Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và gây độc tế bào của protein từ các loài hải miên phổ biến tại vùng biển nha trang khánh hòa

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CƠ SỞ CẤP TRUNG TÂM Tên nhiệm vụ: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA PROTEIN TỪ CÁC LOÀI HẢI MIÊN PHỔ BIẾN TẠI VÙNG BIỂN NHA TRANG – KHÁNH HỊA Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phịng CNSH Y dược Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Phạm Thị Kim Trâm Cán tham gia: TS Phạm Thị Kim Trâm TS Hồng Thành Chí KS Nguyễn Quốc Huy Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2018 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH TÓM TẮT PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC 10 I ĐẶT VẤN ĐỀ 10 II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 2.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo Hải miên 11 2.2 Đa dạng sinh học Hải miên 12 2.3 2.2.1 Trên giới 12 2.2.2 Tại Việt Nam .14 Hoạt tính sinh học Hải miên 14 2.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước hoạt tính kháng vi sinh vật gây độc tế bào Hải miên 15 III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 3.2 Vật liệu 19 3.1.1 Loài Hải miên 19 3.1.2 Dòng tế bào .19 3.1.3 Chủng vi sinh vật .19 Phương pháp nghiên cứu 19 3.2.1 Thu thập phân loại mẫu 19 3.2.2 Tách chiết dịch protein toàn phần .19 3.2.2.1 Quy trình xử lý mẫu .19 3.2.2.2 Thu nhận dịch chiết protein tồng số 19 3.2.3 Phân đoạn dịch protein toàn phần .20 3.2.4 Xử lý protein .21 3.2.4.1 Biến tính protein nhiệt độ .21 3.2.4.2 Xử lý protein với proteinase 21 3.2.5 Xác định hàm lượng protein 21 3.2.6 Khuếch tán giếng thạch (Agar well diffusion) 22 3.2.7 Kiểm tra hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào ung thư 22 3.2.7.1 Kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào dịch protein toàn phần 23 3.2.7.2 Kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào dịch protein sau phân đoạn .23 3.2.7.3 Thử nghiệm MTT 23 3.2.8 Phân tích thống kê .24 IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 25 4.1 Kết 25 4.1.1 Thu thập phân loại mẫu 25 4.1.2 Tách chiết dịch protein toàn phần .27 4.1.3 Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn 29 4.1.4 Kiểm tra hoạt tính kháng nấm 31 4.1.5 Kiểm tra hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào ung thư 32 4.1.5.1 Sàng lọc dịch chiết protein mang hoạt tính gây độc tế bào ung thư 32 4.1.5.2 Kiểm tra hoạt tính gây độc dịch chiết B001 tế bào PBMC 37 4.1.5.3 Xác định giá trị IC50 dịch chiết protein B001 tế bào K562 37 4.1.5.4 Xác định phân đoạn protein B001 có hoạt tính gây độc tế bào 38 4.2 Thảo luận 41 V KẾT LUẬN 42 VI KIẾN NGHỊ 42 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 43 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AO Acridine Orange DNA Deoxyribonucleic Acid EB Ethidium Bromide EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid FACS Fluorescence-Activated Cell Sorting FAU Finkel-Biskis-Reilly Murine Sarcoma Virus (FBR-MuSV) Ubiquitously Expressed IC Inhibitory Concentration MHA Muller Hinton Agar NA Nutrient Agar NaCl Sodium Chloride OD Optical Density PBS Phosphate-Buffered Saline PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell PDA Potato Dextrose Agar pI Isoelectric Point SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis Tris – HCl Tris Hydrocloride DANH SÁCH BẢNG Bảng Sự đa dạng sinh học Hải miên giới 13 Bảng Các hợp chất kháng ung thư có nguồn gốc từ Hải miên giai đoạn phát triển thành thuốc .16 Bảng Các mẫu Hải miên thu Nha Trang 26 Bảng Khối lượng mẫu Hải miên thu Nha Trang 27 Bảng Hàm lượng protein xác định phương pháp Bradford 28 Bảng Hoạt tính kháng vi khuẩn dịch chiết protein từ Hải miên 30 Bảng Hàm lượng protein phân đoạn thu từ dịch chiết B001 39 DANH SÁCH HÌNH Hình Sự đa dạng hình thái Hải miên .11 Hình Cấu trúc đơn giản Hải miên 12 Hình Sự phân bố Hải miên giới 13 Hình Tổng số hợp chất có hoạt tính sinh học khác phân lập từ Hải miên nước mặn từ 2001 – 2010 15 Hình Các mẫu Hải miên thu vùng biển Nha Trang 25 Hình Kết SDS-PAGE kiểm tra hàm lượng protein 12 mẫu Hải miên .28 Hình Kiểm tra hoạt tính ức chế vi khuẩn S aureus dịch chiết protein từ 12 mẫu Hải miên điều kiện không xử lý nhiệt độ sau ủ 24 370C 29 Hình Kiểm tra hoạt tính kháng vi khuẩn E coli dịch chiết protein từ 12 mẫu Hải miên điều kiện không xử lý nhiệt độ sau ủ 24 370C 30 Hình Kiểm tra hoạt tính ức chế vi khuẩn S aureus dịch chiết protein A001, B002 B003 điều kiện bị xử lý với nhiệt độ protease K sau ủ 24 370C 31 Hình 10 Kiểm tra hoạt tính ức chế vi khuẩn E coli dịch chiết protein A001, B002 B003 điều kiện bị xử lý với nhiệt độ protease K sau ủ 24 370C 31 Hình 11 Kiểm tra hoạt tính ức chế nấm C albicans của dịch chiết protein từ 12 mẫu Hải miên điều kiện không xử lý nhiệt độ sau ủ ngày 260C 32 Hình 12 Khảo sát khả ức chế tăng trưởng tế bào K562 dịch chiết protein từ Hải miên điều kiện bình thường .33 Hình 13 Khảo sát khả ức chế tăng trưởng tế bào HepG2 dịch chiết protein từ Hải miên điều kiện bình thường .33 Hình 14 Khảo sát khả ức chế tăng trưởng tế bào MCF-7 dịch chiết protein từ Hải miên điều kiện bình thường .34 Hình 15 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào K562 dịch chiết A001, B001, B002 B003 điều kiện bị xử lý với nhiệt độ 35 Hình 16 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào HepG2 dịch chiết A001, A004, B001, B002 B003 điều kiện bị xử lý với nhiệt độ 35 Hình 17 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào MCF-7 dịch chiết A001, A004, B001, B002, B003 HR2 điều kiện bị xử lý với nhiệt độ 36 Hình 18 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào K562 dịch chiết B001 điều kiện bị xử lý với protease K .36 Hình 19 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào PBMC dịch chiết B001 điều kiện xử lý khác 37 Hình 20 Giá trị IC50 dịch chiết B001 dòng tế bào ung thư máu K562 38 Hình 21 Các phân đoạn thu dịch chiết B001 39 Hình 22 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào K562 phân đoạn dịch chiết B001 điều kiện bình thường 40 Hình 23 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào K562 phân đoạn dịch qua cột điều kiện bị xử lý với protease .40 TÓM TẮT Hải miên (Porifera) xem nhà máy hóa chất sản xuất hàng loạt hợp chất tự nhiên với phổ hoạt tính rộng bao gồm kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng oxi hóa Các hợp chất chủ yếu thuộc nhóm chất alkaloid, terpenoid, steroid, peptide vòng, acid béo dẫn xuất amino acid Tuy nhiên, nhược điểm hợp chất tỷ lệ thu hồi so với tổng lượng chất thô ban đầu thấp dẫn đến việc ứng dụng thương mại hóa thành thuốc điều trị cho người cịn hạn chế Bên cạnh đó, vài nghiên cứu gần cho thấy dịch chiết protein phân đoạn protein từ Hải miên biểu khả kháng khuẩn, tan huyết, gây độc tế bào kháng ung thư Do vậy, mục tiêu nghiên cứu đánh giá sơ hoạt tính kháng vi sinh vật gây độc tế bào dịch chiết thu nhận từ Hải miên vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa, nhằm làm tiền đề cho nghiên cứu sâu sau, hướng tới ứng dụng sản xuất thuốc phục vụ lĩnh vực y tế Kết nghiên cứu cho thấy, số 12 mẫu thuộc 11 loài Hải miên khác thu thập vùng biển Nha Trang – Khánh Hịa, khơng phát protein có khả ức chế phát triển vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus nấm men Candida albicans; không phát protein có khả tiêu diệt tế bào ung thư gan HepG2 ung thư vú MCF-7; nhiên, phát hai phân đoạn protein tiềm từ Lipastrotethya sp có khả ức chế phát triển tế bào ung thư máu K562 Đây kết thú vị nghiên cứu protein Hải miên tiền đề cho nghiên cứu PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật gây độc tế bào protein từ loài Hải miên phổ biến vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa (Mã số: YD04/16-17) Đơn vị chủ trì: Phịng CNSH Y Dược- Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP HCM Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, Khu phố 2, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, Tp HCM Điện thoại: +84 715 7631 Đơn vị phối hợp chính: Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang Địa chỉ: 2A Hùng Vương, Nha Trang, Khánh Hoà, Việt Nam Tel: +84.58.3521781 Fax: +84.58.3521847 Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Phạm Thị Kim Trâm Phòng CNSH Y Dược- Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Cán tham gia thực hiện: Thành viên chính: TS Hồng Thành Chí Thành viên: KS Nguyễn Quốc Huy Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ tháng 01/2016 đến 12/2017) Kinh phí: - Tổng dự tốn: 500.000.000 VNĐ - Kinh phí sử dụng: 500.000.000 VNĐ Mục tiêu nhiệm vụ: Đánh giá sơ hoạt tính kháng vi sinh vật gây độc tế bào dịch chiết protein thu nhận từ Hải miên vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa, làm tiền đề cho nghiên cứu sâu sau, hướng tới việc ứng dụng sản xuất thuốc phục vụ lĩnh vực y tế Các nội dung công việc thực so với đăng ký Nội dung Thời gian (bắt STT Thực đăng ký đầu – kết thúc) Các mẫu Hải miên thu Nội dung 1: Thu 13 tháng thập vùng biển Nha thập phân loại (2/2016-3/2017) Trang phân loại mẫu theo loài Dịch chiết protein toàn phần Nội dung 2: Tách từ mẫu Hải miên thu 12 tháng chiết dịch protein thập có hoạt tính (7/2016-6/2017) toàn phần kháng vi sinh vật hoặc/và gây độc tế bào Protein phân tách từ Nội dung 3: Phân 15 tháng dịch chiết protein toàn phần, đoạn dịch protein (7/2016-11/2017) có hoạt tính kháng vi sinh tồn phần vật hoặc/và gây độc tế bào Xác định loài Hải miên Nội dung 4: có dịch chiết protein tồn Khảo sát hoạt 15 tháng phần phân tính kháng vi (8/2016-11/2017) đoạn protein có hoạt tính sinh vật kháng số vi khuẩn nấm Xác định lồi Hải miên có dịch chiết protein tồn Nội dụng 5: 15 tháng phần phân Khảo sát hoạt (8/2016-11/2017) đoạn protein có hoạt tính tính gây độc tế gây độc dịng tế bào bào ung thư khác người Đánh giá Đúng tiến độ Đúng tiến độ Đúng tiến độ Đúng tiến độ Đúng tiến độ 4.1.5.2 Kiểm tra hoạt tính gây độc dịch chiết B001 tế bào máu PBMC Như đề cập trên, nhóm nghiên cứu tập trung tìm hiểu sâu dịch chiết protein B001 từ lồi Hải miên Lipastrotethya sp dịch chiết mang protein có khả ức chế phát triển tế bào Do đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nhằm kiểm tra khả gây độc B001 tế bào máu ngoại vi PBMC Kết cho thấy, B001 ức chế phát triển tế bào PBMC (Hình 19) Tuy nhiên, hoạt tính gây độc tế bào PBMC có phần yếu so với tế bào K562 xử lý nồng độ 50 µg/ml tế bào K562 chịu ảnh hưởng mạnh (Hình 12, Hình 18 Hình 19) Ngồi ra, dịch chiết B001 bị xử lý với nhiệt độ protease K, hoạt tính B001 tế bào PBMC có phần giảm nhẹ (Hình 19) so với dịch ban đầu khơng bị xử lý Hình 19 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào PBMC dịch chiết B001 điều kiện xử lý khác a, b, c mức phân hạng giá trị 4.1.5.3 Xác định giá trị IC50 dịch chiết protein B001 tế bào K562 Dịch chiết protein B001 từ Hải miên Lipastrotethya sp dịch chiết tiềm mang protein có khả ức chế phát triển tế bào ung thư máu K562 Do đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nhằm xác định giá trị IC50 dịch chiết B001 dòng tế bào bị tác động, mà cụ thể tế bào K562 Để xác định giá trị IC50, dãy nồng độ dịch chiết sử dụng 500 µg/ml; 250 µg/ml; 100 µg/ml; 50 µg/ml; 25 µg/ml; 12,5 µg/ml; 6,25 µg/ml 3,125 µg/ml Nồng độ xác định dựa khối lượng 37 mẫu đơng khơ thể tích đệm Tris-HCl Kết cho thấy giá trị IC50 dịch chiết B001 dịng tế bào K562 vào khoảng 88,9 µg/ml (Hình 20), giá trị tương ứng với hàm lượng protein xấp xỉ 1,7 µg/ml Giá trị IC50 xác định theo phương pháp biểu đồ Hình 20 Giá trị IC50 dịch chiết B001 dòng tế bào ung thư máu K562 4.1.5.4 Xác định phân đoạn protein B001 có hoạt tính gây độc tế bào Nhằm xác định thêm thơng tin protein có khả gây độc tế bào K562 từ dịch chiết B001, tiến hành thực phân đoạn sắc ký trao đổi ion âm sử dụng cột HiScreen Q HP (GE) Kết thu phân đoạn chứa protein bám lên cột phân đoạn không bám lên cột với hàm lượng khác (Hình 21, Bảng 7) Kết kiểm tra SDS-PAGE (Hình 21) cho thấy phân đoạn thu có thành phần protein khơng hồn tồn giống nhau, trừ phân đoạn không bám lên cột (dịch qua cột) Bên cạnh đó, chúng tơi tiến thí nghiệm nhằm xác định phân đoạn protein mang hoạt tính ức chế phát triển tế bào K562 Nồng độ protein xử lý tương ứng với giá trị IC50 dịch chiết B001 Kết thí nghiệm cho thấy, có phân đoạn phân đoạn dịch qua cột có hoạt tính (Hình 22), phân đoạn cịn lại khơng có tác động tế bào Ngồi ra, tiến hành xử lý phân đoạn có hoạt tính với protease K để lần khẳng định có phải hoạt tính protein gây hay không Kết cho thấy, hoạt tính gây độc tế bào hai phân đoạn bị đáng kể sau chúng bị xử lý với protease K (Hình 23) Qua đó, tiếp tục khẳng định hoạt tính ức chế phát triển tế bào K562 B001 đến từ thành phần protein Điểm đáng quan tâm thí nghiệm phân đoạn dịch qua cột, thành phần protein phân đoạn xuất khoảng nhóm protein với kích thước lần 38 lượt vào khoảng 60 kDa, 45 kDa 25 kDa (Hình 21) Trong đó, nhóm protein có kích thước khoảng 25 kDa chiếm đa số Bên cạnh đó, nhiều khả hoạt tính phân đoạn dịch qua cột đến từ protein Đó nồng độ protein xử lý giống (bằng với giá trị IC50 dịch chiết B001) mức độ tác động lên tế bào K562 không giống Mức độ ức chế tăng đáng kể phân đoạn dịch qua cột so với phân đoạn (Hình 22) Hơn nữa, thành phần protein phân đoạn dịch qua cột xuất khoảng ba nhóm protein phân đoạn dịch ban đầu xuất nhiều protein khác (Hình 21) Do vậy, xử lý tế bào nồng độ protein, hàm lượng protein dịch phân đoạn lớn hơn, từ dẫn đến mức độ tác động mạnh Do đó, dịch qua cột xem phân đoạn tiềm dễ dàng xác định protein mang hoạt tính mong muốn Hình 21 Các phân đoạn thu dịch chiết B001 F: phân đoạn thu (fraction); M: marker; FT: dịch qua cột (flow through); Wash: dịch rửa mẫu; 40 µl mẫu/giếng Bảng Hàm lượng protein phân đoạn thu từ dịch chiết B001 Tên mẫu Nồng độ protein (µg/ml) Phân đoạn (F5) 306,013 Phân đoạn (F6) 2355,328 Phân đoạn (F7) 415,633 Dịch qua cột (Flow through) 612,615 39 Hình 22 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào K562 phân đoạn dịch chiết B001 điều kiện bình thường ***: p < 0,001 Hình 23 Thử nghiệm khả ức chế tăng trưởng tế bào K562 phân đoạn dịch qua cột điều kiện bị xử lý với protease ***: p < 0,001 40 4.2 Thảo luận Cho đến nhiều nghiên cứu hoạt tính sinh học Hải miên thực Tuy nhiên, hầu hết tập trung vào hợp chất thứ cấp mà đề cập đến protein Thậm chí kết nghiên cứu cho thấy hợp chất thứ cấp từ Hải miên lĩnh vực tiềm năng, với phổ hoạt tính rộng Cụ thể, số 11 loài Hải miên thu vùng biển Nha Trang – Khánh Hịa, Aaptos suberitoides Haliclona sp có khả sản xuất hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng E coli, S aureus gây độc tế bào K562, HepG2 MCF-7; Gelliodes fibulata có hoạt tính HepG2, MCF-7 khả tổng hợp sterol tiêu diệt tế bào ung thư (Hoàng Lê Tuấn Anh cs, 2015); Biemna fortis có hoạt tính MCF-7 Lipastrotethya sp có khả sản xuất protein ức chế phát triển K562 Trên thực tế, Aaptos suberitoides chứng minh nguồn sản xuất dồi hợp chất aaptamine dẫn xuất aaptamine Đây hợp chất có phổ hoạt tính rộng bao gồm kháng khuẩn, kháng virus, gây độc tế bào, ức chế sortase A, chống trầm cảm ức chế proteasome (Tsukamoto cs, 2010; Liu cs, 2012) Bằng thực nghiệm, tiến hành tách chiết hợp chất tự nhiên từ Aaptos suberitoides dung môi methanol kiểm tra hoạt tính dịch chiết cho thấy dịch chiết methanol từ Aaptos suberitoides có hoạt tính kháng khuẩn mạnh S aureus, E coli Bacilus cereus (Bui Thi Kim Ly cs, 2017) Tương tự, loài thuộc họ Haliclona biết đến nguồn giàu hợp chất tự nhiên, với hàng loạt thành phần khác nhau, gồm amino alcohols, macrocyclic diamides, sphingoid bases, steroids terpenoids, alkaloids, hydroquinones, acetylenes, cyclic peptides nucleosides (Hoppers cs, 2014) Các kết thu chúng tơi tiến hành thí nghiệm cho thấy Haliclona sp có hoạt tính mạnh vi khuẩn tế bào Trên thực tế, nhiều nghiên cứu chứng minh phổ hoạt tính rộng loài thuộc họ Haliclona Cụ thể, nghiên cứu Nazemi cộng (2014) cho thấy Haliclona sp thu vùng biển Iran có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm mạnh Tương tự, loài Hải miên Haliclona sp vùng biển Hàn Quốc chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn S aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Proteus vulgaris, E coli tiêu diệt tế bào ung thư máu K562 nhờ khả sản xuất hợp chất Haliclonin A, macrocyclic diamide (Jang cs, 2009) Ngoài ra, nghiên cứu Fiorini cộng (2015) tìm thấy hợp chất Panicein từ Haliclona mucosa, hợp chất có khả ức chế thụ thể Patched ngăn cản đường tín hiệu Hh tiêu diệt tế bào ung thư hắc tố (melanoma) (Fiorini cs, 2015) Việc kích hoạt khơng bình thường đường tín hiệu tìm thấy nhiều loại ung thư ác tính gồm ung thư vú, phổi, trực tràng, buồng trứng, tụy, melanoma đa u tủy (Fiorini cs, 2015) Ngoài ra, thụ thể Patched tìm thấy tế bào ung thư gan HepG2 (Sicklick cs, 2006) ung thư máu K562 (Bidet cs, 2012) Qua cho thấy, đệm Tris-HCl khơng phải dung mơi thích hợp dùng tách chiết hợp chất biến dưỡng thứ cấp, kết nghiên cứu tương đồng với liệu trước hoạt tính Aaptos suberitoides loài Haliclona spp Ngoài ra, sử dụng đệm Tris-HCl tách chiết, cộng với hoạt tính Hải miên cịn thay đổi theo vị trí địa lý điều kiện môi trường sống nên việc khẳng định loài Hải miên vùng biển Nha Trang – Khánh Hịa khơng có khả tổng hợp hợp chất thứ cấp ức chế vi khuẩn, vi nấm tế bào ung thư chưa hồn tồn xác cần phải tiến hành nhiều nghiên cứu sâu hợp chất thứ cấp để trả lời cho câu hỏi 41 Mặt khác, điểm đáng ý nghiên cứu kết khảo sát Lipastrotethya sp thu hai phân đoạn tiềm mang protein có khả ức chế phát triển tế bào ung thư máu K562 Tuy nhiên, khơng thể loại trừ khả hoạt tính Lipastrotethya sp peptide nhỏ, nhạy nhiệt có vị trí nhận biết proteinase K thành phần protein phân đoạn 5, tương đồng (Hình 21) có phân đoạn có hoạt tính K562 Cùng với đó, peptide từ Hải miên có phổ hoạt tính rộng (Shukla, 2014; Agrawal cs, 2016; Sable cs, 2017) phần lớn chúng bền với tác nhân biến tính nhiệt độ protease (Sable cs, 2017) Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu trước cho thấy Lipastrotethya sp có khả sản xuất nhiều loại hợp chất thứ cấp khác có hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư Điển hình nortriterpene glycosides thuộc nhóm sarasinoside có hoạt tính gây độc tế bào A549 K562 hoạt tính ức chế yếu bơm Na+/K+-ATPase (Lee cs, 2012), hợp chất triterpene galactosides aglycones thuộc nhóm pouoside cho hoạt tính yếu tế bào K562 (Lee cs, 2011) Dragmacidins G H, hai hợp chất bisindole alkaloids từ Lipastrotethya sp gây độc tế bào Hela (Hitora cs, 2016) Hơn nữa, nghiên cứu Choi cộng (2017) chứng minh dịch chiết methanol dichloromethane từ Lipastrotethya sp có khả tiêu diệt tế bào ung thư đại trực tràng người HCT116 Như vậy, nhiều chứng chứng minh Lipastrotethya sp có tiềm lớn nguồn dược liệu phong phú, nhiên, chưa có nghiên cứu cho thấy lồi Hải miên có khả tổng hợp protein gây độc tế bào Do đó, cần có nghiên cứu sâu để xác định thông tin protein Bên cạnh đó, nghiên cứu protein hoạt tính sinh học từ Hải miên hạn chế, chưa có protein từ Hải miên phát có hoạt tính gây độc tế bào, trừ lectin (Perdicaris cs, 2013) Đây tiền đề cho nghiên cứu sâu protein có hoạt tính sinh học Hải miên V KẾT LUẬN Nhìn chung, kết đạt đề tài đáp ứng yêu cầu giải vấn đề cần nghiên cứu Cụ thể, đề tài thu thập 12 mẫu thuộc 11 loài Hải miên khác vùng biển Nha Trang – Khánh Hịa Trong đó, lồi Lipastrotethya sp nhiều khả mang protein có hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư máu K562; hai loài Aaptos suberitoides Haliclona sp sản xuất hợp chất thứ cấp với phổ hoạt tính sinh học rộng, từ ức chế phát triển vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus đến hoạt tính gây độc ba dịng tế bào ung thư gan HepG2, ung thư vú MCF-7 ung thư máu K562 Ngoài ra, Gelliodes fibulata Biemna fortis có khả sản xuất hợp chất tự nhiên có hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan ung thư vú VI KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu đề tài, nhóm nghiên cứu đề xuất nên tiến hành nghiên cứu chun sâu nhằm xác định protein có hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư máu K562 từ loài Hải miên Lipastrotethya sp Ngoài ra, kết thực nghiệm cho thấy số dịch chiết từ hai loài Hải miên Aaptos suberitoides Haliclona sp sản xuất hợp chất thứ cấp với phổ hoạt tính sinh học rộng từ ức chế phát triển vi khuẩn E coli, S aureus đến hoạt tính gây độc ba dòng tế bào ung thư gan 42 HepG2, ung thư vú MCF-7 ung thư máu K562 Do nên có thêm nghiên cứu sâu hợp chất tự nhiên để khám phá lĩnh vực tiềm PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Tên sản phẩm Đánh giá chung Hai phân đoạn protein từ loài Hải miên Lipastrotethya sp có hoạt tính ức chế phát triển tế bào ung thư máu K562 Đạt Bảng thống kê loài Hải miên phổ biến thu Nha Trang – Khánh Hồ với hoạt tính sinh học tương ứng Đạt Quy trình tách chiết phân đoạn protein từ Hải miên Đạt STT Đào tạo 01 Thạc sĩ Chưa đạt, cử nhân chờ báo cáo kết tháng 4/2018 Xuất 01 báo khoa học nước Bui Thi Kim Ly, Nguyen Hai Dang, Ngo Thi Phuong Dung, Nguyen Quoc Huy, Pham Thi Kim Tram, Hoang Thanh Chi, Antibacterial activity of crude methanolic and fractionated extracts of Aaptos Suberitoides Journal of Science Ho Chi Minh City Open University, 2017 7(2), 66-71 Đạt PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO I TIẾNG VIỆT Hồng Lê Tuấn Anh, Dương Thị Dung, Đỗ Cơng Thung, Phạm Hải Yến, Nguyễn Xuân Nhiệm, Đan Thị Thúy Hằng, Bùi Hữu Tài, Nguyễn Thị Cúc, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Các hợp chất sterol từ loài Hải miên Gelliodes fibulata Hội thảo khoa học kỷ niệm 40 năm thành lập Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, 2015 Phan Văn Kiệm, Nghiên cứu khai thác dược liệu từ Hải miên vùng biển Đông bắc Việt Nam theo định hướng hoạt tính diệt tế bào ung thư Viện Hóa sinh biển, 2015 Trần Mỹ Linh, Nghiên cứu đa dạng sinh học chất có hoạt tính sinh học Hải miên (Porifera) Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị Viện Hóa sinh biển, 2013 43 Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Lê Mai Hương, Phạm Quốc Long, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Minh Hà, Đỗ Công Thung, Tống Kim Thuần, Nguyễn Huy Nam, Trương Hương Lan, Đặng Diễm Hồng, Đoàn Thái Hưng, Nghiên cứu sàng lọc chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào chống oxy hóa từ sinh vật biển nhằm tạo sản phẩm có giá trị dược dụng Báo cáo tổng kết khoa học công nghệ đề tài, Bộ khoa học công nghệ, 2009 Thiard Franck, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thụy Vy, Nguyễn Hoài Nghĩa, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Khảo sát hoạt tính ức chế tăng trưởng thuốc Việt Nam dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela Science & Technology Development, 2008 11(01) II TIẾNG ANH Agrawal S., Adholeya A and Deshmukh S K., The Pharmacological Potential of Non-ribosomal Peptides from Marine Sponge and Tunicates Front Pharmacol, 2016 7, 333 Bidet M., Tomico A., Martin P., Guizouarn H., Mollat P and Mus-Veteau I., The Hedgehog Receptor Patched Functions in Multidrug Transport and Chemotherapy Resistance Molecular Cancer Research, 2012 10(11), 1496 Biggs A., McGraw-Hill, Kapicka C., and Hagins W., C., Sponges, Cnidarians, Flatworms, and Roundworms.Biology California Edition: The Dynamics of Life – California edition McGraw-Hill/Glencoe, 2005 692 – 719 Balouiri M., Sadiki M and Ibnsouda S K., Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review Journal of Pharmaceutical Analysis, 2016 6(2): 71-79 10 Bui Thi Kim Ly, Nguyen Hai Dang, Ngo Thi Phuong Dung, Nguyen Quoc Huy, Pham Thi Kim Tram, Hoang Thanh Chi, Antibacterial activity of crude methanolic and fractionated extracts of Aaptos Suberitoides Journal of Science Ho Chi Minh City Open University, 2017 7(2), 66-71 11 Choi K., Lim H K., Oh S R., Chung W H and Jung J., Anticancer Effects of the Marine Sponge Lipastrotethya sp Extract on Wild-Type and p53 Knockout HCT116 Cells Evid Based Complement Alternat Med 2017 7174858 12 Dhanalakshmi J., Kipkirui B F and Selvi S., Regular Article: An invitro antimicrobial activity and Bioactivities of Protein Isolated from Marine Sponge – Callyspongia sp Research in Pharmacy, 2012 2(1), 36-41 13 Dhinakaran D I and Lipton A P., Antimicrobial Potential of the Marine Sponge Sigmadocia pumila from the South Eastern Region of India World Journal of Fish and Marine Sciences, 2012 4(4), 344-348 14 Dojindo Molecular Technologies, INC., Measuring Cell Viability / Cytotoxicity 44 https://www.dojindo.com/Protocol/Cell_Proliferation_Protocol_Colorimetric.pdf 15 Ereskovsky A V., The Comparative Embryology of Sponges Springer, 2010 16 Farha A K, Geetha B S, Mangalam S Nair, Dhanya S R, Latha P G and Remani P., Apoptosis Mediated Cytotoxicity Induced By Isodeoxyelephantopin On Nasopharyngeal Carcinoma Cells Asian J Pharm Clin Res, 2013 6(2), 51-56 17 Fiorini L., Tribalat M A., Sauvard L., Cazareth J., Lalli E., Broutin I., Thomas O P and Mus-Veteau I., Natural paniceins from mediterranean sponge inhibit the multidrug resistance activity of Patched and increase chemotherapy efficiency on melanoma cells Oncotarget, 2015 6(26), 22282-22297 18 Gomes Filho S., Cardoso J., Anaya K., Silva Nascimento E., de Lacerda J., Mioso R., Santi Gadelha T and de Almeida Gadelha C Marine Sponge Lectins: Actual Status on Properties and Biological Activities Molecules, 2015 20, 348357 19 Hitora Y., Takada K., Ise Y., Okada S and Matsunaga S (2016) Dragmacidins G and H, Bisindole Alkaloids Tethered by a Guanidino Ethylthiopyrazine Moiety, from a Lipastrotethya sp Marine Sponge J Nat Prod 79(11), 2973-2976 20 Hoppers A., Stoudenmire J., Wu S and Lopanik N B., Antibiotic activity and microbial community of the temperate sponge, Haliclona sp J Appl Microbiol, 2015 118(2), 419-430 21 Jang K H., Kang G W., Jeon J E., Lim C., Lee H S., Sim C J., Oh K B and Shin J., Haliclonin A, a new macrocyclic diamide from the sponge Haliclona sp Org Lett, 2009 11(8), 1713-1716 22 Koopmans M., Martens D and Wijffels R H., Towards commercial production of sponge medicines Mar Drugs, 2009 7, 787-802 23 Kumar M S., Gupta S and Pal A K., Isolation of Bioactive Proteins from the Marine Sponge Spongosorites halichondriodes (Dendy, 1905) World Applied Sciences Journal, 2012 17 (6), 729-734 24 Kumar M S and Gopalkrishnan S., Evaluation, partial characterization and purification of acetylcholine esterase enzyme and antiangiogenic activity from marine sponges Journal of Coastal Life Medicine, 2014 2(11), 849-854 25 Laport M S., Santos O C S and Muricy G., Marine Sponges: Potential Sources of New Antimicrobial Drugs Current Pharmaceutical Biotechnology, 2009.10, 86105 26 Lee J H., Jang K H., Lee Y J., Lee H S., Sim C J., Oh K B and Shin J., Triterpene galactosides of the pouoside class and corresponding aglycones from the sponge Lipastrotethya sp J Nat Prod, 2011 74(12), 2563-2570 45 27 Lee J H., Jeon J E., Lee Y J., Lee H S., Sim C J., Oh K B and Shin J., Nortriterpene glycosides of the sarasinoside class from the sponge Lipastrotethya sp J Nat Prod, 2012 75(7): 1365-1372 28 Liu C., Tang X., Li P and Li G., Suberitine A-D, four new cytotoxic dimeric aaptamine alkaloids from the marine sponge Aaptos suberitoides Org Lett, 2012 14(8), 1994-1997 29 Mehbub M F., Lei J., Franco C and Zhang W., Review: Marine Sponge Derived Natural Products between 2001 and 2010: Trends and Opportunities for Discovery of Bioactives Mar Drugs, 2014 12, 4539-4577 30 Nazemi M., Alidoust Salimi M., Alidoust Salimi P., Motallebi A., Tamadoni Jahromi S and Ahmadzadeh O., Antifungal and antibacterial activity of Haliclona sp from the Persian Gulf, Iran J Mycol Med, 2014 24(3), 220-224 31 Newbold R W., Jensen P R., Fenical W and Pawlik J R., Antimicrobial activity of Caribbean sponge extracts Aquat Microb Ecol, 1999 19, 279-284 32 Ophardt C E., Denaturation of Proteins Virtual Chembook Elmhurst College, 2003 Web 20 Mar 2018 (http://chemistry.elmhurst.edu/vchembook/568denaturation.html) 33 Perdicaris S., Vlachogianni T and Valavanidis A., Review article: Bioactive Natural Substances from Marine Sponges: New Developments and Prospects for Future Pharmaceuticals Nat Prod Chem Res, 2013 1(3) 34 Perina D., Korolija M., Hadzija M P., Grbesa I., Beluzic R., Imesek M., Morrow C., Marjanovic M P., Bakran-Petricioli T., Mikoc A and Cetkovic H., Functional and Structural Characterization of FAU Gene/Protein from Marine Sponge Suberites domuncula Mar Drugs, 2015 13, 4179-96 35 Provost and Wallert Research, Investigating the Biochemistry & Cellular Physiology of NHE1 EST 1998 MTT Proliferation Assay Protocol Web 21 Mar 2018 http://home.sandiego.edu/~josephprovost/MTT%20Proliferation%20Assay%20Pr otocol.pdf 36 Quang M T., A review of the diversity of sponges (Porifera) in Vietnam, The Proceedings of the 2nd international workshop on marine bioresources of Vietnam Hanoi-Vietnam, 2013 109-115 37 Ravichandran S., Wahidullah S., D’Souza L and Anbuchezhian R M., Antimicrobial activity of marine sponge Clathria indica (Dendy, 1889) Bioorg Khim, 2011 37, 483-489 38 Rode H J., Apoptosis, Cytotoxicity and Cell Proliferation Roche Diagnostics GmbH, 2008 46 39 Roslen N A., Alewi N A., Ahamada H and Rasad M S., Cytotoxicity screening of Melastoma malabathricum extracts on human breast cancer cell lines in vitro Asian Pac J Trop Biomed, 2014 4(7), 545-8 40 Sable R., Parajuli P and Jois S., Peptides, Peptidomimetics, and Polypeptides from Marine Sources: A Wealth of Natural Sources for Pharmaceutical Applications Mar Drugs, 2017 15(4) 41 Salehi A., Patong R and Ahmad A., Isolation and Characterization of some kind bioactive proteins sponse as antibacterial agent International journal of scientific and technology research, 2014 3(2), 233 – 236 42 Shakeri A and Sahebkar A., Opinion Paper – Anti-Cancer Products from Marine Sponges: Progress and Promise Recent Patents on Drug Delivery & Formulation, 2015 (3) 43 Sipkema D., Franssen M C R., Osinga R., Tramper J and Wijffels R H., Marine Sponges as Pharmacy Mar Biotechnol, 2005 7, 142 44 Senthilraja P and Kathiresan K., In vitro cytotoxicity MTT assay in Vero, HepG2 and MCF -7 cell lines study of Marine Yeast Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2015 5(3): 080-084 45 Sepcic K., Kauferstein S., Mebs D and Turk T., Biological activities of aqueous and organic extracts from tropical marine sponges Mar Drugs, 2010 8, 1550-66 46 Sicklick J K., Li Y X., Jayaraman A., Kannangai R., Qi Y., Vivekanandan P., Ludlow J W., Owzar K., Chen W., Torbenson M S and Diehl A M., Dysregulation of the Hedgehog pathway in human hepatocarcinogenesis Carcinogenesis, 2006 27(4), 748-757 47 Suarez-Jimenez G.M., Burgos-Hernandez A and Ezquerra-Brauer J.M., Bioactive peptides and depsipeptides with anticancer potential: sources from marine animals Mar Drugs, 2012 10, 963-986 48 Swatschek D., Schattona W., Kellermannd J., Muller W E G and Kreuter J., Marine sponge collagen: isolation, characterization and effects on the skin parameters surface-pH, moisture and sebum European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2007 53, 107–113 49 Thacker R W., Becerro M A., Lumbang W A and Paul V J., Allelopathic Interactions between Sponges on a Tropical Reef Ecology, 1998 79, 1740-1750 50 Shukla S., Therapeutic importance of peptides from marine source: A mini review Indian Journal of Geo Marine Sciences, 2016 45(11), 1422-1431 51 Tsukamoto S., Yamanokuchi R., Yoshitomi M., Sato K., Ikeda T., Rotinsulu H., Mangindaan R E., de Voogd N J., van Soest R W and Yokosawa H Aaptamine, 47 an alkaloid from the sponge Aaptos suberitoides, functions as a proteasome inhibitor" Bioorg Med Chem Lett, 2010 20(11), 3341-3343 52 Turon X., Becerro M A., Uriz M J and Llopis J., Small-scale association measures in epibenthic communities as a clue for allelochemical interactions Oecologia, 1996 108, 351-360 53 Van Soest R W., Boury-Esnault N., Vacelet J., Dohrmann M., Erpenbeck D., De Voogd N J., Santodomingo N., Vanhoorne B., Kelly M and Hooper J N A., Global diversity of sponges (Porifera) PLoS One, 2012 (4), e35105 54 Wiens M., Krasko A., Perovic S and Müller W E., Caspase-mediated apoptosis in sponges: cloning and function of the phylogenetic oldest apoptotic proteases from Metazoa Biochim Biophys Acta, 2003 1593(2-3), 179-89 55 Wiens M., Diehl-Seifert B and Muller W E., Sponge Bcl-2 homologous protein (BHP2-GC) confers distinct stress resistance to human HEK-293 cells Cell Death Differ, 2001 8, 887-98 ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Đơn vị chủ trì thực Chủ nhiệm đề tài ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Phó Giám đốc phụ trách Phịng QLKH-HTQT ………, ngày tháng năm 20 Giám đốc 48 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng thống kê loài Hải miên phổ biến thu Nha Trang – Khánh Hoà với hoạt tính sinh học tương ứng Hoạt tính STT Lồi hải miên S E C MCF- Nguồn K562 HepG2 aureus coli albicans gốc Spheciospongia sp - - - - - - Xestospongia sp - - - - - - Dasychalina sp - - - - - - Haliclona (Gellius) amboinensis - - - - - - Stylissa sp - - - - - - Paratetilla bacca - - - - - - Aaptos suberitoides + + - + + + Hợp chất Gelliodes fibulata - - - - + + Hợp chất Haliclona sp + + - + + + Hợp chất 10 Biemna fortis - - - - - + Hợp chất 11 Lipastrotethya sp - - - + - - Protein Phụ lục 2: Quy trình tách chiết protein từ Hải miên Mẫu cho vào khay nhựa đặt -800C qua đêm Đông khô mẫu 24 máy đông khô ALPHA 1-4 LD plus (Christ Đức) Sử dụng máy xay để nghiền mẫu thành dạng bột Cân g mẫu cho vào ống falcon 50 ml Bổ sung 20 ml Tris-HCl 0,02M; pH 7,5 vortex Ủ lắc 40C 24h Ly tâm 15.000 vòng/phút 40C 20 phút Thu dịch Siêu ly tâm 40.000 vòng/phút 40C 30 phút 10 Thu dịch 11 Nồng độ dịch chiết protein thô xác định dựa khối lượng mẫu đông khô thể tích Tris-HCl, tương ứng với 50 mg/ml 12 Lọc dịch chiết thu qua màng lọc Millipore GV 0,45 µm (Millipore, USA), sau qua màng lọc Millipore GV 0,22 µm (Millipore, USA) 13 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford điện di SDS-PAGE Phụ lục 3: Quy trình phân đoạn protein từ Hải miên Rửa cột với lần thể tích cột (column volume – CV) tương ứng với 4,7 ml nước cất Cân cột với 10 CV đệm ban đầu (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0) Chỉnh pH mẫu đến pH 8,0 tải lên cột Rửa với 10 CV đệm ban đầu đến tín hiệu UV (ultraviolate) trở tín hiệu Thôi giải protein bám cột đệm giải (Tris-HCl 20 mM + NaCl 1M, pH 8,0) theo gradient từ đến 100% đệm giải (lên đến M NaCl) khoảng 15 CV Rửa cột với CV NaCl 1M (100% đệm giải) để loại bỏ hoàn toàn thành phần tạo liên kết ion cịn sót lại Tái cân cột 10 CV đệm ban đầu đến tín hiệu UV, pH, độ dẫn điện đạt yêu cầu Rửa cột CV nước cất Rửa cột CV ethanol 20% để bảo quản cột Các phân đoạn thu loại muối thông qua amicon KDa 40C, sau đánh giá phương pháp điện di SDS-PAGE đo nồng độ protein phương pháp Bradford