Khảo sát sự tích lũy germanium trong sinh khối nấm ophiocordyceps sinensis và thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ “KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY GERMANIUM TRONG SINH KHỐI NẤM Ophiocordyceps sinensis VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ” Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Tài Hoàng Thành viên tham gia: ThS Lê Quốc Phong ThS Trần Minh Trang CN Nguyễn Thị Trà My CN Nguyễn Thị Thương CN Phạm Tiến Dũng Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ “KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY GERMANIUM TRONG SINH KHỐI NẤM Ophiocordyceps sinensis VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ” Chủ tịch Hội đồng nghiệm thu Chủ nhiệm nhiệm vụ PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Nguyễn Tài Hồng Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Đồn Kim Thành THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG VỀ NHIỆM VỤ Tên nhiệm vụ: Khảo sát tích lũy Germanium sinh khối nấm Ophiocordyceps sinensis thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Vườn ươm Sáng tạo Khoa học Công nghệ trẻ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: NGUYỄN TÀI HOÀNG Ngày, tháng, năm sinh: Học hàm, Học vị: Giới tính: Nam 19/01/1993 Thạc sĩ Chức danh khoa học: Chức vụ: Nghiên cứu viên Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 0989 190 977 Fax: E-mail: hoangnguyenhoang191@gmail.com Tên tổ chức công tác: Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh học Địa tổ chức: 74 Đường số KDC Bình Hưng – Bình Chánh, TP HCM Địa nhà riêng: 17/4, đường 41, phường Linh Đông, quận Thủ Đức, TP HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Điện thoại: 028.38.230.780 Fax: E-mail: vuonuomtst@gmail.com Website: www.khoahoctre.com.vn Địa chỉ: Số 01 Phạm Ngọc Thạch, Phường Bến Nghé, Quận 1, TP Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: ĐỒN KIM THÀNH Số tài khoản: 3713.0.1083277.00000 Kho bạc Nhà nước/Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Quận Tên quan chủ quản đề tài: II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng /năm 2018 đến tháng /năm 2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng /năm 2018 đến tháng /năm 2019 - Được gia hạn (nếu có): KHƠNG Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 80 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 80 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT … Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 09/2018 40 03/2019 24 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 09/2018 40 04/2019 24 Ghi (Số đề nghị toán) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng 40,7 40,7 Nguồn khác 30,6 30,6 NSKH 0 8,7 80 Thực tế đạt Tổng 40,7 40,7 Nguồn khác 30,6 30,6 NSKH 0 8,7 8,7 80 8,7 - Lý thay đổi (nếu có): Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Thiết bị, máy móc mua Theo kế hoạch Tổng NSKH Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác Nhà xưởng xây dựng mới, cải tạo Kinh phí hỗ trợ cơng nghệ Chi phí lao động Nguyên vật liệu, lượng Thuê thiết bị, nhà xưởng Khác Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số TT Số, thời gian ban hành văn 6/2018 Tên văn Ghi Hợp đồng thuê khoán Thẩm tra toán năm 2018 Đợt … Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng q 10 người kể chủ nhiệm) Tên cá nhân STT Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực ThS Nguyễn ThS Nguyễn Tài Hoàng Tài Hoàng ThS Lê Quốc ThS Lê Quốc Phong Phong đăng ký theo Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt Báo cáo tổng kết Báo cáo Xây dựng thuyết minh Thuyết minh đề tài Ghi chú* ThS Trần Minh ThS Trần Đánh giá khả Trang Minh Trang gây độc tế bào CN Nguyễn CN Nguyễn Khảo sát ảnh Thị Trà My Thị Trà My hưởng Ge đến Số liệu Số liệu nấm O sinesis HVCH Nguyễn HVCH Thu nhận hợp Thị Thương Nguyễn Thị chất sinh học Số liệu Thương HVCH Phạm HVCH Thu nhận hợp Tiến Dũng Nguyễn Tiến chất sinh học Số liệu Dũng Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm ) Nội dung: Khảo sát tích lũy Germanium sinh khối nấm Ophiocordyceps sinensis thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư Thời gian: 10/4/2019 Kinh phí: 8tr Địa điểm: Ban quản lý khu Nông nghiệp Công nghệ cao TP HCM, 214, D5, quận Bình Thạnh, TP HCM - Lý thay đổi (nếu có): Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Nội dung: Khảo sát tích lũy Germanium sinh khối nấm Ophiocordyceps sinensis thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư Thời gian: 18/4/2019 Kinh phí: 8tr Địa điểm: Ban quản lý khu Nơng nghiệp Cơng nghệ cao TP HCM, 214, D5, quận Bình Thạnh, TP HCM Ghi chú* Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Số TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Xây dựng thuyết minh chi tiết đề tài Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế hoạch đạt 2/2018 – 3/2018 – 3/2018 4/2018 Khảo sát ảnh hưởng Ge lên nấm O sinensis môi trường agar Khảo sát ảnh hưởng Ge lên sản xuất sinh khối nấm O sinensis môi trường lỏng Thu nhận hợp chất sinh học từ sinh khối nấm 4/2018 – 5/2018 4/2018 – 6/2018 6/2018 – 9/2018 7/2018 – 10/2018 9/2018 – 10/2018 11/2018 – 12/2018 Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư dòng tế bào ung thư 11/2018 – 2/2019 12/2018 – 3/2019 Viết báo cáo tổng kết 2/2019 – 3/2019 3/2019 – 5/2019 Người, quan thực Nguyễn Tài Hoàng Trần Minh Trang Lê Quốc Phong Nguyễn Tài Hoàng Nguyễn Thị Thương Nguyễn Thị Trà My Nguyễn Tài Hoàng Nguyễn Tài Hoàng Nguyễn Thị Trà My Phạm Tiến Dũng Nguyễn Tài Hoàng Lê Quốc Phong Nguyễn Tài Hoàng Lê Quốc Phong Trần Minh Trang III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Sinh khối nấm giàu Ge Ge-IPS Ge-EPS Ge-protein Đơn vị đo gram gram gram gram Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt 1 1 200 250g 2,6g 5g 0,3 g - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế Ghi Quy trình ni cấy nấm O sinensis giàu Ge Thu nhận chủng giống phát triển tốt GeO2 Chọn nồng độ Ge thích hợp Năng suất sinh khối ổn định (tương đương chủng đối chứng không bổ sung Ge) đạt Chủng phát triển tốt môi trường co GeO2 nên cần sử dụng chủng thường Chọn nồng độ Ge 400 mg/l Năng suất sinh khối 20 g/l - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Báo cáo tổng kết đề tài Bài báo “Nghiên cứu hấp thụ germanium sinh khối nấm Ophiocordyceps sinensis nuôi cấy giàu germanium” Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) Đạt Đạt Tạp chí Di truyền học ứng dụng, chuyên san Nấm học công nghệ sinh học - Lý thay đổi (nếu có): d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Số TT Tên sản phẩm đăng ký - Lý thay đổi (nếu có): Kết Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ 2 Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: Trong nước: nghiên cứu cung cấp thêm liệu khoa học làm giàu khoáng vi lượng Ge nấm, làm tiền đề cho nghiên cứu sâu Và cho thấy giá trị dược liệu nấm O sinensis Ge hữu người Thế giới: cung cấp thêm sở, liệu làm giàu Ge nấm O sinensis b) Hiệu kinh tế xã hội: Nghiên cứu tiền đề sở tạo sản phẩm O sinensis giàu Ge hữu có khả dụng sinh học cao Đa dạng thêm sản phầm từ O sinensis từ có thêm nhiều lựa chọn cho khách hàng Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra nhiệm vụ: Số TT I II III Nội dung Báo cáo tiến độ Thời gian thực 12/2018 Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Tình hình thực đề tài đạt 50% Lần … Báo cáo giám định Lần … Nghiệm thu sở …… Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) Nguyễn Tài Hoàng Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH .iii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu germanium 1.1.1 Hoạt tính germanium 1.1.2 Nguồn cung cấp, hấp thụ loại bỏ germanium 1.2 Tổng quan nấm Ophiocordyceps sinensis 1.2.1 Thành phần hoạt tính sinh học 1.2.2 Tình hình ni cấy nấm Cordyceps 11 1.3 Tổng quan nuôi cấy vi lượng nấm Cordyceps sp 12 1.4 Giới thiệu ung thư 12 1.4.1 Khái quát ung thư 12 1.4.2 Điều trị ung thư 13 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 14 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp chuẩn bị giống cấp 17 2.2.2 Phương pháp chuẩn bị giống cấp 17 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng Ge lên nấm O sinensis môi trường PGA 18 Pro 500 0,31 ± 3,97 DMSO 0,5% 12,72 ± 1,15 Camptothecin 0,01 55,75 ± 1,12 Khi sàng lọc mẫu Ge-EPS EPS nồng độ 500 µg/mL chúng cho thấy khả gây độc tế bào ung thư MCF-7 với giá trị 39,93 % 54,02% (bảng 3.2, hình 3.8) Kết cho thấy mẫu có tiềm gây độc tế 70 60 60 50 Tế bào chết (%) Tế bào chết (%) bào nên tiếp tục đánh giá thêm nhiều nồng độ khác (hình 3.7) 50 40 30 20 40 30 20 10 10 Ge-EPS 500 750 1000 Nồng độ (µg/mL) CPT Mẫu thử nghiệm 70 60 60 50 Tế bào chết (%) Tế bào chết (%) 250 CPT 50 40 30 20 40 30 20 10 10 0 10 25 50 100 Nồng độ (µg/mL) 250 CPT EPS CPT Mẫu thử nghiệm Hình 3.7 Sự ảnh hưởng Ge-EPS EPS lên tăng trưởng tế bào A: Mẫu Ge-EPS MFC-7; B: Mẫu Ge-EPS Fibroflast 1000 µg/mL; C: 38 Mẫu EPS MFC-7; D: Mẫu EPS Fibroflast 1000 µg/mL; CPT: camptothecin CPT - 0,01 µg/mL DMSO 0,5% EPS 500 µg/mL Ge-EPS 500 µg/mL IPS 500 µg/mL Ge-IPS 500 µg/mL 39 Pro 50 µg/mL Ge-Pro 50 µg/mL Hình 3.8 Hình thái tăng trưởng tế bào ung thư sau xử lý với mẫu 48 giờ Các tế bào ung thư chụp kính hiển vi quang học mức 200X Sau khảo sát hoạt tính nồng độ thấp Ge-EPS EPS, cho thấy tăng nồng độ mẫu thử, khả gây độc tế bào tăng dần, với IC50 mẫu Ge-EPS 693,97 ± 35,66 µg/mL với mẫu EPS 49,16 ± 6,91 µg/mL Ở thí nghiệm chúng tơi đánh giá an toàn mẫu thử nghiệm khảo sát dòng tế bào thường fibroblast, kết cho thấy mẫu Ge-EPS EPS khơng gây độc với dịng tế bào liều thử nghiệm 1000 µg/mL Theo nghiên cứu trước đây, hợp chất Spirogermanium có khả ức chế dòng tế bào ung thư Hela, NIL [17], dẫn xuất poly Ge hữu khó khả ức chế dòng tế bào ung thư SMMC-7721, Hela K_(562) [41] [23] Cho thấy bis (2-carboxyethylgermanium) sesquioxide có hiệu ức chế khối u số mơ ung thư biểu mơ phổi, ung thư bạch cầu tự phát, ngồi chúng cịn cảm ứng IFN-γ tăng cường hoạt động tế bào NK [22], Ge-132 có tác dụng ức chế đáng kể xuất phát triển khối u gây bệnh Marek (MDV), acid caffie germanium ức chế phát triển khối u U14 chuột gây tự chết tế bào khối u U14 [26] Gần đây, nghiên cứu Choi cộng (2017) cho thấy cao chiết nước nóng từ sinh khối C militaris 40 giàu Ge (CMGe) có hiệu gây độc dòng tế bào ung thư Ramos, A549, Hep G2 [12] Mặc dù nghiên cứu trước cho thấy hợp chất Ge có hoạt tính gây độc tế bào ung thư thí nghiệm kết gây độc tế bào mẫu Ge-IPS Ge-EPS có xu hướng thấp so với DC, nguyên nhân số lý sau: + Có thể hợp chất chứa Ge khơng tác dụng tốt Dịng tế bào ung thư MCF-7, đó, thử nghiệm dòng tế bào ung thư khác Jukat, Hep G2 để đánh giá hoạt tính hợp chất giàu Ge + Có thể hợp chất này, hàm lượng Ge cịn thấp khơng đủ khả gây độc dịng đế bào mà nồng độ thấp lại có khả kích thích phát triển chúng + Cơ chế gây độc tế bào hợp chất không tác động trực tiếp lên tế bào mà theo chế gián tiếp khác kích thích hệ thống miễn dịch, để đánh giá xác sử dụng mơ hình in vivo Theo nghiên cứu khác thử nghiệm mơ hình in vivo, sanumgerman có khả làm giảm khối u lên tới 50% so với DC [17] Những công bố trước cho thấy hợp chất Ge hữu có khả kích thích hoạt động hệ miễn dịch, cảm ứng interferon, đại thực bào, tế bào T & NK, sản xuất bạch cầu, yếu tố có vai trò ức chế tế bào ung thư [22], [7], hoạt tính kháng ung thư có kết rõ ràng mơ hình in vivo 41 Chương Kết luận – kiến nghị 4.1 Kết luận Sàng lọc khoảng nồng độ thích hợp cho O sinensis phát triển môi trường bổ sung GeO2 nồng độ khác 100, 200, 400, 800, 1600 mg/L Chọn nồng độ Ge thích hợp (400 mg/L) cho phát triển O sinensis môi trường lỏng tĩnh với khối lượng sinh khối thu 20,00 g/L lượng Ge tích lũy đạt 232,78 mg Thu nhận hợp chất Ge-EPS, Ge-IPS, Ge-Pro với hiệu suất đạt 2,05 ± 0,27 g/L, 85,99 ± 2,40 mg/g, 0,94 ± 0,30 mg/g Đánh giá hoạt tính hợp chất Ge-EPS, Ge-IPS, Ge-Pro dòng tế bào MCF-7, nhiên hợp chất có hoạt tính gây độc thấp so với đối chứng 4.2 Kiến nghị Xác định số thành phần hoạt chất có sinh khối nấm O sinensis giàu Ge adenosine, cordycepin, ergosterol, acid amin nhằm đánh giá tác động Ge đến trình biến dưỡng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp nấm O sinensis Định tính, định lượng hàm lượng Ge hữu có nấm O sinensis Tối ưu hóa thành phần mơi trường điều kiện ni cấy O sinensis có bổ sung Ge 400 mg/L Tinh hợp chất Ge-IPS, Ge-EPS, Ge-Pro thu nhận thu hợp chất nhiều phân đoạn khác Đánh giá số hoạt tính sinh học khác Ge-EPS, Ge-IPS Ge-Pro như: kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, tăng cường miễn dịch, ức chế khối u mơ hình in vivo 42 Sơ đồ: Quy trình ni cấy nấm O sinensis giàu Ge môi trường lỏng tĩnh Giống gốc O sinensis Hoạt hóa giống PGA Giống cấp Cấy giống PG Giống cấp Bổ sung 10% giống Nuôi cấy lỏng tĩnh, bổ sung Ge 400 mg/L Nuôi cấy 40 ngày 25oC Thu nhận sinh khối Sấy khô 50oC, bảo quản 4-10oC 43 Mô tả quy trình ni cấy: Chuẩn bị giống cấp - Chuẩn bị môi trường PGA: khoai tây (200 g/L), glucose (20 g/L), agar (20 g/L), pH 6-7 Hấp khử trùng 15 phút 121oC, atm - Đổ 10-15 mL mơi trường PGA vào đĩa petri Dùng que cấy vịng lấy miếng thạch nhỏ có giống từ ống giống gốc sang đĩa petri - Ủ nhiệt độ 23oC ngày, thao tác thực tủ cấy vô trùng Chuẩn bị giống cấp - Chuẩn bị môi trường lỏng PG: khoai tây (200 g/L), glucose (20 g/L), pH 6-7 - Cho 200 mL PG vào erlen 250 mL, hấp 15 phút 121 oC, atm - Cấy khoanh giống cấp có đường kính mm vào erlen - Ủ 23oC, từ 10 -12 ngày Nuôi cấy O sinensis môi trường lỏng bổ sung Ge - Môi trường lỏng (KS): Khoai tây (200g/L), saccharose (50 g/L), pepton (6 g/L), cao nấm men (4 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L) MgCl2 (0,1 g/L) Hấp khử trùng 30 phút 121oC, atm, pH – 6,5 - Bổ sung 10% (v/v) giống cấp 400 mg/L GeO2 vào môi trường - Khuấy máy lắc phút - Tiến hành đổ 200 mL môi trường vào hộp nhựa - Nuôi nhiệt độ 23oC, theo dõi 40 ngày - Sinh khối thu nhận cách lọc qua ray rửa nhiều lần vịi nước nhằm loại bỏ hồn tồn Ge cịn lại mơi trường bám vào - Sấy khô 50oC bảo quản – 10oC 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Huynh Thi Diem Phuc, Do Thi Voc, Nguyen Thoai An, Nguyen Do Thanh Phuong, Do Quang Duong, Dinh Minh Hiep, and Ngo Ke Suong, (2016), Optimization of culture medium to enhance the zinc absorption by Cordyceps sinensis Journal of Biotechnology 14(1A): pp 343-350 [2] Trần Tài, Nguyễn Tài Hoàng, and Đinh Minh Hiệp, (2018), Tối ưu hoá thành phần môi trường bán rắn nuôi cấy tạo thể nấm Cordyceps militaris theo hướng hữu Di truyền học Ứng dụng Chuyên san Nấm Công nghệ Sinh học: pp 13-20 [3] Nguyễn Anh Thư, Trần Văn Cảnh, and Đinh Minh Hiệp, (2018), Tối ưu hóa thành phần mơi trường lỏng tĩnh sản xuất sinh khối thể nấm Isaria tenuipes Di truyền học Ứng dụng Chuyên san Nấm Công nghệ Sinh học: pp 21-28 [4] Trần Minh Trang, Phạm Tiến Dũng, Lê Quốc Phong, and Đinh Minh Hiệp, (2016), Nghiên cứu khả hấp thụ selenium nấm Ophiocordyceps sinensis nuôi cấy lỏng Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ 19(T6): pp 53-61 Tài liệu tiếng Anh [5] Angelis, S.D., Exopolysaccharide production and antioxidant activity by submerged co-culture of macromycetes and microalgae 2011, University of Provence, Brazil p PhD thesis [6] Arora, R.K., (2014), Cordyceps sinensis (berk.) sacc.-an entomophagous medicinal fungus-a review International Journal of Advanced Multidisciplinary Research 2: pp 0161-0170 [7] Aso, H., F Suzuki, T Yamagucht, Y Hayashi, T Ebina, and N Ishida, (1985), Induction of interferon and activation of NK cells and 45 macrophages in mice by oral administration of Ge-132, an organic germanium compound Microbiology and immunology 29(1): pp 65-74 [8] Bray, F., J Ferlay, I Soerjomataram, R.L Siegel, L.A Torre, and A Jemal, (2018), Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries CA: a cancer journal for clinicians 68(6): pp 394-424 [9] Chen, h.-w., j.-h Hou, a.-h Chen, j Qin, and j.-m Shi, (2010), Effect of germanium in culture medium on main active component of Cordyceps militaris Food Science 2010(24) [10] Chen, S., Z Xu, W Tao, and W Gu, (2000), Germanium accumulation of Grifola frondosa Journal of Wuxi University of Light Industry 19: pp 248-254 [11] Chen, T.-J and C.-H Lin, (2011) Germanium: environmental pollution and health effects, in Encyclopedia of Environmental Health, Elsevier pp 927-933 [12] Choi, J.S., J.H Heo, D.J Kim, S.M Namkung, T.B Lee, M.W Lee, and S.W Kim, (2017), Anti-cancer Effect of Hot Water Extract from Mycelium in Germanium-enriched Cordyceps militaris Korean Journal of Clinical Laboratory Science 49(2): pp 69-78 [13] Da Rocha, A.B., R.M Lopes, and G Schwartsmann, (2001), Natural products in anticancer therapy Current opinion in pharmacology 1(4): pp 364-369 [14] Fan, D., P Yang, and H.S Hsia, Assimilation of inorganic selenium and organic germanium by yeast 2002, Google Patents [15] Fengzhen, D., H.H.Z Wangqin, and S Jindi, (1998), Studies on Cultivation Techniques of Ge-enriched Ganoderma lucidum (I) Effect of Germanium on Mycelial Growth of Ganoderma lucidum Acta Edulis Fungi 4: pp 008 46 [16] Fung, S.Y., S.S Lee, N.H Tan, and J Pailoor, (2017), Safety assessment of cultivated fruiting body of Ophiocordyceps sinensis evaluated through subacute toxicity in rats Journal of Ethnopharmacology 206: pp 236244 [17] Goodman, S., (1988), Therapeutic effects of organic germanium Medical hypotheses 26(3): pp 207-215 [18] Holliday, J and M Cleaver, (2004), On the trail of the yak ancient Cordyceps in the modern world Online Posting June [19] Ianeva, O., (2009), Mechanisms of bacteria resistance to heavy metals Mikrobiolohichnyi zhurnal (Kiev, Ukraine: 1993) 71(6): pp 54-65 [20] Jaiswal, S., (2011), Role of rhizobacteria in reduction of arsenic uptake by plants: A review Journal of Bioremediation and Biodegradation 2(4): pp [21] Jiraungkoorskul, K and W Jiraungkoorskul, (2016), Review of naturopathy of medical mushroom, Ophiocordyceps sinensis, in sexual dysfunction Pharmacognosy reviews 10(19): pp 1-5 [22] Kaplan, B.J., W.W Parish, G.M Andrus, J.S.A Simpson, and C.J Field, (2004), Germane facts about germanium sesquioxide: I Chemistry and anticancer properties The Journal of Alternative & Complementary Medicine 10(2): pp 337-344 [23] Keith, L.S., O.M Faroon, N Maples-Reynolds, and B.A Fowler, (2015) Germanium, in Handbook on the Toxicology of Metals, Elsevier pp 799-816 [24] Kim, S., J.-S Kim, K Sapkota, B.-S Choi, S.-E Park, Y Park, H.-S Chun, J.-C Yoo, H.-S Choi, and M.-K Kim, (2006), Biosynthesis of organic germanium using Cordyceps militaris The Korean Journal of Mycology 34(2): pp 84-87 47 [25] Lee, J.S., J.I Park, S.H Kim, S.H Park, S.K Kang, C.B Park, T.U Sohn, J.Y Jang, J.K Kang, and Y.B Kim, (2004), Oral single- and repeated-dose toxicity studies on Geranti Bio-Ge yeast, organic germanium fortified yeasts, in rats The Journal of Toxicological Sciences 29(5): pp 541-53 [26] Li, L., T Ruan, Y Lyu, and B Wu, (2017), Advances in Effect of Germanium or Germanium Compounds on Animals—A Review Journal of Biosciences and Medicines 05(07): pp 56-73 [27] Li, S., F Yang, and K.W Tsim, (2006), Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41(5): pp 1571-1584 [28] Mani, A., J Patel, S Kalam, R Singh, and S.S Sandhu, (2015), Evaluation of mycelial and exopolysaccharide production from Cordyceps militaris International Journal of Applied Sciences and Engineering Research 4: pp 609-619 [29] Mao, G., W Feng, H Xiao, T Zhao, F Li, Y Zou, Y Ren, Y Zhu, L Yang, and X Wu, (2014), Purification, characterization, and antioxidant activities of selenium-containing proteins and polysaccharides in royal sun mushroom, Agaricus brasiliensis (higher Basidiomycetes) International Journal of Medicinal Mushrooms 16(5): pp 463–476 [30] Missailidis, S., (2008), Anticancer Therapeutics John Wiley & Sons, Ltd 1-53 [31] Rosenberg, E., (2008), Germanium: environmental occurrence, importance and speciation Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 8(1): pp 29-57 [32] Shrestha, U.B and K.S Bawa, (2013), Trade, harvest, and conservation of caterpillar fungus (Ophiocordyceps sinensis) in the Himalayas Biological Conservation 159: pp 514-520 48 [33] Song, H.W.W.G.Z., (1995), A Study on the Transformation of Inorganic Germanium into Organic Germanium by Mycelia of Ganoderma lucidum [J] Acta Edulis Fungi 3: pp 006 [34] Song, J.-M., S.-Y Han, and Y.-S Na, Method for producing mushroom mycelia and uses thereof 2004, Google Patents [35] Tham, L.X., S Matsuhashi, and T Kume, (1999), Growth and fruitbody formation of Ganoderma lucidum on media supplemented with vanadium, selenium and germanium Mycoscience 40(1): pp 87-92 [36] Wang, J.F., H.M Li, and D.D Yang, (2015), Effects of Germanium Concentrations on Germanium Accumulation and Biotransformation of Polysaccarified Germanium in Cordyceps militaris Zhong Yao Cai 38(11): pp 2331-2335 [37] Xu, J., Y Huang, X.X Chen, S.C Zheng, P Chen, and M.H Mo, (2016), The mechanisms of pharmacological activities of Ophiocordyceps sinensis fungi Phytotherapy Research 30(10): pp 1572-1583 [38] Yang, H.-Y., S.-F Leu, Y.-K Wang, C.-S Wu, and B.-M Huang, (2006), Cordyceps sinensis mycelium induces MA-10 mouse leydig tumor cell apoptosis by activating the caspase-8 pathway and suppressing the NF-κ B pathway Archives of andrology 52(2): pp 103110 [39] Yu, S.J., Y Zhang, and M.Z Fan Analysis of volatile compounds of mycelia of Hirsutella sinensis, the anamorph of Ophiocordyceps sinensis in Applied Mechanics and Materials 2012 Trans Tech Publications [40] Zhang, W., J Yang, J Chen, Y Hou, and X Han, (2005), Immunomodulatory and antitumour effects of an exopolysaccharide fraction from cultivated Cordyceps sinensis (Chinese caterpillar fungus) 49 on tumour‐bearing mice Biotechnology and applied biochemistry 42(1): pp 9-15 [41] Zhang, Y., B Wang, and G Zhang, (2004), Study of Anti-tumor and Mechanism of Organogermanium Poly-derivatinmves Carcinogenesis, Teratogenesis and Mutagenesis 16(1): pp 39-42 [42] Zhendi, Z and M Sandi, (1991), Study on enrichment of germanium in fruit bodies of Lentinus edodes Acta Agriculturae Shanghai 2: pp 007 [43] Zheng, L., L Hao, H Ma, C Tian, T Li, X Sun, M Jia, and L Jia, (2014), Production and in vivo antioxidant activity of Zn, Ge, Seenriched mycelia by Cordyceps sinensis SU-01 Current microbiology 69(3): pp 270-276 [44] Zhou, X., Z Gong, Y Su, J Lin, and K Tang, (2009), Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology 61(3): pp 279-291 [45] 侯进慧朱蕴兰王陶邵颖陈安徽陈宏伟, Method for germanium-enriched cordyceps mycelium 2011: China 50 culturing PHỤ LỤC Phụ lục Hệ sợi nấm O sinensis môi trường PGA sau ngày DC Ge-400 Ge-100 Ge-800 Ge-200 Ge-1600 Phụ lục Hệ sợi nấm O sinensis môi trường PGA sau 10 ngày DC Ge-100 Ge-400 Ge-800 Ge-200 Ge-1600 Phụ lục Phần trăm gây độc tế bào mẫu dòng tế bào ung thư vú MCF-7 xác định phương pháp SRB ST T Mẫu Phần trăm gây độc tế bào (%) Nồng độ (µg/mL) Lần Lần Lần TB ± ĐLC Ge-IPS 500 -16,27 -9,82 -14,57 -13,55 ± 3,34 IPS 500 62,28 57,78 58,47 59,51 ± 2,42 Ge-EPS 500 39,22 41,40 39,16 39,93 ± 1,28 EPS 500 54,39 55,20 52,46 54,02 ± 1,41 Ge-Pro 500 -4,05 3,71 1,27 0,31 ± 3,97 Pro 500 -5,40 5,93 1,27 0,60 ± 5,70 DMSO 0,5% 11,48 12,93 13,75 12,72 ± 1,15 Camptothe cin 0,01 55,90 56,79 54,57 55,75 ± 1,12 Phục lục Phần trăm gây độc tế bào hai mẫu EPS nguyên bào sợi xác định phương pháp SRB Phần trăm gây độc tế bào Mẫu Nồng độ Lần Lần Lần (µg/mL) EPS Ge 1000 7,06 EPS DC 1000 TB ± ĐLC 3,11 13,92 8,03 ± 5,47 25,88 19,25 18,35 21,16 ± 4,11