Nguyễn thị lan anh khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của một số tinh dầu tại việt nam khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

: BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA MỘT SỐ TINH DẦU TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – NĂM 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH 1801029 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA MỘT SỐ TINH DẦU TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Khắc Tiệp Trần Thị Minh Thu Nơi thực hiện: Khoa Công nghệ sinh học HÀ NỘI – NĂM 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ kính trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Khắc Tiệp, người thầy tận tình quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt trình nghiên cứu khoa học thực đề tài Em xin cảm ơn TS Nguyễn Quỳnh Chi cung cấp cho em loại tinh dầu để thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Đàm Thanh Xuân, ThS Lê Ngọc Khánh, HVCH Trần Thị Minh Thu, Đỗ Thị Huyền Thương quan tâm, giúp đỡ, bảo em để em có hướng đắn suốt thời gian vừa qua Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Khoa Công nghệ sinh học, Dược liệu – Dược cổ truyền Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện giúp em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn bạn Thân Đắc Hùng, Khổng Thị Ngọc Anh, Vũ Thành Lập, Bùi Thị Mai Nhung, Bounthavy Phengsavatdy, Bùi Thị Phương Thanh, Mai Phương Thu, Nguyễn Thị Thu Trang bạn sinh viên nghiên cứu K74 Bộ môn Công nghệ sinh học Dược đồng hành, hỗ trợ động viên em khoảng thời gian khó khăn vừa qua Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, nhà trường, thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội trang bị cho em kiến thức vô quý báu để giúp em tự tin vững bước tương lai Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người ln chỗ dựa tinh thần, động lực to lớn để em hồn thành tốt cơng việc Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Lan Anh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tinh dầu 1.1.1 Đại cương tinh dầu 1.1.2 Tinh dầu có tác dụng kháng khuẩn 1.1.3 Tác dụng hiệp đồng tinh dầu kháng sinh 1.2 Tinh dầu nến đất hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu nến đất .8 1.2.1 Đặc điểm nến đất .8 1.2.2 Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu nến đất 10 1.3 Tinh dầu nghệ hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu nghệ 10 1.3.1 Vị trí, phân loại 10 1.3.2 Đặc điểm nghệ .11 1.3.3 Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu nghệ 13 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên liệu, thiết bị .16 2.1.1 Nguyên liệu chủng giống 16 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ .16 2.1.3 Các hóa chất mơi trường sử dụng 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Đánh giá khả diệt vi sinh vật tinh dầu nghệ, nến đất 18 2.2.2 Đánh giá khả tạo tác dụng hiệp đồng với kháng sinh tinh dầu nghệ, nến đất 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Chuẩn bị mơi trường hoạt hóa chủng 18 2.3.2 Phương pháp đánh giá khả diệt vi sinh vật tinh dầu 19 2.3.3 Phương pháp xác định tác dụng hiệp đồng tinh dầu kháng sinh 20 2.3.4 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật phương pháp cấy đếm đĩa thạch 23 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN .24 3.1 Khả diệt vi sinh vật tinh dầu 24 3.2 Khả hiệp đồng tác dụng với số loại kháng sinh 25 3.2.1 Kết thí nghiệm checkerboard tinh dầu kháng sinh .25 3.2.2 Một số thử nghiệm khác 28 BÀN LUẬN 29 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 4.1 Kết luận 33 4.2 Đề xuất 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT ATCC American Type Culture Collection Ngân hàng chủng chuẩn Hoa Kỳ AMR Antimicrobial resistance Kháng thuốc kháng sinh ATP Adenosine triphosphate Phân tử mang lượng CFU Colony Forming Unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc DMSO Dimethyl sulfoxide ESBL Extended-spectrum β-lactamase Men beta-lactam phổ rộng FIC index Fractional Inhibitory Concentration Chỉ số nồng độ ức chế riêng phần (index) KS Kháng sinh MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MFC Minimum Fungicidal Concentration Nồng độ diệt nấm tối thiểu MHB Mueller Hinton broth Môi trường Mueller Hinton lỏng MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MRSA PBS Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus Phosphate-Buffered Saline Staphylococcus aureus kháng methicillin Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicillin Dung dịch đệm phosphate pH 7.4 SDA Sabouraud Dextrose Agar Môi trường thạch Sabouraud dextrose Tinh dầu Tryptic Soy Agar Môi trường thạch Tryptic Soy MSSA TD TSA VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Đối tượng nghiên cứu 16 Bảng 2 Các dụng cụ, thiết bị sử dụng nghiên cứu .16 Bảng Các hóa chất dùng nghiên cứu 17 Bảng Mơ tả xếp thí nghiệm xác định MIC 20 Bảng Mơ tả xếp thí nghiệm tương tác tinh dầu – kháng sinh thông qua thử nghiệm checkerboard .22 Bảng Giá trị MIC, MBC tinh dầu nghệ (l/ml & %) chủng VSV.….24 Bảng Giá trị MIC, MBC tinh dầu nghệ (l/ml & %) chủng VSV….24 Bảng 3 Giá trị MIC, MBC tinh dầu nến đất (l/ml & %) chủng VSV….25 Bảng Kết thí nghiệm checkerboard tinh dầu nghệ meropenem……26 Bảng Kết thí nghiệm checkerboard tinh dầu nghệ meropenem…….26 Bảng Giá trị FIC FIC index kết hợp tinh dầu với kháng sinh………………28 Bảng So sánh giá trị MIC tinh dầu nghệ, nến đất (kết nghiên cứu này) với tinh dầu khác chủng vi sinh vật………………………………………… 31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 Hình ảnh nến đất .8 Hình Hình ảnh nghệ 11 Hình Đường cong nồng độ - đáp ứng meropenem sử dụng đơn phối hợp với tinh dầu nghệ thời điểm 24 giờ………………………………………… 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc kháng sinh coi xương sống y học lâm sàng [47] Tuy nhiên, việc sử dụng lạm dụng kháng sinh thập kỷ gần để lại cho khủng hoảng sức khỏe toàn cầu: Vi sinh vật kháng kháng sinh gia tăng khiến việc điều trị nhiễm trùng trở nên khó khăn [21] Với gia tăng vi sinh vật (VSV) kháng thuốc thiếu loại kháng sinh đưa thị trường, việc cần phải tìm chiến lược để đối phó với trình trạng vơ cấp thiết [46] Thuốc có nguồn gốc thực vật coi lựa chọn thay an toàn so với thuốc tổng hợp Các thành phần hoạt chất loại thuốc sử dụng nhiều kỷ dễ kiếm, chi phí thấp tác dụng phụ không đáng kể Các tinh dầu phận khác chúng cho thấy hiệu tốt chống lại mầm bệnh kháng thuốc Các loại tinh dầu chứng minh chất chống VSV hiệu so với thuốc kháng sinh Cũng kết hợp thuốc tổng hợp với tinh dầu cải thiện hiệu thuốc [33] Dược liệu nến đất từ lâu người dân Trung Bộ sử dụng để xông sát trùng cho phụ nữ sau sinh, trẻ sơ sinh có biểu đầy hơi, quấy khóc dùng để xơng tránh gió cho mẹ trẻ lúc thời tiết thay đổi [3] Nghệ thảo mộc lâu năm, sử dụng rộng rãi làm gia vị thức ăn Trong hệ thống y học Ấn Độ, thân rễ củ nghệ chữa đau dày, làm thuốc lọc máu, tống hơi, khai vị bổ Củ nghệ sử dụng loại thuốc chống ung thư, viêm da, AIDS tăng cholesterol Tinh dầu chiết xuất từ củ nghệ có tác dụng chống viêm, kháng nấm, chống nhiễm độc gan chống viêm khớp [39] Nhằm mục đích ứng dụng hoạt tính sinh học tinh dầu nghệ, nến đất Đặc biệt hoạt tính kháng vi sinh vật để điều trị số bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn, lựa chọn thực đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật số tinh dầu Việt Nam” với mục tiêu: Đánh giá khả diệt vi sinh vật tinh dầu nghệ, nến đất Đánh giá khả tạo tác dụng hiệp đồng với kháng sinh tinh dầu nghệ, nến đất CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tinh dầu 1.1.1 Đại cương tinh dầu 1.1.1.1 Khái niệm Tinh dầu hỗn hợp tự nhiên phức tạp chất chuyển hóa thứ cấp bay phân lập từ thực vật phương pháp chưng cất ép [25] Tinh dầu lấy từ phận hoa, chồi, thân, lá, hạt, cành, rễ, quả, vỏ cây, gỗ [42] Tinh dầu sản xuất lưu trữ cấu trúc tiết phức tạp chẳng hạn tuyến, khoang tiết, ống tiết diện dạng giọt chất lỏng lá, thân, hoa, quả, vỏ rễ [44] Tinh dầu chứa khoảng 20-60 thành phần [19] Tinh dầu thường có mùi thơm, khơng tan nước, tan lipid dung môi hữu cơ, thường có tỷ trọng nhẹ nước, dễ bay nhiệt độ thường [2] 1.1.1.2 Chiết xuất Theo định nghĩa Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc tế (ISO) đưa ra, thuật ngữ tinh dầu có liên quan đến “sản phẩm thu từ nguyên liệu thực vật, cách chưng cất nước nước, từ vỏ loại họ cam quýt quy trình học phương pháp chưng cất khơ.” [11] Tinh dầu chiết xuất từ số loại với phận khác nhiều phương pháp chiết xuất khác Phương pháp sử dụng để chiết xuất tinh dầu thường phụ thuộc vào nguyên liệu thực vật sử dụng Phương pháp chiết xuất yếu tố định chất lượng tinh dầu Quy trình chiết xuất khơng phù hợp gây hư hỏng thay đổi tính chất vật lý, hóa học tinh dầu, dẫn đến hoạt tính sinh học, đặc tính tự nhiên, đổi màu, mùi/hương vị… [43] Các phương pháp chiết xuất tinh dầu thường sử dụng đem lại hiệu suất chiết xuất cao phương pháp cất kéo nước, chiết xuất dung môi, phương pháp ướp, phương pháp ép [2], [44] Phương pháp cất kéo nước phương pháp sử dụng rộng rãi để chiết xuất tinh dầu thực vật, phương pháp phân lập hợp chất bị phân hủy nhiệt độ cao việc chưng cất chúng theo cách mà nước đưa vào nguyên liệu thô [20] Tùy thuộc vào phương pháp lựa chọn, thành phần hóa học tinh dầu thu khác [44] 1.1.1.3 Thành phần Tinh dầu chứa nhiều hợp chất khác nhau, bao gồm terpen, terpenoid, phenylpropen phenolics tất góp phần tạo nên đặc tính thơm hoạt tính sinh 2.3.3.2 Phương pháp xây dựng đường cong nồng độ - đáp ứng Đường cong nồng độ - đáp ứng thực với dải nồng độ từ cao đến thấp, để có nhìn đầy đủ dược lực học KS kết hợp KS Đường cong nồng độ - đáp ứng thực điều kiện tương tự thực xác định MIC, môi trường MHB, đĩa 96 giếng Hỗn dịch vi khuẩn nồng độ 1,5x106 ủ với nồng độ khác bổ sung không bổ sung tinh dầu với nồng độ quan sát thấy giá trị hiệp đồng tốt Hịa tan pha lỗng dịch ni cấy đến nồng độ phù hợp PBS cấy trải lên thạch TSA Số lượng khuẩn lạc (colonyforming unit-CFU) đếm sau ủ 37°C vòng 24 Sự thay đổi số lượng vi khuẩn mẫu so sánh với mẫu khởi điểm t0 Các giá trị Emax Cs tính dựa phương trình hồi quy Hill-Langmuir từ đường cong nồng độ - đáp ứng phần mềm GraphPad 4.0 Giá trị Emax (Δlog10 CFU/ml) hiệu lực diệt khuẩn tối đa biến đổi số lượng VSV sống so với mẫu khởi điểm t0 Giá trị Cs (mg/l) nồng độ KS thấp nhất, có khả ức chế phát triển VSV [5] 2.3.4 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật phương pháp cấy đếm đĩa thạch Chuẩn bị môi trường tương tự mục 2.3.1 Cấy VSV E coli, S aureus lên đĩa thạch TSA cấy C albicans lên đĩa thạch SDA Mẫu pha loãng PBS theo số log10 đến nồng độ phù hợp phương pháp vi pha loãng đĩa 96 giếng: Hút xác 30 µl hỗn dịch VSV pha vào giếng thứ chứa 270 µl PBS, trộn Sau hút xác 30 µl dịch đồng giếng thứ pha lỗng sang giếng thứ (chứa 270 µl PBS), trộn Tiếp tục pha loãng nồng độ pha lỗng cuối Cấy lên mơi trường chuẩn bị đĩa petri, ủ 370C, 24 Đọc số khuẩn lạc mọc đĩa petri CFU tính dựa số khuẩn lạc độ pha loãng, biểu dạng log10 CFU/ml [5] 23 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1 Khả diệt vi sinh vật tinh dầu Để đánh giá khả diệt VSV tinh dầu, thực thử nghiệm MIC MBC Bảng Giá trị MIC, MBC tinh dầu nghệ (l/ml & %) chủng VSV) Chủng VSV MIC MBC (l/ml)* MIC (%)** MBC (%) S aureus ATCC 33591 16-32 1,6-3,2 16-32 1,6-3,2 S aureus ATCC 25923 16-32 1,6-3,2 16-32 1,6-3,2 E coli ATCC 25922 32-64 3,2-6,4 64 6,4 C albicans ATCC 10231 16-32 1,6-3,2 16-64 1,6-6,4 (l/ml)*** *(μl tinh dầu/ml môi trường), ** tỷ lệ % tinh dầu môi trường, *** MBC: - log CFU/ml so với lượng VSV thời điểm t0 Thí nghiệm thực lần độc lập Kết bảng 3.1 cho thấy tinh dầu nghệ thể hoạt tính kháng 4/4 chủng VSV thử nghiệm Với chủng Gram (+) S aureus 33591, S aureus 25923; Gram (-) E coli chủng nấm C albicans có giá trị MIC từ 1,6-6,4% MBC từ 1,6-6,4% Tuy nhiên, nồng độ tinh dầu nghệ cần để kháng khuẩn cao chủng Điều thể tinh dầu nghệ có hoạt tính kháng khuẩn chủng thử nghiệm Các giá trị MBC thu tương đối gần giá trị MIC (MBC/MIC=1-4), thể khả diệt khuẩn tinh dầu nghệ chủng thử nghiệm (MBC/MIC ≤ coi có khả diệt khuẩn) Bảng Giá trị MIC, MBC tinh dầu nghệ (l/ml & %) chủng VSV Chủng VSV MIC MBC (l/ml)* MIC (%)** S aureus ATCC 33591 2-4 0,2-0,4 2-4 0,2-0,4 S aureus ATCC 25923 2-4 0,2-0,4 2-4 0,2-0,4 E coli ATCC 25922 > 32 > 3,2 > 32 > 3,2 0,8-1,6 8-16 0,8-1,6 C albicans ATCC 10231 8-16 MBC (%) (l/ml)*** *(μl tinh dầu/ml môi trường), ** tỷ lệ % tinh dầu môi trường, *** MBC: - log CFU/ml so với lượng VSV thời điểm t0 Thí nghiệm thực lần độc lập 24 Kết bảng 3.2 cho thấy tinh dầu nghệ thể hoạt tính kháng 3/4 chủng VSV thử nghiệm Với chủng Gram (+) S aureus 33591, S aureus 25923 với giá trị MIC MBC từ 0,2-0,4%; chủng nấm C albicans với MIC MBC từ 0,8-1,6% Tuy nhiên, với chủng Gram (-) E coli không xác định MIC MBC nồng độ thử nghiệm cao (MIC MBC > 3,2%) Các VSV thử nghiệm xác định MIC có MBC tương đối gần MIC (MBC/MIC=1-2), thể khả diệt khuẩn tốt mẫu tinh dầu nghệ chủng VSV thử nghiệm Bảng 3 Giá trị MIC, MBC tinh dầu nến đất (l/ml & %) chủng VSV Chủng VSV MIC MIC MBC MBC (%) (l/ml)* (%)** (l/ml)*** S aureus ATCC 33591 0,12-0,24 0,012-0,024 0,12-0,24 0,012-0,024 S aureus ATCC 25923 0,12-0,24 0,012-0,024 0,12-0,24 0,012-0,024 E coli ATCC 25922 > 32 > 3,2 > 32 > 3,2 C albicans ATCC 10231  32  3,2  32  3,2 *(μl tinh dầu/ml môi trường), ** tỷ lệ % tinh dầu môi trường, *** MBC: - log CFU/ml so với lượng VSV thời điểm t0 Thí nghiệm thực lần độc lập Kết bảng 3.3 cho thấy tinh dầu nến đất thể hoạt tính kháng 2/4 chủng VSV thử nghiệm Với chủng Gram (+) S aureus 33591, S aureus 25923 với giá trị MIC MBC từ 0,012-0,024% Tuy nhiên, với chủng Gram (-) E coli nấm C albicans khơng xác định MIC MBC nồng độ thử nghiệm cao (MIC > 3,2%) Các VSV thử nghiệm xác định MIC (2 chủng S aureus) có MBC tương đối gần MIC (MBC/MIC=1-2), thể khả diệt khuẩn tốt mẫu tinh dầu nến đất chủng VSV thử nghiệm 3.2 Khả hiệp đồng tác dụng với số loại kháng sinh 3.2.1 Kết thí nghiệm checkerboard tinh dầu kháng sinh  Đối tượng vi sinh vật: S aureus ATCC 33591 (MRSA)  Kháng sinh Trên nghiên cứu tài liệu tác dụng sinh học, chế kháng khuẩn tinh dầu từ thiết lập thí nghiệm tập chung lên số đích tác dụng lên vi sinh vật Kháng sinh lựa chọn bao gồm: Meropenem acid fusidic 25 Meropenem kháng sinh nhóm beta-lactam, nhóm kháng sinh có đích tác dụng liên quan đến thành màng tế bào Acid fusidic kháng sinh có cấu trúc steroid, thuộc nhóm fusidanin, có tác dụng kìm khuẩn diệt khuẩn, chủ yếu tác dụng lên vi khuẩn Gram dương Acid fusidic ức chế trình tổng hợp protein vi khuẩn  Tinh dầu: nghệ 1, nghệ 2, nến đất Bảng Kết thí nghiệm checkerboard tinh dầu nghệ meropenem Giếng có VSV mọc Giá trị FIC index giá trị B4, C4, D5 E6 (vị trí xác định MIC kháng sinh tinh dầu) tính tốn theo cơng thức mục 2.3.3.1 Dựa vào giá trị FIC index thấy tinh dầu nghệ kháng sinh meropenem có tác dụng hiệp đồng Kết đánh giá tác dụng hiệp đồng meropenem test checkerboard với mẫu tinh dầu nghệ trình bày bảng 3.4 3.6 Các kết thu làm bật tác dụng hiệp đồng rõ rệt (bảng 3.4) tinh dầu nồng độ 1/4 MIC giúp tăng cường hoạt động meropenem làm giảm 16 lần giá trị MIC kháng sinh đối tượng S aureus từ MIC = 16 mg/l sử dụng KS đơn độc giảm xuống mức liều thấp MIC = mg/l phối hợp với tinh dầu Bảng Kết thí nghiệm checkerboard tinh dầu nghệ meropenem Giếng có VSV mọc Giá trị FIC index giá trị C4, D5 E8 (vị trí xác định MIC kháng sinh tinh dầu) tính tốn theo cơng thức mục 2.3.3.1 26 Dựa vào giá trị FIC index thấy tinh dầu nghệ kháng sinh meropenem có tác dụng hiệp đồng Kết đánh giá tác dụng hiệp đồng meropenem test checkerboard với mẫu tinh dầu trình bày bảng 3.5 bảng 3.6 Các kết thu làm bật tác dụng hiệp đồng rõ rệt (bảng 3.5) tinh dầu nồng độ 1/4 MIC giúp tăng cường hoạt động meropenem làm giảm 64 lần giá trị MIC kháng sinh đối tượng S aureus từ MIC = 16 mg/l sử dụng KS đơn độc giảm xuống mức liều thấp MIC = 0,25 mg/l phối hợp với tinh dầu Thiết lập xây dựng đường cong nồng độ - đáp ứng meropenem có khơng kết hợp với tinh dầu quan sát thấy giảm rõ rệt giá trị Cs meropenem đối tượng vi khuẩn S aureus ATCC 33591 bổ sung tinh dầu nghệ MICMEM -1 -2 -3 -4 MEM alone MEM in combination -6 -5  Log10 cfu (24 h – h) MICCombi -2 -1 Log 10 of meropenem concentration (mg/L) Hình Đường cong nồng độ - đáp ứng meropenem sử dụng đơn phối hợp với tinh dầu nghệ thời điểm 24 Tác dụng hiệp đồng tinh dầu nghệ với meropenem thể rõ thông qua khả giảm giá trị Cs – nồng độ ức chế phát triển VSV Sử dụng meropenem kết hợp với tinh dầu nghệ làm giảm khoảng 10 lần giá trị Cs (từ log10 meropenem xấp xỉ mg/L sử dụng đơn lẻ xuống log10 meropenem xấp xỉ mg/L kết hợp với tinh dầu nghệ 1) Tại thời điểm 24h, kết hợp với tinh dầu nghệ làm tăng cường hoạt lực diệt khuẩn meropenem, giá trị Emax – hoạt lực diệt khuẩn tối đa tăng không đáng kể so với sử dụng meropenem đơn kết hợp với tinh dầu 27 3.2.2 Một số thử nghiệm khác Bảng Giá trị FIC FIC index kết hợp tinh dầu với kháng sinh Tinh Kháng sinh Chủng dầu FIC KS FIC TD (mg/L) Nghệ Meropenem S aureus ATCC 0,0625 (l/ml) FIC Biện giải index 0,25 0,3125 *** 0,25 0,5 + ± Nghệ Meropenem S aureus ATCC 0,0156 33591 0,25 0,2656 *** Nghệ Acid fusidic 0,25 0,5 + ± 33591 Nghệ Acid fusidic S aureus ATCC 0,25 33591 S aureus ATCC 0,25 33591 Nến đất Meropenem S aureus ATCC 0,5 33591 0,125 0,625 + ± Nến Acid S aureus ATCC 0,25 0,25 0,5 + ± đất fusidic 33591 ***Có tác dụng hiệp đồng, + có tác dụng dụng cộng, ± khơng có tác động Như vậy, tinh dầu nghệ 1, nghệ không mang lại tác dụng hiệp với acid fusidic, tinh dầu nến đất không mang lại tác dụng hiệp đồng với kháng sinh meropenem acid fusidic chủng S aureus 33591 (MRSA) Mặt khác, không quan sát thấy tác dụng đối kháng tinh dầu kháng sinh 28 BÀN LUẬN Việc sử dụng lạm dụng thuốc kháng sinh dẫn đến xuất tính trạng kháng thuốc kháng sinh người, coi mối quan tâm nghiêm trọng tồn cầu tình trạng kháng thuốc vi khuẩn thông thường đạt đến mức báo động nơi toàn giới [19] Tinh dầu nguồn tài nguyên để đối phó với khủng hoảng [10] Tinh dầu chất chiết xuất từ thực vật khác có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm kháng virus sàng lọc toàn giới nguồn tiềm hợp chất kháng khuẩn mới, chất thay để điều trị bệnh [40] Trong nghiên cứu sử dụng tinh dầu nghệ thuộc họ Zingiberaceae tinh dầu nến đất (Damar batu) để đánh giá khả kháng vi sinh vật chúng Về khả kháng vi sinh vật Nghiên cứu khảo sát khả diệt VSV loại tinh dầu nghệ nến đất chống lại chủng ATCC Kết cho thấy tinh dầu nghệ có tiềm kháng 4/4 chủng thử nghiệm, tinh dầu nghệ có khả kháng 3/4 chủng VSV thử nghiệm, tinh dầu nến đất kháng 2/4 chủng VSV thử nghiệm Nghiên cứu đánh giá tồn diện xác định hoạt tính kháng VSV (kìm khuẩn/diệt khuẩn) tinh dầu Đối với loại tinh dầu, hoạt tính kìm khuẩn diệt khuẩn chủng MSSA MRSA Trong đó, hoạt tính tinh dầu chủng S aureus 33591 S aureus 25923 mạnh nến đất với MIC MBC từ 0,012-0,024%; tinh dầu nghệ với MIC MBC từ 0,2-0,4%; cuối cùng, tinh dầu nghệ có tác dụng yếu với MIC MBC từ 1,6-3,2% Hoạt tính tinh dầu chủng E coli, có tinh dầu nghệ xác định MIC, với MIC từ 3,2-6,4% MBC 6,4%, nhiên, hoạt tính kháng khuẩn, diệt khuẩn E coli yếu; nghệ 2, nến đất không xác định MIC MBC nồng độ tinh dầu cao (MIC MBC > 3,2%) Hoạt tính tinh dầu chủng nấm C albicans, tinh dầu nghệ cho MIC MBC từ 0,8-1,6%; tinh dầu nghệ cho MIC từ 1,6-3,2% MBC từ 1,6-6,4%; tinh dầu nến đất không xác định MIC MBC nồng độ tinh dầu cao (MIC MBC > 3,2%) Các tinh dầu chủng xác định MIC có hoạt tính diệt khuẩn (MBC/MIC ≤ 4) Trên chủng S aureus hoạt tính kìm khuẩn diệt khuẩn tinh dầu nến đất tốt với giá trị MIC MBC nhỏ Đối với chủng S aureus, tỷ lệ MBC/MIC = 1-2 cho thấy tiềm diệt khuẩn tinh dầu nến đất Tuy nhiên, chủng E coli C albicans tinh dầu nến đất khơng có hoạt tính kìm khuẩn, diệt khuẩn Hai loại tinh dầu nghệ nghiên cứu thu Hưng Yên, nhiên, hoạt tính kìm khuẩn loại khác Cụ thể, giá trị MIC MBC 29 tinh dầu nghệ gấp khoảng lần so với tinh dầu nghệ chủng S aureus Đối với chủng S aureus, tỷ lệ MBC/MIC = 1-2 cho thấy tiềm diệt khuẩn loại tinh dầu nghệ Tinh dầu nghệ ghi nhận có hoạt tính diệt VSV Ngồi ra, tinh dầu nghệ cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh chống lại vi khuẩn Helicobacter pylori, Bacillus cereus, B coagulans, B subtilis, Vibrio parahaemolyticus, Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Nó cho thấy tác dụng kháng nấm mạnh chống lại Aspergillus flavus, A niger, A parasiticum, Rhizoctonia solani, Helminthosporium oryzae, Trichoconis padwickii, Curvularia lunata, C pallescens, C trifolii, Fusarium verticillioides, F moniliforme, F oxysporum, Penicillium Digitatum, Alternaria dianthi, Trichophyton longifusus Colletotrichum falcatum [13] Sesquiterpen oxy hóa xác định loại chiếm ưu nguyên nhân tạo nên hoạt tính sinh học tinh dầu nghệ Thơng thường, sesquiterpen chứa chủ yếu turmerone Tuy nhiên, thành phần thay đổi tùy thuộc vào yếu tố bên (di truyền) yếu tố bên ngồi (vị trí địa lý, điều kiện canh tác, xử lý sau thu hoạch…) Cụ thể, ar-turmerone xác định chất dẫn đầu, α-turmerone βturmerone, C longa tinh dầu thân rễ Nhiều tác giả báo cáo tiềm điều trị ar-turmerone vô số lợi ích sức khỏe người Đã có chứng minh hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu nghệ chống lại mầm bệnh người Clostridium perfringens, Escherichia coli [23] hoạt tính kháng nấm mạnh chống lại Aspergillus flavus [13] Ngoài ra, curcumin (thành phần không bay hơi) hợp chất chiết xuất từ nghệ biết đến với đặc tính kháng khuẩn Curcuminoids thành phần curcumin thể hoạt tính kháng khuẩn chống nhiều loại vi khuẩn, vi khuẩn đề kháng với kháng sinh Curcumin chứng minh có hoạt tính chống lại S aureus, E coli, H pylori, Mycobacterium tuberculosis, ngồi curcumin cịn thể hoạt tính kháng Candida [22] 30 So sánh hoạt tính kháng VSV tinh dầu nghệ, nến đất với tinh dầu khác: Bảng So sánh giá trị MIC tinh dầu nghệ, nến đất (kết nghiên cứu này) với tinh dầu khác chủng vi sinh vật MIC (%) VSV Tinh dầu nghệ Tinh dầu nghệ Curcuma longa Curcuma longa Tinh dầu nến đất Damar batu Tinh dầu trầu không Piper betle S aureus 1,6-3,2 0,2-0,4 0,012-0,024 0,2-0,4 [5] E coli 3,2-6,4 >3,2 >3,2 0,2-0,4 [5] C albicans 1,6-3,2 0,8-1,6 3,2 0,2 [5] So sánh với tinh dầu trầu không, tinh dầu nến đất ức chế chủng S aureus tốt, mức nồng độ thấp 0,012-0,024%; tinh dầu nghệ ức chế S aureus tốt, mức nồng độ 0,2-0,4% tinh dầu trầu không; tinh dầu nghệ ức chế S aureus kém, mức nồng độ 1,6-3,2% tinh dầu trầu không Trên chủng E coli tinh dầu nghệ tinh dầu nến đất xác định MIC nồng độ thử nghiệm cao (MIC > 3,2%), tinh dầu nghệ xác định MIC từ 3,2-6,4%, nhiên tinh dầu trầu không cho hiệu ức chế nồng độ thấp từ 0,2-0,4% Trên chủng C albicans loại tinh dầu nghệ nghiên cứu cho hiệu ức chế so với tinh dầu trầu không (0,6-3,2% so với 0,2%), tinh dầu nến đất không xác định MIC nồng độ thử nghiệm cao (MIC > 3,2%) Về đánh giá tác dụng hiệp đồng tinh dầu kháng sinh Các liệu pháp kết hợp tinh dầu để tăng cường hoạt tính kháng sinh đề xuất chiến lược tiềm để chống lại tình trạng kháng kháng sinh [34] Chúng tơi nhận thấy tinh dầu nghệ có khả hiệp đồng với kháng sinh meropenem chống lại MRSA Sự kết hợp tinh dầu nghệ với kháng sinh meropenem chống lại MRSA cho thấy giảm MIC kháng sinh kết hợp hoạt lực diệt khuẩn tối đa tăng cường Khi kết hợp tinh dầu nghệ nghệ với kháng sinh meropenem làm giảm 16 64 lần MIC meropenem so với dùng kháng sinh đơn độc Trong thí nghiệm khơng quan sát thấy tác dụng đối kháng nào, có số kết hợp cho kết không quan sát tác dụng hiệp đồng Nhiều nghiên cứu tác dụng hiệp đồng kháng sinh tinh dầu thực Trong 31 nghiên cứu PSX Yap cộng năm 2013, kết hợp KS piperacillin với tinh dầu hoa oải hương (Lavandula angustifolia) làm giảm MIC KS xuống lần (từ 1024 xuống 128 l/ml) giá trị FIC index 0,26 chủng E coli hay kết hợp tinh dầu bạc hà (Mentha piperita) với piperacillin giúp tăng cường hoạt động piperacillin liều thấp (64 l/ml) so với sử dụng đơn độc (1024 l/ml) với giá trị FIC index 0,31 chủng E coli MIC KS meropenem giảm từ l/ml xuống 0,5 l/ml kết hợp với tinh dầu bạc hà với FIC index 0,26 chủng E coli [45] Sự kết hợp kháng sinh với tinh dầu chống lại vi khuẩn kháng thuốc mở rộng phổ kháng khuẩn để giảm xuất biến thể kháng thuốc giảm thiểu việc sử dụng loại kháng sinh Việc giảm liều kháng sinh hữu ích cho phương pháp điều trị môi trường lâm sàng nhằm giảm tác dụng phụ kháng sinh Điều cho thấy khả loại tinh dầu sử dụng làm tác nhân điều chỉnh tính kháng kháng sinh VSV Cần nghiên cứu mở rộng chế phân tử khả đảo ngược tính kháng loại tinh dầu để làm sáng tỏ tầm quan trọng chúng việc phát triển chế độ dược lý [45] 32 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Nghiên cứu đánh giá khả diệt vi sinh vật (MIC, MBC) loại tinh dầu nghệ, nến đất chủng vi sinh vật (S aureus ATCC 33591, S aureus ATCC 25923, E coli ATCC 25922, C albicans ATCC 10231) Tinh dầu nghệ kháng 4/4 chủng VSV, với MIC từ 1,6-6,4%, MBC từ 1,6-6,4% Tinh dầu nghệ kháng 3/4 chủng VSV, với MIC từ 0,2-1,6%, MBC từ 0,2-1,6%; chủng E coli không xác đinh MIC MBC nồng độ tinh dầu cao Tinh dầu nến đất kháng 2/4 chủng VSV, với MIC từ 0,012-0,024%, MBC từ 0,012-0,024%; chủng E coli C albicans không xác định MIC MBC nồng độ tinh dầu cao Nghiên cứu xác định tác dụng hiệp đồng loại tinh dầu nghệ, nến đất kết hợp với kháng sinh meropenem acid fusidic chủng S aureus MRSA Nghiên cứu xác định loại tinh dầu nghệ có tác dụng hiệp đồng với kháng sinh meropenem chủng MRSA Trong đó, kết hợp KS meropenem với TD nghệ nồng độ 1/4 MIC cho hệ số FIC index 0,3125 làm giảm MIC KS xuống 16 lần (từ 16mg/l xuống mg/l) Từ đường cong nồng độ - đáp ứng meropenem sử dụng đơn phối hợp với tinh dầu nghệ thời điểm 24 (Hình 3.1) tác dụng hiệp đồng TD nghệ meropenem làm giảm khoảng 10 lần giá trị Cs; Emax tăng không đáng kể sử dụng meropenem đơn phối hợp với TD nghệ Khi kết hợp KS meropenem với TD nghệ nồng độ 1/4 MIC cho hệ số FIC index 0,2656 làm giảm MIC KS xuống 64 lần (từ 16 mg/l xuồng 0,25 mg/l) Kết nghiên cứu không ghi nhận tác dụng hiệp đồng loại tinh dầu nghệ kết hợp với acid fusidic tinh dầu nến đất kết hợp với loại kháng sinh (meropenem, acid fusidic) chủng MRSA Tuy nhiên, thí nghiệm không ghi nhận tác dụng đối kháng 4.2 Đề xuất - Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng với kháng sinh nhóm beta-lactam đối tượng chủng lâm sàng - Nghiên cứu rộng khả diệt vi sinh vật tinh dầu nghệ, nến đất 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Quỳnh Chi, Nguyễn Khắc Tiệp, Nguyễn Hoàng Anh, Phạm Tuấn Anh, Lê Thị Tú Anh (2021), "Đánh giá tác dụng hiệp đồng tinh dầu nghệ với cefoxitin Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA)", Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, pp Đại học Dược Hà Nội (2007), Dược liệu học, tập 2, pp Hồ Thị Dung (2015), "Nghiên cứu thành phần hóa học tìm hiểu nguồn gốc dược liệu "Nến đất"", Luận văn thạc sĩ, pp Nguyễn Thị Linh (2019), "Xây dựng dấu vân tay hóa học đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu nghệ vàng", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, pp Đỗ Thị Huyền Thương (2022), "Đánh giá khả kháng vi sinh vật tinh dầu trầu khơng", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, pp 23 Tiếng Anh 10 11 12 13 14 15 Aperce C C., Amachawadi R., et al (2016), "Effects of Menthol Supplementation in Feedlot Cattle Diets on the Fecal Prevalence of Antimicrobial-Resistant Escherichia coli", PLoS One, 11(12), pp Armen Takhtajan (2009), "Flowering Plants", Springer Science & Business Media, pp Avanỗo G.B., Ferreira F.D., et al (2017), "Curcuma longa L essential oil composition, antioxidant effect, and effect on Fusarium verticillioides and fumonisin production", Food Control pp Bouyahya A., Et-Touys A., et al (2017), "Chemical composition of Mentha pulegium and Rosmarinus officinalis essential oils and their antileishmanial, antibacterial and antioxidant activities", Microb Pathog, 111, pp 41-49 Buldain D., Buchamer A V., et al (2018), "Combination of Cloxacillin and Essential Oil of Melaleuca armillaris as an Alternative Against Staphylococcus aureus", Front Vet Sci, 5, pp 177 Cimino C., Maurel O M., et al (2021), "Essential Oils: Pharmaceutical Applications and Encapsulation Strategies into Lipid-Based Delivery Systems", Pharmaceutics, 13(3), pp Dosoky N S., Satyal P., et al (2019), "Variations in the Volatile Compositions of Curcuma Species", Foods, 8(2), pp Dosoky N S., Setzer W N (2018), "Chemical Composition and Biological Activities of Essential Oils of Curcuma Species", Nutrients, 10(9), pp Essien E E., Newby J S., et al (2015), "Chemotaxonomic Characterization and in-Vitro Antimicrobial and Cytotoxic Activities of the Leaf Essential Oil of Curcuma longa Grown in Southern Nigeria", Medicines (Basel), 2(4), pp 340349 Fernandez-Pan I., Royo M., et al (2012), "Antimicrobial activity of whey protein isolate edible films with essential oils against food spoilers and foodborne pathogens", J Food Sci, 77(7), pp M383-90 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Ferreira F D., Kemmelmeier C., et al (2013), "Inhibitory effect of the essential oil of Curcuma longa L and curcumin on aflatoxin production by Aspergillus flavus Link", Food Chem, 136(2), pp 789-93 Ferrentino G., Morozova K., et al (2020), "Extraction of Essential Oils from Medicinal Plants and their Utilization as Food Antioxidants", Curr Pharm Des, 26(5), pp 519-541 Firmino D F., Cavalcante T T A., et al (2018), "Antibacterial and Antibiofilm Activities of Cinnamomum Sp Essential Oil and Cinnamaldehyde: Antimicrobial Activities", ScientificWorldJournal, 2018, pp 7405736 Garcia-Salinas S., Elizondo-Castillo H., et al (2018), "Evaluation of the Antimicrobial Activity and Cytotoxicity of Different Components of Natural Origin Present in Essential Oils", Molecules, 23(6), pp Herman Richard Ansah, Ayepa Ellen, et al (2019), "Essential Oils and their Applications - A Mini Review", Advances in Nutrition & Food Science, pp Hiltunen T., Virta M., et al (2017), "Antibiotic resistance in the wild: an ecoevolutionary perspective", Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 372(1712), pp Hussain Y., Alam W., et al (2022), "Antimicrobial Potential of Curcumin: Therapeutic Potential and Challenges to Clinical Applications", Antibiotics (Basel), 11(3), pp Ibanez M D., Blazquez M A (2020), "Curcuma longa L Rhizome Essential Oil from Extraction to Its Agri-Food Applications A Review", Plants (Basel), 10(1), pp Jardak M., Elloumi-Mseddi J., et al (2017), "Chemical composition, anti-biofilm activity and potential cytotoxic effect on cancer cells of Rosmarinus officinalis L essential oil from Tunisia", Lipids Health Dis, 16(1), pp 190 Kalemba D., Kunicka A (2003), "Antibacterial and antifungal properties of essential oils", Curr Med Chem, 10(10), pp 813-29 Knezevic P., Aleksic V., et al (2016), "Antimicrobial activity of Eucalyptus camaldulensis essential oils and their interactions with conventional antimicrobial agents against multi-drug resistant Acinetobacter baumannii", J Ethnopharmacol, 178, pp 125-36 Kumar A., Singh A K., et al (2017), "Interaction of turmeric (Curcuma longa L.) with beneficial microbes: a review", Biotech, 7(6), pp 357 Kurade N P., Jaitak V., et al (2010), "Chemical composition and antibacterial activity of essential oils of Lantana camara, Ageratum houstonianum and Eupatorium adenophorum", Pharm Biol, 48(5), pp 539-44 Lahmar A., Bedoui A., et al (2017), "Reversal of resistance in bacteria underlies synergistic effect of essential oils with conventional antibiotics", Microb Pathog, 106, pp 50-59 Langeveld W T., Veldhuizen E J., et al (2014), "Synergy between essential oil components and antibiotics: a review", Crit Rev Microbiol, 40(1), pp 76-94 Laxminarayan R., Duse A., et al (2013), "Antibiotic resistance-the need for global solutions", Lancet Infect Dis, 13(12), pp 1057-98 Leal Alab, Bezerra C F., et al (2021), "Chemical composition and potentiating action of Norfloxacin mediated by the essential oil of Piper caldense C.D.C against Staphylococcus aureus strains overexpressing efflux pump genes", Arch Microbiol, 203(7), pp 4727-4736 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 Mittal R P., Rana A., et al (2019), "Essential Oils: An Impending Substitute of Synthetic Antimicrobial Agents to Overcome Antimicrobial Resistance", Curr Drug Targets, 20(6), pp 605-624 Owen L., Laird K (2018), "Synchronous application of antibiotics and essential oils: dual mechanisms of action as a potential solution to antibiotic resistance", Crit Rev Microbiol, 44(4), pp 414-435 Ozel Y., Yilmaz U., et al (2022), "[Antibacterial Activity and Synergistic Interaction of Various Essential Oil Components and Antibiotics]", Mikrobiyol Bul, 56(1), pp 95-102 Setzer W N., Duong L., et al (2021), "Variation in the Chemical Composition of Five Varieties of Curcuma longa Rhizome Essential Oils Cultivated in North Alabama", Foods, 10(2), pp Sindhu S., Chempakam B., et al (2011), "Chemoprevention by essential oil of turmeric leaves (Curcuma longa L.) on the growth of Aspergillus flavus and aflatoxin production", Food Chem Toxicol, 49(5), pp 1188-92 Singh B K., Tiwari S., et al (2021), "Essential oils and their nanoformulations as green preservatives to boost food safety against mycotoxin contamination of food commodities: a review", J Sci Food Agric, 101(12), pp 4879-4890 Singh G., Kapoor I P., et al (2010), "Comparative study of chemical composition and antioxidant activity of fresh and dry rhizomes of turmeric (Curcuma longa Linn.)", Food Chem Toxicol, 48(4), pp 1026-31 Solorzano-Santos F., Miranda-Novales M G (2012), "Essential oils from aromatic herbs as antimicrobial agents", Curr Opin Biotechnol, 23(2), pp 13641 Stevanovic Z D., Bosnjak-Neumuller J., et al (2018), "Essential Oils as Feed Additives-Future Perspectives", Molecules, 23(7), pp Tariq S., Wani S., et al (2019), "A comprehensive review of the antibacterial, antifungal and antiviral potential of essential oils and their chemical constituents against drug-resistant microbial pathogens", Microb Pathog, 134, pp 103580 Tongnuanchan P., Benjakul S (2014), "Essential oils: extraction, bioactivities, and their uses for food preservation", J Food Sci, 79(7), pp R1231-49 Winska K., Maczka W., et al (2019), "Essential Oils as Antimicrobial AgentsMyth or Real Alternative?", Molecules, 24(11), pp Yap P S., Lim S H., et al (2013), "Combination of essential oils and antibiotics reduce antibiotic resistance in plasmid-conferred multidrug resistant bacteria", Phytomedicine, 20(8-9), pp 710-3 Yap P S., Yiap B C., et al (2014), "Essential oils, a new horizon in combating bacterial antibiotic resistance", Open Microbiol J, 8, pp 6-14 Yu Z., Tang J., et al (2020), "The alarming antimicrobial resistance in ESKAPEE pathogens: Can essential oils come to the rescue?", Fitoterapia, 140, pp 104433