Khảo sát hoạt tính kháng phân bào của các hợp chất cô lập từ hai loài địa y thuộc chi parmotrema

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT CƠ LẬP TỪ HAI LỒI ĐỊA Y THUỘC CHI PARMOTREMA DƯƠNG THÚC HUY CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 1/ 2015 MỤC LỤC Trang TÓM TẮT ABSTRACT DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH 10 LỜI CẢM ƠN 11 PHẦN MỞ ĐẦU 12 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 13 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 14 2.1 Định nghĩa phân loại địa y 15 2.2 Vai trò sinh thái hợp chất tự nhiên địa y 16 2.3 Nghiên cứu hoá học hợp chất địa y 17 2.4 Nghiên cứu hoá học số loài địa y thuộc chi Parmotrema 18 2.5 Hoạt tính địa y hợp chất địa y 22 2.5.1 Hoạt tính động vật 22 2.5.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng thực vật bậc cao 22 2.5.3 Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus hợp chất địa y 2.5.4 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y 2.5.5 Hoạt tính gây độc tế bào kháng đột biến hợp chất địa y 23 24 24 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 Hố chất 27 -1- 3.2 Máy móc, thiết bị 27 3.3 Parmotrema sancti-angelii 27 3.4 Q trình lập loài địa y Parmotrema sancti-angelii 28 3.5 Parmotrema planatilobatum 29 3.6 Q trình lập lồi địa y Parmotrema planatilobatum 30 3.7 Phương pháp thử nghiệm độc tính tế bào 30 CHƢƠNG 4: NGHIÊN CỨU – KẾT QUẢ 35 4.1 Methyl lecanorate (8) 36 4.2 5,7-Dihydroxy-1(3H)-isobenzofuranone (9) 36 4.3 Orcinol (10) 37 4.4 Zeorin (11) 37 4.5 6α-Acetoxyhopan-22-ol (12) 38 4.6 Leucotylin (16) 39 4.7 16β-Acetoxyhopan-6α,22-diol (14) 40 4.8 6α- Acetoxyhopan-16β,22-diol (13) 40 4.9 Hopan-6α,16α, 22-triol (15) 41 4.10 (5α,8α)-Esgosterol peroxide (17) 46 4.11 Brassicasterol (18) 46 4.12 Skyrin (19) 47 4.13 Hợp chất (20) 48 4.14 Hợp chất (21) 50 4.15 β-Collatolic acid 51 4.16 Độc tính tế bào số hợp chất lập 53 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN-KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC -2- 55 TĨM TẮT Với mong muốn tìm hiểu thành phần hố học lồi địa y Parmotrema sancti-angelii Parmotrema planatilobatum nói riêng góp phần tìm hiểu hố thực vật địa y nói chung nước ta, đề tài nghiên cứu bước đầu khảo sát thành phần hố học hai lồi địa y thu hái thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng Bột địa y phơi khô, xay nhỏ Parmotrema sancti-angelii trích với acetone theo phương pháp ngâm dầm, lọc thu cao acetone thô tủa P Một phần tủa P thực sắc kí cột thu đươc ba hợp chất chín 5-7 Thực sắc kí cột cao acetone thu phân đoạn H0, H1, C, EA1, EA2, EA3 Tiếp tục tiến hành phương pháp sắc ký khác để cô lập mười sáu hợp chất 1-4, 8-19 Dựa vào kết phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều, khối phổ phân giải cao kết hợp với so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc hợp chất 1-19 xác định Trong nội dung đề tài, mười hai hợp chất 8-19 báo cáo Đó methyl lecanorate (8), 5,7-dihydroxy-1(3H)isobenzofuranone (9), orcinol (10), zeorin (11), 6α-acetoxyhopan-22-ol (12), 6αacetoxyhopan-16β,22-diol (13), 16β-acetoxyhopan-6α,22-diol (14), hopan- 6α,16β,22-diol (15), leucotylin (16), (5α,8α)-esgosterol peroxide (17), brassicasterol (18), skyrin (19) Các hợp chất 8-9, 12-18 lần đầu tìm thấy chi Parmotrema Các hợp chất 10-11, 19 lần tìm thấy lồi địa y Parmotrema sancti-angelii Hợp chất 15 hợp chất Ngoài ra, hợp chất 6-9, 13, 15-16 thử nghiệm độc tính tế bào ba dịng tế bào ung thư gan HepG2, ung thư phổi NCI-H460, ung thư vú MCF-7 Từ nghiên cứu trước, cao ethyl acetate loài địa y Parmotrema planatilobatum tiếp tục thực sắc kí cột thu ba hợp chất 8-(2,4dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-methoxy-3-pentyl-1H-isochromen-1-one (20), 8-(2,4-dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H- isochromen-1-one (21), β-collatolic acid (22) cô lập Các hợp chất 20-21 lần tìm thấy chi Parmotrema Từ khố: Parmotrema sancti-angelii, Parmotrema planatilobatum, độc tính tế bào -3- ABSTRACT In order to improve chemical studies of the lichen species Parmotrema in Vietnam, chemical constituents of the lichen Parmotrema sancti-angelii collected in Da Lat City, Lam Dong province The clean, air-dried and ground material was extracted by maceration with acetone at ambient temperature, and the filtrated solution was evaporated under reduced pressure to afford the crude acetone extract and the precipitate P A part of the precipitate P was chromatographed to afford three major compounds 5-7 The acetone extract was applied on normal phase silica gel column chromatography to afford fractions H0, H1, C, EA1, EA2, and EA3 From the fractions H0, H1, and EA1, nineteen compounds 1-19 were isolated by using extensive isolation methods The chemical structures of compounds were elucidated by using 1D-, 2D-NMR, mass spectrum as well as comparison with the data in the literatures Compounds 819 were elucidated clearly in this report These are methyl lecanorate (8), 5,7dihydroxy-1(3H)-isobenzofuranone (9), orcinol (10), zeorin (11), 6α-acetoxyhopan22-ol (12), 6α-acetoxyhopan-16β,22-diol (13), 16β-acetoxyhopan-6α,22-diol (14), hopan-6α,16β,22-diol (15), leucotylin (16), (5α,8α)-esgosterol peroxide (17), brassicasterol (18), skyrin (19) This is the first time compounds 8-9, 12-18 found in the species Parmotrema Moreover, this is the first time compounds 10-11, 19 found in the lichen Parmotrema sancti-angelii Compound 15 is a new compound Compounds 6-9, 13, 15-16 were evaluated for cytotoxicity against the HepG2, NCIH460, MCF-7 cell lines Due to the previous phytochemical studies on the lichen Parmotrema planatilobatum, the ethyl acetate extract was chromatographed multiple times to afford three compounds 8-(2,4-dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-methoxy-3pentyl-1H-isochromen-1-one (20), 8-(2,4-dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6hydroxy-3-pentyl-1H-isochromen-1-one (21), β-collatolic acid (22) cô lập This is the first time compounds 20-21 found in the species Parmotrema Keywords: Parmotrema sancti-angelii, Parmotrema planatilobatum, cytotoxicity -4- ANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU s Mũi đơn (singlet) d Mũi đôi (doublet) t Mũi ba (triplet) m Mũi đa (multiplet) br Mũi rộng (broad) J Hằng số ghép cặp (coupling constant) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) HSQC Tương quan 1H-13C qua 01 nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation) HMBC Tương quan 1H-13C qua 02, 03 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) LC-MS Khối phổ sắc kí lỏng (Liquid Chromatography – Mass Spectroscopy) HR-ESI-MS High Resolution – Electro Spray Ionization – Mass Spectrometry m/z mass to charge ratio transfer ppm part per million EA Ethyl acetate Me Methanol C Cloroform AcOH Acid acetic Ac Acetone H Hexane CC Sắc kí cột pTLC Sắc kí lớp mỏng điều chế -5- DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Hoạt tính điều tiết tăng trưởng thực vật bậc cao 21 Bảng 2.2: Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus 23 Bảng 2.3: Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y 25 Bảng 2.4: Hoạt tính gây độc tế bào kháng đột biến hợp chất 25 địa y Bảng 2.5: Các loại enzyme bị ức chế hợp chất địa y 26 Bảng 4.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR 11-16 44 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ 13C-NMR 11-16 45 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ 1H- 13C-NMR 17-18 48 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 1H- 13C-NMR 20-22 52 Bảng 4.5a: Độc tính tế bào số hợp chất cô lập 53 Bảng 4.5b: IC50 hợp chất 13 ba dòng tế bào 54 -6- DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 2.1: Ba dạng địa y 13 Hình 2.2: Sinh tổng hợp hợp chất từ địa y 14 Hình 2.3: Các hợp chất lập từ địa y thuộc chi Parmotrema 17 Hình 3.1: Tản địa y Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale 27 Hình 3.2: Tản địa y Parmotrema planatilobatum (Hale) Hale 29 Hình 4.1: Cấu trúc hố học hợp chất 8-19 35 Hình 4.2: Cấu trúc hố học cấu dạng 11 38 Hình 4.3: Cấu trúc hoá học cấu dạng 12 38 Hình 4.4: Cấu dạng số tương quan HMBC quan trọng 16 39 Hình 4.5: Hình 4.6: Hình 4.7: Cấu dạng số tương quan COSY, HMBC quan trọng 14 Cấu dạng số tương quan HMBC quan trọng 13 Cấu trúc hoá học, cấu dạng số tương quan COSY, HMBC NOESY quan trọng 13 40 41 43 Hình 4.8: Thí dụ hiệu ứng bất đẳng hướng cyclohexane 43 Hình 4.9: Cấu trúc hố học 17 18 47 Hình 4.10: Cấu trúc hố học 19 48 Hình 4.11: Cấu trúc hố học tương quan HMBC 20 50 Hình 4.12: Cấu trúc hố học tương quan HMBC 21 51 Hình 4.13: Cấu trúc hoá học 22 51 Sơ đồ 1: Sơ đồ 2: Q trình ly trích lập từ lồi địa y Parmotrema sancti-angelii Q trình ly trích lập từ lồi địa y Parmotrema planatilobatum -7- 33 34 DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục 1: Phổ 1H NMR (8) Phụ lục 2: Phổ 13C NMR (8) Phụ lục 3: Phổ 1H NMR (9) Phụ lục 4: Phổ 13C NMR (9) Phụ lục 5: Phổ 1H NMR (10) Phụ lục 6: Phổ 1H NMR (11) Phụ lục 7: Phổ 13C NMR (11) Phụ lục 8: Phổ 1H NMR (12) Phụ lục 9: Phổ 13C NMR (12) Phụ lục 10: Phổ 1H NMR (16) Phụ lục 11: Phổ 13C NMR (16) Phụ lục 12: Phổ HSQC (16) Phụ lục 13: Phổ HMBC (16) Phụ lục 14: Phổ 1H NMR (14) Phụ lục 15: Phổ 13C NMR (14) Phụ lục 16: Phổ COSY (14) Phụ lục 17: Phổ HSQC (14) Phụ lục 18: Phổ HMBC (14) Phụ lục 19: Phổ 1H NMR (13) Phụ lục 20: Phổ 13C NMR (13) Phụ lục 21: Phổ HSQC (13) Phụ lục 21a: Phổ HMBC (13) Phụ lục 23: Khối phổ phân giải cao chế độ ESI (15) Phụ lục 24: Phổ 1H NMR (15) Phụ lục 25: Phổ 13C NMR (15) Phụ lục 25a: Phổ 13C NMR (15) Phụ lục 26: Phổ COSY (15) Phụ lục 27: Phổ HSQC (15) Phụ lục 28: Phổ HMBC (15) -8- Phụ lục 29: Phổ NOESY (15) Phụ lục 30: Phổ 1H NMR (17) Phụ lục 31: Phổ 13C NMR (17) Phụ lục 32: Phổ 1H NMR (18) Phụ lục 33: Phổ 13C NMR (18) Phụ lục 34: Khối phổ phân giải cao chế độ ESI (19) Phụ lục 35: Phổ 1H NMR (19) Phụ lục 36: Phổ 13C NMR (19) Phụ lục 37: Khối phổ phân giải cao chế độ ESI (20) Phụ lục 38: Phổ 1H NMR (20) Phụ lục 39: Phổ 13C NMR (20) Phụ lục 40: Phổ HSQC (20) Phụ lục 41: Phổ HMBC (20) Phụ lục 42: Khối phổ phân giải cao chế độ ESI (21) Phụ lục 43: Phổ 1H NMR (21) Phụ lục 44: Phổ 13C NMR (21) Phụ lục 45: Phổ HSQC (21) Phụ lục 46: Phổ HMBC (21) Phụ lục 47: Khối phổ phân giải cao chế độ ESI (22) Phụ lục 48: Phổ 1H NMR (22) Phụ lục 49: Phổ 13C NMR (22) Phụ lục 50: Phổ HSQC (22) Phụ lục 51: Phổ HMBC (22) -9- Phụ lục 39: Phổ 13C -NMR (20) Phụ lục 40: Phổ HSQC (20) Phụ lục 41: Phổ HMBC (20) C27H32O7 Phụ lục 42: Khối phổ HR-ESI (21) Phụ lục 43: Phổ 1H -NMR (21) Phụ lục 44: Phổ 13C-NMR (21) Phụ lục 45: Phổ HSQC (21) Phụ lục 46: Phổ HMBC (21) C29H34O9 M = 523 Phụ lục 47: Khối phổ HR-ESI (22) Phụ lục 48: Phổ 1H -NMR (22) Phụ lục 49: Phổ 13C -NMR (22) Phụ lục 50: Phổ HSQC (22) Phụ lục 51: Phổ HMBC (22) PTN SHPT – BM Di truyền – ĐHKHTN KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH TẾ BÀO Người gửi mẫu: Dương Thúc Huy Đơn vị: ĐH Sư phạm Mã số: 145 Ngày trả kết quả: 23/12/2014 IC50 (µg/ml) dịng tế bào ung thư (được tính phần mềm Graphpad Prism 6) Số TT Tên mẫu T2 Dòng tế bào NCI-H460 MCF-7 HepG2 77.86 ± 5.61 47.08 ± 2.64 52.67 ± 2.82 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào dòng tế bào ung thư nồng độ 100 µg/ml Số TT Mẫu Dòng tế bào NCI-H460 MCF-7 HepG2 A4.2 7.74 ± 3.99 Không yêu cầu Không yêu cầu A4.4 9.54 ± 3.14 Không yêu cầu Không yêu cầu PPA1a 21.09 ± 2.73 12.13 ± 0.99 -5.06 ± 5.02 T2 71.35 ± 1.09 88.10 ± 1.33 80.99 ± 3.31 T0 95.18 ± 0.61 88.99 ± 2.43 (2) Hết mẫu RS-C2 10.89 ± 0.76 Không yêu cầu Không yêu cầu H3.79 28.85 ± 0.79 51.00 ± 2.60 31.04 ± 4.36 Kết trình bày dạng: trung bình ± độ lệch chuẩn