Bùi thị hồng hạnh khảo sát thành phần flavonoid trong các mẫu xấu hổ thu hái tại một số vùng ở việt nam khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  BÙI THỊ HỒNG HẠNH KHẢO SÁT THÀNH PHẦN FLAVONOID TRONG CÁC MẪU XẤU HỔ THU HÁI TẠI MỘT SỐ VÙNG Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ HỒNG HẠNH Mã sinh viên: 1801194 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN FLAVONOID TRONG CÁC MẪU XẤU HỔ THU HÁI TẠI MỘT SỐ VÙNG Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Quỳnh Chi Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu Khoa Dược liệu-Dược học cổ truyền HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Những dòng đầu tiên, em xin dành để gửi lời cảm ơn chân thành đến người suốt thời gian qua ln hỗ trợ động viên em hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách tốt Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Quỳnh Chi, người quan tâm hướng dẫn, truyền đạt cho em nhiều kiến thức, động viên em lúc khó khăn tạo điều kiện cho em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tỏ lòng kính sâu sắc tới thầy Nguyễn Trọng Hồng, TS Phạm Tuấn Anh, TS Thân Thị Kiều My, TS Nguyễn Thanh Tùng thầy cô giúp đỡ, hướng dẫn tận tình q trình em thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới giảng viên thầy cô kỹ thuật viên công tác Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Lời cuối, em muốn cảm ơn gia đình, bạn bè thành viên khác tham gia nghiên cứu môn dược liệu, đặc biệt bạn Phạm Thị Thu Trà, bạn Nguyễn Thủy Tiên, bạn Lê Thị Huế, bạn Phan Minh Dương đồng hành, chia sẻ người nguồn động lực lớn em quãng thực thực nghiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Bùi Thị Hồng Hạnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan loài Mimosa pudica L 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật loài Mimosa pudica L 1.1.3 Đặc điểm phân bố loài Mimosa pudica L 1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến 1.1.5 Sử dụng dược liệu Xấu hổ Y học cổ truyền 1.1.6 Thành phần hóa học lồi Mimosa pudica L 1.1.7 Tác dụng sinh học cơng dụng lồi Mimosa pudica L 1.1.8 Các phương pháp định lượng số thành phần dược liệu Xấu hổ 1.2 Tổng quan luteolin .8 1.2.1 Cơng thức hóa học .8 1.2.2 Tính chất 1.2.3 Các phương pháp định tính, định lượng luteolin 1.2.4 Tác dụng sinh học .10 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị 12 2.2.1 Hóa chất, dụng cụ 12 2.2.2 Máy móc, trang thiết bị .12 2.3 Nội dung nghiên cứu 12 2.4 Phương pháp nghiên cứu 13 2.4.1 Định tính dược liệu Xấu hổ sắc ký lớp mỏng 13 2.4.2 Định lượng flavonoid toàn phần mẫu Xấu hổ phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS) 13 2.4.3 Định lượng luteolin Xấu hổ sắc ký lỏng hiệu cao 14 2.4.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng 14 2.4.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng 15 Tính đặc hiệu 15 Tính thích hợp hệ thống 16 Khoảng tuyến tính 16 Độ lặp lại phương pháp định lượng 17 Độ (tỉ lệ thu hồi) 17 Giới hạn phát giới hạn định lượng .18 2.4.3.3 Định lượng luteolin mẫu dược liệu Xấu hổ .18 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Định tính dược liệu Xấu hổ sắc ký lớp mỏng 19 3.1.1 Sắc ký lớp mỏng dịch chiết mẫu Xấu hổ khai triển hệ dung môi 1: ethyl acetat - acid acetic - acid formic - nước (10:0,3:0,3:0,1) 19 3.1.2 Sắc ký lớp mỏng dịch chiết mẫu Xấu hổ khai triển hệ dung môi 2: toluen - ethyl acetat – acid formic (6:4:0,3) 20 3.2 Định lượng flavonoid toàn phần dược liệu xấu hổ .21 3.3 Định lượng luteolin mẫu dược liệu Xấu hổ 22 3.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng 22 3.3.1.1 Khảo sát thể tích rửa giải qua cột SPE 22 3.3.1.2 Khảo sát dung môi chiết xuất 22 3.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng 24 3.3.2.1 Tính đặc hiệu .24 3.3.2.2 Tính thích hợp hệ thống 25 3.3.2.3 Khoảng tuyến tính .26 3.3.2.4 Độ lặp lại phương pháp định lượng 27 3.3.2.5 Độ .27 3.3.2.6 Giới hạn phát giới hạn định lượng 28 3.4 Định lượng luteolin mẫu dược liệu Xấu hổ 28 3.5 Bàn luận 30 Kết luận đề xuất 33 Phụ lục Phiếu giám định tên khoa học - Phụ lục Tiêu chuẩn COA chuẩn Luteolin - Phụ lục Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống - Phụ lục Sắc ký đồ độ lặp lại phương pháp - 15 Phụ lục Sắc ký đồ độ mức nồng độ - 21 Phụ lục Sắc ký đồ mẫu thử - 29 - DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên Tiếng Anh tên Khoa học Tên Tiếng Việt BALF Bronchoalveolar lavage Dịch rửa phế quản EtOH Ethanol Ethanol GC Gas Chromatography Sắc ký khí GC-MS Gas Chromatography – Mass Phương pháp sắc ký khí – Spectroscopy khối phổ High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Chromatography High Perfromance Thin Layer Sắc ký lớp mỏng hiệu Chromatography cao LC Liquid chromatography Sắc ký lỏng MeOH Methanol Methanol MS Mass Spectrometry Khối phổ MS/MS Tandem Mass Spectrometry Khối phổ lần Rf Retention factor Hệ số lưu giữ SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn TF Total Flavonoid Flavonoid toàn phần TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng UV Ultraviolet Tử ngoại UV-VIS Ultraviolet- Visable Phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại - khả kiến HPTLC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Định tính, định lượng luteolin phương pháp HPLC .9 Bảng 1.2 Định tính, định lượng luteolin phương pháp HPTLC Bảng 2.1 Các mẫu dược liệu Xấu hổ Mimosa pudica L 11 Bảng 3.1 Các mẫu hệ số pha loãng tương ứng 21 Bảng 3.2 Kết định lượng flavonoid toàn phần dược liệu Xấu hổ 21 Bảng 3.3 Khảo sát hàm lượng luteolin theo dung môi chiết xuất 22 Bảng 3.4 Kết độ thích hợp hệ thống phương pháp 25 Bảng 3.5 Kết phụ thuộc diện tích pic nồng độ luteolin 26 Bảng 3.6 Kết độ lặp lại phương pháp 27 Bảng 3.7 Kết độ thu hồi phương pháp 27 Bảng 3.8 Kết định lượng luteolin số mẫu Xấu hổ 29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo số hợp chất flavon Xấu hổ Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo số hợp chất chalcon flavanon Xấu hổ Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo số hợp chất flavonol Xấu hổ .5 Hình 1.4 Công thức cấu tạo số hợp chất phenol khác Xấu hổ .6 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo số hợp chất sterol Xấu hổ Hình 2.1 Cây Xấu hổ Mimosa pudica L 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết Xấu hổ hệ dung mơi .19 Hình 3.2 Mô tả sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng M.pudica sau màu thuốc thử NP/PEG (Hệ dung môi 1) .20 Hình 3.3 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết M.pudica hệ dung môi 20 Hình 3.4 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng dịch chiết Xấu hổ hệ dung môi 22 Hình 3.5 Quy trình chiết xuất dược liệu Xấu hổ 23 Hình 3.6 Quy trình xử lý dịch chiết 23 Hình 3.7 Sắc ký đồ thẩm định độ chọn lọc bước sóng 347nm mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b),mẫu thử (c), mẫu thử thêm chuẩn (d) 24 Hình 3.8 Phổ hấp thụ UV mẫu chuẩn mẫu thử 25 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic nồng độ luteolin 26 Hình 3.10 Sắc ký đồ luteolin nồng độ 0.075 µg/ml .28 Hình 3.11 Sắc ký đồ phân biệt dịch chiết M pudica M diplotricha hệ dung môi .30 Hình 3.12 Khảo sát hàm lượng luteolin flavonoid toàn phần mẫu Xấu hổ tỉnh 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Xấu hổ (Mimosa pudica L.) loài phân bố nhiều nơi giới Việt Nam, Ấn Độ, số nước châu Phi, châu Mỹ Cây nghiên cứu với nhiều tác dụng dược lý khác chống viêm, giảm đau [42], [43], [60], chống loét [61], chống oxy hóa [13], [21], [40], [47]; chống nôn [27]; hạ lipid máu [22], [46], hạ đường huyết [11], [53], bảo vệ gan [45], lợi tiểu [49]; giải lo âu [4], chống trầm cảm [51], kháng khuẩn [21], kháng nấm [26], chống sốt rét [31] Những nghiên cứu sàng lọc ban đầu nhóm nghiên cứu cho thấy Xấu hổ dược liệu tiềm dự phòng điều trị hen phế quản [5] Về thành phần hóa học, flavonoid nhóm chất dược liệu Xấu hổ [44], [66] Flavonoid xem nhóm chất có vai trò quan trọng dự phòng điều trị hen phế quản flavonoid có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống dị ứng [55] Trong đó, luteolin chứng minh làm giảm giải phóng cytokin gây viêm (IL-4, IL-5 IL-13), ức chế trình tự thực bào hen dị ứng thông qua hoạt hóa đường truyền tính hiệu PI3K/Akt/mTOR ức chế phức hợp Beclin-1-PI3KC3 [62] Do đó, khảo sát thành phần flavonoid mẫu Xấu hổ để hướng tới xây dựng tiêu chuẩn cần thiết để phát triển nguồn dược liệu Xấu hổ theo hướng hỗ trợ điều trị số bệnh đường hô hấp hen phế quản, viêm phế quản, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính Xuất phát từ ý tưởng đó, đề tài “Khảo sát thành phần flavonoid mẫu Xấu hổ thu hái số vùng Việt Nam” thực với hai mục tiêu sau: - Định tính định lượng flavonoid toàn phần mẫu dược liệu Xấu hổ thu số vùng Việt Nam - Định lượng luteolin mẫu dược liệu Xấu hổ thu số vùng Việt Nam 1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan loài Mimosa pudica L 1.1.1 Vị trí phân loại Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae) Phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) Chi Mimosa Loài Mimosa pudica L [3] 1.1.2 Đặc điểm thực vật loài Mimosa pudica L Cây Xấu hổ cịn có tên mắc cỡ, thẹn, trinh nữ, hàm tu thảo Tên Xấu hổ cành cụp xuống có người đụng vào Cây nhỏ, mọc hoang xịa ven đường cái, thân có gai hình móc Lá lần kép lơng chim, cuống phụ xếp hình chân vịt; khẽ động vào cụp xuống Cuống chung gầy, mang nhiều lông, dài 4cm, cuống phụ đơi, có lơng trắng cứng Lá chét 1520 đơi nhỏ, gần khơng có cuống Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan Quả giáp dài 2cm, rộng 3mm, tụ thành hình ngơi sao, phần hạt hẹp lại, có lơng cứng mép Hạt gần hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1,5mm [9] Đặc điểm phân bố loài Mimosa pudica L Ở Việt Nam, Xấu hổ phân bố rải rác khắp nơi, từ đồng đến miền núi có độ cao 1000m [12] 1.1.3 1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến Dùng toàn rễ Xấu hổ Rễ đào quanh năm, rửa đất cát, thái mỏng, phơi hay sấy khô [9] 1.1.5 Sử dụng dược liệu Xấu hổ Y học cổ truyền Theo Y học cổ truyền, Xấu hổ có vị ngọt, se, tính hàn, có độc, có tác dụng an thần, làm dịu đau, chống ho, long đờm, tiêu viêm, tiêu tích, nhiệt, hạ sốt, lợi tiểu [7] Lá Xấu hổ dùng làm thuốc ngủ dịu tinh thần Liều dùng hàng ngày 612g dạng thuốc sắc, uống trước ngủ [9] Rễ Xấu hổ dùng chữa bệnh xương khớp Rễ Xấu hổ, thái thành miếng mỏng phơi khơ Ngày dùng 120g rang sau tẩm rượu 35-40o lại rang cho khô Thêm 600ml nước, sắc 200-300ml, chia số nước lại làm 2-3 lần uống ngày Thường dùng 4-5 ngày thấy kết (kinh nghiệm dân gian Diễn Châu, Nghệ An miền Nam Việt Nam) [9] 1.1.6 Thành phần hóa học lồi Mimosa pudica L Đã xác định có mặt số nhóm chất sau Xấu hổ: flavonoid, terpenoid, alcaloid, hợp chất phenol, tannin, saponin, acid amin acid hữu [21], [33], [35], [54] Các nghiên cứu hóa học có mặt nhóm chất flavonoid [44], [66] Dịch chiết chứa hàm lượng flavonoid toàn phần phenolic toàn phần cao cao đáng kể so với dịch chiết từ thành phần khác [67] Flavonoid Hơn nửa hợp chất phân lập xác định cấu trúc thuộc nhóm flavonoid, tồn dạng aglycon dạng glycosid (bao gồm hợp chất C-glycosid O-glycosid) Các hợp chất flavon 7,3′,4′-Triacetoxy-3,8-dimethoxyflavon [30] 7,3′,4′-trihydroxy-3,8-dimethoxyflavon 5,7,3′,4′-tetrahydroxy-6-C-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucopyranosyl flavon [65] 7,8,3′,4′-tetrahydroxyl-6-C-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucopyranosyl flavon [65] [30] Mẫu Xấu hổ Phúc Thọ - 30 - Mẫu Xấu hổ Phúc Thọ - 31 - Mẫu Xấu hổ Ba Vì - 32 - Mẫu Xấu hổ Ba Vì - 33 - Mẫu Xấu hổ Ba Vì - 34 - Mẫu Xấu hổ Thanh Hóa - 35 - Mẫu Xấu hổ Thanh Hóa - 36 - Mẫu Xấu hổ Thanh Hóa - 37 - Mẫu Xấu hổ Nghệ An - 38 - Mẫu Xấu hổ Nghệ An - 39 - Mẫu Xấu hổ Nghệ An - 40 - Mẫu Xấu hổ Hịa Bình - 41 - Mẫu Xấu hổ Hịa Bình - 42 - Mẫu Xấu hổ Hịa Bình - 43 - Với hệ dung môi ethyl acetat – acid acetic – acid formic –nước (10:0,3:0,3:0,1) cho thấy khác biệt thành phần flavonoid lồi (Hình 3.12) Đây khảo sát bước đầu hướng đến xây dựng tiêu định tính cho dược liệu Xấu hổ A C B 3 Hình 0.12 Sắc ký đồ phân biệt dịch chiết M pudica M diplotricha hệ dung môi Ký hiệu: (D) UV 254nm trước phun thuốc thử NP/PEG (E) UV 366nm trước phun thuốc tử NP/PEG (F) UV 366nm sau phun thuốc thử NP/PEG Mimosa pudica L Luteolin Mimosa diplotricha C Wright ex Sa - 44 -