26 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CAO CHIẾT METHANOL VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA Dương[.]
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CAO CHIẾT METHANOL VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA Dương Nguyễn Phi Long*, Nguyễn Ngọc Hồng Xuân, Phạm Trần Kim Quyên Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: dnplong090996@gmail.com TÓM TẮT Địa y từ lâu biết đến hệ cộng sinh vi nấm dị dư�ng (mycobiont) sinh vật quang tự dư�ng thường tảo lục v���� lam (photobiont) Chúng thực chất tập đồn vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết, tạo nên loạt chất chuyển hố thứ cấp có tiềm ứng dụng trị liệu, chưa khai thác mức, đặc biệt địa y quốc gia cận nhiệt đới Việt Nam Thành phần chất chuyển hoá thứ cấp địa y xuất phát từ ba đường sinh hố gồm: đường acid shikimic (tạo nên hợp chất terphenyl quinon, dẫn xuất acid tetronic), đường acid mevalonic (tạo nên terpenoid, steroid), đường acetat – polymalonat (tạo nên depsid, depsidon, quinon, xanthon ) Có khoảng 1.000 hợp chất từ địa y phân lập xác định cấu trúc hoá học, chất thường tan nước, chiết xuất dung môi hữu cơ, hàm lượng chất dao động từ 0,1 – 10% khối lượng khơ tản, chí có lên đến 30% Từ khóa: Địa y, mycobiont, photobiont SURVEY OF THE MICROBIOLOGICAL RESISTANCE OF HIGH DETAILS OF METHANOL AND DISTRIBUTION FROM THE LOCAL DIRINARIA APPLANATA Duong Nguyen Phi Long*, Nguyen Ngoc Hong Xuan, Pham Tran Kim Quyen University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City *Corresponding Author: dnplong090996@gmail.com ABSTRACT Lichen known as a symbiotic system between heterotrophic fungi (mycobiont) and a photoautotrophic organism is usually green algae or cyanobacteria (photobiont) They are essentially a group of microorganisms with a close relationship, forming a series of secondary metabolites that have potential for therapeutic use, but have not been properly exploited, especially lichen in Vietnam subtropical countries like Vietnam The composition of secondary metabolites in lichen comes from three main biochemical pathways: shikimic acid pathway (constitutes terphenyl quinone compounds, tetronic acid derivatives), mevalonic acid pathway (constitutes terpenoids, steroid), acetate - polymalonat pathways (make up depsid, depsidon, quinon, xanthon ) More than 1,000 compounds from lichen have been isolated and chemically defined, which are often poorly soluble in water, can be extracted by organic solvents, the content of which ranges from 0.1 - 10% of the dry weight of the sink, even up to 30% Keywords: Lichen, mycobiont, photobiont địa y xuất phát từ ba đường sinh hố gồm: đường acid shikimic (tạo nên hợp chất terphenyl quinon, dẫn xuất acid tetronic), đường acid mevalonic (tạo nên terpenoid, steroid), đường acetat – polymalonat (tạo nên depsid, depsidon, quinon, xanthon ) Có khoảng 1000 hợp chất từ địa y phân lập xác định cấu trúc hoá học, chất thường tan nước, chiết xuất dung mơi hữu cơ, hàm lượng chất dao động từ 0,1 ĐẶT VẤN ĐỀ Địa y từ lâu biết đến hệ cộng sinh vi nấm dị dưỡng (mycobiont) sinh vật quang tự dưỡng thường tảo lục vi khuẩn lam (photobiont) Chúng thực chất tập đồn vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết, tạo nên loạt chất chuyển hoá thứ cấp có tiềm ứng dụng trị liệu, chưa khai thác mức, đặc biệt địa y quốc gia cận nhiệt đới Việt Nam Thành phần chất chuyển hoá thứ cấp 26 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 – 10% khối lượng khô tản, chí có lên đến 30% Nhiều quốc gia phát triển sản phẩm thương mại chứa hoạt chất từ địa y acid usnic, sử dụng làm thuốc sát trùng Đức Ý với biệt dược Camillen 60 Gessato dạng xịt dầu xoa trị nấm móng; Isla-Moos® Broncholind® có nguồn gốc từ Cetraria islandica phát triển Đức dùng điều trị cảm lạnh Điểm đáng ý clofazimine (Lamprene), kháng sinh kháng lao, phong danh mục thuốc thiết yếu WHO, phát triển từ diploicin, hợp chất phân lập từ địa y Buellia canescens Dirinaria applanata loài địa y đặc trưng vùng nhiệt đới cận nhiệt, nhiên có báo cáo lồi Việt Nam Về mặt sinh thái học, sở liệu Global Biodiversity Information Facility (GBIF), Việt Nam có hai ghi nhận lồi lưu vực sơng Hồng Đây lồi thích nghi tốt vùng nhiệt đới ẩm cận nhiệt, thường phát triển thân Trên thân Dừa tỉnh Bến Tre nơi có phát triển đa dạng lồi địa y Kỷ yếu khoa học Đặc điểm đại thể Quan sát, ghi nhận đặc điểm địa y lúc chưa thu hái tiến hành quan sát cấu tử chi tiết tản địa y kính hiển vi soi nổi, ghi nhận đặc điểm Đặc điểm vi thể Thực tiêu cắt ngang, quan sát kính hiển vi soi sau cắt ngang, phản ứng với KOH 10% nước (K test), phản ứng với NaClO (C test), phản ứng với KOH 10% sau đến NaClO (KC test) Quan sát tiêu cắt ngang với kính hiển vi quang học vật kính x40, thu nhật đặc điểm liên quan đến bào tử nấm vi tảo Phân tích sơ thành phần hóa học 10 gam bột địa y sử dụng để xác định nhóm hợp chất dựa phản ứng đặc trưng nhóm nhợp chất theo quy trình Ciuley cải tiến Khoa Dược, Đại học Y Dược Khảo sát dung môi chiết chất kháng k��� Nhằm phân lập định hướng chất kháng vi sinh vật, sử dụng dung môi có độ phân cực tăng dần để chiết cao tồn phần, chọn dung môi chiết cao ức chế mạnh đại diện vi khuẩn gram dương (MSSA), gram âm (E coli) vi nấm (C albicans) Điều chế đánh giá hoạt tính kháng VSV cao tồn phần Sử dụng dung môi chiết lựa chọn để tiến hành điều chế cao toàn phần Ngâm lạnh 150 gam bột địa y với 1,5 lít methanol 24 giờ, lặp lại lần Dịch chiết gộp chung cô áp suất thấp 50 ºC, thu lấy cao tồn phần Xác nhận hoạt tính cao tồn phần, chúng tơi tiến hành thử hoạt tính cao đối tượng VSV gây bệnh thường gặp bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm da phương pháp khuếch tán pha loãng thạch Phân lập xác định chất có hoạt tính kháng vi sinh vật Cao toàn phần tách phân đoạn sắc ký cột chân khơng, xác định cao phân đoạn có hoạt tính kháng VSV phương pháp khuếch tán Từ đó, chất có hoạt tính kháng VSV phân lập định hướng sắc ký cột cổ điển, sắc ký lớp mỏng kết hợp tự sinh đồ Tinh khiết hóa hoạt chất, đo phổ NMR kết hợp MS để giải cấu trúc hoạt chất khánh vi sinh vật ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dược liệu Địa y Dirinaria applanata thu hái thân dừa Cocos nucifera huyện Giồng Trơm, tỉnh Bến Tre bán kính km quanh vị trí có tọa độ 10,14 Bắc, 106,52 Đông Vi sinh vật thử nghiệm Staphylococcus aureus ATCC 29213 (MSSA) Staphylococcus aureus ATCC 33591 (MRSA) Streptococcus pneumoniae ATCC 44619 Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Enterococcus faealis ATCC 29212 Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 35657, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii 1717, Candida albicans ATCC 10231, Candica tropicalis, PNT20, Trichophyton rubrum UPCC01 Trichophyton mentagrophytes UPCC02, Microsporum canis VB2, Microsporum gypseum UPCC03 Phương pháp nghiên cứu Khảo sát đặc điểm hình thái Hình thái học địa y phân tích thơng qua nhóm đặc điểm đại thể vi thể 27 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học µg/ml Hoạt tính ức chế cao vi khuẩn Gram âm khơng đáng kể Cơ lập hoạt chất kháng vi sinh vật Cao toàn phần methanol sau thực sắc ký cột chân không thu phân đoạn tiến hành đánh giá hoạt tính cao phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy với nồng độ mg/đĩa thu kết Cao phân đoạn H C khơng thể hoạt tính kháng vi sinh vật Cao phân đoạn CE cho vòng ức chế nhỏ nấm men Cao phân đoạn E cho vòng ứng chế lớn hầu hết vi sinh vật khảo sát Cao phân đoạn M cho hoạt tính kháng MSSA, MRSA, K pneumoniae nấm da với vòng ức chế nhỏ Sắc ký lớp mỏng kết hợp tự sinh đồ Cao phân đoạn E triển khai SKLM với hệ dung môi CHCl3 – EtOAc – AcOH (9:1:0,2) Quan sát UV 254 nm, 365 nm thuốc thử VS thu vết có Rf 0,09; 0,12; 0,5; 0,71 Tiến hành tự sinh đồ vi sinh vật đại diện gồm Gram dương MSSA, Gram âm A baumannii, nấm men C albicans, nấm da T rubrum đồ xuất vịng kháng MSSA vị trí có giá trị Rf = 0,12; tắt quang UV 254 nm màu đỏ đậm phun thuốc thử VS Vết thể tác động kháng khuẩn định hướng cho bước phân lập (vết mục tiêu) Phân lập xác định chất có hoạt tính kháng vi sinh vật Cao phân đoạn E tiến hành sắc ký cột cổ điển với hệ dung môi tăng dần độ phân cực, phân tách hoạt chất tinh khiết DA-1 DA-2 DA-2 vết mục tiêu DA-1 đạt yêu cầu mặt độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng với hệ Hệ 1: n – hexan – CH2Cl2 – AcOH (7:3:0,2), Rf = 0,20 Hệ 2: CHCl3 – EtOAc – AcOH (9:1:0,2), Rf = 0,58 Hệ 3: EtOEt – Aceton – AcOH (9:1:0,2), Rf = 0,70 DA-2 đạt yêu cầu mặt độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng với hệ Hệ 1: CHCl3 – EtOAc – AcOH (9:1:0,2), Rf = 0,19 Hệ 2: CHCl3 – EtOAc – AcOH (1:9:0,2), Rf = 0,37 Hệ 3: CHCl3 – MeOH – AcOH (7:3:0,2), Rf = 0,62 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu hoạt chất Giá trị MIC xác định phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng theo hướng dẫn CLSI Thử nghiệm động học diệt k��� hoạt chất Thử nghiệm tiến thành hướng dẫn CLSI KẾT QUẢ Khảo sát đặc điểm hình thái Đại thể: Mẫu địa y thu có đường kính tản dao động từ 5-10 cm, tản nhỏ 0,5 cm, thùy phát triển rộng 0,4-2,0 mm, dạng lông chim nhau, gấp nếp theo chiều dọc hướng ngồi Bề mặt có màu xanh nhạt, xanh xám, xám nhạt, lên cấu trúc quan sinh sản đặc trưng cho chi Dirinaria bào tử phấn (soredia) Không thấy xuất thể đĩa Mặt có màu đen giữa, rìa màu đen nâu Vi thể: mẫu địa tươi, cắt thành lát cắt mỏng soi kính hiển vi theo thứ tự từ ngồi vào gồm lớp: lớp vỏ trên, lớp tảo, lớp tủy, lớp vỏ Cơ quan sinh sản vơ tính gồm bào tử phấn cấu tạo sợi nấm bao bọc quanh vi tảo hình cầu Cơ quan sinh sản hữu tính khơng phát Phân tích sơ thành phần hóa học Trong thành phần địa y qua phân tích sơ cho thấy có nhiều tinh dầu, triterpenoid, coumarin, anthraglycosid, tannin Khảo sát dung môi chiết chất kháng k��� Khả ức chế MSSA thể tất dịch chiết, trừ dịch chiết n – hexan Khơng có dịch chiết ức chế vi khuẩn E coli Dịch chiết methanol cho đường kính vịng ức chế lớn nhất, đồng thời thể hoạt tính vi nấm C albicans, đó, chúng tơi chọn methanol làm dung môi chiết tách chất kháng khuẩn, kháng nấm từ địa y Điều chế đánh giá hoạt tính kháng VSV cao toàn phần Cao methanol địa y kháng nhóm VSV thử nghiệm gồm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm men nấm da Trong đó, vi khuẩn Gram dương bị ức chế nồng độ < 200 µg/ml; đặc biệt S pyogenes (MIC ≤ 20 µg/ml), MRSA (MIC = 78,1 µg/ml) Khả ức chế nấm men nấm da dao động nồng độ từ 78,1 – 312,5 28 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Sau hoạt chất xác định độ tinh khiết, đo phổ NMR kết hợp MS, giải phổ thu Kỷ yếu khoa học chất acid atraric (DA-1) acid divaricatic (DA-2) DA-1 DA-2 Hình Hai hoạt chất thu nhận sau giải phổ Xác định nồng độ ức chế tối thiểu hoạt chất Bảng Nồng độ ức chế tối thiểu hoạt chất DA-1 DA-2 Vancomycin Ceftazidim Fluconazol Vi sinh vật MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC > 85 ± 128 ± 256 256 ± S pneumoniae > 512 ≤1 ≤1 512 37 ±0 > 16 ± S pyogenes > 512 ± ≤1 ≤1 2±0 8±0 512 > 64 ± 64 ± 512 E faecalis > 512 ≤1 ≤1 > 512 512 0 ±0 16 ± 32 ± 16 ± 16 ± > MSSA > 512 ≤1 ≤1 0 0 512 > 32 ± 64 ± 256 512 ± MRSA > 512 ≤1 ≤1 512 0 ±0 > > E coli > 512 > 512 - 2±0 2±0 512 512 > > K pneumoniae > 512 > 512 - 2±0 2±0 512 512 > > 64 ± 128 ± A baumanni > 512 > 512 512 512 0 > > P aeruginosa > 512 > 512 - 4±0 4±0 512 512 > 256 512 ± 32 ± 32 ± C albicans > 512 512 ±0 0 > > 16 ± 16 ± C tropicalis > 512 > 512 512 512 0 128 128 ± T rubrum ≤1 ≤1 ±0 T 128 128 ± - 8±0 8±0 mentagrophytes ±0 - không thực Hợp chất DA-1 khơng thể hoạt tính kháng VSV chủng khảo sát nồng độ thử 512 µg/ml Hợp chất DA-2 có tác động tốt vi khuẩn Gram dương, giá trị MIC, MBC tương đương thấp so với ceftazidim Tỷ lệ MBC/MIC DA-2 tất VSV thử nghiệm không vượt 4, cho thấy DA-2 có tác động diệt khuẩn, diệt nấm Hợp chất DA-2 có tác động ức chế mạnh hai vi khuẩn S pyogenes S aureus, tiến hành đánh giá động học diệt 29 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học Sự khác biệt khác mơi trường thử nghiệm, Deskins cs sử dụng môi trường MHB có điều chỉnh cation Acid divaricatic Đã có nhiều báo cáo phân lập acid divaricatic từ loài địa y khác chủ yếu loài Lecanora frustulosa, gần từ Evernia mesomorpha vào năm 2018 Acid divaricatic ghi nhận hợp chất thường tìm thấy địa y thuộc chi Dirinaria Trong nghiên cứu này, acid divaricatic có khả ức chế tốt vi khuẩn Gram dương, cụ thể giá trị MIC 32 µg/ml MRSA µg/ml S pyogenes Khơng thể hoạt tính nấm men vi khuẩn Gram âm thử nghiệm Hoạt tính kháng VSV acid divaricatic báo cáo Oh cs (2018) cho giá trị tương tự nghiên cứu Ngồi ra, chúng tơi bổ sung liệu khả ức chế số chủng nấm da thường gặp người gồm T rubrum T mentagrophytes, giá trị MIC = 128 ± µg/ml Tương tự, Schmeda‐ Hirschmann cs (2008) báo cáo acid divaricatic có khả ức chế nấm da khoảng nồng độ từ 50 – 100 µg/ml Dựa vào tỷ lệ MBC/MIC liệu đường cong diệt khuẩn theo thời gian hai mức nồng độ MIC 2MIC, kết luận sơ acid divaricatic chất diệt khuẩn phụ thuộc nồng độ S aureus ATTC 33591 (MRSA) Thử nghiệm đường cong động học diệt khuẩn đánh giá thử nghiệm kháng khuẩn in vitro cho tương quan in vivo mạnh Kết luận Loài địa y phân bố thân Dừa huyện Giồng Trơm, tỉnh Bến Tre có đặc điểm hình thái phù hợp với mơ tả vầ Dirinaria applanata Qua sơ phân tích thành phần hóa học, nhóm hợp chất D Applanata gồm tinh dầu, triterpenoid, coumarin, anthraglycosid, tannin Khi chiết xuất địa y với dung mơi có độ phân cực khác nhau, kết cho thấy methanol dung môi phù hợp, chiết tốt hợp chất kháng VSV Từ đó, sử dụng kỹ thuật sắc ký kết hợp với tự sinh đồ, phân lập hợp chất DA-1 DA-2 DA2 hợp chất cho tác động kháng khuẩn D applanata Acid divaricatic (DA-2) cho tác động kháng MRSA S pyogenes với MIC 32 µg/ml µg/ml Ngồi ra, DA- khuẩn DA-2 vi khuẩn này; S aureus sử dụng chủng MRSA BÀN LUẬN Đặc điểm thực vật học phản ứng hóa học liên quan đến định danh Các đặc điểm phân bố sinh thái, thực vật học, hóa học phù hợp với mơ tả chi lồi Dirinaria applanata vùng địa lý khác Trong mẫu địa y nghiên cứu, không phát thấy thể đĩa, tượng phù hợp với nhận định thể đĩa gặp Dirinaria applanata, báo cáo tài liệu trước phản ứng hóa học liên quan đến định danh, theo J A Elix (2009) phần vỏ Dirinaria applanata cho màu vàng phản ứng với KOH 20%, âm tính phép thử C KC; phần tủy âm tính với phép thử K, C, KC Đặc điểm hoàn toàn tương đồng với kết nghiên cứu Thành phần hóa học Dirinaria applanata biết đến chứa nhiều atranorin cho phản ứng màu vàng tiếp xúc với KOH 20%, terpenoid (phản ứng Liebermann – Burchard), acid divaricatic, cấu trúc depsid phân lập nghiên cứu Phản ứng kết tinh vi tinh thể cho thấy tinh thể hình kim, dạng chẻ nhánh tương đồng với mơ tả hình ảnh acid divaricatic Huneck cs (1996) Acid atraric Acid atraric tìm thấy rễ Anh đào châu Phi (Prunus africana) hay “rêu sồi” (Evernia prunastri), loài địa y dùng để làm hương liệu nước hoa Hợp chất phân lập từ vỏ loài thuộc họ Núc nác, Newbouldia laevis Tại thời điểm nghiên cứu, chúng tơi chưa tìm thấy báo cáo acid atraric phân lập từ địa y thuộc chi Dirinaria nói chung D applanata nói riêng Về hoạt tính kháng vi sinh vật, nghiên cứu acid atraric hoạt tính ức chế VSV thử nghiệm nồng độ thử 512 µg/ml Tuy nhiên, theo Deskins cs (2014), hợp chất thể hoạt tính ức chế Bacillus cereus, S aureus với MIC 156 µg/ml; ức chế Aspergillus niger với MIC 39 µg/ml; ức chế C albicans MIC 78 µg/ml 30 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019 Kỷ yếu khoa học nghiệm hoạt tính DA-2 mơ hình ức chế bám dính vi khuẩn ức chế biofilm hình thành xây dựng quy trình tổng hợp acid divarcatic acid atraric với số dẫn chất, đồng thời nghiên cứu biến đổi hoạt tính thay đổi nhóm hoạt chất chứng minh chất diệt khuẩn với MBC = 2MIC (trên MRSA) xác định đường cong diệt khuẩn (time-kill curve) Trong nghiên cứu tiếp theo, chúng tơi thử nghiệm số hoạt tính sinh học khác chống oxi hóa, độc tế bào dịng tế bào ung thư chất phân lập được, thử TÀI LIỆU THAM KHẢO BARROW G I., FELTHAM R K A., 1993 Covan and Steel's manual for the identification of medical bacteria, 3nd edn Cambridge University Press, Cambridge CHATTERJEE S., HALDAR S., 2012 Vibrio related diseases in aquaculture and development of rapid and accurate identification methods J Marine Sci Res Dev S1 31 ... thể hoạt tính kháng vi sinh vật Cao phân đoạn CE cho vòng ức chế nhỏ nấm men Cao phân đoạn E cho vòng ứng chế lớn hầu hết vi sinh vật khảo sát Cao phân đoạn M cho hoạt tính kháng MSSA, MRSA, K... khuẩn, kháng nấm từ địa y Điều chế đánh giá hoạt tính kháng VSV cao toàn phần Cao methanol địa y kháng nhóm VSV thử nghiệm gồm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm men nấm da Trong đó, vi. .. quy trình Ciuley cải tiến Khoa Dược, Đại học Y Dược Khảo sát dung môi chiết chất kháng k��� Nhằm phân lập định hướng chất kháng vi sinh vật, sử dụng dung môi có độ phân cực tăng dần để chiết cao