Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa hoạt tính ức chế enzym polyphenoloxydase của các loài rau gia vị và khả năng ứng dụng trong bảo quản lạnh tôm thẻ chân trắng

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA, HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM POLYPHENOLOXYDASE CỦA CÁC LOÀI RAU GIA VỊ VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN LẠNH TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Chủ nhiệm nhiệm vụ Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu (Ký ghi rõ họ tên) Phan Thị Anh Đào Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Đồn Kim Thành Thành phố Hồ Chí Minh- 2019 THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TP.HCM, ngày 03 tháng 06 năm 2019 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Công nghệ trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Phan Thị Anh Đào Ngày, tháng, năm sinh: 15/09/1983 Giới tính: Nữ Học hàm, học vị: TS Chức danh khoa học: Chức vụ Điện thoại: Tổ chức: (+84 -028) 37221223 Nhà riêng: Mobile: 0902373656 Fax: (+84 - 028) 38964922 E-mail: daopta@hcmute.edu.vn Tên tổ chức công tác: ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM Địa tổ chức: Võ Văn Ngân, Phường Linh Chiểu, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh Địa nhà riêng: O2, Villa Park, Bương Ông Thoàn, Phú Hữu, Quận 9, HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ quản nhiệm vụ: Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP HCM Điện thoại: (+84 -028) 37221223 E-mail: pmo@hcmute.edu.vn Fax: (+84 - 028) 38964922 Website: http://hcmute.edu.vn/ Địa chỉ: Võ Văn Ngân, Phường Linh Chiểu, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Đỗ Văn Dũng Số tài khoản: PGS.TS Đỗ Văn Dũng Kho bạc: kho bạc nhà nước Thủ Đức Tên quan chủ trì đề tài: TT Phát triển Khoa học & Công nghệ Trẻ II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 06/ năm 2018 đến tháng 6/ năm 2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng từ tháng 06/ năm 2018 đến tháng 6/ năm 2019 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng… năm… đến tháng… năm… - Lần … Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 80.000 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học : 80.000 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác : tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) Ghi (Số đề nghị toán) … c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính:triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH 47.920 600 15.910 000 Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH 47.920 600 47.920 600 47.920 600 15.910 000 15.910 000 15.910 000 16.169 16.169 .400 400 80.000 80.000 .000 000 Nguồn khác 16.169 16.169 .400 400 80.000 80.000 .000 000 - Lý thay đổi (nếu có): Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Thiết bị, máy móc mua Nhà xưởng xây dựng mới, cải tạo Kinh phí hỗ trợ cơng nghệ Chi phí lao động Theo kế hoạch Tổng NSKH Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác Nguyên vật liệu, lượng Thuê thiết bị, nhà xưởng Khác Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số TT … Số, thời gian ban hành văn Tên văn Ghi Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Chủ nhiệm Thành viên Thành viên Thành viên Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm ) Nội dung hội thảo: “Rau gia vị ứng dụng bảo quản tơm” Thời gian: 10/04/2019 Kinh phí: 12.500.000 Địa điểm: ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Nội dung hội thảo: “Rau gia vị ứng dụng bảo quản tơm” Thời gian: 10/04/2019 Kinh phí: 12.500.000 Địa điểm: ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế hoạch Thực tế đạt 02/04/201802/04/201802/05/2018 02/05/2018 -Xây dựng thuyết minh đề tài - Tổng quan tài liệu 02/05/2018Xây dựng phương pháp 02/07/2018 nghiên cứu 02/05/201802/07/2018 20/07/2018Điều chế mẫu cao chiết 20/08/2018 phục vụ cho sàng lọc 20/07/201820/08/2018 Thực thí nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa ức chế enzyme tyrosinase Thực bảo quản tôm thể chân trắng dịch trích từ loại cao chiết phù hợp Đánh giá tiêu chất lượng vi sinh, hóa sinh tơm thời gian bảo quản 2oC Công bố kết nghiên cứu 22/08/201822/10/2018 22/08/201822/10/2018 22/08/201822/10/2018 22/08/201822/10/2018 22/08/201822/10/2018 22/08/201822/10/2018 022/08/201822/10/2018 022/08/201822/10/2018 Người, quan thực Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly 22/08/201822/10/2018 22/08/201822/10/2018 22/03/201912/04/2019 22/04/201916/05/2019 Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Phan Thị Anh Đào Hồ Thị Yêu Ly Hoàng Minh Hảo Lê Hương Thảo Viết báo cáo Nghiệm thu đề tài - Lý thay đổi (nếu có): Cơng bố báo III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Đơn vị đo Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi Qui trình điều chế mẫu Qui trình cụ thể, cao ethanol, nước đơn giản hiệu ethanol, nước tách qủa chlorophyl Qui trình cụ thể, đơn giản hiệu qủa Qui trình thử hoạt tính kháng Qui trình cụ thể, oxy hóa ức chế enzyme đơn giản hiệu tyrosinase qủa Qui trình cụ thể, đơn giản hiệu qủa Qui trình bảo quản tơm Qui trình cụ thể, dịch chiết rau gia vị đơn giản hiệu qủa Qui trình cụ thể, đơn giản hiệu qủa Báo cáo phân tích Số liệu cụ thể, rõ ràng, trình bày khoa học Số liệu cụ thể, rõ ràng, trình bày khoa học - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Bài báo Bài báo Tạp chí nằm danh mục ISI Scopus Bài báo SCIE (đang phản biện) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2019 Xác nhận đăng - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số TT Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Số TT Kết Tên sản phẩm đăng ký Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ 2 Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: (Nêu rõ danh mục công nghệ mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ cơng nghệ so với khu vực giới…) Qui trình cơng nghệ sử dụng chiết xuất bảo quản đơn giản, nhằm giảm giá sản phẩm phát triển thương mại hóa Nguồn nguyên liệu phục vụ nghiên cứu an toàn, phổ biến Việt Nam b) Hiệu kinh tế xã hội: Hiện nay, nhu cầu sử dụng chất phụ gia kháng oxy hóa tự nhiên nhằm thay phụ gia thương mại lớn Rất nhiều thị trường châu Âu Pháp, Hà Lan đòi hỏi sản phẩm thủy sản Việt Nam không sử dụng phụ gia tổng hợp sodium metabisulfide Các sản phẩm tôm hấp, tôm đông lạnh, cá file, cần có phụ gia tự nhiên thay cho phụ gia tổng hợp nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm, góp phần tiếp cận nhiều thị trường khó tính, khắt khe giới (Nêu rõ hiệu làm lợi tính tiền dự kiến nhiệm vụ tạo so với sản phẩm loại thị trường…) Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra nhiệm vụ: Số TT I II III Nội dung Báo cáo tiến độ Lần Thời gian thực 05/12/2018 Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Đã hồn thành 07 nội dung đề tài … Báo cáo giám định Lần … Nghiệm thu sở …… Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) Tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn tới ban giám đốc, nhân viên thuộc chương trình vườn ươm sáng tạo khoa học cơng nghệ trẻ hỗ trợ tận tình cho thực đề tài Xin gửi lời tri ân tới thầy cô hội đồng phản biện nghiệm thu, góp ý, hướng dẫn cho tơi thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn tới bạn Thanh Trúc (kế tốn), Hồng Sơn Giang bạn trẻ khác tận tình hỗ trợ để tơi thực thủ tục đăng ký, tốn đề tài phù hợp vơi tiến độ Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới phịng khoa học cơng nghệ –trường đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp HCM hỗ trợ cho tơi nhiều q trình thực đề tài Quá trình thực đề tài vườn ươm mang lại cho nhiều kinh nghiệm nghiên cứu khoa học, xin trân trọng gửi lời tri ân xin gửi lời chúc sức khỏe, hạnh phúc tới người Trân trọng cảm ơn Chủ nhiệm đề tài: TS Phan Thị Anh Đào I MỤC LỤC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tôm thẻ chân trắng 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Phân bố đặc điểm sinh thái 1.1.3 Các tiêu đánh giá chất lượng tôm 1.1.4 Giá trị kinh tế tôm thẻ chân trắng 1.1.5 Các biến đổi tơm q trình bảo quản 1.2 Sự biến đen 1.2.1 Sắc tố đen (melanosis) 1.2.2 Cơ chế tượng biến đen 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển melanosis động vật giáp xác 10 1.3 Tổng quan enzyme polyphenoloxidase 11 1.3.1 Khái niệm 11 1.3.2 Nguồn thu nhận 11 1.3.3 Phân loại chức 11 1.3.4 Đặc điểm PPO tôm thẻ chân trắng 12 1.4 Các phương pháp bảo quản tôm 13 1.4.1 Ướp lạnh 13 1.4.2 Lạnh đông 13 1.4.3 Sử dụng chất bảo quản 13 1.5 Tổng quan rau răm 15 1.5.1 Đặc điểm thực vật học 15 1.5.2 Phân loại khoa học 15 1.5.3 Phân bố sinh thái 16 1.5.4 Thành phần hóa học 16 1.6 Tình hình nghiên cứu chất kháng oxy hóa tự nhiên 16 1.6.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 16 1.6.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 1.7 Định hướng điểm nghiên cứu 19 1.7.1 Định hướng nghiên cứu 19 1.7.2 Điểm nghiên cứu 20 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 II Fluprednidene acetate 432,1961 C24H29FO6 500,1829 C25H31F3O5S 432,196 C24H29FO6 198,0511 C9H10O5 Fluticasone 10 propionate Fluprednidene acetate Vanillin mandelic acid 11 Isoquercetin 464,0911 C21H20O12 12 Astragalin 448,0964 C21H20O11 XIX 13 Cefatrizine 462,0765 C18H18N6O5S2 14 Brovincamine 432,1017 C21H25BrN2O3 15 Cloxestradiol 418,0862 C20H25Cl3O3 16 Spironolactone 416,2007 C24H32O4S 17 Morin 302,0398 C15H10O7 XX 18 Azelaic acid 188,1031 C9H16O4 19 Fisetin 286,0451 C15H10O6 153,0415 C7H7NO3 224,1029 C12H16O4 244,1918 C16H24N2 520 Aminosalicylic acid 21 Fepentolic acid DPT / N,N22 Dipropyltrypta mine XXI 23 24 25 Zimelidine Trinexapacethyl Oxonazine 316,0551 C16H17BrN2 252,0974 C13H16O5 222,1239 C9H14N6O 194,0925 C11H14O3 Butyl 426 hydroxybenzoa te (Butylparaben) 27 Usnic acid 344,0862 C18H16O7 28 Embelin 294,1802 C17H26O4 XXII 29 BOH 195,088 C10H13NO3 30 Lotucaine 291,2169 C18H29NO2 251,15 C14H21NO3 284,2688 C18H36O2 MAL / 31 Methallylescali ne 32 33 Stearic acid (TST) Oseltamivir 312,2062 C16H28N2O4 XXIII 34 35 36 Suxemerid Butyl 4aminobenzoate Gemfibrozil 424,33 C24H44N2O4 193,11757 C11H15NO2 250,15744 C15H22O3 XXIV Phụ lục 9: Qui trình điều chế mẫu cao ethanol, nước ethanol, nước tách chlorophyll Sơ đồ quy trình Rau gia vị Xử lý sơ Sấy Nghiền Dung mơi Trích ly Lọc Bã Cơ quay Sấy Cao Thuyết minh quy trình  Xử lý sơ bộ: Các loại rau gia vị sau mua loại bỏ cuống, thân, rễ sau rửa để  Sấy: Rau (100-200g) dàn sấy 60oC (nhiệt độ vừa đủ để không làm ảnh hưởng đến thành phần kháng oxy hóa) Trong q trình sấy thường xuyên đảo trộn để tránh tượng hầm rau Thời gian sấy phụ thuộc vào loại  Nghiền: Rau sau sấy khô nghiền mịn thành bột, q trình nhằm mục đích hỗ trợ cho q trình trích ly  Trích ly: Bột loại rau gia vị đem trích ly với 100ml dung môi 6h 60°C cao EtOH 80°C cao nước hệ thống Soxhlet  Lọc: sử dụng giấy lọc nhằm loại bỏ cặn khơng hịa tan, thu dịch trích chuẩn bị cho q trình quay  Cơ quay: Dịch chiết cô quay chân không 60oC/80oC 30 phút Nhằm mục đích loại bỏ dung mơi thu hồi cao trích, lúc cao trích trạng thái nhão (paste) chưa loại bỏ hồn tồn dung mơi XXV  Sấy: Cao trích dàn đĩa petri sấy khô 60oC 12 giờ, đến dung môi hoàn toàn bay  Lượng bột thu mẫu cao cần điều chế bảo quản hũ bi đậy kín nắp bọc giấy bạc bên để tránh ánh sáng Đối với mẫu cao EtOH cao nước loại diệp lục, trước trích ly tiến hành loại diệp lục cách ngâm mẫu bột gói giấy lọc 400-500ml Acetone 90% 48°C 4-5 ngày (tùy vào loại rau) Sau loại bỏ Acetone phương pháp bay nhiệt độ phịng Thu suất q trình trích ly tính theo cơng thức: %= ộ × 100 (2.1) mcao - khối lượng cao thu sau loại bỏ hồn tồn dung mơi (g) mbột – khối lượng bột rau gia vị trích ly (g) XXVI Phụ lục 10: Qui trình thử hoạt tính kháng oxy hóa ức chế enzyme tyrosinase  Xác định hoạt tính ức chế gốc tự DPPH Nguyên tắc DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) gốc tự bền dung dịch có màu tím bước sóng cực đại hấp thu 517nm Các chất có khả kháng oxy hóa trung hịa gốc DPPH cách cho hydro, làm giảm độ hấp thụ bước sóng cực đại màu dung dịch phản ứng nhạt dần chuyển từ tím sang vàng Phản ứng trung hòa gốc DPPH chất kháng oxy hóa minh họa hình N N + N O 2N AH + NH NO O 2N Chất kháng oxi hoá NO NO2 NO2 DPPHH DPPH Chuẩn bị hóa chất Dung dịch DPPH 100µM, dung dịch làm việc mẫu cao có nồng độ 500µg/mL, dung dịch EtOH 95% Sơ đồ quy trình V1 (μL) mẫu V2 (μL) Ethanol Phối trộn Ủ Đo độ hấp thu quang Thuyết minh quy trình XXVII DPPH A Mỗi mẫu ban đầu thử nồng độ khác nhau: 100; 50; 25; 10µg/mL Mỗi nồng độ lặp lại lần Nếu hoạt tính mẫu thử mạnh ta thử tiếp nồng độ thấp 10; 5; 2; 1µg/mL để tìm I%  Phối trộn: Lấy V2 (µL) EtOH 95% thêm vào V1 (µL) mẫu có nồng độ 500µg/mL 1500µL dung dịch thêm tiếp 1500µL DPPH 100µM  Ủ: Để yên hỗn hợp 30 phút nhiệt độ phịng bóng tối  Đo độ hấp thu: đo độ hấp thụ bước sóng 519nm máy đo quang phổ hồng ngoại khả kiến Các mẫu control nồng độ chuẩn bị tương tự thay mẫu EtOH Tương ứng với nồng độ mẫu thử ta chuẩn bị mẫu blank Mẫu trắng tương tự mẫu thử thay DPPH EtOH Để có sở đánh giá hoạt tính mẫu cao khảo sát sử dụng acid gallic làm chất đối chứng dương chất có hoạt tính ức chế gốc tự DPPH mạnh Khả kháng oxy hóa tính dựa phần trăm ức chế (I%) (%) = × 100% Trong đó: AC - Gía trị mật độ quang dung dịch khơng có mẫu cao (control) AS - Gía trị mật độ quang dung dịch có mẫu cao (sample) Mẫu control: thay V1 (µL) V2 (µL) EtOH Mẫu blank: Được chuẩn bị tương tự mẫu sample ta thay VDPPH VEtOH Xác định IC50 IC50 giá trị dùng để đánh giá khả ức chế mạnh hay yếu mẫu cao IC50 định nghĩa nồng độ mẫu mà ức chế 50% gốc tự enzyme Mẫu có hoạt tính cao giá trị IC50 thấp Tiến hành khảo sát hoạt tính mẫu nồng độ 100; 50; 25; 10µg/mL Với mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ vẽ đường thẳng = + qua tất điểm (với y % ức chế x nồng độ) Với mẫu có hoạt tính khơng biến thiên tuyến tính với nồng độ cách gần chọn nồng độ ức chế 50% tiến hành vẽ đường thẳng = + ta thu phương trình = + XXVIII với hệ số a b biết Thay = 50% vào phương trình ta thu giá trị x Đó nồng độ ức chế 50% gốc tự (IC50)  Xác định khả khử cao trích Sơ đồ quy trình Cao trích Đệm phosphate Khuấy K3[Fe(CN)6]) 1% Ủ TCA 10% Khuấy trộn Ly tâm lần Nước cất Phối trộn FeCl3 Đo độ hấp thụ Thuyết minh quy trình  Khuấy đều: Cao trích (0,1; 0,5 1,0mg) phối trộn với 1,0mL đệm phosphate 2,0M pH 6,6 1,0mL potassium hexacyanoferrate (K3[Fe(CN)6]) 1%  Ủ: Hỗn hợp ủ 50ºC 20 phút;  Khuấy trộn: bổ sung thêm 1,0mL acid trichloroacetic (TCA) 10%  Ly tâm lần 1: tiến hành ly tâm 2000rcf 10 phút Thu 1,0mL lớp lên phía dung dịch  Phối trộn: dung dịch thu phối trộn với 1,0mL nước cất 0,2mL ferric chloride (FeCl3) 0,1%;  Đo độ hấp thụ: đo bước sóng 700nm Sự gia tăng độ hấp thụ cho thấy gia tăng đặc tính khử XXIX  Xác định hoạt tính ức chế enzyme polyphenoloxidase Hoạt tính ức chế enzym polyphenoloxidase (tyrosinase) xác định việc sử dụng L-DOPA theo phương pháp Nirmal, 2009b Nguyên tắc Trong môi trường đệm pH=6,8, enzym polyphenoloxidase chuyển hóa L-DOPA thành DOPAchrom có màu đỏ cam có độ hấp thu cực đại bước sóng λmax= 475 nm (Hình 2.2) Các mẫu khảo sát hoạt tính ức chế enzym polyphenoloxidase làm giảm họat tính xúc tác enzym dẫn đến cường độ màu bị giảm L-DOPA DOPAchrom λmax= 475 nm Sơ đồ quy trình V2 L đệm pH 6,8 V1 L mẫu V3 L enzyme Ủ 30 phút V4 L dd L-DOPA Lắc đợi phút Đo quang 475 nm Thuyết minh quy trình Mẫu hịa tan dung dịch đệm pH 6,8, cho 100 L thể tích enzym polyphenoloxidase 300 U ml-1 ủ 30 phút nhiệt độ phòng Sau ủ, cho thêm 1000 XXX L chất L-DOPA (1,5 mM) lắc đợi lên màu phút Sau đem dung dịch đo quang bước sóng = 475 nm (sơ đồ 2.3) Thể tích dung dịch lấy theo bảng Tổng thể tích dung dịch 3000 μL Các mẫu dung dịch blank cho enzym mà không cho chất nền, mà thay lượng đệm tương ứng Mỗi mẫu ban đầu (chất tinh khiết) thử nồng độ khác nhau: 100; 50; 25; 10 µM Mỗi nồng độ tiến hành lần, ứng với nồng độ ta tính b giá trị phần trăm ức chế (I%) Lấy trung bình giá trị I % từ ta xác định giá trị phần trăm ức chế ứng với nồng độ khảo sát Nếu hoạt tính mẫu thử