Chiết xuất, phân lập và đánh giá hoạt tính kháng ung thư in vitro của một số hợp chất từ phần trên mặt đất cây cỏ mật gấu ( isodon lophanthoides (buch ham ex d don) h hara), họ bạc hà lamiaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HÀ THÙY TRANG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ IN VITRO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CÂY CỎ MẬT GẤU(Isodon lophanthoides (Buch.Ham ex D.Don) H.Hara), HỌ BẠC HÀ - Lamiaceae LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI_2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HÀ THÙY TRANG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ IN VITRO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CÂY CỎ MẬT GẤU (Isodon lophanthoides (Buch.Ham ex D.Don) H.Hara), HỌ BẠC HÀ - Lamiaceae LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Nơi thực đề tài : Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Dược liệu Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đỗ Thị Hà PGS TS Nguyễn Hoàng Tuấn HÀ NỘI_2021 LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, tơi nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ Thầy Cô, nhà khoa học Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Dược liệu, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đỗ Thị Hà PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn, người thầy dành thời gian, tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ, động viên suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tơi xin chân thành cảm ơn cán cán nghiên cứu Khoa Hóa Thực vật Khoa Hố Phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, giúp đỡ đóng góp ý kiến cho tơi q trình học tập thực nghiên cứu Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cám ơn tới Ban Giám hiệu nhà trường Trường Cao đẳng Y tế Hưng Yên tạo điều kiện cho tham gia học tập Luận văn hỗ trợ phần kinh phí từ đề tài Nghị định thư Việt Nam-Hàn Quốc “Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư điều hịa miễn dịch số thuốc Việt Nam”, hợp đồng NCKH số 09/2020/HĐ-NĐT ký ngày 09/9/2020”, xin gửi lời cảm ơn tới Bộ KHCN tạo điều kiện để thực luận văn Lời sau cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình bạn bè ln chia sẻ, ủng hộ tơi suốt q trình học tập vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2021 Học viên MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1:TỔNG QUAN 1.1 Thực vật 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Sinh thái phân bố 1.2 Thành phần hóa học 1.2.1 Diterpenoid 1.2.2 Phenolic đơn giản 12 1.2.3 Triterpenoid steroid 13 1.2.4 Flavonoid 14 1.2.5 Dihydrobenzofuran lignan 16 1.3 Tác dụng sinh học 17 1.3.1 Tác dụng chống ung thư 17 1.3.2 Tác dụng chống virus 18 1.3.3 Tác dụng bảo vệ gan 19 1.3.4 Tác dụng kháng khuẩn 20 1.3.5 Tác dụng chống viêm 20 1.3.6 Tác dụng chống oxy hóa 21 1.3.7 Tác dụng khác 21 1.4 Tính vị cơng dụng 22 PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Dung môi, hóa chất dịng tế bào 24 2.3 Trang thiết bị nghiên cứu 24 2.4 Địa điểm thực 25 2.5 Phương pháp nghiên cứu 25 2.5.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất phân lập 25 2.4.2 Đánh giá tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư in vitro 27 2.6 Thiết kế nghiên cứu 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Chiết xuất 32 3.2 Phân lập hợp chất 32 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất 35 3.3.1 Hợp chất IL1 35 3.3.2 Hợp chất IL2 37 3.3.3 Hợp chất IL3 38 3.3.4 Hợp chất IL4 40 3.3.5 Hợp chất IL5 41 3.4 Tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư cao chiết hợp chất phân lập từ phần mặt đất Cỏ mật gấu 43 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 46 4.1 Về đối tượng nghiên cứu 46 4.2 Về hợp chất phân lập 48 4.3 Về hoạt tính kháng ung thư in vitro phân đoạn chất phân lập 51 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt H-NMR 13 C-NMR Tiếng Anh Tiếng Việt Proton magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt spectroscopy nhânproton Carbon-13 nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt resonance spectroscopy nhân carbon 13 CH2Cl2 Dichloromethan CC Column chromatography Sắc ký cột DEPT Distortionless enhancement Phổ DEPT bypolarization transfer DMEM Dulbecco's modified Eagle’s Môi trường nuôi cấy tế bào medium DMSO Dimethyl sulfoxide EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid Acid ethylendiamin tetraacetic EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol FBS Fetal bovine serum Huyết phơi bị HbsAg Hepatitis B surface antigen Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan siêu vi B HPLC High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography HPLC-MS High-performance liquid Sắc ký lỏng khối phổ chromatography-mass spectrometry Heteronuclear single quantum Phổ tương tác dị hạt nhân coherence qua liên kết IC50 Inhibitory concentration of 50% Nồng độ ức chế 50% IFN-γ Gamma interferon HSQC MCP-1 Monocyte chemoattractantprotein-1 MeOH Methanol MS Mass spectroscopy MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Phổ khối diphenyltetrazolium bromid NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OD Optica density SOD Superoxid dismutase SGPT Serum glutamic-pyruvic Giá trị mật độ quang transaminase TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TNF-α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u alpha WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 Tế bào ung thư vú A549 Human alveolar epithelial cells Tế bào ung thư phổi HepG2 Human liver cancer cell line Tế bào ung thư gan HL60 Human leukaemia 60 Tế bào ung thư máu người DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc diterpenoid (1-73) phân lập từ Cỏ mật gấu 11 Hình 1.2 Cấu trúc acid phenolic phân lập từ Cỏ mật gấu (74 – 89) 13 Hình 1.3 Cấu trúc triterpenoid phân lập từ Cỏ mật gấu (90 – 99) 14 Hình 1.4 Cấu trúc flavonoid phân lập từ Cỏ mật gấu (100 – 108) 15 Hình 1.5 Cấu trúc dihydrobenzofuran lignan phân lập từ Cỏ mật gấu (109 – 114) 17 Hình 2.1 Mẫu nghiên cứu (Cỏ mật gấu - Isodon lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara var lophanthoides) 23 Hình 2.2 Phản ứng nhuộm màu tế bào sống phương pháp MTT 28 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 31 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cao tổng cao phân đoạn từ Cỏ mật gấu 34 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao EtOAc Cỏ mật gấu 35 Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất IL1 36 Hình 3.4 Cấu trúc hợp chất IL2 37 Hình 3.5 Cấu trúc hợp chất IL3 39 Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất IL4 41 Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất IL5 43 DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Đặc điểm số thứ loài Isodon lophanthoides (BuchananHamilton ex D.Don) H Hara Bảng 1.2 Các hợp chất diterpenoid phân lập từ Cỏ mật gấu Bảng 1.3 Các hợp chất phenolic phân lập từ Cỏ mật gấu 12 Bảng 1.4 Các hợp chất triterpenoid phân lập từ Cỏ mật gấu 13 Bảng 1.5 Các hợp chất flavonoid phân lập từ Cỏ mật gấu 15 Bảng 1.6 Các hợpchất dihydrobenzofuran lignan phân lập từ Cỏ mật gấu 16 Bảng 3.1 Dữliệu phổ hợp chất IL1 acid protocatechuic 36 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ hợp chất IL2 acid 4-hydroxybenzoic 37 Bảng 3 Dữ liệu phổ hợp chất IL3 coetsoidin B 38 Bảng Dữ liệu phổ hợp chất IL4 coetsoidin A 40 Bảng Dữ liệu phổ hợp chất IL5 acid rosmarinic 42 Bảng 3.6 Hoạt tính ức chế số dòng tế bào ung thư cao chiết từ phần mặt đất Cỏ mật gấu thể qua giá trị IC50 (μg/ml) 44 Bảng 3.7 Hoạt tính ức chế số dịng tế bào ung thư hợp chất phân lập từ phần mặt đất Cỏ mật gấu thể qua giá trị IC50 (μM) 44 Bảng 4.1 Đặc điểm thực vật loài I lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara I lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara var lophanthoides 46 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, bệnh ung thư trở thành vấn đề sức khỏe hàng đầu người toàn giới Ung thư nguyên nhân gây tử vong thứ hai sau bệnh tim mạch tỷ lệ mắc có xu hướng tăng nhanh hầu Các bệnh ung thư đa dạng nguy hiểm không phát điều trị kịp thời Trong đó, thuốc điều trị ung thư thị trường nhiều tác dụng phụ giá thành tương đối cao tạo gánh nặng tâm lý vật chất cho người bệnh xã hội Vì vậy, việc tìm kiếm phát triển thuốc có tác dụng kháng ung thư với giá thành hợp lý, tác dụng khơng mong muốn vấn đề cấp thiết Việt Nam có y học cổ truyền lâu đời với nguồn dược liệu vô phong phú hứa hẹn nguồn nguyên liệu dồi cho việc nghiên cứu phát triển thuốc nói chung thuốc điều trị ung thư nói riêng Cỏ mật gấu (Isodon lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara) hay gọi Hùng đởm thảo, Nhị rối vằn, Đằng nha sọc Cây phân bố rải rác số tỉnh miền núi Lào Cai, Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên Bắc Kạn [1] Phần mặt đất sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị vàng da cấp tính, viêm túi mật, viêm ruột, kiết lỵ chấn thương; chúng sử dụng làm đồ uống hàng ngày giúp tăng cường sức khỏe Cao chiết nước phần mặt đất I lophanthoides var graciliflorus có tác dụng gây độc tế bào ung thư biểu mô tế bào người [28] Diterpenoid thành phần I lophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) H.Hara có tác dụng kháng khuẩn [29], [30], [72], kháng ung thư [72], tác dụng chống lao [72], chống sốt rét [72], chống oxy hóa [30], [72] Mặc dù Cỏ mật gấu nghiên cứu nhiều giới, nhiên, theo tra cứu tài liệu khoa học, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng ung thư Cỏ mật gấu Việt Nam chưa có Chính vậy, chúng tơi thực đề tài “Chiết xuất, phân lập đánh Phụ lục 2.3.6 Phổ HMBC (500/125 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10A11 Phụ lục 2.3.7 Phổ NOESY (500/500 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10A11 Phụ lục 2.4 Dữ liệu phổ hợp chất NRV-10C11 (IL4) Cấu trúc hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.3 Phổ DEPT hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.4 Phổ COSY (500/500 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.5 Phổ HSQC (500/125 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.6 Phổ HMBC (500/125 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.7 Phổ NOESY (500/500 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.3 Phổ DEPT hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.4 Phổ COSY (500/500 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.5 Phổ HSQC (500/125 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.6 Phổ HMBC (500/125 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.4.7 Phổ NOESY (500/500 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-10C11 Phụ lục 2.5 Dữ liệu phổ hợp chất NRV-11C2 (IL5) Cấu trúc hợp chất NRV-11C2 Phụ lục 2.5.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-11C2 Phụ lục 2.5.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-11C2 Phụ lục 2.5.3 Phổ DEPT hợp chất NRV-11C2 Phụ lục 2.5.1 Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-11C2 Phụ lục 2.5.2 Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) hợp chất NRV-11C2 Phụ lục 2.5.3 Phổ DEPT hợp chất NRV-11C2 ... thư Cỏ mật gấu Việt Nam chưa có Chính vậy, thực đề tài ? ?Chiết xuất, phân lập đánh giá hoạt tính kháng ung thư in vitro số h? ??p chất từ phần mặt đất Cỏ mật gấu Isodon lophanthoides (Buch. -Ham ex. ..BỘ GIÁO D? ??C VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI H? ??C D? ?ỢC H? ? NỘI H? ? THÙY TRANG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ IN VITRO CỦA MỘT SỐ H? ??P CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CÂY CỎ MẬT GẤU... bào ung thư h? ??p chất phân lập từ phần mặt đất Cỏ mật gấu thể qua giá trị IC50 (? ?M) 44 Bảng 4.1 Đặc điểm thực vật loài I lophanthoides (Buch. -Ham ex D. Don) H. Hara I lophanthoides (Buch. -Ham ex