Chiết xuất các đường steviol glycoside từ lá cỏ ngọt stevia rebaudiana bertoni nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN Chiết xuất đường Steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni Mã số đề tài Thuộc nhóm ngành khoa học: Hóa Dược TP Hồ Chí Minh, tháng 4/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN Chiết xuất đường Steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni Thuộc nhóm ngành khoa học: Hóa Dược Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thời Thịnh Nam, Nữ: Nam Dân tộc: Kinh Lớp: DH11SH06 - Khoa Công nghệ Sinh học - Năm thứ: /Số năm đào tạo: Ngành học: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Minh Hồng TP Hồ Chí Minh, tháng 4/2014 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN I CHẤT NGỌT THAY THẾ ĐƯỜNG Chất nhân tạo Chất tự nhiên II ĐẠI CƯƠNG CỎ NGỌT Thông tin Nguồn gốc Lịch sử phát triển Phân loại Đặc điểm thực vật học Các steviol glycosides cỏ 11 Phương pháp chiết xuất tinh chế 14 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I ĐỐI TƯỢNG THÍ NGHIỆM 20 II DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 20 Dụng cụ 20 2.Thiết bị 21 Hóa chất 21 III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 Quy trình chiết chung 23 Phương pháp trích ly 25 Các phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 27 Phương pháp sắc ký cột để phân tách stevioside từ mẫu steviol glycosides thô 30 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I KẾT QUẢ KHẢO SÁT Q TRÌNH TRÍCH LY 34 Kết khảo sát tác dụng Ca(OH)2 đến trình lọc 34 Kết khảo sát khối lượng steviol glycosides thơ theo thời gian ly trích 35 II KẾT QUẢ KHẢO SÁT SẮC KÝ BẢN MỎNG 36 Kết khảo sát hệ dung môi 36 Khảo sát phương pháp hình sắc ký mỏng 38 Kiểm tra mẫu steviol glycosides kết tinh thu 39 III ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC – MS 40 IV KẾT QUẢ KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SẮC KÝ CỘT 41 Nạp mẫu dạng khô 41 Nạp mẫu dạng dung dịch 43 Kết sắc ký cột phân đoạn thu 43 V SO SÁNH KẾT QUẢ THU ĐƯỢC VỚI CÁC ĐỀ TÀI TRONG NƯỚC GẦN ĐÂY 416 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh cấu trúc độ steviol glycosides (sucrose = 1) 13 Bảng 1.2 Ưu nhược điểm phương pháp chiết Soxhlet 14 Bảng 3.1 Hiệu suất trích ly steviol glycosides thơ có bổ sung Ca(OH)2 35 Bảng 3.2 Hiệu suất trích ly Soxhlet theo thời gian 35 Bảng 3.3 Kết phân tích với tiêu rebaudioside A, stevioside 41 Bảng 3.4 Các phân đoạn sắc ký cột 41 Bảng 3.5 Các phân đoạn sắc ký cột 44 Bảng 3.6 So sánh quy trình trích ly tinh chế 47 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Saccharin Hình 1.2 Sodium cyclamate Hình 1.3 Aspartame Hình 1.4 Acesulfame K Hình 1.5 Xylitol Hình 1.6 Stevia rebaudiana Bertoni 10 Hình 1.7 Stevioside 12 Hình 1.8 Rebaudioside A 13 Hình 1.9 Túi mẫu hệ thống Soxhlet 15 Hình 1.10 Đồ thị thể mối quan hệ độ tan nhiệt độ 16 Hình 1.11 Các bước lọc thu tinh thể 17 Hình 2.1 Lá cỏ khơ Stevia rebaudiana Bertoni 20 Hình 2.3 Đèn UV huỳnh quang Vilber Lourmat VL – 6.LC 22 Hình 2.2 Bếp khuấy từ có gia nhiệt VELP ARE + cá từ 22 Hình 2.5 Hệ thống chưng cất thu hồi dung môi 22 Hình 2.4 Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ LC–MS micrOTOF–Q (Bruker, Đức) 22 Hình 2.6 Q trình chung trích ly stevioside 23 Hình 2.7 Lọc dịch ethanol khơng bổ sung lọc Ca(OH)2 25 Hình 2.8 Lọc dịch ethanol có bổ sung Ca(OH)2 26 Hình 2.9 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian trích ly Soxhlet 27 Hình 3.1 Khơng dùng Ca(OH)2 có dùng Ca(OH)2 34 Hình 3.2 Khảo sát hệ sắc ký 37 Hình 3.3 Hiện hình tia UV (trái), iod (giữa), H2SO4 10% ethanol (phải) 38 Hình 3.4 Độ tinh khiết steviol glycosides thô 40 Hình 3.5: Hiện tượng cột sắc ký gãy (trái) vón cục nạp mẫu khơ (phải) 42 Hình 3.6: Cột sắc ký (trái) nạp mẫu dạng dung dịch (phải) 43 Hình 3.7: Phân đoạn CN – – (trái) phân đoạn CN – 10 – 11 (phải) so với stevioside chuẩn 46 Chiết xuất đường steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê International Diabetes Federation (IDF), giới có 382 triệu người mắc bệnh tiểu đường (2013) Trong tương lai 2035, số người mắc bệnh tăng lên mức 592 triệu người Bệnh tiểu đường type chiếm 90% số ca mắc bệnh tăng quốc gia Quan trọng hơn, 80% người bị bệnh tiểu đường có hầu hết quốc gia, từ nước nghèo đến nước phát triển hay nước cường quốc giới Tuổi thọ trung bình người mắc bệnh tiểu đường khoảng 40 – 59 tuổi Riêng Việt Nam độ tuổi từ 20 – 79 tuổi có triệu người mắc bệnh (chiếm 5,81% so với dân số nước) Số người chết bệnh tiểu đường tăng với 54.953 ca tử vong Ước tính, năm phút trơi qua có thêm người mắc bệnh, biến tiểu đường trở thành mối đe dọa với cộng đồng xã hội Đối với người mắc bệnh tiểu đường việc tiếp xúc với loại thực phẩm có chứa glucid hạn chế, lẽ việc hấp thu glucid bữa ăn dẫn đến lượng đường máu tăng vọt lại khơng có khả chuyển hóa cung cấp lượng cho thể Vì vậy, chất thay đường mía sucrose phần ngày áp dụng cho người bệnh gồm: chất nhân tạo chất có nguồn gốc từ thiên nhiên với độ cao gấp nhiều lần Tuy nhiên, chất nhân tạo đem đến e ngại cho người sử dụng ảnh hưởng mà mang lại sử dụng lâu dài sức khỏe người saccharin, cyclamate, aspartame… Cỏ (Stevia rebaudiana) có độ gấp 10-15 lần so với sucrose dạng lá, gấp 30 lần khô trà, chất tự nhiên biết đến nhiều Nhiều nghiên cứu phân lập S.rebaudiana xác định đường có dẫn xuất từ diterpenoids, đặc biệt chất từ dẫn xuất glycosides ent-kaurene gồm stevioside, rebaudioside A, B, C Ngồi việc có độ cao gấp nhiều lần đường mía (sucrose), đường cỏ lại khơng tạo calorie yếu tố cho phép người Trang Chiết xuất đường steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni bị bệnh tiểu đường sử dụng, điều trị bệnh áp dụng vào phần dinh dưỡng dành cho người ăn kiêng Các báo cáo cho thấy stevia có khả kháng khuẩn, chống vi khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa [5] hạ đường huyết [4] ; tăng hiệu điều trị chứng bệnh như: đau dây thần kinh tọa, thiếu máu, đau lưng, thấp khớp, bệnh chàm, viêm da, [6] Cho ta thấy lợi ích cỏ việc chăm sóc, bảo vệ chữa trị sức khỏe người Ngày nay, stevia thương mại hóa thơng qua công ty lớn khắp quốc gia giới với sản phẩm: Zevia, Stevia Dent, Purevia, Truvia… Do vậy, hàng nghìn hecta phủ xanh cỏ phục vụ trình sản xuất loại thảo dược này, quốc gia: Brazil, Argentina, Paraguay, Nhật Bản, Trung Quốc… Tuy nhiên, số quốc gia phát triển nước nghèo, sản phẩm stevioside nhập từ thị trường bên ngồi nên khơng phổ biến giá thành cao, có Việt Nam Trong năm gần Việt Nam, người ta bắt đầu quan tâm đến cỏ Nhiều cơng trình nghiên cứu mở nhằm tìm kiếm lối tạo nên dòng sản phẩm stevia tinh khiết phù hợp với cỏ Việt Nam (Stevia rebaudiana Bertoni) Qua khảo sát quy trình, báo ngồi nước Gần có cơng trình nghiên cứu hoàn thiện chiết xuất tinh chế stevioside từ cỏ ngọt[2] Mặc dù thành cơng q trình nghiên cứu chiết tách thành cơng stevioside cỏ chưa giải đáp vấn đề giá thành chi phí sản xuất stevia Chính yếu tố khách quan tạo động lực cho việc nghiên cứu quy trình “Chiết xuất đường steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni” mang lại giá trị thực tiễn kinh tế, sức khỏe tiền đề cho nghiên cứu sau Trang Chiết xuất đường steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni PHẦN 1: TỔNG QUAN Trang Chiết xuất đường steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni I CHẤT NGỌT THAY THẾ ĐƯỜNG – LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN:[7] Chất nhân tạo: 1.1 Saccharin: - Tên IUPAC: 1,1-dioxo-1,2-benzothiazol-3-one - Công thức phân tử: C7H5NO3 - Tinh thể trắng, không mùi, tan nước - Độ gấp 200 – 800 lần sucrose, vị chát, hậu vị kim loại Hình 1.1 Saccharin - Saccharine (E 954) phát tình cờ vào năm 1879 giáo sư Ira Remsen nghiên cứu sinh Constain Fahlberg từ Đại học Johns Hopkins nghiên cứu hóa học số dẫn xuất toluene Vào năm 1907, saccharin đường hóa học dùng phụ gia thay đường thực phẩm cho bệnh nhân tiểu đường 1.2 Sodium cyclamate: - Tên IUPAC: sodium N-cyclohexylsulfamate - Công thức phân tử: C6H12NO3S.Na - Màu trắng, không mùi, dạng bột tinh thể có vị (độ gấp 30 lần so với đường mía) - Tan nước, khơng tan benzen, chloroform, ethanol diethyl ether Hình 1.2 Sodium cyclamate - Tính ổn định: dung dịch cyclamate ổn định với nhiệt, ánh sáng khơng khí khoảng pH rộng Trang ... steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni? ?? mang lại giá trị thực tiễn kinh tế, sức khỏe tiền đề cho nghiên cứu sau Trang Chiết xuất đường steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni. ..TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN Chiết xuất đường Steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni Thuộc nhóm ngành khoa học: Hóa... rebaudiana Bertoni PHẦN 1: TỔNG QUAN Trang Chiết xuất đường steviol glycoside từ cỏ Stevia rebaudiana Bertoni I CHẤT NGỌT THAY THẾ ĐƯỜNG – LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN:[7] Chất nhân tạo: 1.1