Đang tải... (xem toàn văn)
Một vài vật liệu ban đầu nhƣ mảnh lá, có thêm một một số giai đoạn đƣợc gọi là organogenesis để biến các dạng tế bào chuyên biệt thành các tế bào có khả năng phân bào và phát [r]
(1)BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -
NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN
“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.)
CỦA VIỆT NAM”
LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
(2)BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -
NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN
“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.)
CỦA VIỆT NAM”
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 6020114
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC Hƣớng dẫn : TS Trần Mỹ Linh Hƣớng dẫn 2: TS Nguyễn Tƣờng Vân
(3)LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác
Các số liệu kết trình bày luận án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác
(4)LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn TS Trần Mỹ Linh – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (VAST), TS Nguyễn Tƣờng Vân – Viện Công nghệ sinh học, VAST ThS Nguyễn Chi Mai - Viện Hóa sinh biển, VAST tận tình hƣớng dẫn, động viên tơi suốt trình thực luận văn Xin cảm ơn Nhiệm vụ HTQT cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, mã số QTBY01.05/18-19 TS Trần Mỹ Linh làm chủ nhiệm hỗ trợ q trình thực nghiên cứu
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Học viện Khoa học Công nghệ, VAST hết lịng truyền đạt kiến thức cho tơi xong suốt hai năm học vừa qua
Tôi xin chân thành cảm ơn cán thuộc Phòng Nghiên cứu Tài nguyên sinh vật – Viện Hóa sinh biển, VAST tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình thực luận văn
Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên
(5)
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10
1.1 Giới thiệu chung dừa cạn 10
1.1.1 Đặc điểm sinh học phân bố 10
1.1.2 Giá trị y học 11
1.2 Nuôi cấy mô tế bào thuốc in vitro 12
1.2.1 Các xu hƣớng sản xuất chất thứ cấp in vitro 13
1.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng ni cấy mô tế bào thuốc in vitro 16
1.2.3 Nuôi nhân chồi in vitro 19
1.2.4 Nuôi cấy mô sẹo tế bào huyền phù 20
1.3 Nuôi cấy mô dừa cạn để tăng cƣờng sx chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 23 1.4 Những thách thức sản xuất chất thứ cấp in vitro 26
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1 Vật liệu 27
2.1.1 Các giống thực vật nghiên cứu 27
2.1.2 Các môi trƣờng dùng cho nghiên cứu 27
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 28
2.2.1 Khử trùng nảy mầm hạt 28
2.2.2 Tạo nguồn vật liệu phƣơng pháp nhân nhanh chồi in vitro 28
2.2.3 Thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo từ đoạn thân dừa cạn 28
2.2.3.1 Tối ƣu hóa loại nồng độ chất điều hịa sinh trƣởng lên khả tạo mô sẹo 28
(6)2.2.3.3 Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân 29
2.2.3.4 So sánh khả tạo mô sẹo giống dừa cạn thu thập Việt Nam30 2.2.4 Tối ƣu hóa mơi trƣờng nhân nhanh mơ sẹo dừa cạn 30
2.2.5 Phát triển điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù dừa cạn 30
2.2.6 Đánh giá ảnh hƣởng ánh sáng nhiệt độ lên phát triển tế bào huyền phù dừa cạn 31
2.2.7 Tách chiết định lƣợng alkaloid tổng số 31
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1 Nghiên cứu tạo mô sẹo phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào huyền phù từ vật liệu ban đầu khác hai giống dừa cạn 33
3.1.1 Đánh giá khả nảy mầm hạt dừa cạn điều kiện in vitro 33
3.1.2 Đánh giá khả nhân chồi in vitro dừa cạn 33
3.1.3 Nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ vật liệu nuôi cấy in vitro 35
3.1.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng đoạn lóng thân đến khả hình thành mơ sẹo 39 3.1.5 Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân dùng thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo39 3.1.5 Đánh giá khả hình thành mơ sẹo hai giống dừa cạn QN02 H01 từ đoạn thân thứ 3, kích thƣớc 0,3cm 41
3.2 Nghiên cứu phát triển tế bào huyền phù dừa cạn 43
3.2.1 Phát triển môi trƣờng nhân nhanh mô sẹo, bảo toàn khả sinh tổng hợp alkaloid 43
3.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ tế bào ban đầu đến phát triển tế bào dừa cạn nuôi lỏng 47
3.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ ánh sáng lên tốc độ phát triển tế bào 49
3.2.4 So sánh khả nhân nhanh tế bào huyền phù hai giống dừa cạn QN02 H01 51
CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54
4.1 Kết luận 54
4.2 Kiến nghị 54
(7)DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic axit 2,4-D Axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic
B5 Môi trƣờng nuôi cấy Gamborg (1968) BAP 6-benzyladenine
CT Công thức
DDW Nƣớc cất hai lần (double distilled water) DW Trọng lƣợng khô – dry weight
IAA Indole Acetic acid IBA Indole-3-butyric acid
Kin Kinetin
LS Môi trƣờng nuôi cấy Linsmaier Skoog (1965) MS Môi trƣờng nuôi cấy Murashige Skoog (1962) N6 Môi trƣờng nuôi cấy Chu cs (1975)
NAA α-Naphthaleneacetic acid
(8)DANH MỤC CÁC BẢNG
(9)DANH MỤC CÁC HÌNH
(10)MỞ ĐẦU
Từ lâu thực vật nguồn cung cấp số lƣợng khổng lồ hợp chất hóa học có hoạt tính đƣợc dùng làm thuốc Các hợp chất hoạt tính sinh học đƣợc chiết xuất từ thực vật đƣợc sử dụng nhƣ thuốc điều trị bệnh, thực phẩm chức năng, thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm, thuốc nhuộm, chất tạo hƣơng vị mỹ phẩm Hiện có khoảng 25–28% thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật, 60% thuốc điều trị ung thƣ trực tiếp gián tiếp từ thực vật có nhiều loại khơng có sản phẩm tổng hợp bán tổng hợp thay Vì nguồn sinh khối thực vật ngày tăng cao nghiên cứu nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp có hoạt tính dƣợc học địi hỏi cấp bách
Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật có bƣớc phát triển vƣợt bậc, phƣơng pháp thay thích hợp việc tạo nguồn sinh khối quy mô khác không phụ thuộc vào mùa vụ Ngồi ra, việc ni cấy mơ tế bào cịn tiến hành nơi điều kiện vô trùng sử dụng chất bảo vệ thực vật độc hại Một tiến đáng kể kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào khơng bị biệt hóa) thực vật để nghiên cứu hoạt tính sinh học sản xuất chất trao đổi thứ cấp có giá trị Ni cấy tế bào huyền phù giải pháp để cải thiện khó khăn nồng độ chất trao đổi thứ cấp thấp đƣợc phát triển thành công nhƣ chất artemisinin (phân lập từ hao hoa vàng, có tác dụng chữa sốt rét) chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ thơng đỏ, có tác dụng chữa ung thƣ)
(11)(lymphosarcoma), ung thƣ biểu mô rau (choriokarsinoma), u nguyên bào thần kinh, ung thƣ vú, ung thƣ phổi, bệnh Hodgkin, khối u dạng Wilkin ung thƣ tế bào lƣới Trên thực tế nhu cầu alkaloid ngày tăng, nhƣng trình sản xuất hợp chất gặp nhiều khó khăn hai hợp chất có mặt dừa cạn với hàm lƣợng thấp, khoảng 0,0002-0,0005% tổng hàm lƣợng alkaloid phụ thuộc vào giống quan khác Vì thế, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro để phát triển sinh khối sau điều khiển sinh tổng hợp chất thứ cấp có giá trị đƣợc nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt dừa cạn, nhiên kết hạn chế phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy bao gồm vật liệu, điều kiện nuôi cấy… Trong khuôn khổ luận văn này, nghiên cứu tập trung “ Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù dừa cạn (Catharanthus roseus L.) Việt Nam” nhằm chọn tạo đƣợc dòng tế bào có khả phát triển sinh khối với tốc độ nhanh giữ đƣơc khả tổng hợp chất thứ cấp Kết luận văn sở cho nghiên cứu nhằm cải thiện khả tổng hợp chất thứ cấp tế bào dừa cạn điều kiện in vitro
Để đạt đƣợc mục tiêu, công việc cụ thể đƣợc tiến hành nhƣ sau:
1 Nghiên cứu ảnh hƣởng vật liệu, mơi trƣờng, chất kích thích sinh trƣởng khác đến khả hình thành mơ sẹo 02 giống dừa cạn Việt Nam
(12)CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung dừa cạn
1.1.1. Đặc điểm sinh học phân bố
Dừa cạn có tên khoa học Catharanthus roseus (L) G Don, tên thƣờng gọi dừa cạn dừa hay trƣờng xuân hoa loài thực vật thân thảo thuộc chi Catharanthus, họ Trúc đào (Apocynaceae) Chi Catharanthus gồm lồi, lồi có nguồn gốc từ bán đảo Madagascar (C coriaceus, C lanceus, C longifolius, C ovalis, C roseus, C scitulus, C trichophyllus) loài C pusillus từ Ấn Độ Loài Catharanthus roseus (L) G Don (dừa cạn) đƣợc du nhập vào Việt Nam, phân bố nhiều vùng, trải dài từ Bắc vào Nam [1] Loài chủ yếu đƣợc trồng nƣớc nhiệt đới, vùng lạnh đƣợc trồng vào mùa hè khơng chịu đƣợc lạnh
(13)của ống vành, tâm bì rời noãn sào với năm cánh giống thùy hoa Quả cặp nang dài khoảng 2-4 cm rộng mm Dừa cạn C roseus loài khác biệt với hầu hết loài khác họ khả tự tƣơng thích Tuy nhiên, q trình tự thụ phấn hoa thƣờng không xảy dừa cạn tách biệt vật lý nhụy bao phấn, tƣợng đƣợc gọi herkogamy ngƣợc, nhụy bị thấp xuống dƣới mức bao phấn [3]
Ở Việt Nam, dừa cạn hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tƣơng đối đặc trƣng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung tỉnh miền Trung nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định Phú n Ngồi dừa cạn xuất đảo nhƣ Cô Tô, Côn Đảo Phú Quốc [1] Ở vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có mọc gần nhƣ loại bãi cát dƣới rừng phi lao, trảng cỏ bụi thấp, có khả chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn vùng cát ven biển
1.1.2. Giá trị y học
(14)phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme glucosidase từ rễ dừa cạn thu hái Hồi Nhơn, Bình Định, có chất lần đƣợc phân lập từ lồi Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thƣ ngƣời, gồm ung thƣ gan (Hep-G2), ung thƣ biểu mô (KB), ung thƣ phổi (LU-1), ung thƣ vú (MCF-7), melanoma cancer ung thƣ sắc tố (SK-Mel2), ung thƣ bạch cầu cấp tính (HL60), ung thƣ buồng trứng (SW626), ung thƣ tuyến tiền liệt (LNCaP) ung thƣ ruột kết (HT-29) có kết định Mặc dù có vai trò quan nhƣng cấu trúc phức tạp vinblastine vincristine làm cho việc tổng hợp hóa học chất khó khăn
Dừa cạn đƣợc dùng phổ biến thuốc Đông y để trị cao huyết áp, trị bệnh tiểu đƣờng, tiêu hóa kém, lỵ thơng tiểu tiện, bệnh tiểu đỏ Một số trƣờng hợp cịn dùng để trị ung thƣ máu, ung thƣ phổi [7] Trƣớc đây, nguồn dừa cạn mọc tự nhiên Việt Nam tƣơng đối dồi Trƣớc năm 1975, miền Bắc xuất sang Đông Âu 1-3 tấn/năm Những năm gần đây, lƣợng xuất sang Pháp (khoảng 10 tấn/năm) thƣờng xuyên hơn, nhƣng chủ yếu từ trồng Phú Yên
1.2. Nuôi cấy mô tế bào thuốc in vitro
(15)cấp dùng chăm sóc sức khỏe cho ngƣời (ví dụ, thuốc chống ung thƣ) [8]
Những ƣu điểm hệ thống ni cấy mơ tế bào so với trồng trọt tự nhiên bao gồm: hợp chất thực vật đƣợc lựa chọn đƣợc tạo liên tục khơng phụ thuộc yếu tố bên ngồi nhƣ mùa vụ, điều kiện đất đai khí hậu; tế bào nuôi cấy không bị đe dọa công vi sinh vật côn trùng; tế bào loài thực vật chí lồi q có nguy tuyệt chủng dễ dàng trì để tạo chất chuyển hóa thứ cấp; trình sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp điều khiển nhằm giảm chi phí cải thiện suất
1.2.1. Các xu hướng sản xuất chất thứ cấp in vitro
Nuôi cấy in vitro liên quan đến việc sản xuất tế bào, mô quan đơn từ phân bào, tạo tế bào, mơ quan, có gen di truyền mẹ Việc sử dụng kỹ thuật in vitro để tạo chất thứ cấp, đặc biệt chất có hoạt tính dƣợc học có ƣu điểm nhƣ khơng bị ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng bên ngồi điều kiện ni cấy đƣợc kiểm sốt phịng ni cấy; việc sinh tổng hợp chất thứ cấp có khả cải thiện cách tạo quy trình đặc thù cho bƣớc để tăng tốc tích lũy sinh khối tƣơi tăng nồng độ chất mơ; sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ; chất thứ cấp đƣợc tạo điều kiện vơ trùng có rủi ro bị nhiễm hợp chất độc hại không mong muốn
(16)chế trong điều kiện thiếu ánh sáng CO2 nồng độ thấp; chất điều
hòa sinh trƣởng thực vật, đƣợc sử dụng để kiểm soát phát triển mơ để kích thích gia tăng sinh khối thực vật hàm lƣợng chất thứ cấp; chất bổ sung khác nhƣ axit amin, vitamin, than hoạt tính, chất chống oxy hóa chất khác tùy thuộc vào loài cụ thể
Các vật liệu ban đầu cho việc nuôi cấy thƣờng chồi mang mô phân sinh, mảnh non mô phù hợp khác, đƣợc khử trùng bề mặt (vô trùng) để loại bỏ vi sinh vật sử dụng cồn 70% natri hypochlorite Tiếp theo, vật liệu ban đầu đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy phù hợp để bắt đầu thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro Khởi đầu hệ thống tạo mô sẹo từ các mô phân sinh, tạo hoàn chỉnh, tạo chồi tạo rễ in vitro Một vài vật liệu ban đầu nhƣ mảnh lá, có thêm giai đoạn đƣợc gọi organogenesis để biến dạng tế bào chuyên biệt thành tế bào có khả phân bào phát triển mô sẹo (indirect organogenesis) chồi chồi trực tiếp từ mô ban đầu (direct organogenesis) Sau thiết lập thành công giai đoạn khởi đầu nuôi cấy in vitro, không bị nhiễm với vi khuẩn nấm, giai đoạn bao gồm trình nhân tế bào, mô, chồi rễ Các giai đoạn quan trọng, có tính định hiệu kinh tế trình, chủ yếu nhiều tế bào mô đƣợc sản xuất, suất chất thứ cấp mục tiêu cao
(17)xuất chất thứ cấp mục tiêu; iii) biến đổi gen thuốc để sản xuất chất thứ cấp mô cụ thể, nhằm cải thiện hiệu sản xuất sinh khối, tế bào đó, chất thứ cấp từ lồi khó phát triển tự nhiên, chất nồng độ thấp loài ban đầu đƣợc cải thiện hiệu
Quá trình vi nhân giống góp phần vào việc sản xuất thuốc thảo dƣợc sản phẩm thông thƣờng sử dụng hợp chất thứ cấp đƣợc chiết xuất từ thuốc Các kỹ thuật vi nhân giống in vitro đẩy nhanh q trình sản xuất vơ tính từ giống có khả sinh tổng hợp chất thứ cấp tốt phát triển tốt điều kiện tự nhiên Mặc dù hai phƣơng thức lại dẫn đến việc sản xuất loại thuốc thảo dƣợc, nhƣng đƣợc ứng dụng chủ yếu để sản xuất chất thứ cấp có giá trị cao chi phí kỹ thuật liên quan tƣơng đối đắt đỏ [9] Dùng chất elicitor phƣơng tiện thúc đẩy khó khăn khác liên quan đến việc sản xuất quy mô lớn hầu hết chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học quan trọng từ thực vật, ni cấy mơ biệt hóa khơng biệt hóa cách áp dụng nồng độ thấp yếu tố sinh học phi sinh học đƣợc tiến hành rộng rãi Một vài hợp chất hóa học thƣờng đƣợc sử dụng salicylic axit, metyl salicylat, axit bezoic, chitosan, v.v có ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất phenolic kích hoạt enzym liên quan đến chống chịu thực vật [10] Đối với tạo thuốc biến đổi gen, có nhiều yêu cầu an toàn sinh học liên quan đến việc trồng dƣợc liệu chuyển gen tự nhiên nhận thức ngƣời tiêu dùng [9] Do vậy, mô chuyển gen in vitro có nghĩa để tạo sinh khối cho việc chiết xuất hợp chất hóa học tinh khiết (nhƣ khơng chuyển gen)
(18)muốn Các tế bào phát triển nhanh cho phép tăng khả sinh tổng hợp chất thứ cấp theo cấp số nhân Tế bào thuốc đƣợc lựa chọn tế bào dễ dàng tiến hành biến đổi gen cho phép điều khiển trình phát triển sinh khối Ngoài ra, thuốc biến đổi gen đƣợc dùng để sản xuất loại chất có hoạt tính khác nhƣ vắc-xin, hormone kháng thể [11]
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng ni cấy mô tế bào thuốc in vitro Kiểu gen yếu tố có ảnh hƣởng trực tiếp việc sản xuất sinh khối thực vật chất thứ cấp Các giống có hàm lƣợng chất thứ cấp cao lựa chọn cho việc sử dụng ni cấy mơ Ví dụ nhƣ gai Ấn độ (Pilocarpus microphyllus) có hàm lƣợng pilocarpin, alkaloid có vai trò tăng cƣờng hoạt động hệ thần kinh giao cảm, nằm khoảng từ 16,3 đến 235,9 µg/g khơ tùy thuộc vào giống [12], có chênh lệch đến 14,5 lần hàm lƣợng pilocarpin Tuy nhiên, kiểu gen quý dƣợc liệu có hàm lƣợng chất có hoạt tính cao cịn hạn chế cần phải có nghiên cứu chi tiết giống vùng địa lý khác
(19)mô, đồng hồ sinh học; yếu tố ngoại sinh, chẳng hạn nhƣ chu kỳ quang, cƣờng độ chiếu sáng bƣớc sóng, nhiệt độ, nguồn nƣớc, loại đất thành phần khơng khí, riêng rẽ phối hợp ảnh hƣởng đến thành phần nồng độ chất thứ cấp đơn lẻ nhiều chất khác [14,15]
Những yếu tố tƣơng tự ảnh hƣởng đến hình thành chất thứ cấp có hoạt tính ni cấy in vitro Ví dụ, Kapoor cs [16] cho biết cần thay đổi yếu tố chất lƣợng ánh sáng có ảnh hƣởng đến tích lũy sinh khối, tốc độ sinh trƣởng nồng độ hợp chất phenolic Salidroside rễ vàng Rhodiola imbricata Dƣới tác động ánh sáng đỏ, mô sẹo có số tăng trƣởng cao (2,97) nồng độ phenolic tổng số Salidroside lại cao dƣới ánh sáng xanh sau 21 ngày nuôi cấy Trong trƣờng hợp này, nuôi cấy mô sẹo để phát triển sinh khối cần ánh sáng trắng sau để tăng cƣờng sinh tổng hợp chất mong muốn chuyển đổi sang ánh sáng xanh Các yếu tố khác đƣợc cần đƣợc tối ƣu hóa để cải thiện q trình ni cấy, chẳng hạn nhƣ kết hợp ánh sáng xanh /trắng với tỷ lệ thích hợp cải thiện đồng thời việc tăng sinh khối sinh tổng hợp chất thứ cấp
(20)Diện tích cần dùng cho ni cấy in vitro thay đổi tùy theo loại kích cỡ bình, hiệu tạo sinh khối hệ thống sử dụng Các hệ thống thông thƣờng bao gồm môi trƣờng bán rắn, chứa agar mơi trƣờng lỏng, có khuấy trộn khơng liên tục hệ thống bioreactor ngập tạm thời (TIB) Việc sử dụng TIB đƣợc cho gia tăng tích lũy sinh khối tốt so với nuôi cấy môi trƣờng bán rắn [17, 18]
Các yếu tố phi sinh học, chẳng hạn nhƣ nhiệt độ, ánh sáng cƣờng độ, thời gian chiếu sáng bƣớc sóng, độ ẩm tƣơng đối thành phần khơng khí bình ni ảnh hƣởng mạnh đến tích lũy sinh khối tƣơi khô, nồng độ chất sinh khối thời gian nuôi Những đặc điểm phụ thuộc vào lồi thuốc cần ni cấy Môi trƣờng nuôi cấy thành phần dinh dƣỡng, chẳng hạn nhƣ lƣợng nƣớc áp suất môi trƣờng nuôi cấy, dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, carbohydrate, vitamin axit amin, chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm khác nhƣ auxin, cytokinin [19], gibberellin, jasmonate salicylate [20] ảnh hƣởng sâu sắc đến đặc điểm
http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/195)