Kỹ thuật tạo cây hoàn chỉnh và huấn luyện thích nghi giống cây cỏ ngọt stevia bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HỌC NGUYỄN THỊ TÙNG VN Kỹ THUậT TạO CÂY HOàN CHỉNH Và HUấN LUYệN THíCH NGHI GIốNG CÂY Cỏ NGọT STEVIA công nghệ nu«i cÊy m« in vitro KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC VINH - 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HC Kỹ THUậT TạO CÂY HOàN CHỉNH Và HUấN LUYệN THíCH NGHI GIốNG CÂY Cỏ NGọT STEVIA b»ng c«ng nghƯ nu«i cÊy m« in vitro KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC Người thực : Nguyễn Thị Tùng Vân Lớp : 49A1 - Sinh Người hướng dẫn : ThS Phạm Thị Như Quỳnh VINH - 5.2012 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS Phạm Thị Như Quỳnh - cán hướng dẫn khoa học, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào hướng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu hồn thiện khố luận Tơi xin chân thành cảm ơn ý kiến đóng góp quý báu thầy giáo, cô giáo môn Sinh lý - Sinh hoá, tạo điều kiện ủng hộ cán Phịng thí nghiệm ni cấy mô - tế bào thực vật Trung tâm thực hành thí nghiệm, trường Đại học Vinh Xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ, cung cấp tư liệu, hoá chất, nguồn giống viện Công nghệ sinh học (thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) Cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Lần tham gia nghiên cứu khoa học không tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn bè để đề tài nghiên cứu tơi hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Vinh, tháng năm 2012 Sinh viên thực Nguyễn Thị Tùng Vân MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở sinh vật học cỏ 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học cỏ 1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh Cỏ 1.1.4 Các chất cỏ 1.2 Tình hình sản xuất cỏ giới 1.3 Tình hình sản xuất nghiên cứu cỏ nước 1.4 Tình hình nghiên cứu cỏ Nghệ An 13 Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 15 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Kỹ thuật nhân giống in vitro 18 3.2 Phương pháp xử lý số liệu 21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Kết nghiên cứu giai đoạn rễ 22 3.2 Kết nghiên cứu giai đoạn thích nghi 26 3.3 Lưu ý giai đoạn huấn luyện thích nghi cỏ 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT α -NAA: Axit α- naphtyl acetic ĐC: Đối chứng IAA: Axit β- indol acetic IBA: Axit indol butyric KI: kinetin KHKT: khoa học kỹ thuật Mm: milimol MS: (Môi trường dinh dưỡng) Murashige & Skoog- 1962 NCM-TB: Nuôi cấy mô- tế bào ppm: part per millon (phần triệu) TTTHTN: trung tâm thực hành thí nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH Bảng: Bảng 1.1 Thành phần cỏ Bảng 1.2 Tình hình sản xuất sử dụng cỏ số nước giới (Paraguay, Brazin, Thái Lan, Malaixia) [15] Bảng 1.3 Định lượng số chất số giống cỏ Bảng 1.4 Thành phần môi trường dinh dưỡng sử dụng cho nuôi cấy in vitro cỏ 12 Bảng 1.5 Diện tích trồng Cỏ vùng nguyên liệu 14 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến thời gian rễ khả rễ cỏ in vitro (sau tuần nuôi cấy) 22 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả sinh trưởng rễ cỏ in vitro (sau tuần nuôi cấy) 23 Hình 3.2 Chồi cỏ M3 in vitro giai đoạn rễ 25 Bảng 3.3 Ảnh hưởng giá thể, dinh dưỡng đến sức sống cỏ M3 in vitro 26 Hình 3.3 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ cỏ M3 in vitro 27 Hình 3.4 Ảnh hưởng giá thể đến sức sống cỏ M3 in vitro 27 LỜI MỞ ĐẦU Sức khỏe thứ mà dù thời đại vấn đề mà tất người quan tâm Đặc biệt bước vào kỷ XXI với phát triển nhanh chóng kinh tế, đời sống người dân nâng cao sức khỏe vấn đề quan tâm hàng đầu Bởi đồng nghĩa với phát triển kinh tế bệnh tật ngày gia tăng, đặc biệt gia tăng bệnh đái tháo đường béo phì Theo nhận định Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) vào năm 20 kỷ này, hàng năm giới khoảng 425 tỷ USD để phòng trị bệnh tiểu đường Tuy nhiên người chưa tìm cách hữu hiệu để chặn đứng bệnh Mà nguyên nhân việc sử dụng chất hóa học thay cho chất tự nhiên sản xuất thực phẩm quy mô công nghiệp Chất hóa học cịn ngun nhân dẫn dến nhiều bệnh hiểm nghèo khác ung thư gan, ung thư phổi, dị dạng bào thai, ảnh hưởng đến yếu tố di truyền Tâm lý chung người tiêu dùng tìm với sản phẩm thiên nhiên để thay cho sản phẩm hóa học Trong nhóm chất tạo vị thiên nhiên, cỏ (Stevia rebaudiana Bertoni) ngày nhiều người ý đến Từ cỏ nhà kỹ nghệ chế biến đường Rebaudiana (Reb-A), sản phẩm có độ cao gấp 300-400 lần đường saccaroza lại không sinh lượng Đây giải pháp tốt bệnh đặc biệt bệnh đái tháo đường Cỏ sản phẩm thiên nhiên để thay loại đường hóa học, có tác dụng bổ tim, lợi tiểu, làm giảm huyết áp đặc biệt người bị bệnh tiểu đường Do không tạo calorie nên cỏ thích hợp để giúp giảm cân Ngồi ra, giúp vào việc làm lành vết thương da nên dùng rộng rãi y học sử dụng cho người bị đái tháo đường, chống xơ cứng động mạch, lưu thơng khí huyết, chống béo phì phụ nữ cao huyết áp , mỹ phẩm [11] Với tác dụng lớn vậy, sản phẩm cỏ không tiêu thụ mạnh thị trường nội địa mà thị trường giới đặc biệt quan tâm Nước ta có điều kiện đất đai khí hậu thuận lợi để trồng cỏ ngọt, mà số tỉnh thành nước tiến hành trồng cỏ có tỉnh Nghệ An Việc nhân giống trồng cỏ không nâng cao thu nhập cho người lao động mà cung cấp lượng lớn cỏ cho khu vực Bắc trung bộ, góp phần đẩy nhanh tiến trình cơng nghiệp hóa, đại hóa nông nghiệp phát triển nông thôn Tuy nhiên việc trồng cỏ nước ta gặp nhiều khó khăn chất lượng chất lượng khối lượng Để khắc phục tình trạng trên, góp phần phát triển vững đem lại hiệu kinh tế cao cho cỏ ngọt, nhiệm vụ cấp bách phải ứng dụng công nghệ cao vào sản xuất tạo giống Kỹ thuật nhân giống in vitro cho phép sản xuất nguồn giống bệnh, chất lượng cao, có độ đồng lớn, giữ đặc tính quý gốc mà phương pháp nhân giống truyền thống khó đáp ứng Áp dụng phương pháp vào nhân giống có nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro số loại hoa như: đồng tiền, lily, hồng môn, phong lan Tuy nhiên, nghiên cứu hồn thiện quy trình đề xuất kỹ thuật nhân giống cho giống cỏ ngọt, giống nhập nội, thực cần thiết Xuất phát từ lý đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xây dựng kỹ thuật tạo hoàn chỉnh huấn luyện thích nghi giống cỏ Stevia” Mục tiêu đề tài: Góp phần hồn thiện qui trình nhân giống cỏ M3 phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro Nhiệm vụ đề tài là: Thử nghiệm tìm điều kiện ni cấy in vitro thích hợp cho giai đoạn rễ, tạo hoàn chỉnh huấn luyện thích nghi, từ đề xuất kỹ thuật nhân giống tạo hồn chỉnh huấn luyện thích nghi giống cỏ Stevia Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở sinh vật học cỏ 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại Cỏ có nguồn gốc tự nhiên vùng Amambay Iquacu thuộc biên giới Brazin Paraguay Theo nhiều tài liệu dường cỏ có nguồn gốc vùng Nam Mỹ (Brazin, paraguay, Achentina) Tiếng địa phương gọi “cỏ paraguay” “kahe-e”hoặc “cỏ mật - honey grass” Gosling (1901), Bertoni (1905), Hemslay (1906) cho biết cỏ phân bố nhiều Tây Nam nước Mỹ, miền bắc Achentina, Mehico, Trung Mỹ, Nam Mỹ cao nguyên Brazin Cỏ không thấy trồng vùng Tây Ấn Độ vùng Amazon Cây cỏ thuộc chi Stevia họ cúc Asteraceae (Compositae) Trong 80 lồi chi Stevia có cỏ (Stevia rebaudiana bertoni) chứa chất cỏ (Grashoff) chuyển thành dạng trồng từ năm 1931 [12], [15] 1.1.2 Đặc điểm thực vật học cỏ [3] Có thể xem Bertoni (1905) người nghiên cứu hình thái sinh trưởng  Thân Cỏ bụi nhiều năm Thân gỗ, dạng bụi, nhiều nhánh, thân cành trịn, có nhiều lơng, cao từ 80 - 120cm (cho đến hoa), thân có kính từ 2,5 - 8cm Trong sản xuất cỏ thu hoạch có độ cao từ 30- 50cm, điều kiện đất màu mỡ, cao tới 60cm thu hoạch Thơng thường cỏ cho 25- 35 cành cấp Cỏ có hệ thân ngầm phát triển mạnh  Hệ rễ Cỏ lâu năm có thân rễ khoẻ, phân nhánh, mọc nơng từ 030cm tuỳ thuộc vào độ phì nhiêu, tơi xốp, tầng canh tác mực nước ngầm đất Rễ gieo hạt hệ rễ cọc, phát triển rễ từ cành giâm (hệ rễ chùm) Hệ rễ chùm lan rộng đường kính 40cm, hệ rễ phát triển tốt điều kiện đất tơi xốp đủ ẩm  Lá Mọc đối, hình ovan, trứng ngược thn dài, nằm ngang nghiêng, phiến thường có 12 - 16 cưa, chiều dài trưởng thành đạt tới - 8cm, rộng 1,5 - 2cm, có gân song song gân phụ phân nhánh Cây gieo từ hạt có mầm hình trịn, đến cặp thứ xuất cưa xanh đậm phụ thuộc giống khác  Hoa Hoa cỏ có hoa tự, nhóm họp dày đặc đế hoa, có - hoa đơn lưỡng tính Mỗi hoa đơn hình ống có cấu trúc gồm đế hoa, với đài màu xanh, cánh tràng màu trắng dài 5mm, bắc tiêu giảm thành sợi để phát tán, nhị - dính tràng có màu vàng sáng, nhị rời nhau, đính gốc kéo dài phía phần trung đới Bầu hạ ơ, nỗn, vịi nhị mảnh chẻ đơi, nhánh hình cao bao phấn, mà khả tự thụ phấn thấp khơng có  Quả hạt Quả (hạt) cỏ nhỏ, thuộc loại bế, chín nâu thẫm, cạnh dài từ - 2,5cm Hạt có hai vỏ hạt, có phơi, nội nhũ trần tỉ lệ nảy mầm thấp hạt dễ sức nảy mầm bảo quản Khối lượng 1000 hạt khoảng 0,35 - 0,4g 1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh Cỏ [1], [2], [7] - Yêu cầu nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến điều kiện sinh trưởng phát triển cỏ Cỏ sinh trưởng nhiệt độ từ 10-35ºC Nhiệt độ tốt từ 20-30ºC sinh trưởng tốt, cho suất cao Nếu nhiệt độ 30-35ºC mà đảm bảo độ ẩm tốt sinh trưởng cho thu hoạch tốt Tuy nhiên tuỳ - Phải giữ ẩm cho cây, đưa từ ống nghiệm cần che chắn để giữ ẩm tránh ánh sáng mạnh Cụ thể độ ẩm đất phải đạt 76 - 80%, độ ẩm khơng khí phải đạt 82 - 85% 2.3.1 Kỹ thuật nhân giống in vitro 2.3.1.1 Vật liệu khởi đầu Vật liệu khởi đầu cho trình nghiên cứu chối nuôi cấy ống nghiệm cụm chồi cỏ M3 sử dụng để tạo hồn chỉnh huấn luyện thích nghi chối có 2-3 cặp đồng Cây giống cỏ Nguyên liệu khởi đầu cho trình nghiên cứu 18 2.3.1.2 Giai đoạn rễ tạo hoàn chỉnh Để nghiên cứu ảnh hưởng IAA đến rễ chồi in vitro sử dụng công thức với nồng độ sau: CT1: 1mg IAA/l môi trường CT2: 2mg IAA/l môi trường CT3: 3mg IAA/l môi trường CT4: 4mg IAA/l môi trường Để bổ sung vào môi trường (MS + 8g/l Agar + 30g/l saccaroza + 10% nước dừa + 2.5ml KI ) Công thức đối chứng không bổ sung IAA Các tiêm hình thái là: - Số rễ - Hình thái rễ Tổng số rễ - Số rễ trung bình/ = Tổng số chồi theo dõi - Chiều dài trung bình rễ/ = Tổng chiều dài rễ Tổng số chồi theo dõi Thời gian nghiên cứu giai đoạn tuần Tất thí nghiệm nói bố trí ngẫu nhiên với lần nhắc lại, lần theo dõi 10 bình, bình cấy 3-5 chồi, chồi mang mắt ngủ Điều kiện nuôi cấy cho giai đoạn là: Nhiệt độ: 25 ± 20C; Độ ẩm: 65-70 %; ánh sáng: 2000 - 2500 lux; Thời gian chiếu sáng 12h/ngày Môi trường để nuôi cấy cở thường sử dụng môi trường Muarshine- skoog, 1962 (MS) có thành phần nêu bảng sau: 19 Bảng 1.6 Thành phần môi trường MS sử dụng NCM-TB thực vật [4],[10] Hóa chất NH4NO3 KNO3 Đa lượng CaCl2.2H2O KH2PO3 Na2EDTA.2H2O FeSO4.7H2O MnSO4 ZnSO4.7H2O Vi lượng H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CaCl2.6H2O Glycine Myo- inositol Nicotin acid Vitamin Pyrodocine Thiamine Saccarose Các chất hữu Agar Cytokinin Chất ĐTST Auxin 2.3.1.3 Giai đoạn huấn luyện thích nghi Nồng độ (mg/l) 1650,000 1900,00 440,00 370,00 37,26 27,80 16,90 8,60 6,20 0,83 0,25 0,025 0,025 2,00 100,00 0,50 0,50 0,10 30,00 g/l 8.00g/l 0,1- 10 0,1-5 Khi cỏ in vitro đạt tiêu chuẩn định hình thái chồi cỏ có từ - rễ, chiều dài trung bình rễ từ 3-4cm, khoẻ mập, đưa vườn ươm Trong giai đoạn này, chúng tơi bố trí in vitro vào loại giá thể khác điều kiện chăm sóc, huấn luyện để nghiên cứu ảnh hưởng giá thể khác đến tỷ lệ sống sức sống in vitro Các công thức giá thể bố trí là: - CT1: Cát phù sa 20 - CT2: Đất thịt - CT3: Cát phù sa + đất thịt tỷ lệ 1:1 Điều kiện huấn luyện: Độ ẩm không khí 80 - 85%; Độ ẩm giá thể 65 80%; Nhiệt độ: 25 ± 20C; Nguồn khoáng bổ sung dung dịch dinh dưỡng MS phun lên dạng sương mù Các tiêu theo dõi: - Tỷ lệ sống Số sống = x 100% Số theo dõi - Độ tăng chiều cao = Chiều cao đo lần cuối - chiều cao ban đầu Số theo dõi - Số mới/cây = Số đếm lần cuối - số ban đầu Số theo dõi - Hình thái cây, màu sắc Số theo dõi - Sự phát triển rễ: Thời gian giai đoạn tuần 3.2 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý toán xác suất thống kê phần mềm Microsoft Excel 2003 21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu giai đoạn rễ IAA loại hoocmon có tác dụng kích thích rễ bất định Trong giai đoạn này, chúng tơi bố trí cơng thức thí nghiệm bổ sung thêm IAA nồng độ khác vào môi trường Kết nghiên cứu sau 40 ngày, nhận thấy rằng: Khi bổ sung nồng độ khác IAA vào môi trường nhân giống cỏ làm ảnh hưởng tới rễ hình thái rễ Kết cụ thể sau: Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến thời gian rễ khả rễ cỏ in vitro (sau tuần nuôi cấy) Công thức Nồng độ IAA (mg/l) Số chồi cấy Ngày bắt đầu rễ Số chồi rễ Tỷ lệ rễ (%) ĐC 30 35 22 73,33% CT1 30 28 30 100% CT2 30 24 30 100% CT3 30 21 30 100% CT4 30 16 30 100% 40 35 30 25 ngày rễ 20 số chồi rễ 15 10 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến thời gian số chồi rễ cỏ in vitro (sau tuần nuôi cấy) 22 Theo dõi khả sinh trưởng rễ chồi cỏ in vitro (sau tuần nuôi cấy) thu kết trình bày bảng Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến khả sinh trưởng rễ cỏ in vitro (sau tuần nuôi cấy) Công thức Nồng độ IAA (mg/l) Số chồi cấy Tỷ lệ rễ (%) Số rễ Cây Độ dài rễ (mm) (ĐC) 30 73.333% 2.21 45.0 CT1 30 100% 3.18 24.3 CT2 30 100% 3.76 30.06 CT3 30 100% 4.68 37.5 CT4 30 100% 4.02 35.91 50 45 40 35 30 số rễ 25 độ dài rễ 20 15 10 (ĐC) CT1 CT2 CT3 CT4 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ IAA đến sinh trưởng cỏ in vitro (sau tuấn nuôi cấy) Nhận xét kết quả: Trong cơng thức có bổ sung IAA số rễ hình thành từ chồi in vitro nhiều hơn, cứng khỏe so với công thức đối chứng chiều dài trung bình rễ có ngắn 23 Về thời gian bắt đầu rễ công thức thí nghiệm, chúng tơi thấy: thời gian bắt đầu rễ cơng thức có sai khác Công thức đối chứng, tỷ lệ số rễ nhất, chí có số không rễ, thời gian rễ (35 ngày) lâu so với công thức thử nghiệm ( 16- 28 ngày) Trong tất cơng thức có bổ sung IAA vào mơi trường rễ đạt 100% Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ 1- 4mg/l IAA thời gian bắt đầu rễ chồi cỏ biến động từ (16- 28 ngày) điều chứng tỏ có mặt IAA có tác động tới thời gian rễ cỏ ngọt, IAA kích thích rễ khác nồng độ khác Qua nghiên cứu chúng tơi thấy nồng độ IAA cao số ngày rễ sớm Đặc biệt CT4 với nồng độ IAA 4mg/l số ngày rễ có 16 ngày, sớm CT3 với 3mg/l (21ngày) nhiên xét đến số rễ /cây chiều dài trung bình rễ CT3 cho số lượng rễ nhiều so với CT4 Cụ thể: - Công thức CT1: Sử dụng nồng độ 1mg/l IAA cho kết in vitro thí nghiệm rễ sớm công thức đối chứng tương đối chậm (28 ngày) so với công thức khác; sau tuần, rễ bất định phát sinh; rễ ngắn dễ đứt so với công thức đối chứng Điều chứng tỏ nồng độ 1mg/l IAA cịn thấp, khả kích thích rễ chậm cơng thức khác đồng thời khả kích thích phát triển rễ chưa cao - Cơng thức CT2: Nồng độ IAA 2mg/l cho thấp yếu, số lượng rễ tăng đặc điểm hình thái rễ khơng khác nhiều so với cơng thức 1; 2mg/l IAA chưa phải nồng độ thích hợp cho rễ cỏ in vitro - Công thức CT3: Nồng độ IAA 3mg/l cho hiệu kích thích rễ tốt so với công thức khác Ở công thức này, rễ phát triển tương đối nhanh, in vitro cao (6,2- 6,8 cm), xanh đậm, dáng cứng đẹp Tất phát sinh rễ sớm, số lượng rễ nhiều (trung bình 4,68 rễ/cây), đường 24 kính rễ to so với cơng thức cịn lại; đặc biệt rễ bị đứt gãy trình đưa vườn ươm Điều chứng tỏ, nồng độ 3mg/l IAA có hiệu cao việc kích thích chồi cỏ in vitro rễ, tạo hồn chỉnh - Cơng thức CT4: Nồng độ 4mg/l IAA: chồi in vitro có rễ có đường kính rễ lớn (35.91cm), lại yếu, dịn dễ bị đứt gãy, thấp yếu Xét hình thái, in vitro cơng thức thấp Điều này, chứng tỏ nồng độ IAA môi trường cao ức chế khả sinh trưởng chồi cỏ Như theo chúng tôi, bổ sung vào môi trường dinh dưỡng 3mg/l IAA (CT3) thích hợp cho rễ chồi cỏ in vitro Cây invitro sau tuần rễ Cây in vitro sau tuần rễ Cây in vitro rễ sau tuần rễ Cây in vitro chuẩn bị vườn ươm Hình 3.2 Chồi cỏ M3 in vitro giai đoạn rễ 25 3.2 Kết nghiên cứu giai đoạn thích nghi Để nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến sức sống in vitro, chúng tơi bố trí cơng thức giá thể khác với điều kiện huấn luyện là: - Độ ẩm khơng khí 80 - 85% - Độ ẩm giá thể 65 - 80% - Nhiệt độ: 25 ± 20C Cây chăm sóc theo yêu cầu chặt chẽ nhiệt độ, ánh sáng, gió,… Kết giai đoạn huấn luyện thích nghi trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng giá thể, dinh dưỡng đến sức sống cỏ M3 in vitro Công thức giá thể CT1: Cát Số Tỷ lệ Số Chiều Hình thái in mẫu sống (%) (lá) cao (cm) vitro Cây nhỏ, mỏng, 30 70.35% 4.14 5.83 xanh nhạt, dễ bị đổ, sinh trưởng chậm Cây mập, khoẻ, CT2: Đất thịt 30 94.30% 5.67 7.20 to, dày, xanh, bị đổ héo; sinh trưởng mạnh Cây to, mỏng, CT: xanh (Đất + cát) 30 89.76% 5.23 6.76 nhạt, sinh trưởng nhanh 1số hay bị héo, = (1:1) đổ non 26 tỷ lệ sống 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% tỷ lệ sống CT1: cát CT2: đất thịt CT3: đất thịt+ cát Hình 3.3 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ cỏ M3 in vitro số mới/ chiều cao CT1: cát CT2: đất thịt CT3: đất thịt+ cát Hình 3.4 Ảnh hưởng giá thể đến sức sống cỏ M3 in vitro 27 Nhận xét chung: - Giá thể cát không thích hợp để huấn luyện thích nghi cỏ in vitro, tiêu đánh giá so với loại giá thể khác giá thể cát, cỏ in vitro nhạy cảm với độ ẩm giá thể Mặc dù thường xuyên phun nước (dạng sương mù) khả giữ ẩm cát nên sau thời gian ngắn, độ ẩm giá thể giảm, thiếu nước nên bị héo, đổ rạp Tỷ lệ sống đạt 70,35%, chiều cao đạt 5,83 cm, trung bình có 4,14 mới/cây, rễ phát triển nhanh yếu, sức sống - Đối với giá thể đất thịt (đã nghiền mịn), tiêu nghiên cứu cao hẳn so với giá thể khác Tỷ lệ sống thích nghi với mơi trường đạt 94,3%, chiều cao đạt 7,20 cm; số mới/cây trung bình 5,67 lá; rễ thời gian đầu phát triển chậm sang tuần thứ phát triển mạnh, đường kính thân to, dày, đẹp, màu xanh đậm Dáng khoẻ mạnh, đầy sức sống - Đối với giá thể hỗn hợp cát đất thịt, tỷ lệ sống tương đối cao (89,76%); chiều cao trung bình 6,76 cm; số (5,23 lá) so với giá thể đất thịt Cây to, mỏng, sinh trưởng tương đối nhanh khơng bóng đẹp công thức Như điều kiện huấn luyện, với độ ẩm khơng khí 80 - 85%; độ ẩm giá thể 65 - 80%; nhiệt độ: 25 ± 20C; nguồn khoáng bổ sung dung dịch dinh dưỡng MS giá thể thích hợp để huấn luyện thích nghi cỏ in vitro đất thịt Từ kết thu được, đề xuất giai đoạn rễ giai đoạn huấn luyện thích nghi quy trình nhân giống cỏ in vitro sau: 28 Điều kiện nuôi cấy Quy trình Cây giống Các đỉnh sinh trưởng Giai đoạn vào mẫu, cấy gây Mẫu in vitro Giai đoạn nhân nhanh Chồi in vitro Môi trường rễ MS + 8g/l Agar + 30g/l saccaroza + 10% nước dừa + 3mg/l IAA + 2.5ml KI Thời gian rễ là tuần Giai đoạn rễ, tạo hoàn chỉnh Cây in vitro hoàn chỉnh Giá thể sử dụng để huấn luyện: Giai đoạn huấn luyện Đất thịt thích nghi Thời gian huấn luyện tuần Cây in vitro Vườn ươm 29 3.3 Lưu ý giai đoạn huấn luyện thích nghi cỏ Cây in vitro đưa từ bình ni mơi trường tự nhiên để huấn luyện thường có sức đề kháng yếu (do thay đổi từ môi trường in vitro với đầy đủ chất dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng ổn định điều kiện tự nhiên với nhiều biến động) Vì thế, giai đoạn đầu trình huấn luyện, cần tạo điều kiện mơi trường huấn luyện với chế độ giữ ẩm chiếu sáng hợp lý, sau từ từ điều chỉnh để thích nghi kịp Cây cỏ in vitro loại khó huấn luyện thích nghi ngồi môi trường tự nhiên, dễ bị đổ gãy nhạy cảm với độ ẩm môi trường Nếu môi trường có độ ẩm cao >80%, dễ bị thối rữa; Nếu môi trường khô, dễ bị héo đổ rạp, phải đảm bảo chặt chẽ việc che chắn chăm sóc Khi tưới nước, thiết phải phun nước dạng sương mù để tránh làm bị đổ 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ A Kết luận Từ kết nghiên cứu, chúng tơi xây dựng quy trình kỹ thuật in vitro nhân giống cỏ M3 sau: Giai đoạn rễ, tạo hồn chỉnh Mơi trường thích hợp cho chồi cỏ in vitro rễ là: (MS + g/l agar +30 g/l saccaroza +10% nước dừa +3mg/l IAA + 2.5ml KI) Thời gian rễ, tạo hoàn chỉnh tuần Trong giai đoạn ni cấy phịng thí nghiệm rễ tạo hồn chỉnh, chồi cỏ in vitro ni cấy điều kiện: nhiệt độ 25 ± 20C, độ ẩm 65 - 70 %, cường độ ánh sáng 2000 - 2500 lux, thời gian chiếu sáng 12h / ngày Giai đoạn huấn luyện thích nghi Giá thể thích hợp để huấn luyện cỏ in vitro đất thịt nghiền mịn Điều kiện huấn luyện là: độ ẩm khơng khí 80 - 85%, độ ẩm giá thể 65 80%, nhiệt độ 25 ± 20C, nguồn khoáng bổ sung dung dịch dinh dưỡng MS phun lên dạng sương mù Thời gian giai đoạn tuần B Đề nghị Đề tài cần nghiên cứu mở rộng để đánh giá vai trò sinh lý chất điều tiết sinh trưởng khác nhân giống invitro cỏ để xây dựng hồn thiện quy trình nhân giống invitro loại có giá trị kinh tế cao mang lại nhiều lợi ích 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc Công nghệ trồng hoa cho thu nhập cao, Cây hoa cúc NXB Lao động Xã hội, Hà Nội, 2003 Nguyễn Như Khanh, Sinh lý sinh trưởng phát triển thực vật, NXB Giáo dục, 2002 Hoàng Thị Sản Phân loại thực vật NXB Giáo dục, Hà Nội, 1999 Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô, tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2000, trang - 54 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2005, trang 13 - 23 Đỗ Năng Vịnh Công nghệ sinh học trồng NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2002 Vũ Văn Vụ (chủ biên) Sinh lý học thực vật NXB Giáo dục, Hà Nội, 2005 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp Công nghệ sinh học, Tập II NXB Giáo dục, Hà Nội, 2005, trang 22 - 34 Nguyễn Văn Uyển chủ biên tác giả Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng Trung tâm công nghệ sinh học, 1998 10 Murashige T., Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassay with tobaco tissue culure J Physiol Plant, vol 15, 1962, pp 473 - 479 11 Ds Phan Đức Bình Ts Võ Duy Huấn - Cây cỏ steviosid, http//: Baomoi.vn 12 http//:congnghehoahoc.org 13 http//:stevia.com 14 http://steviaventures.com.vn 15 Giới thiệu chung Cỏ ngọt: http//:xa.yirng.com 16 BS Phan Sĩ Thục, Báo sức khỏe đời sống, http//:ykhoanet.com 32 ... rễ, tạo hoàn chỉnh Cây in vitro hoàn chỉnh Giá thể sử dụng để huấn luyện: Giai đoạn huấn luyện Đất thịt thích nghi Thời gian huấn luyện tuần Cây in vitro Vườn ươm 29 3.3 Lưu ý giai đoạn huấn luyện. .. chồi cỏ Như theo chúng tôi, bổ sung vào môi trường dinh dưỡng 3mg/l IAA (CT3) thích hợp cho rễ chồi cỏ in vitro Cây invitro sau tuần rễ Cây in vitro sau tuần rễ Cây in vitro rễ sau tuần rễ Cây in. .. nhân giống cỏ M3 phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro Nhiệm vụ đề tài là: Thử nghi? ??m tìm điều kiện ni cấy in vitro thích hợp cho giai đoạn rễ, tạo hoàn chỉnh huấn luyện thích nghi,