Nghiên cứu kĩ thuật vào mẫu, nhân nhanh cây cỏ ngọt stevia rebaudiana bertoni m3 bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HỌC NGUYỄN THỊ OANH Nghiên cứu kĩ thuật vào mẫu, nhân nhanh cỏ ngät Stevia rebaudiana Bertoni M b»ng c«ng nghƯ nu«i cÊy m« in vitro KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC VINH - 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HC Nghiên cứu kĩ thuật vào mẫu, nhân nhanh c©y cá ngät Stevia rebaudiana Bertoni M b»ng c«ng nghƯ nu«i cÊy m« in vitro KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC Người thực : Nguyễn Thị Oanh Lớp : 49A2 - Sinh Người hướng dẫn : ThS Phạm Thị Như Quỳnh VINH - 5.2012 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giáo Th.S Phạm Thị Như Quỳnh - Cán hướng dẫn khoa học, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu hồn thành khố luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn ý kiến đóng góp vơ quý báu thầy cô giáo khoa, tạo điều kiện ủng hộ cán Phịng thí nghiệm ni cấy mơ - tế bào thực vật khoa Sinh học, trường Đại học Vinh Xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, cung cấp tư liệu, hố chất, nguồn giống Viện Cơng nghệ sinh học (Thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) Cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Lần tham gia nghiên cứu khoa học khơng tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp quý báu thầy giáo, cô giáo bạn bè để đề tài tơi hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Vinh, tháng năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Oanh MỤC LỤC Trang NHỮNG CHỮ VIÊT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN BA/BAP: benzyl adenin / 6-benzyl amino purin CNSH: Công nghệ sinh học IAA: Axit β- Indol acetic IBA: Axit Indol butyric KI: Kinetin mM: Milimol MS: (Môi trường dinh dưỡng) Murashige & Skoog 1962 NCM-TBTV: Nuôi cấy mô-Tế bào ppm: Part per millon α NAA: Axit α-Naphtyl acetic DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH MỞ ĐẦU Con người ta sống ln ln có nhu cầu Thèm nhu cầu tự nhiên thể Nhưng ăn nhiều thường xun khơng tốt cho sức khoẻ Có thể gây sâu răng, gây béo phì, gây bệnh tiểu đường… Yêu cầu đặt tìm cho nguồn cung cấp chất (thay đường) đảm bảo hai yếu tố vừa đáp ứng nhu cầu lại vừa khơng gây bệnh Hiện có nhiều sản phẩm hố học dùng để thay đường Những chất có vị gấp trăm lần đường lại chứa calo, chúng đáp ứng nhu cầu đồ mà không gây vấn đề sử dụng chất thông thường, nhiên người ta lại lo ngại ảnh hưởng lâu dài chúng sức khoẻ Trước viễn cảnh không sáng sủa chất hố học, tâm lí chung người tiêu thụ tìm với sản phẩm tự nhiên có tính tương tự Một nhóm chất tạo vị thiên nhiên có chứa cỏ stevioside với hàm lượng - 10% hoa khơ, 0.4% thân, có vị lớn nhiều so với đường mía Cây cỏ gọi cỏ đường, cỏ cúc, cỏ mật, cúc ngọt… Chất chiết xuất từ (stevioside) chỉ cung cấp lượng ở mức thấp, không gây tác dụng phụ, không độc hại tốt cho người cao tuổi Được dùng công nghiệp sản xuất bánh kẹo, nước giải khát… Trong y học dùng để thay đường cho người bị bệnh tiểu đường, béo phì, thừa cholestron… Với tầm quan trọng nhu cầu tiêu thụ cỏ lớn, nguồn cung không đủ cầu giá thành tăng cao, hội cho người dân làm giàu Xu hướng mở rộng diện tích trồng cỏ Tuy nhiên để làm điều cịn mắc phải nhiều vấn đề khó khăn như: Giống cỏ trồng bằng phương pháp hữu tính hiệu khơng cao Giống cỏ trồng bằng phương pháp vơ tính (giâm cành) sau trồng thời gian bị thoái hoá, giảm chất lượng (hàm lượng stevioside giảm) Nguồn cung ứng giống có chất lượng cao nước Muốn giống tốt bắt buộc phải nhập khẩu điều làm giá thành giống tăng cao, kéo theo lợi ích kinh tế giảm Đứng trước tình hình việc tìm phương thức nhân giống cỏ phù hợp cần thiết Trong Ni cấy mơ tế bào thực vật in vitro đánh giá phương pháp tiên tiến, ưu việt Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro ngày phát triển thực tiễn để nhân giống nhiều loại trồng Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào cho phép sản xuất giống với số lượng lớn, khoẻ mạnh, bệnh, có độ đồng cao chất lượng tốt ngồi cịn có ưu điểm sau: Thời gian đưa sản phẩm nhanh, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm không gian, nâng cao chất lượng trồng, lợi vận chuyển khả tiếp thị, tiềm công nghiệp hố cao, sử dụng ưu lai… Xuất phát từ tất lý trên, thực đề tài: “Nghiên cứu kĩ thuật vào mẫu, nhân nhanh cỏ ngọt Stevia rebaudiana bertoni M3 bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro” Mục tiêu đề tài: “Góp phần hồn thiện qui trình nhân giống cỏ Stevia rebaudiana bertoni M3 phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro Phục vụ cho cơng tác trì sản xuất giống chất lượng cao để cung ứng cho sản xuất” NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cỏ ngọt 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại của cỏ ngọt [3, 22] Cây cỏ gọi cỏ đường hay Cúc mật, có nguồn gốc ở thung lũng Rio Monday nằm Paraguay Brasil Vào kỷ XVI, thủy thủ Tây Ban Nha từng đề cập đến diện loại thảo mộc Nhưng phải đến năm 1888, nhà thực vật học người Paraguay Moises Santiago Bertoni phân loại thức đặt tên gọi Stevia rebaudiana bertoni Thở dân Guarani ở Paraguay gọi cỏ Cấ-êhê có nghĩa cỏ Trong phân loại hệ thống thực vật, cỏ xếp vào lớp hai mầm (Dycotyledones), phân lớp cúc (Asteriles), cúc (Asterales), họ cúc (Asteraceae), phân họ cúc (Ateroideae), chi: Stevia Họ cúc họ lớn nhất: bao gồm tới 1000 chi 20 nghìn lồi, phân bố ở khắp nơi trái đất, sống ở nhiều môi trường khác Nước ta có 125 chi thuộc họ cúc Trên giới phát 200 loài thuộc chi stevia Ở Việt Nam phát 100 lồi thuộc chi Stevia chất chỉ tìm thấy ở lồi Stevia rebaudiana, khơng tìm thấy Glucozit ở loài Stevia khác Cỏ lưu niên bán nhiệt đới, dễ canh tác đem lại hiệu kinh tế cao giới Việt Nam Khả thích nghi cao với điều kiện sinh thái khác nên cỏ phân bố rộng ở khắp nơi giới Phổ biến ở nước bán nhiệt đới hay nhiệt đới Việt Nam xem nơi mà cỏ thích nghi tốt 1.1.2 Đặc điểm thực vật học [4] Cỏ thân thảo, đa niên, có thân rễ khoẻ, mọc cạn từ - 30 cm (tuỳ thuộc độ phì nhiêu tơi xốp mực nước ngầm đất) Rễ cỏ gieo từ hạt phát triển rễ từ cành giâm Cỏ có dạng thân bụi chiều cao trung bình thu hoạch 50 - 60 cm, điều kiện thâm canh có cao tới 80 - 120 cm Phân cành cấp nhiều, chỉ đến hoa phân cành cấp 2, cấp Cành cấp thường xuất ở nách cách mặt đất 10 cm thân chính, đốn cành xuất ở tất đoạn thân Cụ thể cỏ có đặc điểm sau: - Rễ: Cây cỏ thuộc loại rễ chùm, hình nón, điều kiện tự nhiên phân nhánh mạnh, rễ ăn sâu mà phát triển theo chiều ngang ở độ sâu chừng 10 20 cm, ăn sâu ở lớp đất có từ 20 - 30 cm, chịu ảnh hưởng bởi độ ẩm đất Khối lượng rễ lớn sinh nhiều rễ phụ lông hút, nên khả hút nước dinh dưỡng mạnh - Thân: Thân trịn, có nhiều lơng, đường kính thân chỡ to từ -8 mm, than già có màu tím nâu, phần non màu xanh, có khả rễ bất định (dựa vào đặc điểm để đặt qui trình, kĩ thuật chăm sóc thu hái thích hợp) - Lá: Mọc đối, hình ovan, trứng ngược hoặc thuôn dài, nằm ngang nghiêng, phiến thường có 12 - 16 cưa, chiều dài ở trưởng thành đạt tới - cm, rộng 1.5 - 2cm, có gân song song gân phụ phân nhánh Cây gieo từ hạt có mầm hình trịn, đến cặp thứ tư xuất cưa hoặc xanh đậm phụ thuộc vào giống khác Trên thân, số đạt tới 70 - 90 - Hoa: Hoa cỏ hoa tự, nhóm họp dày đặc đế hoa, có - hoa đơn lưỡng tính Mỡi hoa đơn hình ống có cấu trúc gồm đế hoa, với đài màu xanh, cánh tràng màu trắng khoảng 5mm dài, bắc tiêu giảm thành sợi để phát tán, nhị - dính tràng có màu vàng sáng, chỉ nhị rời cịn bao phấn dính mép với nhau, đính gốc kéo dài lên phía bởi phần Hình 3.1 Một số hình ảnh quá trình lấy mẫu cấy gây giống cỏ ngọt Stevia rebaudiana Bertoni M3 Cây cỏ vườn ươm Thao tác lấy mẫu Sau tuần bật chồi Sau tuần bật chồi Sau tuần bật chồi Sau tuần bật chồi 27 3.2 Kết nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh Kinetin chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm xytokinin, có tác dụng kích thích phân hố chồi tạo cụm chồi Trong quy trình nhân giống in vitro nhân nhanh giai đoạn định tính hiệu thể ở hệ số nhân chồi Hệ số nhân chồi cao qui trình xem tối ưu Nhiều tác giả nghiên cứu trước cho biết kinetin có ảnh hưởng tốt đến hệ số nhân chồi chất lượng chồi nhiều đối tượng trồng Đặc biệt cỏ thuộc họ cúc, nghiên cứu nhân giống vơ tính bằng phương pháp ni cấy mơ in vitro lồi cúc cho thấy giai đoạn nhân nhanh việc bổ sung kinetin cho hệ số nhân nhanh tương đối cao Vì chúng tơi nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng kinetin đến giống cỏ in vitro giai đoạn nhằm tìm cơng thức mơi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy phù hợp để đạt hiệu nhân chồi cao Để nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin lên khả nhân chồi cỏ ngot in vitro, tiến hành bổ sung kinetin vào môi trường dinh dưỡng với nồng độ thay đổi là: Công thức 1: ppm; Công thức 2: 4ppm; Công thức 3: 6ppm; Công thức 4: ppm; Công thức đối chứng: 0ppm Mỗi công thức chúng tơi tiến hành bao gồm 20 bình, mỡi bình từ - chồi, mỡi chồi gồm mắt ngủ tiến hành lần lặp lại Kết thí nghiệm trình bày ở bảng 3.2 bảng 3.3 28 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất ĐTST (kinetin) đến khả bật chồi hệ số nhân chồi cỏ ngọt in vitro (Sau tuần cấy gây) Nồng Độ Công chất ĐTST thức (kinetin) Số chồi Số chồi tạo Số mắt Hệ số nhân ban đầu thành ngủ/ chồi nhanh ĐC ppm 120 120 8.1 4.05 N1 ppm 120 182 7.03 5.33 N2 ppm 120 252 7.36 7.73 N3 ppm 120 312 7.68 9.98 N4 ppm 120 174 6.43 4.65 Hệ số nhân nhanh 12 10 HSNN 0 ppm ppm ppm ppm 8ppm Cơng thức Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ KI đến hệ số nhân nhanh của chồi Stevia rebaudiana bertoni M3 in vitro 29 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất kinetin (KI) đến khả bật chồi hệ số nhân chồi cỏ in vitro (Sau tuần cấy gây) cho thấy: - Trong môi trường dinh dưỡng không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng, chồi cỏ khơng phát sinh thêm chồi mới, hệ số nhân nhanh chồi thấp (4.05) Còn tất công thức bổ sung chất ĐTST (kinetin), đa số chồi cỏ hình thành chồi - Công thức nhân nhanh N1: Bổ sung 2ppm kinetin vào môi trường dinh dưỡng Với việc bổ sung lượng nhỏ kinetin vào môi trường dinh dưỡng, nhận thấy thay đổi rõ rệt so với công thức đối chứng cụ thể: Một số chồi phát sinh chồi mới, lượng chồi hình thành 182 chồi tổng số 120 chồi ban đầu Hệ số nhân nhanh công thức là: 5.33 Chứng tỏ kinetin bở sung vào đóng vai trị định việc hình thành chồi cỏ in vitro, ở nồng độ ppm thấp - Công thức nhân nhanh N2: Bổ sung 4ppm kinetin vào môi trường dinh dưỡng Tăng nồng độ kinetin lên 4ppm, nhận thấy tăng vọt số lượng chồi hình thành 252 chồi hình thành tổng số 120 chồi gốc cho hệ số nhân nhanh là: 7.73, cao so với công thức (N1) nhiều so với công thức đối chứng (ĐC) - Công thức nhân nhanh N3: Bổ sung ppm kinetin vào môi trường dinh dưỡng Kết cho thấy, việc tăng nồng độ kinetin lên ppm cho ta số lượng chồi hình thành cao tất cơng thức Số chồi tạo thành 312 tổng số 120 chồi gốc Hệ số nhân nhanh công thức là: 9.98 Trung bình mỡi chồi đẻ nhánh cho - chồi/chồi cấy, số mắt ngủ chồi là: 7.68 cao tất công thức cịn lại Chứng tỏ, nồng độ 6ppm kinetin có tác 30 dụng tốt việc kích thích hình thành chồi sinh trưởng, phát triển chúng - Công thức nhân nhanh N4: Bổ sung ppm kinetin vào môi trường dinh dưỡng Kết cho thấy, công thức cho hiệu nhân nhanh kém tất thức có bở sung kinetin Tuy số chồi hình thành là: 174 chồi nhiều công thức N1(120 chồi), hệ số nhân chồi chỉ đạt (4.65) Điều chứng tỏ việc bổ sung nồng độ kinetin lên ppm cao ức chế trình hình thành chồi sinh trưởng chồi cỏ in vitro Như vậy: Kết cơng thức thí nghiệm giai đoạn nhân nhanh cho thấy, nồng độ ppm kinetin thích hợp phát triển chồi, cho hệ số nhân nhanh cao 31 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất kinetin đến khả sinh trưởng, phát triển của chồi cỏ ngọt in vitro (sau tuần) Thời gian (tuần) tuần tuần tuần Công Chiều cao Số Đặc điểm hình thái chồi thức chồi (cm) lá/chồi in vitro ĐC 2.8 5.2 Chồi cao, yếu N1 1.28 3.6 N2 1.26 4.73 Chồi khoẻ, to, xanh nhạt N3 1.31 4.72 Chồi vươn cao, mập, lá xanh đậm N4 1.01 4.38 Chồi thấp, yếu ĐC 3.3 6.3 Chồi cao lại yếu N1 2.05 5.7 N2 2.16 6.5 Chồi vươn cao, to, màu xanh nhạt N3 2.16 6.5 Chồi mâp, lá to xanh đậm N4 1.5 5.28 Chồi thấp, yếu, số lá xoăn ĐC 4.28 7.29 Chồi cao, đường kính thân nhỏ N1 3.03 7.11 N2 3.52 7.48 N3 3.36 7.74 N4 2.18 6.54 32 Chồi tương đối cao, nhỏ màu xanh nhạt Chồi cao, nhỏ, xanh nhạt Chồi tương đối cao, nhỏ, số màu phớt vàng Chồi khoẻ, cao, to xanh nhạt Chồi vươn cao, mập, lá to, màu xanh đậm Chồi yếu, thấp, nhỏ, xoăn, số hoá nâu ở phiến Kết đánh giá đặc điểm hình thái chồi cỏ (chiều cao, số trung bình/chồi) trình bày ở bảng 3.3 cho thấy: - Cơng thức đối chứng: Ở công thức này, hầu hết chồi cỏ khơng hình thành chồi mà chỉ phát triển chiều cao nên chồi cỏ ở cao tất cơng thức cịn lại Đường kính chồi nhỏ, mỏng màu xanh nhạt, phiến nhỏ nên ảnh hưởng xấu đến trình quang hợp, hấp thu ánh sáng - Công thức N1: Tuy chồi cỏ có thấp so với cơng thức đối chứng, đường kính chồi cỏ lại lớn mặc dù không đáng kể Ở công thức mặc dù cỏ mỏng màu xanh nhạt, có lớn đối chứng Điều chứng tỏ, bổ sung kinetin vào môi trường dinh dưỡng có tác động sinh lý tới hình thái, chất lượng chồi cỏ - Công thức N2: Khi nồng độ kinetin tăng lên, chúng tơi nhận thấy q trình sinh trưởng phát triển chồi cỏ tăng lên rõ rệt, đường kính chồi cỏ lớn hơn, dày màu xanh đậm, chiều cao trung bình/chồi là: 3.52cm, tăng nhanh từ tuần thứ tuần thứ 4, lớn so với công thức N1 là: 3.03 cm Những chồi in vitro khoẻ, cứng cáp phù hợp cho giai đoạn nghiên cứu - Công thức N3: Bổ sung kinetin nồng độ 6ppm vào môi trường dinh dưỡng Nhận thấy chồi cỏ có đường kính thân lớn, dày, có màu xanh đậm, chồi vươn cao mập khoẻ, dáng đứng đẹp Về chiều cao trung bình chồi cỏ sau tuần nhân nhanh là: 3.36cm Tuy thấp so với công thức nhân nhanh N2, xét chỉ tiêu khác hẳn, chất lượng chồi cỏ ở công thức nhân nhanh N3 tốt Chứng tỏ ở nồng độ 6ppm kinetin có tác dụng tốt đến khả sinh trưởng, phát triển chồi cỏ in vitro - Công thức nhân nhanh N4: Tăng nồng độ Kinetin lên 8ppm môi trường dinh dưỡng 33 Kết nghiên cứu cho thấy: Chồi in vitro yếu, độ cao trung bình chồi thấp, thấp nhiều so với tất công thức, sau tuần chỉ đạt (2.18cm), số trung bình/chồi là: 6.54, phiến mỏng, có màu xanh nhạt hoặc vàng, đường kính chồi nhỏ Vì đánh giá sinh trưởng chất luợng chồi cỏ in vitro ở công thức kém xấu Chứng tỏ việc bổ sung nồng độ chất ĐTST kinetin vào dung dịch dinh dưỡng cao ảnh hưởng xấu tới sinh trưởng phát triển chồi cỏ in vitro * Nhận xét: Qua nghiên cứu khả bật chồi, hệ số nhân chồi khả sinh trưởng phát triển cỏ in vitro ảnh hưởng chất ĐTST kinetin giai đoạn nhân nhanh, nhận thấy môi trường nhân nhanh tốt cho chồi cỏ in vitro là: (MS + g/l agar + 20 g/l saccaroza + ppm kinetin + 100 ml nước dừa) 34 Hình 3.3 Một số hình ảnh chồi cỏ ngọt giai đoạn nhân nhanh Chồi cỏ bắt đầu nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh 35 3.3 Nhận xét chung Từ kết nghiên cứu thu được, chúng tơi đề xuất quy trình nhân giống in vitro giống cỏ Stevia rebaudiana bertoni M3 sau: Điều kiện ni cấy Quy trình Cây giống Chồi đỉnh Công thức khử trùng đoạn thân mang mắt ngủ HgCl2 0.1% – phút Môi trường vào mẫu: Giai đoạn vào mẫu, MS + 8g/l agar +30g/l saccaroza + cấy gây 1.5mg BAP + 200ml nước dừa Thời gian cấy gây tuần Mẫu in vitro Môi trường nhân nhanh MS + 8g/l agar + 20g/l saccaroza + 100 ml nước dừa + ppm kinetin Thời gian nhân nhanh tuần Giai đoạn nhân nhanh Chồi in vitro (Tiến hành cho rễ huấn luyện thích nghi) 36 3.4 So sánh kết nghiên cứu của đề tài với số nghiên cứu khác So sánh với kết nghiên cứu nuôi cấy mô in vitro cỏ (Nguyễn Thị Hằng, Trần Đình Long, Mai Thị Phương Anh cộng sự, 1992) Chúng nhận thấy rằng giai đoạn nhân nhanh bổ sung thêm chất ĐTST kinetin với nồng độ ppm cho hệ số nhân nhanh 9.98 tuần Trong bở sung vào môi trường nuôi cấy 0.5 mgl -1 hệ số nhân nhanh tuần Như vây việc bổ sung với hàm lượng tương đối khả thi Môi trường nghiên cứu ở bảng 1.3 môi trường lỏng (không bổ sung aga) môi trường thạch (bổ sung 8g agar) Với môi trường lỏng cho hệ số nhân nhanh cao 20 lần tuần, nhiên chồi in vitro lại yếu, sức sống khơng cao Trong với môi trường thạch hệ số nhân nhanh thấp chồi in vitro lại khoẻ, sinh trưởng tốt tiến hành nghiên cứu việc bổ sung kinetin vào mơi trường thạch với mục đích thu chồi in vitro tốt tìm xem bở sung hàm lượng thích hợp Với kết nghiên cứu trên, nhận thấy rằng môi trường mà đề tài sử dụng tương đối phù hợp mang lại hiệu nhân nhanh cao Đối với giai đoạn vào mẫu, khơng có nhiều tài liệu để tiến hành so sánh nên q trình thực đề tài chúng tơi tiến hành khử trùng phối hợp loại hoá chất HgCl2 - phút H2O2 - phút kết bước đầu cho thấy số mẫu chết giảm, nhiên số mẫu nhiễm tăng lên, đến kết luận với công thức khử trùng chưa phù hợp nhận thấy công thức khử trùng đề tài xem tương đối hiệu 3.5 Một số lưu ý quá trình nghiên cứu đề tài Đề tài tiến hành phịng thí nghiệm nên số vấn đề cần lưu ý sau: Nhiễm vi khuẩn, nấm mốc khó khăn thường gặp nhân giống in vitro Các môi trường nuôi cấy giai đoạn u cầu vơ trùng, có 37 sơ suất kỹ thuật, hoặc điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ẩm độ phịng) khơng đảm bảo, làm cho bào tử nấm mốc, rơi vào bình ni, mơi trường dinh dưỡng bình tạo điều kiện cho vi khuẩn, nấm mốc phát triển nhanh chóng, ảnh hưởng xấu đến môi trường nuôi cấy Kết giai đoạn vào mẫu phụ thuộc vào thời điểm lấy mẫu Các cỏ dùng làm nguyên liệu cho nghiên cứu đề tài trồng nhà lưới nên lấy mẫu điều kiện độ ẩm không khí lớn (80%) hoặc thời tiết q nóng làm cho sức sống mẫu cỏ cấy gây giảm nhiều, ảnh hưởng tới khả bật chồi mẫu Mẫu sử dụng để cấy gây chồi đỉnh chồi bên tương đối mọng nước giòn nên dễ gãy dập thao tác xử lý Lớp lông mịn phủ bề mặt mẫu làm giảm hiệu tác động hoá chất khử trùng, cần phải làm lớp lông trước khử trùng mẫu Trong trình thao tác cấy mẫu cần phải thực đầy đủ khâu vô trùng Tuyệt đối khơng để tay chạm vào miệng bình, khơng nói chuyện Các dụng cụ bằng kim loại cần khử trùng thật kĩ lửa đèn cồn, thời gian không qua ngắn Các vật dụng khác phải khử trùng lại bằng cồn (trước dụng cụ dùng cấy mẫu môi trường khử trùng bằng nồi hấp, tủ sấy ), mỗi lần cấy mẫu thực khơng q 10 bình tránh trường hợp mỏi tay, thao tác khơng xác Phải khử trùng buồng cấy phòng cấy trước cấy mẫu để đảm bảo yếu tố vơ trùng Thao tác tốt tỉ lệ mẫu bật chồi cao, tỉ lệ nhiễm giảm 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, xây dựng phần quy trình kỹ thuật nhân giống cỏ (Stevia rebaution bertoni M3) bằng phương pháp nhân giống invitro Giai đoạn vào mẫu - Các đoạn thân mang mắt ngủ hoặc đỉnh sinh trưởng cỏ giống ban đầu khử trùng bằng dung dịch khử trùng HgCl 0.1% khoảng thời gian từ - phút sau xử lý sơ bằng etanol 700 - phút Môi trường dinh dưỡng sử dụng để vào mẫu, cấy gây là: (MS + g/l agar +30 g/l scaccaroza +1.5 mg BAP + 200ml nước dừa) - Thời gian cấy gây tuần Giai đoạn nhân nhanh - Môi trường để sử dụng cho nhân nhanh cỏ Stevia rebaudiana bertoni giống M3 là: (MS + g/l agar +20 g/l scaccaroza + 100 ml nước dừa + 6ppm kinetin) - Thời gian nhân nhanh tuần II Kiến nghị Trên sở kết thời gian nghiên cứu chúng tơi có kiến nghị sau: Cần tiến hành nghiên cứu tác động chất ĐTST như: kinetin với IAA BAP hoặc 2,4D… để xem xét vai trò sinh lý chúng trình hình thành chồi từ chồi ban đầu Tiếp tục nghiên cứu giai đoạn rễ huấn luyện thích nghi để nhanh chóng hồn thiện qui trình nhân giống 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997) CNSH thực vật cải tiến giống trồng NXB nông nghiệp 1997 Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, Từ Thị Hoài Thu (1999) “Nghiên cứu nhân nhanh số giống hoa cúc chùm hoa lan” Báo cáo khoa học hội nghị CNSH toàn quốc, NXB Hà Nội trang 859-865 Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1988) Phân loại thực vật, NXB Đại học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội trang 424-436 Vũ Văn Vụ (chủ biên) Sinh lý học thực vật NXB Giáo dục, Hà Nội, 2005 Nguyễn Thị Kim Lý (2001) Nghiên cứu, tuyển chọn nhân giống hoa cúc vùng đất trồng hoa Hà Nội, Luận án tiến sỹ khoa học, viện KHKT nông nghiệp Việt Nam Nguyễn Quang Thạch, Đặng Văn Đông (2002) Cây hoa cúc kỹ thuật trồng NXB nông nghiệp, Hà Nội Khămlom Văntha Nuoong Luận văn thạc sỹ trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội Trần Thị Thu Hiền, phạm Thị Như Quỳnh, Mai Văn Chung, Nguyễn Đình San Nhân nhanh giống hoa cúc CN97 kỹ thuật ni cấy mơ in vitro Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, số 7,2007, trang 30 - 33 Nguyễn Đức Thành (2000) Nuôi cấy mô, tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội, trang - 54 10 Hoàng Thị Sản Phân loại thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội, 1999 trang 176-178 11 Nguyễn Quang Phổ (2001), Sinh lý thực vật (Bài giảng cho hệ Đại học) 12 Mai Văn Chung Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro nhân giống vơ tính hoa cúc Tạp chí khoa học trường Đại Học Vinh, số 4A, 2004, trang 11 - 15 13 Trần Khắc Hạnh và cs Xây dựng quy trình nhân giống hoa cúc CN01 phương pháp ni cấy mơ Tạp chí nơng nghiệp PTNT, số 11, 2004, trang 1506 -1508 40 14 Nguyễn Thị Diệu Hương, Trương Tấn Nhựt Hồn thiện quy trình nhân nhanh giống hoa cúc bệnh kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tạp chí sinh học, tập 26, số4, 2004, trang 45 - 48 15 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị lý Anh Nhân nhanh in vitro giống hoa cúc Nhật “ Rivalry” Tạp chí khoa học kỹ thuật nơng nghiệp 16 Nguyễn Văn Uyển chủ biên và các tác giả Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác chọn giống trồng Trung tâm CNSH, 1998 17 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp Công nghệ sinh học, tập NXB Giáo dục Hà Nội, 2005 18 Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô, tế bào thực vật- Nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2000 19 Albert Sasson: Công nghệ sinh học phát triển (tài liệu dịch), UNESCO, 1998 20 Hort, R K.(1990), Handbook of pland all culure, vol 5, Newyork, pp 215 - 217 21 Hoogeweg 22 Tài liệu công ty CP đầu tư phát triển Stevia Á Châu 23 http://www.khoahocphothong.com.vn/ /cayco-ngot-chatthaytheduong 24 Bs Phạm Thị Thục, Sức khỏe đời sống//http:www.Ykhoanet.com/ yhoccotruyen//baoviet/29-483htm 25 Lê Hữu Tiệp, báo Nghệ An, 25/6/2010 Trồng cỏ ngọt.http://vietlinh.vn/langviet/trongtrot/ congot/htm 26 Xuân Thông (2010) - Báo công an Nghệ An - Khảo nghiệm trồng giống Cỏ http//: www Congannghean.vn/NewsDetalls.aspx?new 27 Ds Phan Đức Bình Ts Võ Duy Huấn - Cây cỏ steviosid, http//: Baomoi.vn 28 Báo nông nghiệp Việt Nam.http//:wwwspchcm.epi 29 http:// www.Stevia Ventures.com.vn 30 http://www.globastevia.com//gioithieuvecaycongot 41 ... giai đoạn nhân nhanh Chồi cỏ bắt đầu nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh Chồi cỏ sau tuần nhân nhanh 35 3.3... hình nghiên cứu tạo giống in vitro cỏ ngọt Cùng với phát triển mạnh mẽ nuôi cấy mô nhiều người nghiên cứu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro cỏ nhằm nhân nhanh giống bệnh Nghiên cứu nhân. .. trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy phù hợp để đạt hiệu nhân chồi cao Để nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin lên khả nhân chồi cỏ ngot in vitro, tiến hành bổ sung kinetin vào môi trường dinh dưỡng