Khảo sát hoạt tính ức chế enzym alpha amylase của loài mật gấu trâm bầu và ngọc nữ biển phía nam

BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ THƯỜNG XUYÊN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ALPHA AMYLASE CỦA LOÀI MẬT GẤU, TRÂM BẦU VÀ NGỌC NỮ BIỂN PHÍA NAM Chủ nhiệm nhiệm vụ CN Lý Hải Triều Đơn vị Trung tâm Sâm Dược liệu Tp Hồ Chí Minh Thời gian thực 12/2016 đến 11/2017 Tp Hồ Chí Minh – 11/2017 BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ THƯỜNG XUYÊN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ALPHA AMYLASE CỦA LOÀI MẬT GẤU, TRÂM BẦU VÀ NGỌC NỮ BIỂN PHÍA NAM CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ TRƯỞNG ĐƠN VỊ VIỆN DƯỢC LIỆU Tp Hồ Chí Minh, 11/2017 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÝ HIỆU VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG .ii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ iii TÓM TẮT iv SUMMARY v PHẦN A: CÁC THÔNG TIN CHUNG vi I TĨM TẮT NỘI DUNG, CƠNG VIỆC CHỦ YẾU ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC vi II CÁC SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI vii 2.1 Kết nghiên cứu vii 2.2 Hình thức, cấp độ cơng bố kết viii III TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ viii PHẦN B: NỘI DUNG BÁO CÁO TỔNG KẾT .ix MỞ ĐẦU ix CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Mật gấu (Vernonia amygdalina Del.) 1.1.1.Giới thiệu chung 1.1.2.Một số nghiên cứu giới 1.2 Tổng quan Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kuz.) 1.2.1.Giới thiệu chung 1.2.2.Một số nghiên cứu giới 1.3 Tổng quan Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme (L.) Gaertn.) 1.3.1.Giới thiệu chung 1.3.2.Một số nghiên cứu giới 1.4 Tổng quan enzym α-amylase 1.4.1.Giới thiệu chung 1.4.2.Cơ chế tác dụng enzym α-amylase phản ứng thủy phân 1.4.3.Một số yếu tố liên quan đến động học phản ứng enzym 10 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nguyên vật liệu 13 2.1.1.Nguyên liệu 13 2.1.2.Thiết bị, dụng cụ hóa chất 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1.Chiết xuất dược liệu [3, 5] 15 2.2.2.Chuẩn hóa quy trình đánh giá tác động ức chế enzym α-amylase in vitro 18 2.2.3.Đánh giá kết 21 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Hiệu suất chiết xuất dược liệu 22 3.2 Tối ưu quy trình khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-amylase in vitro 25 3.3 Khảo sát tác động ức chế enzym α-amylase in vitro 30 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÝ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ANS 3-amino,5-nitrosalicylic acid Acid 3-amino,5-nitrosalicylic BuOH Buthanol Butanol Ca Calcium Canxi DNSA 3,5-dinitrosalicylic acid Acid 3,5-dinitrosalicylic EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat IC50 Half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế trung bình NaCl Sodium chloride Natri clorua OD Optical Density Mật độ quang UV-Vis Ultraviolet-visible Tử ngoại-khả kiến i DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách thiết bị, dụng cụ hóa chất, thuốc thử sử dụng nghiên cứu 13 Bảng 3.1 Các thông số chuẩn hóa quy trình dãy giá trị tương ứng 20 Bảng 3.2 Hiệu suất chiết cao toàn phần 22 Bảng 3.3 Tỷ lệ ức chế enzym α-amylase cao chiết Mật gấu 30 Bảng 3.4 Tỷ lệ ức chế enzym α-amylase cao chiết Trâm bầu 31 Bảng 3.5 Tỷ lệ ức chế enzym α-amylase cao chiết Ngọc nữ biển 31 Bảng 3.6 Phương trình hồi quy tuyến tính cao chiết từ lồi dược liệu 32 Bảng 3.7 Tỷ lệ ức chế α-amylase acarbose nồng độ khảo sát 32 Bảng 3.8 Giá trị IC50 loại cao chiết enzym α-amylase 32 ii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cây Mật gấu (Vernonia amygdalina) Hình 1.2 Cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare) Hình 1.3 Cây Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme) Hình 1.4 Cấu trúc sinh học enzym α-amylase Hình 1.5 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất 11 Hình 1.6 Sự phụ thuộc vận tốc phản ứng vào nồng độ enzym 11 Hình 1.7 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ enzym 12 Hình 2.1 Bột khô Mật gấu (trái); Trâm bầu (giữa); Ngọc nữ biển (phải) 13 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần từ dược liệu 17 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao phân đoạn từ dược liệu 18 Hình 3.1 Hiệu suất trích ly cao toàn phần cao phân đoạn Mật gấu 23 Hình 3.2 Hiệu suất trích ly cao toàn phần cao phân đoạn Trâm bầu 24 Hình 3.3 Hiệu suất trích ly cao tồn phần cao phân đoạn Ngọc nữ biển 25 Hình 3.4 Tương quan độ hấp thu (ΔOD) với yếu tố nồng độ chất (a), nồng độ enzym (b), pH (c), nhiệt độ (d), thời gian hoạt hóa enzym (e), thời gian phản ứng (f) 29 Hình 3.5 Giá trị IC50 loại cao chiết enzym α-amylase 33 iii TÓM TẮT Bệnh đái tháo đường gia tăng ngày nhanh chóng giới gây gánh nặng lớn cho xã hội Ước tính có đến 90% số bệnh nhân mắc bệnh đái tháo thuộc đái đường tuýp Việc kiểm soát glucose máu lúc đói glucose máu sau ăn trọng Trong đó, tăng glucose máu sau ăn yếu tố quan trọng kiểm soát cách ức chế enzym tiêu hóa tinh bột (α-amylase) và/hoặc hấp thu glucose (αglucosidase) Nghiên cứu tiến hành chuẩn hóa quy trình khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-amylase phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm đánh giá hiệu ức chế enzym α-amylase in vitro cao chiết từ loài thảo dược Kết cho thấy tất cao chiết từ Mật gấu (Vernonia amygdalina Del.), Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kuz.) Ngọc nữ biển (Clerodendrum inerme (L.) Gaertn.) có hoạt tính ức chế α-amylase thể qua giá trị IC50 Giá trị IC50 chiết toàn phần, cao n-hexan, cao chloroform, cao ethyl acetat, cao n-butanol, cao nước từ Mật gấu 18,49 µg/ml, 65,98 µg/ml, 13,58 µg/ml, 102,22 µg/ml, 55,45 µg/ml, 73,98 µg/ml; cao chiết từ Trâm bầu 169,52 µg/ml, 81,09 µg/ml, 594,76 µg/ml, 243,44 µg/ml, 173,33 µg/ml, 205,11 µg/ml; cao chiết từ Ngọc nữ biển 51,72 µg/ml, 44,13 µg/ml, 37,72 µg/ml, 45,50 µg/ml, 51,08 µg/ml, 53,85 µg/ml Trong đó, giá trị IC50 acarbose 214,78 µg/ml Kết nghiên cứu chứng minh hoạt chất dược liệu Mật gấu, Trâm bầu Ngọc nữ biển ức chế enzym α-amylase in vitro Từ kết cho thấy loài dược liệu sử dụng kiểm sốt đường huyết sau bữa ăn, hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường iv SUMMARY The rapid increase of diabetes mellitus world-wide have put enormous burden on the society Approximately 90% of diabetic patients are of type diabetes The control of blood glucose levels not only when being hungry but after eating is taken into consideration Therein, the growth of blood glucose levels after ingestion is an important factor and regulated by the inhibition of starch-digesting enzyme (αamylase), and/or the absorption of glucose (α-glucosidase) This study is to optimize the investigation process of α-amylase inhibitory activity in vitro in laboratory conditions and to evaluate the inhibition efficiency of α-amylase in vitro of the extracts from three types of herbs The results showed that all of the leaves extracts from Vernonia amygdalina Del., Combretum quadrangulare Kuz and Clerodendrum inerme (L.) Gaertn exhibited α-amylase inhibitory activity through the IC50 value The IC50 values of the crude extracts and the fractions extracted by employing n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-buthanol and water from the leaves of Vernonia amygdalina Del were 18,49 µg/ml, 65,98 µg/ml, 13,58 µg/ml, 102,22 µg/ml, 55,45 µg/ml, 73,98 µg/ml respectively Those extracted from the leaves of Combretum quadrangulare Kuz were 169,52 µg/ml, 81,09 µg/ml, 594,76 µg/ml, 243,44 µg/ml, 173,33 µg/ml, 205,11 µg/ml; and from the leaves of Clerodendrum inerme (L.) Gaertn were 51,72 µg/ml, 44,13 µg/ml, 37,72 µg/ml, 45,50 µg/ml, 51,08 µg/ml, 53,85 µg/ml, sequentially While, the IC50 value of acarbose was 214,78 µg/ml The results demonstrated that active elements in Combretum quadrangulare Kuz., Vernonia amygdalina Del., and Clerodendrum inerme (L.) Gaertn inhibited α-amylase activity in vitro That presents these three types of herbs studied are potentially employed in the control the blood glucose levels after eating to support the diabetes treatment v PHẦN A: CÁC THƠNG TIN CHUNG TĨM TẮT NỘI DUNG, CÔNG VIỆC CHỦ YẾU ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC I STT Nội dung Sản phẩm phải đạt Sản phẩm theo kế hoạch đạt Đủ số lượng nguyên Đủ Thu thập sơ chế nguyên liệu Đánh giá lượng số liệu nghiên cứu nguyên liệu nghiên đạt yêu cầu “mất cứu đạt yêu cầu Đạt khối lượng làm “mất khối lượng khô” làm khô” 03 loại cao tổng Chiết cao tổng 03 loại cao tổng 15 cao phân đoạn cao phân đoạn 15 cao phân đoạn đủ số lượng nghiên Đạt cứu Chuẩn hóa phương Chọn giá trị tối pháp thử hoạt tính ưu thơng số: enzym α- nồng độ enzym, amylase cao chất, nhiệt độ, pH chiết từ dược liệu phản ứng Chọn giá trị tối ưu cho thơng số quy Đạt trình Khảo sát hoạt tính ức chế α-amylase Chỉ số ức chế Chỉ số ức chế của cao chiết từ cao chiết từ 03 cao chiết từ 03 Mật gấu, Trâm bầu loài dược liệu Đạt loại dược liệu Ngọc nữ biển vi Dịch enzym α-amylase 1U/ml: Cân 2,5 mg α-amylase hòa tan ml dung dịch đệm, thêm dung dịch đệm vừa đủ ml Dung dịch tinh bột 1%: Cân 0,1 g tinh bột pha 10 ml dung dịch đệm Pha NaOH 2M: Cân g NaOH pha 25 ml nước cất hai lần Thuốc thử DNSA: Cân g DNSA pha 20 ml NaOH 2M, thêm 30 g potassium sodium tartrate, thêm nước cất hai lần vừa đủ 100 ml Thuốc thử pha bảo quản tránh sáng, nhiệt độ phịng sử dụng tháng Dịch thử nghiệm pha DMSO 10% Thực Phản ứng ức chế thủy phân tinh bột enzym α-amylase cao chiết thực theo phương pháp mô tả Unnikrishnan cộng (2015) tối ưu điều kiện phịng thí nghiệm sau: hỗn hợp phản ứng dung dịch đệm natri phosphat 0,02M có chứa NaCl 6mM (pH 6.9), bao gồm 250 µl dịch chiết thuốc đối chiếu 250 µl dung dịch đệm có chứa enzym α-amylase U/ml Hỗn hợp ủ 15 phút 37 oC, sau 250 µl tinh bột 1% thêm vào Hỗn hợp phản ứng sau ủ 20 phút 37 °C, thêm 500 µl thuốc thử DNSA, tiếp tục đun sôi hỗn hợp phản ứng phút để nguội đến nhiệt độ phòng Hỗn hợp phản ứng đo máy đo quang phổ bước sóng 540 nm Mẫu đối chứng dương thực thuốc acarbose Xác định giá trị IC50 để đánh giá khả ức chế mẫu Hoạt tính (% ức chế) mẫu thử tính theo cơng thức: 𝐼 (%) = (𝐴𝑐 − 𝐴0𝑐 ) − (𝐴𝑡 − 𝐴0t ) × 100 (𝐴𝑐 − 𝐴0𝑐 ) Trong đó: I: phần trăm ức chế enzym α-amylase Ac: Độ hấp thụ quang (ĐHTQ) mẫu chứng (có enzym, khơng có chất thử) A0c: ĐHTQ mẫu trắng chứng (khơng có enzym, khơng có chất thử) At: ĐHTQ mẫu thử (có enzym, có chất thử) A0t: ĐHTQ mẫu trắng thử (khơng có enzym, có chất thử) Hình Bể siêu âm Sonorex RK-1028H (trái), máy đo quang UV – Vis Beckman (giữa), bể điều nhiệt DK-8D (phải) BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU NHIỆM VỤ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP VIỆN TÊN NHIỆM VỤ: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ALPHA AMYLASE CỦA LOÀI MẬT GẤU, TRÂM BẦU VÀ NGỌC NỮ BIỂN PHÍA NAM PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘ ENZYM ΑPHA AMYLASE IN VITRO Chủ nhiệm nhiệm vụ: CN Lý Hải Triều Đơn vị: Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM Thời gian thực hiện: 12/2016-11/2017 Tp Hồ Chí Minh, 2017 TỔNG QUAN VỀ ENZYM APHA AMYLASE 1.1 Giới thiệu chung Enzym α-amylase protein có trọng lượng phân tử thấp, thường nằm khoảng 50.000 đến 60.000 Dal Đây enzym quan trọng hệ thống tiêu hóa xúc tác bước thủy phân tinh bột tạo hỗn hợp oligosaccharid ngắn maltose, maltotriose số oligoglucan thông qua việc cắt liên kết α-1,4 glycosid nằm phía phân tử chất (tinh bột hay glycogen) cách ngẫu nhiên Trong thể người hầu hết động vật có vú dạng chủ yếu amylase α-amylase Ở người αamylase có nước bọt dịch tụy Hình Cấu trúc sinh học enzym α-amylase α-amylase từ nguồn khác thực vật, động vật hay vi sinh vật có thành phần acid amin khác α-amylase protein giàu tyrosin, tryptophan, acid glutamic aspartic Trong đó, acid glutamic aspartic chiếm khoảng 25% tổng lượng acid amin cấu thành nên phân tử enzym α-amylase có methionin có khoảng - 10 gốc cystein Protein α-amylase có tính acid yếu, điểm đẳng điện nằm vùng pH 4,2 - 5,7 Amylase dễ tan nước, dung dịch muối rượu loãng α-amylase metaloenzym, phân tử α-amylase có chứa 1-30 nguyên tử gram Ca/mol Canxi tham gia vào hình thành ổn định cấu trúc bậc enzym, trì hoạt động enzym Do đó, canxi cịn có vai trị trì tồn enzym bị tác động tác nhân gây biến tính tác động enzym phân giải protein Tuy nhiên, hầu hết enzym α-amylase bền với tác động protease pepsin, trypsin, papain,… Nhưng phân tử α-amylase bị loại bỏ hết canxi hồn tồn bị hết khả thủy phân chất Đặc tính bền với nhiệt độ enzym α-amylase enzym khác liên quan đến hàm lượng Ca phân tử nồng độ Mg2+ Các amylase nói chung bị kiềm hãm kim loại nặng Cu2+, Ag+, Hg+ Điều kiện hoạt động αamylase từ nguồn khác thường không giống nhau, chúng tường bị ảnh hưởng yếu tố chất, pH môi trường, nhiệt độ 1.2 Cơ chế tác dụng enzym α-amylase phản ứng thủy phân Quá trình thủy phân tinh bột α-amylase trình đa giai đoạn Giai đoạn dextrin hóa, số phân tử chất bị thủy phân tạo thành lượng lớn dextrin phân tử thấp (αdextrin), độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose amylopectin bị dịch hóa nhanh) Giai đoạn đường hóa, dextrin phân tử thấp bị thủy phân tạo tetra-trimaltose không cho màu với iodin Các chất bị thủy phân chậm α-amylase disaccharid monosaccharid Dưới tác dụng α-amylase, amylose bị phân giải nhanh thành oligosaccharid gồm - gốc glucose Sau đó, polyglucose bị phân cách tiếp tục tạo mạch polyglucose colagen ngắn dần bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose maltose Qua thời gian sản phẩm thủy phân amylose chứa 13% glucose 87% maltose Tác dụng α-amylase lên amylopectin xảy tương tự không phân cắt liên kết α-1,6-glycosid mạch nhánh phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu sản phẩm cuối cùng, ngồi đường nói (72% maltose 19% glucose) cịn có dextrin phân tử thấp isomaltose 8% Tóm lại, tác dụng α-amylase, tinh bột chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase thủy phân tinh bột thành chủ yếu dextrin phân tử thấp không cho màu với iodin maltose Khả dextrin hóa cao α-amylase tính chất đặc trưng Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘ ENZYM ALPHA AMYLASE IN VITRO Nguyên tắc Hoạt tính enzym α-amylase biểu thị khả enzym amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin 37 oC thể số đơn vị enzym g mẫu Đường tạo α-amylase phản ứng với DNSA (3,5-dinitrosalicylic acid) tạo thành ANS (3-amino,5-nitrosalicylic acid) hấp thụ bước sóng 540 nm 3,5-dinitrosalicylic acid 3-amino,5-nitrosalicylic acid Thực Phản ứng ức chế thủy phân tinh bột enzym α-amylase cao chiết thực theo phương pháp mô tả Unnikrishnan cộng (2015) tối ưu điều kiện phịng thí nghiệm sau: hỗn hợp phản ứng dung dịch đệm natri phosphat 0,02M có chứa NaCl 6mM (pH 6.9), bao gồm 250 µl dịch chiết thuốc đối chiếu 250 µl dung dịch đệm có chứa enzym α-amylase U/ml Hỗn hợp ủ 15 phút 37 oC, sau 250 µl tinh bột 1% thêm vào Hỗn hợp phản ứng sau ủ 20 phút 37 °C, thêm 500 µl thuốc thử DNSA, tiếp tục đun sôi hỗn hợp phản ứng phút để nguội đến nhiệt độ phòng Hỗn hợp phản ứng đo máy đo quang phổ bước sóng 540 nm Mẫu đối chứng dương thực thuốc acarbose Xác định giá trị IC50 để đánh giá khả ức chế mẫu Hoạt tính (% ức chế) mẫu thử tính theo công thức: 𝐼 (%) = (𝐴𝑐 − 𝐴0𝑐 ) − (𝐴𝑡 − 𝐴0t ) × 100 (𝐴𝑐 − 𝐴0𝑐 ) Trong đó: I: phần trăm ức chế enzym α-amylase Ac: Độ hấp thụ quang (ĐHTQ) mẫu chứng (có enzym, khơng có chất thử) A0c: ĐHTQ mẫu trắng chứng (khơng có enzym, khơng có chất thử) At: ĐHTQ mẫu thử (có enzym, có chất thử) A0t: ĐHTQ mẫu trắng thử (khơng có enzym, có chất thử) BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU NHIỆM VỤ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP VIỆN TÊN NHIỆM VỤ: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ALPHA AMYLASE CỦA LỒI MẬT GẤU, TRÂM BẦU VÀ NGỌC NỮ BIỂN PHÍA NAM CÁC BẢNG SỐ LIỆU VỀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ALPHA AMYLASE CỦA CÁC CAO CHIẾT Chủ nhiệm nhiệm vụ: CN Lý Hải Triều Đơn vị: Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM Thời gian thực hiện: 12/2016-11/2017 Tp Hồ Chí Minh, 2017 Khả ức chế enzym α-amylase cao Mật gấu trình bày Bảng Ở nồng độ 20 µg/ml 40 µg/ml, cao chiết toàn phần cao chloroform thể hoạt tính cao rõ rệt so với cao chiết khác với phần trăm ức chế cao toàn phần 50,84% 61,97%; cao chloroform 60,25% 71,30%, gấp khoảng 2-3 lần cao chiết lại Bảng Tỷ lệ ức chế enzym α-amylase cao chiết Mật gấu Cao chiết Nồng độ phản ứng(µg/ml) Cao T Cao C Nồng độ phản ứng(µg/ml) Cao H Cao E Cao B Cao N Tỷ lệ ức chế α-amylase (%) 10 38,63± 0,40 29,50±0,70 43,00± 0,40 45,22± 0,34 20 20 40 50,84± 0,30 60,25±3,08 61,97± 0,70 71,30±2,05 60 80 100 46,10± 0,45 34,27±0,37 54,99±0,39 45,30 ± 0,19 56,61±0,45 41,74±0,49 64,20 ±1,56 51,81 ± 0,93 71,32±0,75 48,71±2,20 73,67 ± 0,39 60,93 ± 0,37 40 24,92± 3,30 17,87±3,06 29,44±0,52 26,42 ± 0,65 33,93 ±0,30 27,54±1,22 40,47±2,20 36,28 ± 0,84 60 74,08± 0,10 73,80 ±2,73 Kết cho thấy, cao chiết Trâm bầu thể hoạt tính ức chế enzym α-amylase phụ thuộc nồng độ (Bảng 2) Tỷ lệ ức chế nồng độ 400 µg/ml cao phân cực n-butanol đạt giá trị cao (83,97%) Trong đó, nồng độ thấp (20 µg/ml) tỷ lệ ức chế cao không phân cực n-hexan cao (41,87%) Bảng Tỷ lệ ức chế enzym α-amylase cao chiết Trâm bầu Cao chiết Nồng độ phản ứng (µg/ml) Cao T Cao H Cao C Cao E Cao B Cao N Tỷ lệ ức chế α-amylase (%) 20 100 200 31,90 ± 0,23 41,87 ± 2,63 13,86 ± 0,27 17,16 ± 0,35 22,29 ± 2,60 12,06 ± 2,55 44,49 ± 0,57 52,39 ± 1,20 19,25 ± 0,27 23,97 ± 6,93 43,36 ± 3,82 33,19 ± 2,98 54,37± 0,68 65,63 ± 5,34 24,90 ± 0,27 41,01 ± 0,71 56,18 ± 0,15 56,17 ± 0,14 300 65,38 ± 0,57 71,37 ± 4,39 30,55 ± 0,81 58,40 ± 1,18 68,40 ± 5,34 69,79 ± 0,71 400 72,19 ± 0,11 81,26 ± 1,04 38,49 ± 1,75 78,26 ± 0,35 83,97 ± 0,76 77,87 ± 7,09 Đối với cao chiết từ Ngọc nữ biển, hiệu ức chế enzym α-amylase phụ thuộc vào nồng độ (Bảng 3) Khơng có khác biệt đáng kể khả ức chế enzym α-amylase cao chiết nồng độ 60 µg/ml cụ thể cao chloroform (70,63%), cao ethyl acetat (60,30%), cao n-hexan (60,05%), cao toàn phần (59,05%), cao n-butanol (56,99%) cao nước (56,57%) Bảng Tỷ lệ ức chế enzym α-amylase cao chiết Ngọc nữ biển Cao chiết Nồng độ phản ứng (µg/ml) Cao T Cao H Cao C Cao E Cao B Cao N Tỷ lệ ức chế α-amylase (%) 10 20 30 40 50 60 8,51±1,34 25,41± 0,12 21,19 ± 9,42 28,71± 0,99 25,06 ± 2,21 14,48 ± 0,12 17,62 ±0,73 31,80 ± 0,83 31,72± 4,83 35,25 ± 1,39 31,35 ± 1,98 22,02 ± 2,07 28,68 ±1,82 39,83± 0,35 43,87 ± 2,11 39,21 ± 0,40 36,71± 3,61 29,56± 0,61 39,49 ±4,13 49,17± 0,24 53,16 ± 8,92 45,74± 0,79 41,84± 7,11 37,83± 2,07 46,54 ± 0,73 54,49± 0,83 63,20 ± 4,83 52,28 ± 0,59 48,60± 0,58 45,86± 0,12 59,05 ± 0,11 60,05 ± 1,42 70,63± 1,36 60,30 ± 0,50 56,99± 1,05 56,57 ± 1,09 Hoạt tính ức chế enzym α-amylase acarbose nồng độ 20, 100, 200, 300, 400 µg/ml 29,69 ± 2,96, 35,61 ± 0,68,47,90 ± 5,23, 59,16 ± 1,25, 72,35 ± 5,35 % Giá trị IC50 cao chiết từ Trâm bầu, Mật gấu, Ngọc nữ biển phía Nam chứng dương acarbose trình bày bảng khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Bảng Phương trình hồi quy tuyến tính cao chiết từ loài dược liệu Cao chiết Cao T Cao H Cao C Cao E Cao B Cao N Mật gấu y=0,632x+38,31 (0,995) y=0,577x+11,93 (0,994) y=18,261ln(x)+2,358 (0,979) y=0,379x+11,26 (0,996) y=0,561x+18,89 (0,993) y=0,422x+18,78 (0,996) Phương trình (R2) Trâm bầu y=0,105x+32,21 (0,983) y=0,101x+41,81 (0,981) y=0,063x+12,54 (0,996) y=0,164x+10,32 (0,987) y=0,154x+23,49 (0,979) y=0,174x+14,31 (0,955) Ngọc nữ biển y=x+1,717 (0,997) y=0,716x+18,4 (0,992) y=1,002x+12,2 (0,995) y=0,615x+22,02 (0,992) y=0,618x+18,43 (0,993) y=0,829x+5,36 (0,996) Bảng Tỷ lệ ức chế α-amylase acarbose nồng độ khảo sát Tỷ lệ ức chế α-amylase (%) Nồng độ phản ứng (µg/ml) 20 100 200 300 Acarbose 29,69 ± 2,96 35,61 ± 0,68 47,89 ± 5,23 59,16 ± 1,25 Phương trình (R ) y = 0,113x + 25,73 (0,994) 400 72,35 ± 5,35 Bảng Giá trị IC50 loại cao chiết enzym α-amylase Dược liệu Cao T Mật gấu 18,49 Trâm bầu 169,52 Ngọc nữ biển 51,72 Acarbose Cao H 65,98 81,09 44,13 IC50 (µg/ml) Cao C Cao E 13,58 102,22 594,76 243,44 37,72 45,50 214,78 Cao B 55,45 173,33 51,08 Cao N 73,98 205,11 53,85 Giá trị IC50 mẫu cao chiết toàn phần, cao n-hexan, cao n-butanol cao nước Trâm bầu thấp acarbose cho thấy khả ức chế enzym α-amylase mẫu cao tốt so với acarbose Cụ thể, tác động ức chế α-amylase giảm dần theo thứ tự: cao n-hexan (IC50 = 81,09 µg/ml) > cao tồn phần (IC50 = 169,52 µg/ml) > cao n-butanol (IC50 = 173,33 µg/ml) > cao nước (IC50 = 205,11 µg/ml) > acarbose (IC50 = 214,78 µg/ml) > cao ethyl acetat (IC50 = 243,44 µg/ml) > cao chloroform (IC50 = 594,76 µg/ml) Trong đó, cao n-hexan có hoạt tính ức chế α-amylase lớn acarbose 2,65 lần Giá trị IC50 tất cao chiết từ Mật gấu Ngọc nữ biển thấp nhiều lần so với acarbose cho thấy khả ức chế enzym α-amylase mẫu cao tốt acarbose Cụ thể, hiệu ức chế cao chiết Mật gấu enzym α-amylase giảm dần theo thứ tự: cao chloroform (IC50 = 13,58 µg/ml) > cao tồn phần (IC50 = 18,49 µg/ml) > cao n-butanol (IC50 = 55,45 µg/ml) > cao n-hexan (IC50 = 65,98 µg/ml) > cao nước (IC50 = 73,98 µg/ml) > cao ethyl acetat (IC50 = 102,22 µg/ml) > acarbose (IC50 = 214,78µg/ml) Hiệu ức chế cao chiết Ngọc nữ biển enzym α-amylase giảm dần theo thứ tự: cao chloroform (IC50 = 37,72 µg/ml) > cao n-hexan (IC50 = 44,13 µg/ml) > cao ethyl acetat (IC50 = 45,50 µg/ml) > cao n-butanol (IC50 = 51,08 µg/ml) > cao tồn phần (IC50 = 51,72 µg/ml) > cao nước (IC50 = 53,85 µg/ml) > acarbose (IC50 = 214,78 µg/ml) Trong đó, khả ức chế α-amylase cao chiết từ Mật gấu Ngọc nữ biển lớn acarbose từ 2,1 – 15,8 lần 5,7 – 4,0 lần Nhìn tổng thể, hiệu ức chế α-amylase cao chiết từ Mật gấu Ngọc nữ biển cao tốt từ Trâm bầu So sánh giá trị IC50 cao toàn phần từ ba dược liệu theo thứ tự giảm dần: Mật gấu (IC50 = 18,49 µg/ml) > Ngọc nữ biển (IC50 = 51,72 µg/ml) > Trâm bầu (IC50 = 169,52 µg/ml) > acarbose (IC50 = 214,78 µg/ml) BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU NHIỆM VỤ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP VIỆN TÊN NHIỆM VỤ: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ALPHA AMYLASE CỦA LOÀI MẬT GẤU, TRÂM BẦU VÀ NGỌC NỮ BIỂN PHÍA NAM BÀI BÁO KHOA HỌC Chủ nhiệm nhiệm vụ: CN Lý Hải Triều Đơn vị: Trung tâm Sâm Dược liệu TP HCM Thời gian thực hiện: 12/2016-11/2017 Tp Hồ Chí Minh, 2017