Đánh giá tác động của cao chiết methanol cây Ích mẫu (Leonurus japonicus Houtt.) lên tế bào ung thư máu K562 và khả năng gây độc trên ấu trùng tôm

Bài viết Đánh giá tác động của cao chiết methanol cây Ích mẫu (Leonurus japonicus Houtt.) lên tế bào ung thư máu K562 và khả năng gây độc trên ấu trùng tôm tập trung vào việc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu K562 và độc tính trên ấu trùng tôm của cao methanol chiết xuất từ cây Ích Mẫu.

ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 19, NO 3, 2021 37 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA CAO CHIẾT METHANOL CÂY ÍCH MẪU (LEONURUS JAPONICUS HOUTT.) LÊN TẾ BÀO UNG THƯ MÁU K562 VÀ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TRÊN ẤU TRÙNG TÔM INVESTIGATION INTO THE CYTOTOXIC EFFECTS OF ORIENTAL MOTHERWORT (LEONURUS JAPONICUS HOUTT.) METHANOL EXTRACT ON K562 LEUKEMIA CELLS AND THE ARTEMIA ACUTE TOXICITY TEST Trần Hoàng Hải1, Nguyễn Thái Thanh Ngân1, Hồng Thành Chí1, Nguyễn Thị Liên Thương1, Bùi Thị Kim Lý1* Viện Phát triển Ứng dụng, Trường Đại học Thủ Dầu Một *Tác giả liên hệ: lybtk@tdmu.edu.vn (Nhận bài: 30/3//2020; Chấp nhận đăng: 23/3/2021) Tóm tắt - Ích Mẫu có tên khoa học Leonurus japonicus Houtt., từ lâu ứng dụng rộng rãi điều trị bệnh quốc gia phương Đông, đặc biệt bệnh phụ khoa phái nữ Ở Việt Nam, Ích Mẫu biết đến với số tên gọi dân gian khác Chói đèn Sung úy Mặc dù, ứng dụng nhiều việc phòng ngừa chữa trị nhiều bệnh khác cịn cơng bố nước độc tính Ích Mẫu tế bào ung thư, đặc biệt bệnh ung thư máu Do đó, nghiên cứu nhóm tác giả tập trung vào việc đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu K562 độc tính ấu trùng tơm cao methanol chiết xuất từ Ích Mẫu Kết cho thấy, cao chiết methanol Ích Mẫu có khả ức chế tốt phát triển dòng tế bào ung thư máu K562 với giá trị IC50 62,49 ± 9,43 g/ml Đồng thời, cao chiết không gây độc cho ấu trùng tôm Artemia Abstract - Oriental Motherwort has the scientific name of Leonurus japonicus Houtt in Eastern countries, it is widely used to treat many types of human diseases especially gynecological diseases In Viet Nam, Oriental Motherwort is also referred to as Choi den and Sung uy Although it has been extensively used in the prevention and treatment of many diseases, there is still very little publication on the cancer toxicity of this herb Therefore, this study focuses on the cytotoxicity effects of Oriental Motherwort methanol extract on K562 leukemia human cancer and the Artemia acute toxicity test The results have shown that, the methanol extract from Oriental Motherwort has a good ability to inhibit the proliferation of K562 cells; the IC50 value is 62.49 ± 9.43 g/ml In addition, the Methanol extract shows no negative effect on Artemia Từ khóa - Ích Mẫu; Leonurus japonicus Houtt.; khả gây độc tế bào; tế bào ung thư máu K562; Artemia Key words - Oriental Motherwort; Leonurus japonicus Houtt.; Cytotoxicity effects; K562 leukemia cells; Artemia Đặt vấn đề Ích Mẫu dân gian cịn biết đến với số tên gọi khác như: Chói đèn Sung úy (dành để hạt) Loài thảo dược có tên khoa học Leonurus japonicus Houtt., lồi thân cỏ thuộc họ hoa môi (Lamiaceae), sống từ đến năm, cao mét, thân vuông, có phiến chẻ sâu thành 3-5 thùy hẹp, có lơng mặt Chụm nách lá, đài cao 5-6mm, răng, có lơng, vành đỏ cao 15-20 mm, môi rộng, môi ngắn môi trên, thùy, tiểu nhụy, bế to 2mm, có cạnh [1] Ích Mẫu phát nhiều nước Đông Á như: Trung Quốc, Nhật Bản Hàn Quốc [1] Tại Việt Nam, mọc hoang bãi sông, ruộng ngô thung lũng trồng nhiều số tỉnh, thành, trải dài từ Bắc vào Nam như: Lào Cai (Sa Pa), n Bái (n Bình), Hà Giang (Hồng Su Phì) Thành Phố Hồ Chí Minh (Chợ Quán) [1] Về thành phần hóa học, theo viện dược liệu Ích Mẫu Việt Nam có chứa loại alkaloid, có alkaloid với N bậc 4; flavonoid có rutin, glucoid có khung steroid, acid amin, tanin, chất đắng, saponin 0,03% tinh dầu Cho đến nay, giới phân lập 280 chất chuyển hóa thứ cấp từ lồi [2] Về hoạt tính sinh học, từ lâu Ích Mẫu xem thần dược phái đẹp Trung Quốc, có nhiều nghiên cứu chuyên sâu thành phần hóa học hoạt tính dược lý Ích Mẫu quốc gia [3] Các hoạt tính sinh học báo cáo gồm có hoạt động điều hịa mạch máu [4], hoạt tính đơng máu [5], hoạt tính gây độc tế bào [6], hoạt tính tạo mạch [7], hoạt tính kháng khuẩn [8], hoạt động ngưng kết tiểu cầu [9] tác động lên trơn tử cung [10] Theo Dược điển Việt Nam V, Ích Mẫu dùng để điều trị rối loạn kinh nguyệt, kinh đau, kinh bế, khí hư bạch đới, rong kinh, rong huyết, huyết hôi không hết, phù thủng, tiểu tiện không lợi [11] Mặc dù, nghiên cứu rộng rãi giới, nghiên cứu hoạt tính sinh học Ích Mẫu nước cịn ít, đặc biệt công bố đánh giá mức độ gây độc dịng tế bào ung thư máu Do đó, báo nhóm tác giả tập trung nghiên cứu khả gây độc tế bào cao chiết methanol Ích Mẫu tế bào ung thư máu dịng K562 đánh giá tính an tồn sử dụng cao chiết mơ hình ấu trùng Artermia Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu, tế bào Ích Mẫu phơi khơ thu mua Cơng ty Thảo dược Thanh Bình (Quận Gị Vấp, Thành phố Hồ Chí Minh) vào tháng năm 2020 Institute of Applied Technology, Thu Dau Mot University (Tran Hoang Hai, Nguyen Thai Thanh Ngan, Hoang Thanh Chi, Nguyen Thi Lien Thuong, Bui Thi Kim Ly) 38 Trần Hoàng Hải, Nguyễn Thái Thanh Ngân, Hồng Thành Chí, Nguyễn Thị Liên Thương, Bùi Thị Kim Lý Tế bào K562 cung cấp TS Phạm Thị Kim Trâm (Trung tâm Công nghệ Sinh học, TPHCM) 2.2 Phương pháp thu nhận cao chiết methanol 100 gram Ích Mẫu phơi khơ xay nhuyễn ngâm dầm ngập dung môi methanol (Merk), ngâm dầm cho lượng dung môi ngập qua khỏi bề mặt bột Ích Mẫu đạt khoảng 200 ml, lắc hỗn hợp máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút 24 Lọc lấy phần dịch bên qua giấy lọc Whatman, phần bã Ích Mẫu cịn lại tiếp tục bổ sung thêm 200 ml dung môi methanol lặp lại bước thêm lần Dịch lọc từ lần chiết gom lại, sau quay loại bỏ dung môi để thu cao methanol [12] 2.3 Phương pháp chuẩn bị dịch chiết Cao chiết methanol Ích Mẫu hịa tan dung mơi Dimethyl sulfoxide (DMSO) để đạt nồng độ gốc 200 mg/ml Sau đó, dịch chiết lọc qua màng lọc 0,45 0,22 µm tủ cấy vơ trùng Dịch chiết lưu trữ lạnh -20°C rã đông trước sử dụng 2.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào Dịng tế bào ung thư máu K562 ni cấy đĩa có chứa mơi trường Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 có bổ sung 10% huyết phổi bò (fetal bovine serum) kháng sinh 5% penicillin/streptomycin Sau đó, đem ni cấy 37°C điều kiện cấp ẩm nạp CO2 liên tục mức 5% 2.5 Phương pháp đánh giá độc tính tế bào Hoạt tính gây độc tế bào cao chiết methanol Ích Mẫu xác định theo phương pháp nhuộm Trypan Blue [13] Các bước cụ thể tiến hành sau: 2.5.1 Chuẩn bị tế bào Theo dõi mật số tế bào đĩa nuôi cấy đến đạt 80% khơng gian ni tiến hành thu hoạch ly tâm để loại bỏ dịch nuôi cũ, tạp chất hình thành trình phát triển tế bào Hịa cặn tế bào với lượng môi trường RPMI định, cho mật độ tế bào dung dịch đạt 2x10 tế bào/ml 2.5.2 Chuẩn bị dịch chiết Dịch chiết methanol Ích Mẫu (200 mg/ml) pha lỗng thành nồng độ khác nhau, cho nồng độ cuối tổng thể tích dịch thử có giá trị khoảng từ 6,25 đến 100 µg/ml 2.5.3 Đánh giá khả gây độc tế bào Tế bào ung thư máu K562 bổ sung vào đĩa giếng, giếng 1,5 ml dung dịch tế bào 1,5 ml dịch chiết methanol Ích Mẫu nồng độ khảo sát khác chuẩn bị Ở giếng đối chứng, bổ sung vào 1,5 ml mơi trường ni cấy thay cao chiết methanol Ích Mẫu, lượng DMSO thêm vào tương ứng với giá trị cao nồng độ giếng xử lý Mẫu thử lắc ủ vịng 48 Sau hồn tất trình ủ, mẫu thu hoạch ly tâm để thu hồi cặn chứa tế bào Hòa cặn với môi trường RPMI Trộn dịch tế bào với thuốc nhuộm Trypan blue theo tỷ lệ 1:1 Sau đó, nhỏ 10 µl hỗn hợp vừa trộn vào mép lamen để dịch mao dẫn tràn khắp buồng đếm Dựa vào tượng bắt màu để đếm số lượng sống, chết tế bào vật kính 10 Trong đó, tế bào sống không bắt màu thuốc nhuộm ngược lại tế bào chết bắt màu thuốc nhuộm Tính tốn tỉ lệ tế bào sống giếng xử lý so với đối chứng [13] 2.6 Phương pháp thử nghiệm độc tính ấu trùng tôm Artermia Ấp ấu trùng dung dịch nước muối nồng độ 10 gram NaCl/1 lít nước điều kiện sục khí oxy liên tục 24 ánh sáng Sau trứng nở, chuyển ấu trùng vào cốc thủy tinh chuẩn bị sẵn từ trước đó, cho số lượng ấu trùng cốc đạt 30 cá thể/20 ml nước muối Pha lỗng cao chiết methanol Ích Mẫu (200 mg/ml) nước muối nuôi ấu trùng nồng độ 100 mg/ml Sau đó, bổ sung vào cốc chứa ấu trùng: 6,25; 12,5; 25; 50 100 µL dịch chiết Ích Mẫu Đồng thời, bổ sung vào cốc đối chứng âm 100 µL DMSO Trước cho dịch chiết DMSO vào cốc, cần phải hút bỏ lượng thể tích mơi trường tương ứng với thể tích dịch thử bổ sung vào Thường xuyên lắc mẫu để dịch chiết tác động lên ấu trùng Sau giờ, sử dụng thấu kính phóng đếm số lượng ấu trùng chết tính tốn tỷ lệ phần trăm tử vong Ấu trùng coi chết chúng không di chuyển vài giây sau dùng vật nhọn chạm vào quan sát Nồng độ gây chết 50% có trung bình sai số chuẩn tính tốn cách sử dụng đường cong hồi quy phi tuyến tính có phần mềm thống kê lăng kính Graphpad Prism [14] 2.7 Phương pháp phân tích số liệu Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Kết thí nghiệm xử lý phần mềm Graphpad Prism Kết thảo luận 3.1 Tác động cao chiết methanol Ích Mẫu lên tăng sinh tế bào K562 theo nồng độ Kết khảo sát khả gây độc cao chiết methanol Ích Mẫu dòng tế ung thư máu K562 thể cụ thể thơng qua Bảng Hình Bảng Tác động cao chiết Ích Mẫu lên tăng sinh tế bào K562 theo nồng độ Phần trăm tế bào sống (%) Nồng độ (g/ml) Lần Lần Lần 100,00 100,00 100,00 6,25 92,93 91,61 76,49 12,5 70,98 75,81 63,01 25 70,49 68,06 60,50 50 69,27 47,42 57,68 100 44,39 31,29 42,32 Từ kết Bảng cho thấy cao chiết methanol Ích Mẫu có tác động gây độc lên sống dòng tế bào ung thư máu K562 theo nồng độ Giá trị IC50 trung bình lần lặp lại sau xử lý thống kê 62,49 ± 9,43 (g/ml) Hình biểu đồ thể mối tương quan nồng ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 19, NO 3, 2021 độ cao chiết Ích Mẫu phần trăm tế bào K562 sống sau xử lý phần mềm thống kê từ Bảng Từ Hình suy rằng, ức chế tăng sinh tế bào K562 cao chiết từ Ích Mẫu phụ thuộc vào nồng độ cao chiết 39 Khả tăng sinh dòng tế bào ung thư máu K562 mẫu chứng mẫu thử có khác biệt đáng kể 72 khảo sát (Hình 2) Đối với mẫu chứng, số lượng tế bào K562 không ngừng gia tăng qua mốc thời gian khảo sát Ngược lại, số lượng tế bào K562 mẫu thử tăng nhẹ 48 đầu sau bắt đầu suy giảm giai đoạn 72 Phần trăm tế bào sống (%) 1000 800 600 Ích mẫu 400 200 Hình Tác động cao chiết Ích Mẫu lên tăng sinh tế bào K562 3.2 Tác động cao chiết methanol Ích Mẫu lên tăng sinh tế bào K562 theo thời gian Bên cạnh xác định giá trị IC50 việc tìm hiểu tác động dược liệu lên dòng tế bào ung thư mục tiêu theo mốc thời gian tiêu quan trọng việc nghiên cứu thuốc giai đoạn tiền lâm sàng Bảng kết thống kê phản ánh khác biệt phần trăm tế bào ung thư máu K562 cịn sống có diện (mẫu thử) khơng có diện (mẫu chứng) cao chiết methanol Ích Mẫu nồng độ 100 g/ml theo cột mốc thời gian (0 giờ, 24 giờ, 48 72 giờ) Bảng Phần trăm tế bào sống mẫu chứng mẫu xử lý cao chiết theo thời gian Phần trăm tế bào sống (%) Mẫu chứng Đối chứng 24 48 72 Thời gian (giờ) Hình Tác động cao chiết Ích Mẫu lên tăng sinh tế bào K562 theo thời gian 3.3 Tác động cao chiết methanol Ích Mẫu lên sống ấu trùng tôm Kết khảo sát độc tính cao chiết methanol Ích Mẫu liều cao ấu trùng tôm thể thông qua Bảng Bảng Phần trăm tôm sống mẫu chứng mẫu xử lý cao chiết Phần trăm tôm sống (%) Nồng độ (g/ml) Lần Lần Lần (DMSO) 100,00 100,00 100,00 50 100,00 100,00 112,27 100 82,76 89,28 99,07 Thời gian Lần Lần Lần 150 93,10 89,29 110,18 100,00 100,00 100,00 200 96,55 85,71 110,65 24 225,64 180,00 165,83 250 93,10 85,71 93,98 48 525,64 400,00 322,08 300 86,21 85,71 94,44 72 779,48 805,00 824,58 350 89,66 89,29 97,69 Mẫu cao chiết 400 79,31 85,71 102,55 Thời gian Lần Lần Lần 450 79,31 71,43 94,44 100,00 100,00 100,00 500 72,41 89,29 102,08 24 135,00 184,62 140,00 48 180,00 220,51 215,00 72 155,00 207,69 195,00 Nhìn chung, kết Bảng cho thấy, tác động cao chiết methanol Ích Mẫu dịng tế bào ung thư máu K562 24 đầu gần khơng có khác biệt đáng kể Ở cột mốc 24 (48 giờ), phần trăm tế bào K562 sống mẫu thử mẫu chứng có khác biệt rõ rệt; Số lượng tế bào K562 mẫu chứng cao khoảng 1,5 - lần so với mẫu thử Kết cho thấy, cao chiết methanol Ích Mẫu có khả gây độc nhẹ cho ấu trùng Artermia liều cao Cụ thể, số lượng ấu trùng chết khoảng 30% so với mẫu chứng phải nồng độ 500 g/ml Mặc dù, dãy nồng độ khảo sát tương đối cao chưa xác định nồng độ gây chết 50% số lượng ấu trùng (LC50) Số lượng ấu trùng sống so với thời điểm ban đầu ln trì mức 70% trở lên sau lần lặp lại Từ biểu đồ Hình thấy, ấu trùng tơm có chịu tác động cao chiết methanol Ích Mẫu Tuy 40 Trần Hồng Hải, Nguyễn Thái Thanh Ngân, Hồng Thành Chí, Nguyễn Thị Liên Thương, Bùi Thị Kim Lý nhiên, gần khơng có khác biệt ý nghĩa mặt thống kê nồng độ khảo sát Hình Tác động cao chiết Ích Mẫu lên sống ấu trùng tôm Kết luận Từ kết khảo sát sơ nhóm tác giả rút kết luận, Ích Mẫu cao chiết có tiềm ức chế tăng sinh tế bào ung thư máu không gây độc ấu trùng tôm Kết nghiên cứu sở, định hướng cho nghiên cứu sâu sau chế tác động cần làm rõ để có thêm sở khoa học đưa Ích Mẫu ứng dụng vào thực tiễn điều trị bệnh ung thư máu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm-Hoàng-Hộ, Cây cỏ Việt Nam Quyển II Nhà xuất Trẻ, 1999 [2] L.-L Miao, Q.-M Zhou, C Peng, Z.-H Liu, and L Xiong, "Leonurus japonicus (Chinese motherwort), an excellent traditional medicine for obstetrical and gynecological diseases: A comprehensive overview", Biomedicine & Pharmacotherapy, vol 117, Elsevier, 2019, 1-18 [3] C Peng, "Chinese genuine medicinal materials”, Chinese Press of Traditional Chinese Medicine, Beijing, 2011, 4187-4188 [4] F Peng, L Xiong, and X.-M Zhao, "A bicyclic diterpenoid with a new 15, 16-dinorlabdane carbon skeleton from Leonurus japonicus and its coagulant bioactivity", Molecules, vol 18, MDPI, 2013, 13904-13909 [5] Q.-m Zhou, C Peng, H Yang, L.-s Liu, Y.-t Yang, X.-f Xie, et al., "Steroids from the aerial parts of Leonurus japonicus", Phytochemistry Letters, vol 12, Elsevier, 2015, 287-290 [6] Y.-L He, J.-Y Shi, C Peng, L.-J Hu, J Liu, Q.-M Zhou, et al., "Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos", Fitoterapia, vol 128, Elsevier, 2018, 36-42 [7] L Xiong, C Peng, Q.-M Zhou, F Wan, X.-F Xie, L Guo, et al., "Chemical composition and antibacterial activity of essential oils from different parts of Leonurus japonicus Houtt", Molecules, vol 18, MDPI, 2013, 963-973 [8] L Xiong, Q.-M Zhou, C Peng, X.-F Xie, L Guo, X.-H Li, et al., "Sesquiterpenoids from the herb of Leonurus japonicus", Molecules, vol 18, MDPI, 2013, 5051-5058 [9] H Yang, Q Zhou, C Peng, L Liu, X Xie, L Xiong, et al., "Coumarins from Leonurus japonicus and their anti-platelet aggregative activity", China Journal of Chinese Materia Medica, vol 39, 2014, 4356-4359 [10] J Liu, C Peng, Q.-M Zhou, L Guo, Z.-H Liu, and L Xiong, "Alkaloids and flavonoid glycosides from the aerial parts of Leonurus japonicus and their opposite effects on uterine smooth muscle”, Phytochemistry, vol 145, Elsevier, 2018, 128-136 [11] Bộ Y Tế, “Dược-điển-Việt-Nam-V, (Tập 2)” Hà Nội: Nhà xuất Y học, 2018 [12] Nguyễn-Kim-Phi-Phụng, Phương pháp cô lập hợp chất hữu Tp HCM: Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 2007 [13] Nicholas Greco and L O’Donnel., "Determining cellular viability using Trypan blue Cellular Therapy: Principle, Method and Regulation", chapter 47, method 47-1, Bethesda, Ed., 2019, 565 – 566 [14] O A.-O Ogbole, P A Segun, and A J Adeniji, "In vitro cytotoxic activity of medicinal plants from Nigeria ethnomedicine on Rhabdomyosarcoma cancer cell line and HPLC analysis of active extracts", B M C Complement Altern Med, vol.17, Springer Nature, 2017, 1472-6882  ... 3.1 Tác động cao chiết methanol Ích Mẫu lên tăng sinh tế bào K562 theo nồng độ Kết khảo sát khả gây độc cao chiết methanol Ích Mẫu dịng tế ung thư máu K562 thể cụ thể thơng qua Bảng Hình Bảng Tác. .. 3.3 Tác động cao chiết methanol Ích Mẫu lên sống ấu trùng tôm Kết khảo sát độc tính cao chiết methanol Ích Mẫu liều cao ấu trùng tôm thể thông qua Bảng Bảng Phần trăm tôm sống mẫu chứng mẫu xử... 6,25 đến 100 µg/ml 2.5.3 Đánh giá khả gây độc tế bào Tế bào ung thư máu K562 bổ sung vào đĩa giếng, giếng 1,5 ml dung dịch tế bào 1,5 ml dịch chiết methanol Ích Mẫu nồng độ khảo sát khác chuẩn bị