫu 1 — 5 mm, dung môichiết là nước với tỉ lệ mẫu:dung môi là 1:10, và nhiệt độ 80°C trong thời gian 60 phút.Đồng thời, các thành phần hóa học như hàm lượng polyphenol đạt 49,90 + 0,95 mgGAE/g chất khô, flavonoid đạt 2,92 + 0,13 mg QE/g chất khô, CGA đạt 118 + 0,13mg/g chất khô và caffein đạt 25,8 + 0,07 mg/g chất khô Kết quả khảo sát hoạt tínhkháng oxy hóa cho thấy khả năng kháng oxy hóa với DPPH khá cao với giá trị ICso đạt22,71 + 0,3 ug/mL, đối với ABTS* khả năng kháng oxy hóa cao với giá trị ICso dat

29,17 + 0,68 ug/mL.

Từ khóa: hạt cà phê nhân Robusta phế phẩm, TPC, TFC, TLC, HPLC, caffeine, CGA,

DPPH, ABTS'.

Coffee is one of the popular beverages not only in Vietnam but all over the world,

with many valuable biological compounds such as polyphenols, flavonoids, CGA,

caffeine, and many others However, during coffee production, large quantities of poor quality coffee beans and waste products are generated This project was carried out to investigate the factors affecting the extraction process, quantifying the chemical composition and antioxidant activity of defective Robusta coffee beans, in order to take advantage of the potential of compounds in this coffee bean Experiments in extracting and obtaining high are carried out by solid-liquid extraction method Investigate the factors affecting the optimal extraction process based on the polyphenol content determined by the Folin-Ciocalteu method Quantification of the chemical composition

of coffee beans by high-performance liquid chromatography Evaluation of antioxidant

activity by DPPH and ABTS+ methods The results of the study identified the optimal

factors for the extraction process, including a sample size of 1 — 5 mm, an aqueous extraction solvent with a sample:solvent ratio of 1:10, and a temperature of 80°C over a period of 60 minutes At the same time, chemical components such as polyphenol content reached 49,90 + 0,95 mg GAE/g dry matter, flavonoids reached 2,92 + 0,13 mg QE/g dry matter, CGA reached 118 + 0,13 mg/g dry matter and caffeine reached 25,8

+ 0,07 QE/g dry matter The results of the antioxidant activity survey showed that the

oxidation resistance with DPPH is quite high with an [C50 value of 22,71 + 0,3 ug / mL,

for ABTS+ the antioxidant capacity 1s high with an [C50 value of 29,17 + 0,68 ug / mL.

Keywords: Substandard Robusta coffee beans, TPC, TFC, TLC, HPLC, caffeine, CGA, DPPH, ABTS+.

1V

MỤC LỤC

Trang

8989, =¬ „>uaảỪŨỒ iTOA NHÂN rễ AM DAI ecscccsscansepnenesncnsmnsaan sme snosc sc tease cia etsatcasieetsianlan iiTÓM Ot 6 2222222 222E225221121211211211211211211211211211211211211211211211211211211211112121 re iii

ABSTRACT 5+ 2222122112212212211211111211211121121121121111121111211211111211211 21 re iv MỤC LỤC 552 5< 22 2E2E12212112112111211211211211211111211111211011221121 21 xe v

TIAT(H BA VE TAL busvenatoikistbs)sininhbtsigsnst6x4600 8658068108sE04001860m3 06 Vii

TA Be t2) ế" ẻ ha viiiDANH SÁCH CAC HINH 0.0 c.scsscssessessessessessessessessessessessessessssssnssessessessessesaeneeaee ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 22 222222222EE2211221221221122112112212211211221211211 21.22 xe |

1.1 Đặt vấn đề +5 2s s21 2121121221211212112112111211211121121112212221211 22 re |

ae | |

[;3, NI dung thực HIẾN: cong be c6 no nha Số mnie 1

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU - 2 2+222E2E£2E2E2E2E2EZEzErrrrree 3

2.1 Tổng quan về Coffea robusta ÌL - -©22-552-552222222222E222ES222222S22ES2zsszssres 3

San le, HAT LOAN srssconnoioioSiLGEIGELSGS.ENGWEGEESAEGUIGHIRHSNGHHGEE-HIRSSEIIEEEEESSEIEGGGGNGSGCSGERGASIEERRGS 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái chung của cây cà phê -2-2¿©2222z+2E+2£x2zzzzxrzxz 3

SN on mä 42.2 Tổng quan về hạt cà phê 2 2 22222E22E2E22E22E2252251251231231231231232222222 222 42.2.1 Cau tạo hạt cà phê - 2 22222 +E2E2E12512112112112112112112112112112112112112121 2x6 42.2.2 Thành phan hóa học của hạt cà phê 2- 22 222+2222E22E2EE2EEzzzzrrcrxee 62.3 Các dạng khiếm khuyết của hạt cà phê 2-2 2+Sz+Ez+EE2EE2EE2EEzzxrrrrer 10

2.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn 2 2 2+22222E22EE2EE2EE2E12E125123123123122222222222x xe 12

2.4.3 Bảo vệ thần kinh 2 2s Ss+S2E£EEEE2EE7X221217121171212112121 11211121 cee 122.5 Các nghiên cứu về hạt cà phê 2 22©22+2E2E+2EE+EE+2EE£EE+2EEzEErzExzrxrrrree 13

2:5-L; N ghiền Cứu TONS TUCO sassssasatsecsioecazvstoSS0609039830123935630585960805821989v40030605.0010SE8 13 25.2), NBIEn: CU NS OAL MU OC sscccseeeebeelSitinnusieszLsdttiotlosginling0sg00cggkggi003.40k2n4480g0.00gi0 08g88 13

CHƯƠNGä, VAT LIBU XÃ PHITONG BEAD xeeeeeeeessennnnnnsrennreraesee is3.1 Thời gian và địa điểm nghiên Ctr oo cccecccccsecsesssessesseessesseessessesseessecseesees 15

3, Wate LISU 0 EAN Sh 6 UI om Sa a i a a Se ee is 15

kU? on 120 88 153.2.2 Dụng cu, hóa chất, thiết bị - 2 22222222E221221221221221221221221221271221 221 xe 15

3:3 Phương Pháp ñiEhIEH GỮU acc eniieeoesaisssiss18s356555TSSGSSSEPIAGHLEXEEHASSSEE.-SSSSAS5S8 16

3.3.1 Chiết, thu nhận cao tổng, định lượng thành phan polyphenol - 163.3.2 Khảo sát một số thành phần hóa học của cao chiết 2-52 5sccs+czss2 22

3.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính oxy hóa - 5c eee eeeeeeeeeeeeeeeeeeees 243.3.4 Phương pháp xử lí số liệu - 2-2 2 2+2+EE+EE+EE2EE£EE2EE2EE2EE2EE2EEzrxzrxrrxee 37

CHƯƠNG 4 KET QUẢ -©2-5222222E2E2252252251231211211211211211211211211211211 2e 29

4.1 Các yêu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao tông - - 294.2 Một số thành phần hóa học của cao chiẾT 2-52 Ss+222222E222222E22E22zcxcree 32

4.2.1 Dinh tính bằng phương pháp nhận diện phản ứng sinh hóa - 32

Bảng 4.6 Dinh tính các hợp chat tự nhiên 2222 2222+22z+2222Ez+2xzzzxzzxrer 324.2.2 Định tinh bằng phương pháp TLC 2-22 2222222222z2222EZ+22+22+zzzce2 324.2.3 Định lượng polyphenol - -.-~ xs sesscsesrrersieserkareririesesdrriorseo2LT4.2.4 Định lượng thành phan flavonoid -2- 2 22222222+22z22Ez2E+2EEz2Szzzxzrzcee 344.2.5 Định lượng caffein bằng phương pháp HPLC -2 52©222 55+: 35

4.2.6 Dinh lượng chlorogenic acid bằng phương pháp HPLC - 374.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóÓa - 5+ 25+ + *+2c+srrerrrrerrrrrrrrrrrerrrrree 384.3.1 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH 384.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ABTS 40

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ -555ccccreriecree 43

TÀI LIEU THAM KHẢO -22-©2222222S22EE22EE22EE222122212221222122212221221 22x 45

PHU LUC 2 51

vi

Acid formic Chlorogenic Acid

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl Ethanol

Ethanol 50%

Ethanol 70%

Ethyl Acetate Gallic acid equivalent High-performance liquid chromatography

Methanol Water Optical density Appendix

Quercetin equivalent Toluen

Trifluoracetic acid Total flavonoid content Thin Layer Chromatography Total phenolic content

Volume Mass

Gốc tự do

Cộng tác viênGốc tự do

Đương lượng gallic acidSắc ký lỏng hiệu năng cao

Nước

Mật độ quang Phụ lục

Đương lượng quercetin

Hàm lượng flavonoid tổngSắc ký bản mỏng

Hàm lượng polyphenol tổngThể tích

Khối lượng

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 3.1 Phương pháp định tinh hop chat tự nhiên 2-2¿ 222 55z552z£: 19

Bảng 3.2 Dinh tính các hợp chat tự nhiên bằng sắc ký bản mỏng 20Bang 3.3 Bang thông số chạy HPLC định lượng caffeine -2-25+ 23Bang 3.4 Bang thông số chạy HPLC định lượng CGA 222552252552 24

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của kích thước đến hiệu suất chiết và hàm lượng polyphenol29

Bang 4.2 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết và hàm lượng polyphenol30Bảng 4.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu với dung môi đến hiệu suất chiết và hàm lượng

POLY HGHHO xen seeaseibieiiiisddESESEEG00GESS55ASSS.SS00495558258930TEEGSELSEG1883G0SE5054810G0150GEGSH0314E88 30

Bang 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết và hàm lượng polyphenol 31Bảng 4.5 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết và hàm lượng polyphenol 31Bảng 4.6 Dinh tính các hợp chất tự nhiên 2-22©2222222+2ES22E2EEcEEzzxzrxeee 32Bảng 4.7 Giá trị ICso của cao chiết cà phê và Vitamin C đối với DPPH 40Bảng 4.8 Giá trị ICso của cao chiết cà phê và Vitamin C đối với ABTS 41

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình.7.1: Hình thai hod và Wat C8 PS ceeaesnosrntbddeitosoiSiEEtGSE201138008589348883851353858 3Hình 2.2, Cu tạo hái BEB ros cacenõnganggiênon ghe ngokHhag2ug1soitcdgagi9G300001000028005/2000u6 5Hình 2.3 Cau trúc một số nhóm polyphenol - 2-22 2222222+22z+2z+z2zzz+zzz+zzs+2 §Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của flavonoid + 2+ 2+s+2s+Sz+E££E+Ez2Ez2zzzzzxerxrcee 8

Hình 2.5 Cấu trúc của chlorogenic acid + 2 2222222E+2E+2E2E2EzEzxzxzzzeez 9

Tình 3.1, Sơ đồ nội Hưng nghiÊn GỮN: sescesuessesisiediiisbnibalsdl161040100433814n001 00:04 16Hình 3.3 Sơ đỗ quy trình christs phế, ssseeneeesieseioiekolirokiediisikeSig se 17

Hình 3.3 Cơ chế phản ứng của DPPH 2 2 22222EE22EZ2EE22E222E22E222222xee2 25

Hình 3.4 Sự chuyển màu của gốc tự do ABTST -2-©22222222222z22zz2zxccscee 26Hình 4.1 Sắc ký đồ các hợp chat tự nhiên -2- 2 5c5cecse=secse-sc . 33Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn Gallic acid 2 222+2E+22E£2E2E2E22E2Ezzxcrxec 34Hình 4.3 Đồ thị đường chuẩn Quercetin - 22+ 252+222E+EE2E22E£EE2E2E2EEzEzzxcree 35Hình 4.4 Đồ thị đường chuẩn Caffeine 2: 22©2222222E22E22E2EE2EESExerxcrrree 36Hình 4.5 Diện tích peak caffeine của cao chiết - 2-22 ©2s+22++22z+2zzzzzzeex 36Hình 4.6 Đồ thị đường chuẩn GA - 2 2+222EE2E1221221221221221221221221222 xe 37Hình 4.7 Diện tích peak CGA của cao chiết 2 2©722222222E2222222221222222222z22 38Hình 4.8 Hiệu suất trung hoa DPPH của Vitamin C -2- 2252222255222 39Hình 4.9 Hiệu suất trung hòa DPPH của cao chiẾ -2- 52522 522S22S2S22£22222+2 39Hình 4.10 Hiệu suất trung hòa ABTS của Vitamin C -2 2+-2+zz+zz+zzzsz 41Hình 4.11 Hiệu suất trung hoa ABTS của cao chiẾt -5-552222222222z225c+2 41

Tuy nhiên, quá trình sản xuất cà phê tạo ra lượng phế phẩm lớn bao gồm vỏ, hạt

cà phê kém chất lượng, vỏ lụa và bã cà phê (Madhava Naidu và ctv, 2008), trong đó hạt

cà phê kém chất lượng có thé chiếm tới 20% tông lượng cà phê được tiêu thụ (Oliveira

và ctv, 2008) Hạt cà phê kém chất lượng là những hạt cà phê bị lỗi sau khi đã tiến hành

sảng lọc và phân loại Những hạt này không chỉ làm ảnh hưởng đến chất lượng và hương

vị của cà phê sau khi pha chế, mà còn gây ra nhiều thách thức về việc xử lý hiệu quảlượng phế phẩm nay

Trong thành phần hóa học của hạt cà phê, các hợp chất polyphenol, chlorogenicacid (CGA), caffein, lignin chiếm hàm lượng lớn Các nhóm hợp chất này đã và đangthu hút được sự quan tâm vì có nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxy hóa,chống ung thư, kháng khuân đến giảm đau, hạ huyết áp, và hạ đường huyết (Zottich vactv, 2011) Tuy nhiên, nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt

cà phê nhân phế phẩm trên thé giới và ở Việt Nam van còn hạn chế và chưa đầy đủ Do

vậy đề tài, “Khảo sát điều kiện tách chiết, thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính

kháng oxy hóa của cao chiết hạt cà phê nhân Robusta phế phẩm” được thực hiệnnhằm mục đích tận dụng được tiềm năng của các nhóm hợp chất từ hạt ca phê nhân phếphẩm, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường, góp phan nâng cao giá trị của ngành

cà phê Việt Nam.

1.2 Mục tiêu đề tài

Khao sát các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao tổng, một số thànhphần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết hạt cà phê nhân Robusta phếphẩm

1.3 Nội dung thực hiện

Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trung tâm

Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh với những nội dung như sau:

Nội dung 1: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao tổngNội dung 2: Khảo sát một số thành phần hóa học của cao chiết

Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tông quan về Coffea robusta L

Loài: Coffea arabica, Coffea robusta, Coffea liberica

Chi ca phé thudc ho Rubiaceae, bao gồm nhiều chi như Gardenia, Ixora,Cinchona, Rubia, Coffea Cho đến nay chi quan trọng có giá trị kinh tế nhất trong

họ Rubiaceae van là chi cà phê (Coffea) Chi Coffea gồm xap xi 100 loài (Charrier vàBerthaud, 1985) Hai loài chính của cây cà phê được trồng rộng rãi trên thế giới là càphê chè (Coffea arabica) va cà phê véi (Coffea canephora hay robusta) (Marshall,

1985).

2.1.2 Đặc điểm hình thái chung của cây cà phê

Cà phê là loại cây trồng lâu năm, thân gỗ nhỏ, vỏ mỏng, có nhiều vết nứt đọc,thân dang cây bụi, cao 3 — 4 m, trong điều kiện thích hợp cây có thé cao tới 6 — 7 m Cây

cà phê có xu hướng phát triển theo hai hướng: đọc và ngang Sự phát triển theo chiều

dọc liên quan đến chéi đỉnh phát triển trên thân chính và chồi mọc thang đứng từ thân

chính được gọi là chéi bên Cây cà phê có hệ thống rễ cái được chôn sâu dưới lòng dat,cách mặt đất khoảng 0,3 đến 1 m Nó phân bố xung quanh thân cây theo hình tròn cóđường kính khoảng 1,5 m (Da Matta và ctv, 2007) Nhánh sơ cấp nhỏ và yếu, có nhiềunhánh thứ cấp nói tiếp nhau hình thành cùng với nhánh sơ cấp (Wintgens, 2004) Hoa

cà phê là loài lưỡng tính và có thé thụ phan khi hoa khép kin Nhụy hoa thường được

thụ phấn từ 1 đến 2 giờ trước khi hoa nở Khi hoa nở, chúng tỏa ra mùi hương giống hoanhài (Carvalho, 1988) Cây cà phê mắt từ 6 đến 9 tháng từ khi ra hoa đến đậu quả Quả

cà phê có hình bầu dục, thuôn dài, khi chín có màu đỏ tươi hoặc vàng, thường có haihạt, vỏ dày, mọng nước, hàm lượng đường cao và vị rất ngọt Cuống quả ngắn và dễgãy Hạt cà phê thường được mô tả có màu xanh xám, xanh xám hoặc xanh lục, tùythuộc vào loại và phương pháp chế biến Nó có nội nhũ cứng ở trung tâm, mặt trong

phăng có rãnh hẹp ở giữa, mặt ngoài cong, bên dưới là phôi, rễ non hình chóp và hai ládiệp cuộn tron (Wintgens, 2004).

2.1.3 Phân bố va sinh thái

Cà phê được trồng trên hơn 10 triệu ha ở khoảng 80 quốc gia trên thế giới Hiệnnay, hai loại cà phê được trồng chính ở Việt Nam là Robusta và Arabica, trong đóRobusta chiếm trên 95% tổng diện tích trồng trọt Cà phê được trồng chủ yếu ở vùngnúi phía Bắc, Tây Nguyên và miền Trung Nam Bộ Việc trồng cà phê tập trung nhiềunhất ở vùng Tây Nguyên Diện tích trồng ca phê tại khu vực này chiếm tới 90% tổngdiện tích cả nước và sản lượng cũng chiếm khoảng 80% tổng sản lượng cả nước Theo

Nhật Anh (2023) thì diện tích cà phê năm 2022 của Việt Nam đạt khoảng 710.000 ha,

năng suất đạt 28,2 tạ/ha cho sản lượng hơn 1,84 triệu tấn Trong đó, 5 tỉnh Tây Nguyênchiếm 93,2% về sản lượng cà phê và 91,2% về diện tích cà phê cả nước Đắk Lắk đượcxem là thủ phủ cà phê của Việt Nam, với diện tích khoảng 213.000 ha (chiếm trên 30%diện tích cả nước), sản lượng đạt khoảng 558.000 tấn cà phê nhân

2.2 Tống quan về hạt cà phê

Endosperm fold Endosperm

Seed, Bean

Epidermis

Silver Skin

Quả cà phê xanh được cấu tạo với lớp vỏ ngoài bao phủ lớp vỏ thịt (lớp trung bì)

có chứa xơ và ngọt, kế tiếp là lớp chất nhay mỏng, nhớt (gọi là pectin), sau là một lớpgiấy da (vỏ trau) mau vàng nhạt, và lớp da bạc (vỏ lụa) bao bọc mỗi bán cầu của hạt cà

phê (Belitz và ctv, 2009).

Lớp vỏ ngoài: khi bat dau phát triển vỏ quả có màu xanh lục do sự hiện diện củalục lạp, chuyển qua màu vàng ở giai đoạn phát triển đến khi chín chuyên sang màu đỏ

do sự mất đi của các sắc tố điệp lục và tích tụ các sắc tố anthocyanin, có một số gen tích

tu lutein sẽ có quả chín màu vàng (Marin va ctv, 2004) Vỏ quả được hình thành bởi mộtlớp tế bào nhu mô đơn gồm các tế bào có chứa lục lạp và có khả năng hấp thụ nước

(Wintgens, 2008).

Chat nhay: khi quả chin, các enzym pectolytic sẽ phá vỡ các chuỗi pectic tạo ra

hydrogel không hòa tan rất nhiều đường và pectin nằm bên dưới lớp màng nhay làm nên

một cấu trúc mềm, mong nước có độ nhớt cao, độ dày khoảng 0,5 — 2 mm (Ouguerram,1989) Đối với quả cà phê mới thu hoạch, chất nhay bao gồm nước 84,2%, protein 8,9%,

pectat 0,91%, fructose 27%, glucose 21%, sucrose 6-9% và axit hữu cơ 7,3%, trong đó

axit malic, axit quinic và axit gluconic là phong phú nhất

Lớp vỏ trấu: là lớp cứng bao quanh hạt cà phê, bao gồm ba đến bảy lớp tế bào xơ

cứng sclerenchyama có kích thước khoảng 150 um Vỏ trấu là lớp ngoài cùng của phần

hạt thành phần chính là Cellulose 40 — 49%, nhám và tiếp xúc trực tiếp với thịt quả,chứa một ít caffein khoảng 0,4%, hemicellulose 25 — 32%, lignin 33 — 35% (Bekalo và

ctv, 2010).

Lớp vỏ lụa: là lớp ngoài cùng bao quanh hat được hình thành từ các tế bao xơ

cứng có màu trang bạc sau khi phơi khô dày khoảng 70 um nên còn được gọi là vỏ bạc,

chứa khoảng 18% protein, cùng lượng nhỏ các chất béo và carbohydrate (Dedecca,

1957).

Nhân cà phê: bao gồm ngoại nhũ, nội nhũ và phôi, kích thước của hạt cà phê sẽ

thay đồi tùy theo giống cà phê, trung bình hạt có thé dài 10 mm, rộng 6 mm Thông

thường, một quả cà phê sẽ có 2 nhân nằm đối xứng với nhau, các dạng đột biến cà phê

sẽ có 3 nhân hoặc | nhân tròn Ngoại nhũ sẽ có nhiệm vụ chính là tích lũy chất dinh

dưỡng cho quá trình nảy mầm của phôi, góp phần thê hiện được các đặc tính vật lý của

hạt cà phê (Geromel và ctv, 2008) Nhìn từ bên ngoài thì ngoại nhũ phải có màu vàng

hồ phách đồng nhất, không có đốm, không có vết dập, không có dấu hiệu và triệu chứngcủa bệnh Ngoại nhũ còn có tác dụng bảo vệ nội nhũ và phôi bên trong Nội nhũ là môđược tạo ra bên trong hạt nơi chứa gần như tất cả chất dinh dưỡng của hạt cà phê, và

hàm lượng caffein cao nhất nằm ở đây Các hợp chất hòa tan trong nước là caffein,trigonelline, acid nicotinic, acid chlorogenic, disaccharides, protein, khoáng chat và các

acid cacboxylic Các thành phần không hòa tan trong nước là cellulose, polysaccharides,

lignin, hemicellulose, một sỐ protein, khoáng chất, vitamin và lipid, acid glutamic, acid

aspartic, leucine va valine (Wintgens va ctv, 2008).

2.2.2 Thành phan hóa học của hạt cà phê

Nhóm chất cơ bản sau đây đều có mặt ở tất cả các giống loài cà phê, tuynhiên tùy theo giống cà phê và phụ thuộc vào điều kiện canh tác mà các thànhphần hóa học trong cà phê có thé thay đổi

Nước: hàm lượng nước chiếm từ 70 — 80% trong quả tươi, qua quy trình chế biến

hàm lượng nước ở trong hat còn lại khoảng 10 — 12%, hàm lượng nước cao hơn sé dé

làm hạt bị nắm mốc đồng thời các vi sinh vật phát triển mạnh mẽ ảnh hưởng đến chấtlượng hương thơm và hương vị, hàm lượng nước quá thấp làm màu hạt cà phê sẽ nhạt

đi tạo ra các vết nứt trên hạt, làm giảm khả năng nảy mầm và có mùi cỏ khô Sau khirang lượng nước sẽ còn từ 1 — 2% tùy vào mức độ rang (Farah và ctv, 2004).

Carbohydrate (glucid): chiếm hơn 50% trọng lượng và cũng là thành phần chính

của ca phê (Trugo và ctv,1985) polysaccharid chiếm từ 44 — 47%, và sucrose chiếm từ

6 — 9% trọng lượng khô của hạt, sẽ bị phân hủy trong quá trình rang tạo thành anhydro,

đường và các hợp chất glyoxal (Kolling và ctv, 2005), các carbohydrate là tiền chất cho

phản ứng Maillard, sucrose sẽ bi thủy phân dưới tac dụng của acid hữu cơ và các enzyme

thủy phân trong phản ứng caramel hóa sản phẩm tạo ra acid acetic Hàm lượng đường

trong hạt sẽ phụ thuộc vào độ chin của quả ca phê Saccharose bi caramen hóa trong quá

trình rang tạo thành hương vị cho nước cà phê (Farah và ctv, 2006).

Thành phần protein: hàm lượng protein chiếm khoảng 9 — 11% đóng vai trò trong

việc hình thành nên hương vi của cà phê Trong protein có những acid amin như: Cytein, Alanine, Phenylalanine, Histidine, Leucine, Lysine các acid amin này cùng đường khử tham gia vào phản ứng Maillard sẽ được giải phóng ra bên ngoài hoặc tác dụng với

những chất tạo mùi thơm và hương vị trong cà phê (Belitz và ctv, 2009) Bằng các

phương pháp định tính người ta nhận thấy trong thành phần protein có những acid aminchính như: cysteine, alanine, phenylalanine, histidine, leucine, lysine (Arya va ctv,

2007).

Lipid: hàm lượng lipid chiếm khoảng 15% trong hat Arabica hay khoảng 10%trong hạt Robussta (Ginz va ctv, 2001), thành phan lipid chủ yếu là tria — cylglycerolkhoang 75%, cac axit béo tu do 1%, sterol 2,2%, tocopherol 0,05%, dau va sap chiém 8

— 18% khối lượng khô (Belitz va ctv, 2009), dưới tac dụng nhiệt sẽ tạo ra mùi hương,gitt được mùi thơm nhờ vào các acid béo không bão hòa (Toci và ctv, 2008), và tạo cảmgiác ngon miệng cho cà phê, còn lượng không bị biến đối bởi nhiệt làm dung môi hòatan cho các chất thơm

Polyphenol là một nhóm các chất hóa học được tìm thấy trong thực vật được đặctrưng bởi sự hiện diện của một hay nhiều đơn vị phenol trên mỗi phân tử (Marzag vàctv, 2014) Đặc điểm chung của polyphenol là trong phân tử có vòng thơm (vòngbenzen) chứa một, hai, hay ba hoặc nhiều nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòngbenzen Tuỳ thuộc vào số lượng và vị trí của tương hỗ của các nhóm OH với bộ khunghóa học mà các tính chất lý hóa học hoặc hoạt tính sinh học thay đôi Polyphenol có hơn

8000 cấu trúc khác nhau (Ziaullah và ctv, 2014) Polyphenol có thé bảo vệ cơ thé, giúp

cơ thê chống lại nhiều loại bệnh khác nhau đo gốc tự do gây ra (Piccolella va ctv, 2015)

Các nghiên cứu gần đây đã khẳng định polyphenol thể hiện hiệu quả to lớn trong việc điềutrị và ngăn ngừa các bệnh thoái hóa thần kinh (Watson, 2015)

Stilbenes Lignans

Hình 2.3 Cau trúc một số nhóm polyphenol

(Nguôn: Pandey và Rizvi, 2009)

Flavonoid là các hợp chất polyphenol có trong hầu hết các loại thực vật Chúng

thường được tìm thấy trong trái cây, thảo mộc, ngũ cốc, quả hạch (Ullah va ctv, 2020).Theo cấu trúc hóa học, khoảng 6000 flavonoid đã được xác định và phân loại thành

flavanol, flavanon, flavon, isoflavon, catechin, anthocyanin, proanthocyanidins Tac

dụng có lợi của flavonoid đối với sức khỏe con người chủ yếu nằm trong hoạt độngchống oxy hóa mạnh (Miller, 1996) Đồng thời, cũng có tác dụng trong bảo vệ thần kinh

và tim mach (Ullah và ctv, 2020) Theo Phan Quốc Kinh (2011), các chất flavonoid lànhững chat oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do (có thé lànguyên nhân làm cho tế bảo hoạt động khác thường)

Flavones Anthocyanins Isoflavones

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của flavonoid

(Nguồn: Pandey và Rizvi, 2009)

Chlorogenic acid (CGA): có công thức hóa học CisHisOs, là este của acid

caffeic và acid quinic, hoạt động như một chất trung gian trong sinh tông hợplignin (Boerjan và ctv, 2003), có màu vàng nhạt đến bột trắng Cấu trúc chlorogenic acid

là este được hình thành giữa acid caffeic và 3 - hydroxyl của acid L - quinic (Barnes va

ctv, 1950), đồng phan chlorogenic acid bao gồm các este caffeoyl tại các vi tri hydroxyl

khác nhau trên vòng acid quinic 4 — acid caffeoylqumic (4 - CQA) va 5 - acid

caffeoylquinic (5 - CQA) Các cấu trúc có nhiều hơn một nhóm acid caffeic được gọi làacid isochlorogenic và có thê được tìm thấy trong cà phê (Corse và ctv,1965) Có một

số đồng phân, chang hạn như acid 3, 4 — đicaffeoylquinic và acid 3, 5 — dicaffeoylquinic

và cynarine (acid 1, 5 — dicaffeoylquinic) (Vogt, 2010).

Chlorogenic acid có thé được tim thấy trong cây tre (Phyllostachys edulis) (Jalal

va ctv, 1982) hay trong chổi của cây thạch nam (Calluna vulgaris) (Clifford, 2003) cũng

như trong nhiều loại cây khác (Zhen va ctv, 2016) Trong thực pham, chlorogenic acid

và các hợp chất liên quan như cryptochlorogenic acid va neochlorogenic acid đã đượctìm thay trong lá của cây dam but (Sabdariffa) Các chất đồng phân của chlorogenic acidđược tìm thấy trong khoai tây Ngoài ra, chlorogenic acid có trong thịt quả cà tím, đào,man khô và quả cà phê Tác dụng của chlorogenic acid chủ yêu bang cách ức chế enzymealphaglucosidase (là chất chịu trách nhiệm phá vỡ carbonhydrate) Bằng cách đó có thé

làm giảm sự hấp thụ carbonhydrate và glucose của cơ thể trong quá trình tiêu hoá

(Naveed va ctv, 2018) Chlorogenic acid (CGA, 5 — CQA) là một đồng phân phổ biếnnhất trong số các đồng phân acid caffeoylquinic (3 —, 4 — và 5 — CQA) Nó là một trongnhững acid có sẵn nhất trong số các hợp chất acid phenolic có thé được tìm thay tựnhiên, trong dịch chiết xuất từ cà phê xanh và trà Chlorogenic acid là một polyphenolquan trọng và có hoạt tính sinh học Chlorogenic acid đóng một số vai trò quan trọngtrong y được như chống oxy hóa, kháng khuẩn, bảo vệ gan, bảo vệ tim mạch, chốngviêm, hạ sốt, bảo vệ thần kinh, chống béo phì, kháng virus, chống tăng huyết áp, chống

sốc tự do và một chất kích thích hệ thống thần kinh trung ương Chlorogenic acid tạo ra

tác dụng bảo vệ gan bằng cách bảo vệ động vật khỏi các ton thương do hóa chất hoặclipopolysacarit độc hại Ảnh hưởng hạ đường huyết của chlorogenic acid có thể là do sự

9

tác động vào quá trình chuyền hóa các chất dinh dưỡng, bao gồm acid amin, glucose và

acid béo (Campa và ctv, 2005).

Alkaloid là chất tạo ra vi đắng trong cà phê, giữ vai trò quan trọng và được nghiêncứu nhiều như là Caffein và Trigonulin Caffein chiếm 1 — 4% phụ thuộc vào loại hạt,

giống cây trồng (Mazzafera và ctv, 2010) Trong hạt Arabica thì caffein từ 0,9 — 1,7%,còn trong hạt Robusta hàm lượng caffein gấp đôi chiếm 1,8 - 4% Caffein đóng góp

khoảng 10% vị đắng và là đặc tính kích thích hệ thần kinh trung ương, tăng tuần hoàn

máu, và nồi tiếng với tác dụng làm tăng sự tinh táo (Belitz va ctv, 2009) Caffein còn có

tác dụng như một chất bảo vệ cây trồng chống chọi với dịch bệnh gây hại Hàm lượngcaffein trong vỏ quả thấp hơn từ hai đến mười lần so với trong hạt (Koshiro và ctv,2006), sự thay đổi hàm lượng này còn phụ thuộc vào kiểu gen từng loại và giai đoạn

phát triển của qua Trigonellin (Acid N — metylnicotinic C7H7NO2) lên đến 0,8% trong

hat cà phê xanh, nhiệt độ nóng chảy là 218°C Dưới tác dụng của nhiệt Trigonellin sẽ bị

thủy phân 50% tạo thành acid nicotinic (tiền chất của vitamin có tác dụng giảmCholesterol), pyridine, 3-metyl pyridin, metyl este Trong thành phần hóa học sẽ

không có acid nicotinic, nó chỉ được hình thành trong phản ứng thủy phân Trigonellin (Lang và ctv, 2008).

Nhóm chất hương, chất khoáng: hàm lượng chất khoáng chiếm 3 — 5% chủ yếulà: kali, magie, chlo, photpho, nito, nhôm, sat, đồng Trong số các khoáng chất này,hàm lượng của magie sẽ có chênh lệch đáng kê giữa các loại hat (Clarke va ctv, 2003).Người ta cũng có thé dựa vào thành phần các chất khoáng đề phân biệt được thành phandinh dưỡng đất trồng (Costa và ctv, 2010) Cà phê nhân xanh chứa hơn 200 chất bay hơi

và ít mùi thơm Quá trình rang tạo ra một lượng lớn hơn 800 các hợp chất aromatic (hợpchất tạo ra mùi hương trong cà phê) nhưng chỉ có khoảng 40 hợp chất góp phần vào mùithơm (Belitz và ctv, 2009) Các chất thơm bao gồm nhiều phân tử cầu thành như: acid,adehide, aceton, ethylic, phenol, este Các chất thơm là những chất đễ bay hơi nếukhông bao quản tốt hat cà phê sẽ bi mat mùi rất nhanh

2.3 Các dạng khiếm khuyết của hạt cà phê

khiếm khuyết SƠ cấp, còn nếu đen lốm đốm (đen 1/2 hạt, hoặc ít hơn) nó được tính làkhiếm khuyết thứ cấp Dạng khiếm khuyết này có thé gây nên mùi lên men hoặc mùihôi thối, ban, mốc, vị chua và vị phenol trong cà phê nếu không được loại bỏ.

2.3.2 Nhần chua — nau

Khuyết điểm điển hình là có mau nâu, vị chua, thậm chí có mùi hôi do lên men tùy

thuộc vào mức độ lên men của hạt cà phê Dạng khiếm khuyết này xảy ra khi hạt cà phê

bị nhiễm ban ở các giai đoạn thu hoạch và chế biến khác nhau Các nguyên nhân baogồm nhặt những quả cà phê chín quá, nhặt những quả cà phê rơi, làm ô nhiễm nướctrong quá trình chế biến và thậm chí độ âm khiến quả cà phê bị thối hoặc lên men khi

vẫn còn trên cây.

2.3.3 Vỏ khô, quả khô

Trong chế biến ướt, quả lép được sấy khô thông qua quá trình xát vỏ mà khôngloại bỏ các hạt nổi ban đầu (hạt xốp, rỗng) Quá trình sấy khô bằng không khí dẫn đến

quả ca phê bị khô do bóc vỏ va phân loại không đúng cách (do không bảo trì hoặc cai

đặt máy kém) Những lỗi lọc này có thể khiến cà phê có vị đắng, chát (và là điều kiện

lý tưởng cho nam mốc phát triển và làm hỏng mẻ cà phê) Ngoài ra, vỏ trau khô có thể

bị cháy trong quá trình rang và làm hỏng các hạt cà phê khác.

2.3.4 Nhân trắng

Nhân trắng là do bảo quản hoặc sấy khô không đúng cách Hạt nồi thường bi kẹt

ở các góc máy say, nơi phơi khiến hạt nhạt mau, và xốp (vì khô quá nhanh) Cà phê chế

biến khô có thé gây hạt nổi nếu bảo quản trong thời gian dai Nếu không được loại bỏ,mùi lên men, mùi cỏ đại, rơm ra, bụi ban và nam mốc có thé vẫn còn trong cốc ca phê.Tuy nhiên, những hương vi này không khó chịu lắm và có thé dé dàng pha loãng nếuvới một lượng nhỏ.

bị cắt xảy ra trong quá trình bóc vỏ Điêu này có thê dân dén quá trình lên men do nam

lãi

mốc phát triển và hoạt động của vi khuẩn, từ đó tạo ra nhiều mùi vị khó chịu Mặt khác,

cặn xay khô (sau khi chế biến khô) thường sạch và không có dấu hiệu oxy hóa

2.3.6 Hạt tai voi

Hat tai voi hạt bị biến dạng bao gồm các phan bên trong và bên ngoài riêng biệt(hoặc cùng nhau) và là kết quả của biến dạng ban đầu của quả cà phê Một hoặc cả haiphần của hạt tai voi có thể có trong lô hạt và trong một số trường hợp thậm chí có thểcòn tồn tại cùng nhau Phần bên ngoài có hình vỏ sò nhưng thực chất lại giống "tai voi".Phần bên trong có thé là hình nón hoặc hình trụ Hạt tai voi thường không có khiếmkhuyết về hương vị, nhưng vì chúng mỏng và nhẹ nên dé cháy và có mùi khét khi rang

2.4 Hoạt tính sinh học

2.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa là khả năng ức chế sự oxy hóa của các phân tử, các phảnứng hóa học sản sinh ra các gốc tự do (các gốc tự do tan công vào những thành phan tếbào như DNA, carbonhydrat, protein, phospho lipid gây nên những bệnh nguy hiểm).Trong tự nhiên, các chất kháng oxy hóa có được từ nhiều nguồn khác nhau nhưng thựcvật vẫn là nguồn cung cấp được quan tâm nhiều nhất Phenol thực vật là một nhóm lớn

và đa dạng, bao gồm acid cinnamic, acid benzoic, flavonoid, anthocyanin, stilben,coumarin, hợp chất lignan va lignin với các đặc tính khác nhau Trong các thử nghiệm

in vitro, phenol thực vật được biết là có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Dựa trên điềunày, người ta đã suy đoán rang phenol thực vật có thé bảo vệ DNA của tế bào và ngănngừa tôn thương gốc tự do trong cơ thé Vì các gốc tự do đóng một vai trò quan trọng

trong việc gây ra các bệnh tim mạch và ung thư, nên việc tiêu thụ polyphenol thực vật

có thé ngăn ngừa hiệu qua sự xuất hiện của các bệnh như vậy Một số chất kháng oxyhóa đã được tìm ra, chứng minh và được sử dụng hàng loạt như Vitamin A, Vitamin C,

polyphenol và flavonoid.

2.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng vi sinh vật là khả năng tiêu diệt vi sinh vat (bao gồm vi khuẩn,nắm, virus và kí sinh trùng) hoặc ức chế sự phát triển của chúng Các tác nhân giết chết

vi sinh vật được gọi là chất khử trùng — “microbicide”, trong khi các tác nhân chỉ đơn

thuần ức chế sự sinh trưởng của chúng, được gọi là chất kim hãm vi sinh vật - “biostatic”.2.4.3 Bảo vệ thần kinh

Các nghiên cứu dich té học đã chỉ ra rằng uống ca phê theo thói quen có thé làm

giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer (Martina và ctv, 2019) và lượng cà phê của bệnh

nhân nam mắc bệnh Parkinson nguyên phát có tương quan nghịch với mức độ nghiêm

trọng của chứng run (Mellbye và ctv, 2017).

2.5 Các nghiên cứu về hạt cà phê

2.5.1 Nghiên cứu trong nước

Nhiều nghiên cứu về cà phê đã được thực hiện trên thế giới cũng như tại ViệtNam Da phan, các nghiên cứu này tập trung vào vỏ và hạt ca phê xanh Ở Việt Nam,tính đến nay có rất ít bài báo khoa học viết về hạt cà phê nhân phế phẩm Năm 2022,Huỳnh Văn Chung và Đinh Thị Thanh Vy đã nghiên cứu việc chiết xuất các hợp chấtphenolic chống oxy hóa từ bã cà phê đã qua sử dụng Hiệu quả chiết tốt nhất khi sử dụngdung môi ethanol 50%, tỉ lệ nguyên liệu với dung môi thích hợp nhất là 1:40 (g/ml), ởnhiệt độ 60°C trong 45 phút, pH = 5 Hàm lượng polyphenol là 20,825 mg GAE/g chấtkhô Hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá thông qua khả năng ức chế HaO; tốt với

ICs là 313,447 pg/mL.

Nghiên cứu hoạt chất sinh học từ chất chiết cà phê xanh cho ngành dược mỹphẩm, vật liệu nano từ cà phê Robusta Đăk Lăk (Đỗ Thủy Tiên và ctv, 2023) Kết quảcho thấy chiết xuất cao thu được đạt 28,5 — 29,1% Trong chiết xuất cà phê có chưa hàmlượng chlorogenic acid đạt 6,7% và caffein 2,7% có thé ứng dụng trong các ngành được

mĩ phẩm va sản phâm bảo vệ sức khỏe Hơn nữa, đây cũng là nguồn liệu dé phát triểnchất kháng khuân hiệu quả, thân thiện môi trường ở dạng nano bạc có hoạt tính khángkhuẩn, nam phát triển các sản phẩm hoá nông được

Lâm Trịnh Diễm Ngọc và ctv, 2022 đã nghiên cứu thành phần hóa học và tácdụng chống oxy hóa của vỏ quả cà phê Nghiên cứu cho thấy vỏ quả cà phê có tiềm năngphát triển thành nguyên liệu dùng làm thuốc, đặc biệt là hướng đến phân lập các hợpchất có tính chống oxy hóa

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 2020, Kaisangsri và ctv đã nghiên cứu các hợp chất phenolic và hoạt tínhsinh học của cao chiết cà phê cho sản xuất mỹ phẩm Cao chiết hạt ca phê Robusta cótong hàm lượng phenolic 193,26 + 20,61 mg GAE/g chất khô trong khi đó cao chiết hạt

cà phê Arabica là 158,74 + 15,62 mg GAE/g chất khô Hơn nữa, cao chiết hạt cả phêRobusta còn cho thấy hoạt tính chống oxy hóa mạnh với ICso DPPH 0,131 + 0,003mg/mL so với cao chiết hạt cà phê Arabica 0,163 + 0,004 mg/mL, đối với ABTS thì ICso

13

của cà phê Robusta và Arabica thì không khác biệt quá nhiều với giá trị lần lượt là 0,361+ 0,005 mg/mL va 0,338 + 0,030 mg/mL.

Theo Ramón-Goncalves va ctv (2019) đã nghiên cứu quy trình chiết xuất đơngiản và kinh tế dé thu hồi các polyphenol có giá trị gia tăng từ các loại bã ca phê đã qua

sử dụng Việc sử dụng hỗn hợp ethanol — nước với tỷ lệ ethanol thấp từ 15 đến 20% (v),làm dung môi chiết, dé chiết các polyphenol như acid chlorogen, acid p-coumaric, acidtrans-ferulic, rutin, naringin va resveratrol Ham lượng polyphenol tông số được tìmthay dao động từ 9 — 29 mg GAE/g chất khô, hàm lượng flavonoid tổng số trong khoảng

từ 11 — 27 mg QE/g chất khô

Nghiên cứu về chlorogenic acid, hàm lượng caffeine và đặc tính chống oxy hóacủa chiết xuất cà phê xanh của Jeszka-Skowron và ctv (2016) cho thấy chiết xuất cà phêRobusta chứa lượng caffeine gấp đôi so với Arabica và hàm lượng của nó thay đổi từ3,41% trên khối lượng khô ở loại Arabica từ Lào hoặc Rwanda đến 8,16% trong cà phêRobusta từ Indonesia Hạt cà phê xanh chứa chlorogenic acid, các dẫn xuất và hàm lượng

của chúng là 3,5 — 7,5% đối với cà phê Arabica và 4,0 — 7,0% đối với cà phê Robusta

Chiết xuất cà phê Robusta cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao hơn đáng ké trong xétnghiệm Folin—Ciocalteu so với chiết xuất Arabica

Theo Masek và ctv (2020) đã nghiên cứu về đặc tính chống oxy hóa của chiết

xuất cà phê xanh Kết quả nghiên cứu chỉ ra răng sự ức chế ABTS của chiết xuất cà phênhân 4 mg/mL là 90,0 + 0,20% đối với ethanol, 92,2 + 0,19% đối với nước trong 10phút và 97,4 + 0,25% đối với nước trong 30 phút Khả năng của chiết xuất cà phê xanh

trong việc giảm gốc DPPH cũng đã được tìm thay Sự ức chế DPPH của chiết xuất cà

phê nhân 4 mg/mL là 63,9 + 0,15% đối với ethanol, 69,6 + 0,23% đối với nước trong 10

phút và 81,6 + 0,29% đối với nước trong 30 phút

Một nghiên cứu về các phương pháp phân tích ứng dụng để xác định đặc tính vàxác định các hợp chất có hoạt tính sinh học trong ca phê (Jeszka-Skowron và ctv, 2015).Kết quả nghiên cứu chi ra rang chlorogenic acid va các dẫn xuất, caffeine là những hop

chất phổ biến nhất được tìm thay trong hạt ca phê xanh, cà phê pha va cà phê hòa tan

Dé phân tích các hợp chat này, kỹ thuật HPLC-UV là thích hợp nhất mặc du việc phântách nhanh hơn khi sử dụng UHPLC Việc sử dụng kỹ thuật LC—MS cho chlorogenicacid và các dẫn xuất, đồng thời cũng có thé được sử dụng dé xác định các thành phầnchưa biết

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2023 đến tháng 12/2023 tại phòng thí nghiệm

Công nghệ sinh học thực phẩm, Trung tâm công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu: hạt cà phê nhân Robusta phế phẩm được thu mua tại ở tỉnh Dak

Lắk, Thành phố Buôn Ma Thuột

3.2.2 Dụng cụ, hóa chat, thiết bị

Các dụng cụ được sử dụng trong thí nghiệm: bình duran, bình tam giác, đầu tip,đĩa 96 giếng, eppendorf, falcon, găng tay y tế, micro pippet, túi zipper, giá eppendorf,

cốc thủy tinh, giấy loc, vial, kim tiêm

Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm: máy đọc dia Elisa (Moleular Devices),máy cô quay chân không (Buchi), máy đo quang pho UV-vis (Shimadzu), cân 4 số lẻ(Mettler Toledo), máy đông khô (Christ), bộ lọc chân không (Mercle), máy nghiền mẫu(Pháp), bể 6n nhiệt (Memmert), ân 2 số lẻ (Mettler Toledo), máy ly tâm (Mỹ), máy

HPLC (Mỹ), tủ âm 80°C (Nhat).

Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm: ABTS [2,2-azino-bis-3-ethyl

benzothiazoline-6-sulfonic acid] (Cat#30931-67-0, Biobasic), Ascorbic acid

(Cas#50-81-7, Sigma), DPPH [1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl] (Cat#1898-66-4, Sigma), Gallic

acid (Cas#144-62-7, Sigma), Potassium Persulphate [K2S2Os]| (Cat#7727-21-1, Merck), Methanol (Cat#67-56-1, Việt Nam), Sodium Carbonate [Na2CO3] (Cat#497-19-8,

TBN), Caffeine (Cas#58-08-2, Merck), Chlorogenic acid (Cas#327-97-9, Merck),

Quercetin (Cas#117-39-5, Merck), Aluminum chloride [AICH] (Cat#7784-13-6, Xilong), Sodium acetate [CHsCOONa] (Cat#6131-90-4, Merck), Ethyl acetae (Cat#141-78-6, Xilong), Toluen (Cat#108-88-3, Samchun), Ferric Chloride anhydrous [FeC1:| (Cat#7705-08-0, Xilong).

LS

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Dinh tinh va Dinh luong Danh gia hoat

dinh luong flavonoid, tinh khang oxypolyphenol caffeine va hoa

CGA )

Hình 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

3.3.1 Chiết, thu nhận cao tổng, định lượng thành phan polyphenol

3.3.1.1 Phương pháp chiết

Phương pháp thu thập và xử lý sơ bộ mẫu cà phê

Hat cà phê nhân Robusta phế phẩm được xay va ray bằng bộ sàng (ray) với kích

thước đường kính các mắt sàng mong muốn Loại bỏ hoàn toàn lớp vỏ lụa còn lại sau

khi ray dé thu mẫu Cho mẫu vao các túi có khóa kéo và bao quản ở nhiệt độ phòng.Quy trình chiết xuất cà phê

8 Bì

Hạt cà phê

Rửa sơ thiết ae

nhân phê phâm

-Hình 3.2 Sơ đồ quy trình chiết cà phê.

Thí nghiệm được tiến hành với 20 g hạt cà phê nhân phế phẩm sau khi xay, thêmdung môi vào và tiến hành dập mẫu cơ học trong 5 phút Mẫu sau khi dập tiến hành chiết

với các yêu tố được khảo sát, tiếp tục quá trình chiết thêm hai lần nữa cho đến khi chiết

kiệt mẫu Dịch chiết được ly tâm 4500 vòng/phút trong 20 phút, sau đó dịch chiết đượclọc qua máy lọc chân không Cô cạn bằng máy cô quay chân không 6 50°C dé tạo thànhcao chiết, cao chiết đặc được đông khô chân không để tạo thành dạng cao khô, phục vụcho các thí nghiệm tiếp theo

Khảo sát kích thước mẫu

Kích thước nguyên liệu là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình chiết xuất.

Mau cà phê được khảo sát ở kích thước hạt sau khi xay là: 0,1 — 1 và 1 —5 mm.

Khảo sát dung môi chiết

Dung môi được sử dụng thường xuyên nhất dé chiết xuất và phân lập các hopchất có hoạt tính sinh học Tuy nhiên, hiệu suất và chất lượng các chất chiết xuất phụthuộc nhiều vào bản chất của dung môi chiết xuất Dung môi phân cực thường được sửdụng dé thu hồi các chất có hoạt tinh sinh học có trong nguyên liệu thực vật Hỗn hợpnước với etanol, metanol, acetone và etyl acetate thông thường được lựa chọn dé nghién

cứu (Sultana va ctv, 2009) Lua chon các dung môi nên tuân theo các đặc tính phù hop

như độ phân cực, độ chọn lọc, độ hòa tan, khả năng thu hồi, nồng độ, sức căng bề mặt,

và phản ứng hóa học (Cacace và Mazza, 2003) Dung môi để khảo sát chiết được lựa

chọn dựa theo Lê Trung Khoảng va ctv (2020) có sửa đổi, sử dung dung môi ethanol

50%, ethanol 70% và nước dé tiến hành khảo sát

Khảo sát tỷ lệ mẫu với dung môi

Theo Pandey và ctv (2018) tỷ lệ dung môi với nguyên liệu thay đối sẽ làm thayđổi hiệu suất quá trình trích ly các thành phan trong nguyên liệu Nếu lượng dung môi

ít dẫn đến trích ly các chất trong nguyên liệu không hoàn toàn, trong khi lượng dungmôi lớn hơn có thê gây ra lãng phí và ô nhiễm môi trường Khi lượng dung môi tăng,

làm tăng các hoạt chat sinh học tiếp xúc với dung môi dẫn đến khả năng thẩm thấu cao

hơn Tác động chính của thay đôi ty lệ dung môi so với chat rắn là làm thay đồi độ hòatan và hằng số cân bằng, do đó làm tăng hiệu quả trích ly các chất tan có trong nguyênliệu, khi tỷ lệ dung m6i/ nguyên liệu lớn, nghĩa là sự khác biệt về nồng độ giữa dungmôi và các chất hòa tan trở nên lớn (Linh và Thủy, 2014) Do vậy, tiến hành khảo sát tỷ

17

lệ mẫu với dung môi dựa theo khảo sát của Lê Trung Khoảng và ctv (2020) có chỉnh

sửa, ở các mức tỉ lệ mẫu với dung môi lần lượt là: 1:5; 1:10 và 1:15 (w/v)

Khảo sát nhiệt độ chiết

Theo nghiên cứu của Cacace va ctv (2003) thì nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến quátrình trích ly các thành phần có trong nguyên liệu vào dung môi Nguyên nhân là nhiệt

độ trích ly tăng dẫn đến tính thâm thấu của thành tế bào cao hơn, độ hòa tan của cáchợp chất trong nguyên liệu cao hơn, dẫn đến động học của các quá trình chiết xuất

cao (Cacace và Mazza, 2003) Mặt khác, theo nhận định của Li va ctv (2006) nhiệt

độ cao sẽ làm phá vỡ liên kết giữa các chất tan với các thành phần khác trong nguyên

liệu và làm tăng hiệu quả chiết xuất (Li và ctv, 2006) Nhiệt độ chiết được sử dụng dựavào nghiên cứu cua Li va ctv (2013), có điều chỉnh Nhiệt độ ở 40°C, 60°C, 80°C và100°C được sử dụng đề chiết xuất cao tổng

Khảo sát thời gian chiết

Thời gian ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chiết xuất các chất có hoạt tính sinhhọc Nếu thời gian càng lâu thì hiệu suất chiết xuất càng cao nhưng nếu lâu quá thì cóthé làm giảm hiệu suất do các chất hoạt tinh bị biến đôi làm giảm hoạt tính sinh học, vi

dụ như các chất có trong dịch chiết xuất bị oxy hóa (Aboshora và ctv, 2014; Ksouri

và ctv, 2009) Thời gian lâu thì dung môi trích ly bị bay hơi nhiều làm tốn dung môi

trích ly Thời gian ngắn thì các chất hòa tan có trong nguyên liệu chưa khuếch tán radung môi hết Khảo sát thời gian chiết được tiến hành theo Trần Thị Thu Hà và PhạmThị Hoài Trâm (2020) có sửa đôi, thời gian chiết được khảo sát ở các mốc là: 30 phút,

60 phút và 90 phút.

Hiệu suất chiết:

trong đó: H : hiệu suất chiết (%)

a : khối lượng mẫu cao sau khi đông khô (g)

b_: khối lượng mẫu ban đầu trước khi chiết (g)

3.3.1.2 Phương pháp định tính hợp chất tự nhiên

3.3.1.2.1 Định tính bằng phương pháp nhận diện phản ứng sinh hóa

Phương pháp định tính được thực hiện theo mô tả của Jasuja (2013), Sofowora

và ctv (1993) có hiệu chỉnh Cao chiết với nồng độ 10 mg/mL được tiến hành kiểm tra

sự có mặt của các hợp chất cần định tính bằng các phản ứng sinh hoá đặc trưng

H;SO¿ đậm đặc hoặc có mảu xanh

Chỉ tiêu đánh giá: Quan sát hiện tượng màu sắc trước và sau phản ứng dé ghi nhận có hoặc

không có các hop chat tự nhiên trong cao chiết.

3.3.1.2.2 Dinh tính bằng phương pháp TLC

Nguyên tắc:

Thin Layer Chromatography (TLC) là phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng

dé tách hỗn hợp chat bằng cách cho pha động di chuyên qua pha tĩnh Pha động là một

hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau, chuyển mẫu qua vùng chứa

pha tĩnh hấp thụ Tại đây, chất cần phân tích sẽ tương tác với chất hấp thụ nhờ tính cócực của chúng Do sự tương tác này mà chất phân tích sẽ chuyền động chậm hơn trong

hệ thống sắc ký Chất phân tích có ái lực yếu hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động nhanhhơn và đạt tới khoảng cách chuyền dịch lớn hơn so với chất có ái lực cao hơn Nhờ vậy

mà các chất được phân tách trong quá trình chạy sắc ký ở các vị trí khác nhau

Quy trình:

Phương pháp định tính được thực hiện dựa theo mô tả của Nguyễn Quốc Tuấn(2012) có chỉnh sửa Say ban mong ở nhiệt độ 50°C trong thời gian 120 phút dé pha tinhkhô hoàn toàn sau đó phân bé mẫu phân tích lên ban mỏng Dung bút chi đánh dấu vạchxuất phát cách mép dưới của bản mỏng 10 mm, các vết chấm cách nhau 10 mm và cáchhai mép ngoài của bản mỏng 5 mm Cham một lượng mẫu can phân tích khoảng 1,5 uLlên bản mỏng đã được thiết kế và kết hợp sấy khô Đặt bản mỏng gần như thắng đứngvới bình triển khai có chứa pha động là hệ dung môi đã bão hòa, các vết chấm phải ởtrên bề mặt của dung môi Day kín bình và dé yên ở nhiệt độ phòng Khi dung môi đã

di chuyển một quảng đường hơn 3/4 bản mỏng, lấy ban mỏng ra khỏi bình, đánh dấu

19

điểm kết thúc bằng bút chì Làm bay hơi dung môi còn động lại trên bản mỏng rồi hiệnvết bằng phu thuốc thử dé hiện mau và hiển thị vệt tối đưới đèn UV.

Bảng 3.2 Định tính các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký bản mỏng

Định tính Chat chuẩn Pha động Thuốc thử

Phenolic Gallic acid M:EA (2:1) FeCl3 (1%)

Flavonoid Quercetin T:EA:AF (5:4:1) UV

Chi tiêu đánh giá: Quan sát quãng đường di chuyển của chất phân tích và pha động để ghi

nhận có hoặc không có các hợp chát tự nhiên trong cao chiết.

Kết quả là sắc ký đồ TLC của các hợp chất và giá trị hệ số di chuyển R; của cáchợp chất (được tính bang tỉ số giữa quãng đường di chuyên của chất cần phân tích và

quảng đường di chuyên của pha động) Hệ số R, được tính theo công thức sau:

„=5trong đó: Ry : hệ số đi chuyền

a : quãng đường di chuyến của chất cần phân tích (cm)

b_ : quãng đường di chuyển của dung môi (cm)

3.3.1.3 Phương pháp định lượng polyphenol

Nguyên tắc:

Nguyên lý định lượng dựa trên phản ứng oxy hóa — khử giữa các hợp chatpolyphenol với thuốc thử Folin — Ciocalteu (Singleton và ctv, 1999) Thuốc thử này

chứa chất oxy hóa là phospho-vonframic acid, trong quá trình khử, các nhóm hydroxy

phenol dé bi oxi hóa, chất oxi hóa này sinh ra mau xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước

sóng 765 nm Phản ứng này là do sự hình thành mau xanh của vonfarm và molypden Quy trình:

Hàm lượng polyphenol tông được xác định theo phương pháp Folin — Ciocalteu(Vương và ctv, 2013) có sửa đôi Cân 0,3 mg mẫu cao chiết cho vào 1 mL nước cat dé đạtnồng độ 300 ug/mL Tiến hành hút 0,1 mL cao chiết vào 0,5 mL thuốc thử Folin — Ciocalteu

10% Dé phản ứng trong 10 phút Sau đó thêm 0,4 mL dung dịch NazCO3 7,5% va ủ trong

bóng tối Sau 1 giờ phan ứng ở nhiệt độ phòng, đo độ hap thụ bằng máy đo quang phố

UV-vis ở bước sóng 765 nm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Đường chuẩn acid gallic được xây

dựng tương tự như trên, thay thế mẫu bằng chất chuẩn acid gallic và thực hiện phản ứng ởdãy nồng đồ 500; 250; 125; 62,5; 31,25 và 15,625 ug/mL, sau đó dựa vào đường chuẩnacid gallic để xác định hàm lượng TPC trong mẫu

Hàm lượng polyphenol tổng được tính theo công thức:

m : khối lượng cao chiết dùng định lượng (g)

Hàm lượng phenol tông theo chất khô được tính dựa trên hàm lượng phenolic tổngtheo cao chiết và hiệu suất chiết tương ứng theo công thức:

P=PxH

trong đó: P’ : hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g chất khô)

P : hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g chiết xuất)

H : hiệu suất chiết (%)

3.3.1.4 Phương pháp định lượng flavonoid

Nguyên tắc:

Hàm lượng flavonoid được xác định thông qua phản ứng màu với các muối kimloại Thường thấy nhất là các phản ứng với Al**, đây là kim loại tạo phức màu mạnh,

bền và không độc hại AI?” liên kết với nhóm ketone ở C4 và các nhóm hydroxyl liền kề

ở C5 hoặc C6 trong cau trúc của flavone hay flavanol dé tạo thành phức hợp có mau

Quy trình:

Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp tạo mau với AICI(Chang và ctv, 2002) có sửa đổi, bằng cách xây dựng chuẩn với quercetin (QE) Hàmlượng flavonoid tông được biểu diễn theo miligram đương lượng quercetin trên gramcao chiết (mg QE/g cao chiết) Cân 1 mg mau cao chiết cho vào 1 mL nước cat dé đạtnồng độ 1 mg/mL Hút 0,1 mL mẫu đã pha loãng cho vào 0,3 mL methanol và chờ trong

5 phút Sau đó, thêm tiếp 0,02 mL AICI; 10% và dé phản ứng trong 6 phút Cuối cùng,hỗn hợp được thêm 0,02 mL CH3COONa IM và 0,56 mL nước cat, lắc đều rồi dé 6nđịnh ở nhiệt độ phòng trong 45 phút Tiến hành xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang

21

phổ ở bước sóng 415 nm Đường chuẩn quercetin được xây dựng với các bước thực hiệntương tự như trên với day nồng độ 500; 250; 125; 62,5; 31,25 và 15,625 ug/mL, sau đó

dựa vào đường chuẩn quercetin dé xác định hàm lượng TFC trong mẫu

Hàm lượng flavonoid tông được tính theo công thức:

CxV

m

trong do: ham lượng flavonoid tông số (mg QE /g cao chiết)

nồng độ quercetin quy ra từ phương trình chuẩn (g/mL).thé tích dich mẫu (mL)

< m

m : khối lượng cao chiét dung dinh luong (g)

Hàm lượng flavonoid tổng theo chất khô được tính dựa trên hàm lượng flavonoidtổng theo cao chiết và hiệu suất chiết tương ứng theo công thức:

F.=txÑl

trong đó: F’ : hàm lượng flavonoid tổng (mg GAE/g chất khô)

F_: hàm lượng flavonoid tổng (mg GAE/g chiết xuất)

H : hiệu suất chiết

3.3.2 Khảo sát một số thành phần hóa học của cao chiết

3.3.2.1 Định lượng caffein bằng phương pháp HPLC

HPLC là phương pháp chia tách, trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứatrong cột là chất ran đã được phân chia dưới dạng tiéu phân hoặc một chat lỏng phủ lênmột chất mang rắn, hay một chất mang đã được biết bằng liên kết hoá học với các nhómchức hữu cơ Phương pháp được sử dụng rộng rãi vì có độ nhạy cao, khả năng địnhlượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc đễ bị phân huỷ nhiệt

Định lượng caffein thu được trong dịch chiết từ hạt cà phê nhân phế phẩm đượcchuẩn bị theo phương pháp của Pokhrel va ctv (2016) Cân 1 mg mẫu bột ca phê chovào bình tam giác 250 mL, thêm 200 mL nước cất, ủ hỗn hợp tại nhiệt độ 100°C trong

vòng 30 phút Sau đó để nguội dung dich và lọc qua giấy lọc Hút 1 mL dich lọc cho

vào bình định mức 10 mL và định mức đến vạch bằng nước HPLC Mẫu cuối cùng đượclọc qua phin lọc 0,2 im và cho vào các lo vial dé phân tích bằng hệ thống HPLC Agilent

1260, cột sắc ký pha đảo C18 150 x 4,6 mm, theo thiết kế ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Bảng thông số chạy HPLC định lượng caffeine

Thời gian phân tích: 19

Tát cả các dung dịch pha động được khử khí và lọc qua bộ lọc 0,2 um Thiết bị đã được hiệu

chuán và kiêm định chát lượng trước khi phân tích.

Xây dựng đường chuẩn caffein bằng HPLC

Tiến hành chạy thử caffein ở dãy nồng độ: 1; 5; 10; 25; 50 va 100 mg/L bangphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, đo diện tích peak Lập đường chuẩn

trong đó: x’ : hàm lượng caffeine tổng (mg GAE/g chất khô)

x : ham lượng caffeine tổng (mg GAE/g chiết xuất)

H : hiệu suất chiết

3.3.2.2 Xác định hàm lượng chlorogenic acid bằng phương pháp HPLC

Các mẫu chiết xuất cà phê nhân được chuẩn bị dé phân tích HPLC dựa trên quy

trình sau theo phương pháp của Beyene và Sabally (2013), Wanika và ctv (2010) bằng

cách cân khoảng 10 mg mẫu cho vào bình định mức 100 mL Các dung dịch được dun

nóng 100°C trong 5 phút làm nguội đến nhiệt độ phòng Mẫu được đưa vào hệ thống

23

HPLC Agilent 1260, cột sắc ký pha đảo C18 150 x 4,6 mm, thực hiện phân tích theo

thiết kế ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Bảng thông số chạy HPLC định lượng CGA

Pha động Nước: Acid acetic:Methanol (799:1:200)

: Chat chuân: Chlorogenic acid

Mau 79 z

Mau thử: Bột chiết hat cà phê

Nhiệt độ: 25°CĐầu đò: UV-vis bước sóng 278 nm

Điều kiện phân tích Tốc độ dòng: 1 mL/phút

Thể tích bơm: 10 pL

Thời gian phân tích: 30 phút

Tat ca cac dung dich pha động được khử khí và lọc qua bộ lọc 0,2 mm Thiết bị đã được hiệu

chuán và kiêm định chát lượng trước khi phân tích.

Xây dựng đường chuẩn CGA bằng HPLC

Tiến hành chạy thử CGA ở dãy nồng độ: 5; 10; 25; 50; 75 và 100 mg/L bằngphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, đo diện tích peak và lập đường chuẩn

CGA.

Đường chuẩn có dang:

y=ax+b trong đó: y : diện tích peak

x : nồng độCGA (g/mL)Hàm lượng chlorogenic acid theo chất khô được tính dựa trên hàm lượngchlorogenic acid theo cao chiết và hiệu suất chiết tương ứng theo công thức:

x= eK

trong đó: x’ : hàm lượng chlorogenic acid tổng (mg GAE/g chất khô)

x : hàm lượng chlorogenic acid tổng (mg GAE/g chiết xuất)

H : hiệu suất chiết (%)

3.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính oxy hóa

3.3.3.1 Đánh giá hoạt tính oxy hóa bằng phương pháp DPPH

Nguyên tắc:

DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bên, trong dung dich

ethanol tuyệt đối có màu tím và độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi phán ứngvới các chất có tính chéng oxy hóa, electron thừa của nguyên tử nito trong DPPH sẽ kếthợp với nguyên tử hydro từ chất có tính chống oxy hóa dé tạo thành dang hydrazinetương ứng (Diphenylpicrylhydrazine) không có gốc tự do Kết quả làm mất màu tím của

DPPH ban đầu và dung địch dần chuyển sang màu vàng (Teixeira và ctv, 2013) Cơ chế

bắt gốc tự do của DPPH được mô tả ở hình 3.3

vào eppendorf đã chứa sẵn 400 L mẫu cà phê ở các nồng độ: 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70

ug cao chiét/mL, sau đó vortex cho hỗn hợp phản ứng được trộn đều U ở nhiệt độ phòng

30 phút và trong điều kiện không có ánh sáng, sau khi ủ tiến hành đo độ hấp thụ quangphô của DPPH được đo ở bước sóng OD = 517 nm bằng máy đọc đĩa Elisa VersaMax.Giá trị mật độ quang OD biểu thị khả năng kháng oxy hóa của mẫu Đối chứng dươngtrong thí nghiệm là Ascorbic acid với dãy nồng độ khảo sát: 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5;20; 25 g/mL Mẫu blank là hỗn hợp gồm 400 pL nước cat và 400 pL DPPH 0,3 mM(Kim và ctv, 2017) Khả năng kháng oxy hóa của mẫu cao chiết được xác định dựa vàohiệu suất trung hòa sốc tự do DPPH và giá trị ICso Gia trị ICso được tính dựa trênphương trình hồi quy tuyến tinh của mẫu cà phê khảo sát

Arg = TÚC Amiutnidl ọg

máu đối chứng

trong đó: Amãuhu : mật độ quang của mâu thử

25