Thiết lập công nghệ nuôi cấy tế bào 2d, 3d tự động dùng trong sàng lọc một số dược liệu có tác động gây độc tế bào hepg2, cd133⁺ hepg2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN TRƯỜNG SINH THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO 2D, 3D TỰ ĐỘNG DÙNG TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO HEPG2, CD133+ HEPG2 Ngành: Sinh lý học người động vật Mã số ngành: 62420114 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Tp Hồ Chí Minh - Năm 2022 Cơng trình hồn thành tại: Viện Tế Bào Gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Người hướng dẫn khoa học: HDC: GS.TS Trương Đình Kiệt HDP: PGS.TS Phạm Văn Phúc Phản biện 1: TS Bùi Thị Kim Lý Phản biện 2: TS Nguyễn Thị Lệ Thủy Phản biện 3: TS Trần Thị Hải Yến Phản biện độc lập 1: TS Nguyễn Thị Lệ Thủy Phản biện độc lập 2: TS Trần Mạnh Hùng Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Cơ sở đào tạo họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHCM, vào hồi ……… ………, ngày …… tháng …… năm …… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM Thư viện Đại học Quốc gia Tp.HCM DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT II DANH MỤC HÌNH III DANH MỤC BẢNG IV MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1 Tình hình giới 1.1.2 Tình hình Việt Nam 1.2 CÁCH TIẾP CẬN MỚI TRONG SÀNG LỌC PHÁT TRIỂN THUỐC 1.2.1 Mơ hình tế bào gốc ung thư sàng lọc thuốc 1.2.2 Nuôi cấy tế bào 3D ưu điểm so với nuôi cấy 2D CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 2.1 TẾ BÀO 2.2 HOÁ CHẤT 2.2.1 Dung môi 2.2.2 Các hóa chất 2.3 PHƯƠNG PHÁP 2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm bố trí thí nghiệm 2.3.2 Các phương pháp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC CAO CHIẾT KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO 3.1.1 Thiết lập mơ hình tế bào đối chứng sàng lọc 3.1.2 Thiết lập dòng tế bào gốc ung Sthư sử dụng sàng lọc 3.1.3 Xây dựng mơ hình sàng lọc sử dụng tế bào ung thư gan tế bào gốc ung thư gan dạng 2D 3D 11 3.2 ÁP DỤNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC ĐÃ THIẾT LẬP ĐỂ SÀNG LỌC CAO CHIẾT TRONG THƯ VIỆN 14 3.3 ĐÁNH GIÁ CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG KHÁNG PHÂN BÀO CỦA CÁC CAO CHIẾT TIỀM NĂNG 16 3.3.1 Kết chọn lọc cao chiết tiềm 16 3.3.2 Các cao chiết top hit cảm ứng chết tế bào theo đường apoptosis 17 3.3.3 Tác động hợp chất tinh khiết phân lập từ cao chiết rễ Ngãi Bún B Panduratin 19 TỔNG HỢP DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC 25 i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Thuật ngữ tiếng Từ viết tắt Viết đầy đủ Việt 2D Two dimentional chiều 3D Three dimentional chiều 7-AAD 7- amino-actinomycin D ABC transporter ATP-binding cassette transporter Kênh vận chuyển cần ATP ADMETox Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion and Toxicity Hấp thu Phân bố - Chuyển hoá – Thải trừ Độc tố ADSC Adipose-tissue derived mesenchymal stem cell Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ALDH Aldehyde dehydrogenase AMPK AMP-activated protein kinase CI Cell index CSC Cancer stem cells DDR Drug Development Research HF Human fibroblast SEI Selective effect index IC50 The half-maximal inhibitory concentration MACS Magnetic Cell Separation ii Chỉ số tế bào Tế bào gốc ung thư Nghiên cứu phát triển thuốc Nguyên bào sợi người Chỉ số chọn lọc tác dụng phụ Nồng độ ức chế nửa Tách tế bào dựa vào từ tính DANH MỤC HÌNH Hình 3: Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu sàng lọc cao chiết có khả kháng phân bào tế bào ung thư biểu mơ gan HepG2 Hình : Giá trị IC50 doxorubicin khác lần cấy chuyền DF ADSC Hình 9: Giá trị SEI doxorubicin DF ADSC lần cấy chuyền khác chúng so sánh với tế bào HepG2 MCF-7 Hình 13 Sự khác biệt tế bào HepG2 trước sau tách kỹ thuật MACS Hình 16 Hình thái tế bào trước sau xử lý DOX 10 Hình 17 Hình thái khối cầu sau cấy vào đĩa Hanging drop 10 Hình 18 Tỷ lệ phần trăm quần thể HepG2 biểu marker CD133 sau phân tách ba phương pháp 10 Hình 19 Biểu đồ thể phần trăm tế bào HepG2 biểu marker CD133 Enrich: lơ xử lí thuốc doxorubicin 150 nM 11 Hình 23 Giá trị IC50 doxorubicin dòng tế bào tham chiếu HepG2 sau lần lặp lại thí nghiệm 12 Hình 24 Giá trị IC50 doxorubicin dòng tế bào gốc ung thư CD133+ HepG2 sau lần lặp lại thí nghiệm 12 Hình 29 Đường cong tăng trưởng khối cầu tế bào HepG2 13 Hình 33: Nồng độ ức chế nửa tirapazamine lên tế bào ung thư HepG2 3D 13 Hình 34: Nồng độ ức chế nửa tirapazamine lên tế bào gốc ung thư CD133+ HepG2 3D 14 Hình 37: Quy trình chọn lọc cao chiết theo hình phễu 17 Hình 38 Độc tính gây độc doxorubicin cao chiết H Odorata tế bào HepG2 tế bào nguyên bào sợi người 17 Hình 41 Phân tích dịng chảy tế bào HepG2 sau xử lý với cao chiết Sao Đen 18 Hình 45 Biểu đồ giá trị trung bình IC50 P trimera doxorubicin tế bào HepG2 ADSC 18 Hình 49 Biểu đồ ức chế đường cong tăng trưởng cao chiết Ngãi Bún dòng tế bào ADSC HepG2 18 iii Hình 50 Tế bào HepG2 nhuộm Annexin V sau xử lý với cao chiết Ngãi Bún (BP) 19 Hình 54 Giá trị IC50 hợp chất tách chiết từ B pandurata HepG2 điều kiện ni cấy 2D 19 Hình 55 Giá trị IC50 hợp chất B pandurata HepG2 điều kiện ni cấy 3D 20 Hình 56 Kiểu hình tế bào khối cầu spheroid HepG2 sau ngày xử lý hợp chất tách chiết từ Ngãi Bún B pandurata 20 Hình 58 Các tế bào trải qua trình apoptosis điều trị isopanduratin A nồng độ mức 500 nM 21 DANH MỤC BẢNG Bảng Tổng hợp IC50 cao chiết thực vật dòng tế bào dòng tế bào HepG2 CD133+HepG2 14 iv MỞ ĐẦU Hiện hầu hết hoạt động sàng lọc hoạt tính sinh học chủ yếu thực mơ hình ni cấy tế bào ung thư dạng 2D Mơ hình sàng lọc nhiều nghiên cứu cho không cung cấp đầy đủ thông tin cần thiết để chọn lọc cao chiết giai đoạn chuyển tiếp thử nghiệm từ in vitro sang in vivo trình nghiên cứu khám phá thuốc Điều dẫn đến tỉ lệ thất bại cao đánh giá hợp chất tiềm giai đoạn thử nghiệm ứng cử viên thuốc động vật Để tiết kiệm thời gian kinh phí, cần phát triển mơ hình sàng lọc cung cấp đầy đủ thông tin để giúp đưa lựa chọn cao chiết chuẩn xác giai đoạn nghiên cứu in vitro Mục tiêu nghiên cứu thiết lập quy trình kĩ thuật ni cấy 2D 3D tế bào ung thư tế bào gốc ung thư HepG2 với thơng lượng trung bình hệ thống máy chia dịch tự động Tiếp theo, nghiên cứu áp dụng sàng lọc hoạt tính kháng phân bào 35 cao chiết thực vật lên tế bào HepG2 tế bào gốc ung thư HepG2 mơ hình thiết lập Cuối cùng, nghiên cứu tìm kiếm cao chiết có khả gây độc HepG2 tiềm để tách hợp chất, dựa khác biệt tác động kháng phân bào cao chiết thô lên tế bào ung thư HepG2 tế bào gốc ung thư HepG2 nuôi cấy điều kiện 2D 3D Để thực mục tiêu trên, nội dung đầu nghiên cứu hợp tác với khoa Hóa, trường Đại học Tự nhiên ĐHQG Tp HCM để tạo cao chiết thô từ loại thực vật thu thập từ khu rừng khu vực miền Nam Việt Nam Kết nội dung tạo 35 cao chiết Trong nội dung tiếp theo, nghiên cứu tiến hành khảo sát loại tế bào gốc mô mỡ tế bào da người thường để chọn loại tế bào dùng làm tế bào đối chứng thí nghiệm sàng lọc Nghiên cứu tiến hành khảo sát so sánh nồng độ loại dung mơi để tìm dung mơi thích hợp cho thí nghiệm sàng lọc Trong nội dung tiếp theo, nghiên cứu tiến hành xây dựng mơ hình quy trình sàng lọc đối tượng tế bào ung thư gan Quần thể tế bào gốc ung thư gan phân lập từ quần thể tế bào ung thư gan HepG2 Cả quần thể tế bào ung thư gan tế bào gốc ung thư gan sử dụng để thiết lập quy trình sàng lọc dạng nuôi cấy lớp đơn (mononuclear cell-thường gọi nuôi cấy chiều hay 2D) dạng nuôi cấy khối cầu (sphere culture hay 3D) Trong bước đầu tiên, quần thể tế bào ung thư gan HepG2 sử dụng để phân lập tế bào gốc ung thư gan dựa vào biểu protein CD133 bề mặt tế bào Bước tiếp theo, hai dòng tế bào ung thư gan HepG2 CD133+ HepG2 sử dụng để nuôi cấy dạng 2D 3D để xây dựng mơ hình sàng lọc Về việc xây dựng quy trình sàng lọc dạng 2D, nhóm nghiên cứu khảo sát mật độ tế bào ban đầu nuôi cấy, xây dựng đường cong tăng trưởng tế bào để xác định giá trị IC50 Trong trình xây dựng mơ hình sàng lọc dạng 3D, nghiên cứu tạo khối cầu sử dụng kĩ thuật giọt treo (hanging drop) sử dụng hệ thống robot đĩa 96 well hanging drop Sử dụng hệ thống robot với kĩ thuật giọt treo, quy trình đạt thơng lượng trung bình hay cao (medium/high throughput) Nghiên cứu khảo sát mật độ tế bào thích hợp để tạo khối cầu Đường cong tăng trưởng khối cầu khảo sát Để khẳng định khối tế bào thu khối cầu tế bào ung thư (chứ cụm tế bào), nghiên cứu đánh giá cấu trúc khối cầu, đánh giá biểu protein liên kết tế bào khối cầu Cuối cùng, nghiên cứu sử dụng quy trình ni cấy thiết lập: (1) tế bào ung thư gan nuôi dạng 2D, (2) tế bào ung thư gan nuôi dạng 3D, (3) tế bào gốc ung thư gan nuôi dạng 2D, (4) tế bào gốc ung thư gan nuôi dạng 3D để sàng lọc cao chiết có thư viện Từ kết sàng lọc mơ hình này, nghiên cứu chọn cao chiết có IC50 thấp tế bào ung thư tác dụng phụ thấp tế bào thường để phân lập hợp chất tinh khiết Một số chất từ cao chiết tiềm tiếp tục xác định chế gây độc cho tế bào ung thư CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Ung thư biểu mô tế bào gan giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình giới Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) chiếm khoảng 5,6% tất loại ung thư [1], chiếm 80% bệnh nhân bị ung thư gan [2] Hiện HCC kháng với hầu hết phương pháp điều trị thơng thường, hóa trị xạ trị Mặc dù HCC ung thư phổ biến thứ sáu toàn giới, tiên lượng nghiêm trọng bệnh khiến trở thành nguyên nhân hàng đầu gây tử vong liên quan đến ung thư HCC cho chịu trách nhiệm cho khoảng 600.000 ca tử vong hàng năm [3-5] 1.1.2 Tình hình Việt Nam Theo thống kê số liệu ung thư toàn cầu GLOBOCAN cho thấy Việt Nam đứng thứ tư tỷ lệ mắc ung thư biểu mô tế bào gan tồn giới, sau Mơng Cổ, Ai Cập Gambia [6] Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc HCC 39,0 100.000 người nam 9,5 100.000 người nữ So với Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh có tỉ lệ mắc HCC nam cao đáng kể (tỷ lệ mắc = 1,22, 95% tỷ lệ cao chút nữ (1,21, 95%) [7] Ung thư biểu mô tế bào gan vấn đề Việt Nam với phần lớn bệnh nhân chẩn đốn giai đoạn ung thư biểu mơ tế bào gan tiến triển nên kết điều trị Điều trị ung thư biểu mô tế bào gan giai đoạn cuối tốn thách thức kinh tế kinh tế phát triển Việt Nam [8, 9] 1.2 Cách tiếp cận sàng lọc phát triển thuốc 1.2.1 Mô hình tế bào gốc ung thư (CSCs) sàng lọc thuốc Có chứng thực nghiệm cho thấy CSCs kháng lại thuốc chống ung thư trị liệu [10-12] Điều cho thấy quy trình sàng lọc nên sửa đổi theo hướng chọn thuốc kết hợp thuốc nhắm mục tiêu CSCs Hiện tại, sàng lọc hệ thống in vitro, với mơ hình dòng tế bào NCI 60 biết đến rộng rãi Tác dụng gây độc tế bào đánh giá thí nghiệm đánh giá sống chết tế bào, thường sử dụng xét nghiệm MTT (khử MTT thành formazan), phép đo dựa lượng ATP nội bào Một số phương pháp thí nghiệm sàng lọc khác đề xuất để sàng lọc chất chống ung thư đặc hiệu CSC Một số đó, thí nghiệm gây độc tế bào sử dụng quần thể CSC tách dựa biểu dấu ấn bề mặt tế bào kỹ thuật FCM Sau đó, tác dụng gây độc tế bào CSC so sánh với tác dụng gây độc tế bào CSC Một biến thể đơn giản phương pháp tách tế bào quần thể phụ (SP) từ quần thể tế bào khối u Phương pháp áp dụng để đánh giá hiệu thuốc chống ung thư mơ hình động vật Một cách khác để làm giàu quần thể tế bào CSC tạo tế bào dạng khối cầu (sphere) điều kiện thiếu bám dính tế bào khối u với chất Việc thực theo nhiều cách khác nhau, mà điển hình sử dụng phương pháp ni cấy bề mặt bám dính Phức tạp phương pháp sử dụng từ trường trọng lực, tế bào khối u ni cấy hydrogel hạt nano oxit sắt từ tính, với hệ thống từ trường kiểm soát từ [13] Trong nghiên cứu trước, nuôi cấy tế bào glioblastoma phương pháp từ trường trọng lực cho thấy cấu hình biểu protein tương tự protein quan sát thấy khối u dị ghép [13] Các mơ hình sphere sử dụng để xác định hoạt tính gây độc tế bào thuốc chống ung thư loại tế bào khối u khác nhau, bao gồm tế bào ung thư biểu mô tuyến vú (mammosphere), tế bào thần kinh (neurosphere) phổi carcinomas [14] [15] [16, 17] 1.2.2 Nuôi cấy tế bào 3D và ưu điểm so với ni cấy 2D Có lý để nhà nghiên cứu ung thư chọn nuôi cấy tế bào dạng 3D [18]: + Khi nuôi cấy tế bào dạng 2D, tế bào phát triển giống khác biệt oxy, dinh dưỡng, tác nhân sinh trưởng Tế bào nuôi cấy dạng 3D tạo vùng phát triển khác oxi, dinh dưỡng, tác nhân sinh trưởng khối u + Các tế bào nuôi cấy dạng 3D chứng minh gia tăng kháng lại thuốc so với nuôi cấy dạng 2D Tế bào bên bảo vệ tế bào ngoài, giúp hạn chế xâm nhập thuốc vào bên Hình 19 Biểu đồ thể phần trăm tế bào HepG2 biểu marker CD133 Enrich: lơ xử lí thuốc doxorubicin 150 nM Từ kết khảo sát, nghiên cứu sử dụng quy trình phân lập tế bào gốc ung thư gan CD133+ HepG2 cách xử lí thuốc doxorubicin 150 nM Quần thể tế bào gốc ung thư gan CD133+ HepG2 tế bào ung thư gan HepG2 sử dụng để xây dựng quy trình sàng lọc nội dung 3.1.3 Xây dựng mơ hình sàng lọc sử dụng tế bào ung thư gan và tế bào gốc ung thư gan dạng 2D và 3D 3.1.3.1 Xây dựng mơ hình/quy trình sàng lọc nuôi tế bào dạng 2D (TB gan, TBG gan) áp dụng mơ hình/quy trình sàng lọc chất chuẩn a) Nâng cao thơng lượng (throuhput) q trình sàng lọc hệ thống robot Các thông số thiết lập bước thao tác: Tốc độ hút Tốc độ nhả Độ hỗn (mm/sec) (mm/sec) thổi khí (ms) Seed tế bào 15,4 10 Pha xử lý 1,5 3,5 thuốc Nạp Alamar 11 11 Blue 11 Tốc độ thổi khí (mm/sec) 10 33 b) Áp dụng quy trình sàng lọc ni cấy tế bào dạng 2D chất chuẩn Hình 23 Giá trị IC50 doxorubicin dòng tế bào tham chiếu HepG2 sau lần lặp lại thí nghiệm Tế bào HepG2 ngày sau seed lên đĩa robot xử lý doxorubicin dãy nồng độ 2000, 1000, 500, 250, 125, 60, 30 15nM, đối chứng không xử lý thuốc Số liệu OD xử lý phần mềm Graphpad Prism Giá trị IC50 lần lặp lại thí nghiệm khơng có khác biệt ý nghĩa thơng kê, P value 1 Bước 2: Ưu tiên lựa chọn cao chiết có giá trị tỉ lệ IC50 ADSC/HepG2 ADSC/ CD133+HepG2 >2 Bước 3: Loại bỏ cao chiết tỉ lệ IC50 CD133+HepG2/HepG2 2D CD133+HepG2/HepG2 3D có giá trị >5 Bước 4: Ưu tiên chọn lọc cao chiết mà nơi nghiên cứu có khả tách chiết hợp chất 3.3.2 Các cao chiết top hit cảm ứng chết tế bào theo đường apoptosis 3.3.2.1 Cây đen Cao chiết đen gây độc tính chọn lọc lên dịng ung thư gan HepG2 Hình 38 Độc tính gây độc doxorubicin cao chiết H Odorata tế bào HepG2 tế bào nguyên bào sợi người 17 Hình 41 Phân tích dịng chảy tế bào HepG2 sau xử lý với cao chiết Sao Đen HepG2 xử lý cao chiết H Odorata nồng độ 30µg / ml, 60µg / ml, 125µg / ml, 250µg / ml Sau 48 giờ, tế bào nhuộm màu với Annexin V / PI ủ thêm 15 phút Các tế bào sau phân tích CellQuest Pro FasCalibur Thí nghiệm lặp lại với n=3 3.3.2.2 Xáo tam phân Kết xác định khả kháng phân bào cao chiết Xáo tam phân (Paramignya trimera) thuốc chuẩn doxorubicin lên tế bào HepG2 điều kiện ni cấy 2D Hình 45 Biểu đồ giá trị trung bình IC50 P trimera doxorubicin tế bào HepG2 ADSC Số liệu xử lý phép tính t – test ANOVA phần mềm GraphPad Prism Giá trị p < 0.0001 3.3.2.3 Ngãi bún Xác định IC50 cao chiết Ngãi Bún tế bào HepG2 ADSC Hình 49 Biểu đồ đường cong tăng trưởng cao chiết Ngãi Bún dòng tế bào ADSC HepG2 Tế bào xử lý với cao chiết Ngãi Bún nồng độ 1000, 500, 250, 125, 60, 30, 15 ug/ml sau 48 Hình A Đường cong IC50 cao chiết Ngãi Bún dòng tế bào ADSC HepG2 Hình B Biểu đồ cột giá trị IC50 trung bình lần lặp lại thí nghiệm Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy P