Hồ Chí Minh, tháng 7/2023KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ, KHÁNG VIÊM VÀ KHÁNG SỎI CỦA LOÀI CHUỐI CHÂN VOI ENSETE GLAUCUM TẠI VƯỜN QUỐC GIA BÙ GIA MẬP GVHD: PGS.
TỔNG QUAN
Tổng quan về chuối Chân voi
1.1.1 Phân bố và phân loại khoa học
Chuối Chân voi còn được gọi là chuối Cô đơn hay chuối Mồ côi được trồng và mọc hoang dại ở nhiều nơi trên thế giới như Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Việt Nam, Ấn Độ, Philippine[1] Ở Việt Nam chúng thường mọc trong những khu rừng hoang của các tỉnh miền Bắc, Trung, Tây Nguyên, được ưu ái gọi với cái tên là” thần dược”[2]
Hình 1.1 Cây chuối Chân voi ở vườn Quốc gia Bù Gia Mập Loài Ensete glaucum có phân loại khoa học như sau:
Bảng 1.1 Phân loại khoa học của chuối chân voi
Lớp Monocots Loài Ensete glaucum
Tên khoa học Ensete glaucum
Tên tiếng việt Chuối Chân voi/ chuối Cô đơn/ chuối Mồ côi
Loài Ensete glaucum là dạng cây một lá mầm, thân giả cao từ 3,5- 4 mét màu xanh xám và bóng phình to ở gốc Nhựa cây nhanh chóng chuyển sang màu vàng khi tiếp xúc với không khí và sau đó chuyển sang màu xám đen Cuốn lá mập mạp, màu lục nhạt, hình
2 mũi mác thuôn dài Hoa xếp xác nhau thường có 10-16 hoa xếp thành hai hàng Quả chuối khi chín có màu vàng nhạt, mỗi quả chứa từ 10- 25 hạt Hạt chuối có dạng hình cầu màu đen bên trong có bột màu trắng [4] Từ khi cây mọc đến khi trổ buồng mất khoảng 18 tháng Một buồng chuối có 8-10 nảy nằm khích nhau hình thể trông giống như một bông hoa sen đang nở
Khác với các loài chuối thông thường, chuối chân voi không mọc thành bụi mà mọc đơn độc, sinh sôi bằng hạt chứ không phải bằng phần củ dưới đất Sau khi chuối chín vàng cây sẽ tự héo và chết đi
Hình 1.2 Hình dạng loài Ensete glaucum
1.1.3 Các bài thuốc dùng chuối Chân voi để chữa bệnh trong dân gian
Trong dân gian các bộ phận của chuối Chân voi được sử dụng để trị nhiều bệnh như: sỏi thận, đau lưng, nhức mỏi xương khớp, bệnh dạ dày, kích thích tiêu hóa, lợi tiểu, giải nhiệt, trị kém ăn, mất ngủ, táo bón, cảm sốt, bồi bổ cơ thể và một số bệnh trẻ em[3, 5] Những bài thuốc sau được tổng hợp dựa trên kinh nghiệm dân gian:
Chữa trị bệnh tiểu đường: thân cây sau khi làm sạch cắt thành từng mãnh nhỏ ép lấy nước uống hằng ngày hoặc đem đi phơi khô xay nhuyễn pha với nước uống hằng ngày
Chữa bệnh sỏi thận: Hạt chuối sau khi phơi khô được xay, giã nhỏ được nấu với công thức là bảy thìa bột hạt chuối nấu cùng hai lít nước Cho đến khi nước nấu còn 2/3 thì tắt bếp Người bệnh sỏi thận dùng nước hằng ngày sẽ thấy triệu chứng của bệnh giảm hẳn
Ngoài các phương pháp sử dụng nước với chuối Chân voi như trên người ta còn dùng phương pháp ngâm rượu với hạt quả chuối Chân voi uống hàng ngày để chữa bệnh sỏi thận
Chữa bệnh táo bón ở trẻ: nướng chuối bằng cách vùi hẳn vào bếp Đồng thời khi thấy vỏ chuối chuyển sang màu đen có thể lấy ra Tiếp tục, chờ tới khi chuối nướng nguội hẳn là có thể bóc vỏ cho trẻ ăn trị táo bón
1.1.4 Các nghiên cứu về chuối Chân voi trong và ngoài nước
Nghiên cứu trên loài Ensete glausum rất hạn chế và nghiên cứu trên các cây cùng chi
Ensete cũng vậy Năm 2019 loài Ensete superbum là một loài thuộc chi Ensete được Kumar và cộng sự nghiên cứu và công bố rằng thành phần hoá học của loài có sự tồn tại của polyphenol, acid phenolic, flavonoid và tanin Các hợp chất này có thể được dùng như thuốc điều trị bệnh tiểu đường trong thời gian sớm, hạ sốt, giảm đau, chống viêm khớp, chất ức chế và điều hòa miễn dịch[6]
Nghiên cứu về các loài cùng họ Chuối (Musaceae) cũng không nhiều, năm 2020, Oyeyinka và Afolayan đánh giá các đặc tính tiềm năng của quả Musa sinensis và Musa paradisiaca đã chứng minh được quả M sinensis và M paradisiaca có vai trò là chất chống oxy hóa tự nhiên, chống lại stress giúp cải thiện khả năng thu nạp dinh dưỡng được chiết xuất từ các hoạt chất ở thịt và vỏ của những loại quả này[7]
Một nghiên cứu khác của Lopes và cộng sự vào năm 2022 về họ chuối (Musaceae) cho thấy vỏ và củ chuối chứa một lượng đáng kể tổng số phenolic, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa[8]
Về tình hình nghiên cứu trong nước, năm 2022, nhóm nghiên cứu của KS Khương Hữu Thắng và các cộng sự đã hoàn thành đề tài: “Nghiên cứu, bảo tồn và phát triển loài chuối Chân voi (Ensete glausum) tại VQG Bù Gia Mập tỉnh Bình Phước” Kết quả nghiên cứu bước đầu cũng chứng minh sự hiện diện của những thành phần hoạt chất giá trị trong quả chuối, đặc biệt là hạt chuối[9]
Nghiên cứu phối hợp giữa vườn quốc gia Phước Bình, tỉnh Ninh Thuận và Trung tâm sâm và dược liệu Thành Phố Hồ Chí Minh cho thấy, trong quả chuối Chân voi có một số thành phần như flavonoid, tannin, saponin, alkaloid, triterpenoid,…[10]
Như vậy, Việt Nam cây chuối Chân voi chỉ mới được nghiên cứu sơ lược về thành phần các nhóm chất tồn tại trong chuối Xong các hoạt tính hoá học như chống oxy hoá, kháng viêm kháng sỏi chưa được nghiên cứu Do đó, tìm hiểu về thành phần hoá học, hoạt tính
4 sinh học của các cây cùng chi Ensete rất được quan tâm góp phần định hướng nghiên cứu cho loài chuối Chân voi này.
Thành phần hoá học của chi Ensete
Thành phần hoá học của các loài thuộc chi Ensete được trình bày ở bảng 1.2
Bảng 1.2 Thành phần hoá học của một số loài thuộc chi Ensete
Stt Loài Bộ phận Nhóm hợp chất hoá học TLTK
Hạt Alkaloid, flavonoid, phenol, steroid và tanin [11]
Alpha-dodecene; alpha-tetradecene; 2,8- dimethylundecane; 1-nonadecene; 3,7- dimethyldecane; (3E)-3-octadecene; 9E)-9- hexacosene; tetrapentacontane; nonane; 5- methyl-5-propyl; bicyclo[2.2.1]heptane2- methyl; decane; 2,3,8-trimethyl; pentadecyl alcohol; 3,5-dimethyl-4-octanone; 1-(+)- ascorbic acid 2,6- dihexadicane; phthalic acid; cyclobutyl tridecyl est; 1-octadecanol, methyl; octadecanoic acid; 1-heptacosanol; Palmetic acid beta-monoglyceride; methoxyacetic acid;
4-tridecyl ester; Phenol, 2,4-di-tert-butyl
Hạt Alkaloid; steroid; phenolics; glycoside; đường và phenylphenalenone
Cellulose; hemicellulose; lignin; các hợp chất đường (monosaccharide); các chất màu; tannin; protein
Eugenol; acidt n-hexadecanoic; 9-eicosyne, 3– aciddecanyoic; 1-tetradecyne; 7–metyl–Z– tetradecen; 1–ol-axetat; 1–Hexadecyne; Z– tetradec–11–en–1–ol; axit octadecanoic; tridecanedial axetat; axit cis -13-eicosenoic; gallic; axit caffeic; rutin; quercetin; axit ferulic
Thân Alkaloid; sterol; tanin; flavonoid; protein và đường [16]
Trên thế giới đã có các nghiên cứu được công bố về tác dụng chữa bệnh của các loài thuộc chi Ensete, các chất được tìm thấy bao gồm: terpenoid; phenyl-propanoid; flavonoid[17, 18] 9-phenylphenalonene[12]; lectin[19]; flavonoid leucocyanidin[17]; Dopamine serotonin; norepinephrine; tryptophan; hợp chất indole; alkaloid; tanin; ascorbic acid một số flavonoid và các hợp chất liên quan (Leucocyanidin; quercetin và
3-O-galactoside của nó; 3-O-glucoside và 3-O-rhamnosyl glucoside) Các sterol như β- sitosterol; campesterol; stigmasterol.[20]
Hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Ensete
Từ một số nghiên cứu về chi Ensete, nhận thấy các nhóm hợp chất sinh học trong phần quả chuối chủ yếu là polyphenol, flavonoid, proanthocyanidin Đây là những nhóm hoạt chất thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, chống ung thư, chống tiểu đường, suy giảm thoái hóa thần kinh, rối loạn tim mạch, tổn thương đường tiêu hóa và tổn thương xương, kháng viêm Các hoạt tính ở các bộ phận của từng loài được trình bày cụ thể ở bảng 1.3
Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Ensete
STT Loài Bộ phận Tác dụng chữa bệnh TLTK
1 Ensete gilletii Rễ Đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, viêm phổi, thương hàn, sỏi thận và gan rối loạn
Thịt Đau bụng, đau bụng kinh, tiêu chảy, kiết lỵ, rối loạn gan [11, 16]
Lá Gãy xương, kích thích chuyển dạ hoặc gây sảy thai [13, 22]
Quả và lá Viêm gan [13, 22]
Hạt Loại bỏ nhau thai ở người và động vật [13, 22]
Viêm ruột thừa, ung thư, tiểu đường, bệnh bạch cầu, sỏi thận, chó cắn, tiểu khó, sởi, rối loạn tâm thần
Rễ Đau bụng, giúp dễ sinh [23]
Lá và quả Tốt cho tử cung [23]
Hoạt tính chống oxy hoá
Oxy là một nguyên tố quan trọng giúp duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp và nhiều quá trình sinh hoá khác trong cơ thể Trong khi tham gia vào các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là gốc tự do (ROS) Các gốc tự do là những nguyên tử, phân tử hay ion có điện tử độc thân lớp ngoài cùng, năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với các đại phân tử như protein, lipid, DNA, gây rối loạn các quá trình sinh hoá trong cơ thể [24]
Mức độ ROS tăng lên có thể làm hỏng cấu trúc của các phân tử sinh học và thay đổi chức năng của chúng, đồng thời dẫn đến rối loạn chức năng tế bào và thậm chí là chết tế bào Tác động tích lũy của việc tăng ROS được biểu hiện dưới dạng một loạt các vấn
6 đề sức khỏe như ung thư, bệnh liên quan đến tuổi tác và bệnh tim mạch[25, 26] ung thư, xơ vữa động mạch, teo cơ,… [27]
Chất chống oxy hoá là chất có khả năng làm chậm hoặc ức chế quá trình oxy hoá, ngăn ngừa sự tổn hại của sinh vật do gốc tự do gây ra.[28] Nhiều chất chống oxy hóa được coi là tác nhân phòng ngừa và điều trị có thể ứng dụng trong chống bức xạ [29], chống ung thư và các bệnh liên quan đến tuổi già[30]
Chất chống oxy hoá được chia làm hai loại là: Chất chống oxy hoá bậc một và chất chống oxy hoá bậc hai Chất chống oxy hoá bậc một có khả năng khử các gốc tự do, phá vỡ chuỗi oxy hoá của các phân tử Chất chống oxy hoá bậc hai có tác dụng kiềm hãm sự hình thành của các gốc tự do, làm chậm tốc độ oxy hoá.[28]
Hệ thống chất chống oxy hoá trong cơ thể ngoài các chất chống oxy hoá có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase( SOD), enzyime glutathion perosidase(GSP-Px), enzyme catalase(CAT), [24] còn được bổ sung bằng cách sử dụng các thực phẩm xanh sạch như trái cây, rau củ, thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật,…
1.4.3 Một số cơ chế chống oxy hoá phổ biến
Là cơ chế chuyển một điện tử từ chất chống oxy hóa tiềm năng (ArOH) đến gốc tự do (ROO•), cơ chế này gồm hai quá trình Trong quá trình thứ nhất một electron từ chất chống oxy hoá chuyển sang gốc tự do và quá trình thứ hai là chuyển một proton Trong cơ chế này khả năng chống oxy hoá được quyết định bởi khả năng chuyển electron, được đặc trưng bởi năng lượng ion hóa( IP) Trong quá trình thứ hai của cơ chế phụ thuộc bởi năng lượng phân ly proton ( PDE).[31]
ROO • + ArOH ROO - + ArOH •+ ROOH + ArO •
Trong cơ chế này các chất chống oxy hoá tiềm năng sẽ chuyển một nguyên tử hydro đến gốc tự do và quá trình này được đặc trưng bởi năng lượng phân ly liên kết (BDE) Năng lượng phân ly liên kết (BDE) thể hiện độ bền nhiệt động của liên kết BDE thấp thì liên
7 kết dễ dàng bị cắt đứt và nguyên tử hydro dễ dàng chuyển đến kết hợp với gốc tự do, điều này sẽ đóng vai trò rất quan trọng trong phản ứng chống oxy hóa.[31]
1.4.4 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hoá
Có nhiều phương pháp khảo sát khả năng chống oxi hoá của mẫu Các phương pháp được sử dụng phổ biến được trình bày ở bảng 1.4
Bảng 1.4 Các phương pháp thử hoạt tính chống oxi hoá
STT Phương pháp Nguyên tắc Cách xác định
1 Frap Phản ứng với Fe 3+ Đo màu
2 DPPH Phản ứng với gốc tự do Đo màu
3 ABTS Phản ứng với gốc tự do Đo màu
4 DMPD Phản ứng vối gốc tự do Đo màu
6 CUPRAC Khử Cu 2+ thành Cu 1+ bằng các chất chống oxi hóa Đo màu
Trong bài này sử dụng phương pháp Frap và DPPH để xác định khả năng chống oxi hoá của các mẫu cao trích
1.4.4.1 Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH
DPPH là tên viết tắt của 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl là gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàn lọc hoạt tính chống oxy hoá của các chất nghiên cứu
Phương pháp này được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả Khả năng chống oxy hoá của chất nghiên cứu được xác định thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH ban đầu có màu tím, các chất chống oxy hoá trung hoà DPPH bằng cách cho hydrogen làm nhạt dần màu tím của DPPH Sự giảm màu này được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517nm
Hình 1.3 Phản ứng trung hoà gốc tự do DPPH
Phương pháp FRAP được thực hiện đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng lực khử hoá của các chất trong huyết tương Nhưng đây cũng là phương pháp để thử nghiệm các chất chống oxy hoá trong thực vật Phương pháp này dựa vào sự khử phức ferric 2,4,6- tripyridin-s-triazin (Fe 3+ - TPTZ) thành phức ferrous 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe 2+ - TPTZ) bền hơn bằng chất chống oxy hoá Phức Fe 2+ - TPTZ tạo thành có màu xanh dương đậm, bền vững và có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 700 nm.
Hoạt tính kháng viêm
Viêm là một phản ứng tự nhiên của cơ thể đối với nhiều tác nhân thù địch bao gồm ký sinh trùng, vi sinh vật gây bệnh, các chất hóa học độc hại và tổn thương vật lý đối với mô[32] Quá trình này dẫn đến các hiện tượng thoát huyết tương, xuyên bạch cầu, tăng sinh tế bào tại ổ viêm và hiện tượng thực bào, gây ra bốn triệu chứng điển hình là sưng, nóng, đỏ và đau[12]
1.5.2 Các phương pháp khảo sát hoạt tính kháng viêm được công bố
1.5.2.1 Khả năng ức chế sản sinh NO và các cytokine tiền viêm
Quá trình viêm trong cơ thể sẽ giải phóng các chất trung gian gây viêm như nitric oxide (NO), gốc tự do (ROS), cytokine tiền viêm tumor necrosis factor-α (TNF-α) và interleukin (IL-6, IL-1β, ).Như vậy sự hiện diện của NO và cytokine tiền viêm có thể phản ánh được mức độ của quá trình viêm[33]
Thông qua tác động kích thích của LPS, tế bào đáp ứng lại kích thích này bằng cách điều hòa miễn dịch và sản sinh NO, phóng thích các gốc tự do [34] Nếu sự có mặt của cao chiết làm ức chế đáng kể sự sản sinh NO có thể kết luận khả năng kháng viêm của cao chiết đó
1.5.2.2 Khả năng ức chế biến albumin
Các chất trung gian được giải phóng trong quá trình viêm làm nhiệt độ cơ thể tăng, gây biến tính các loại protein trong cơ thể thông qua các liên kết của protein như liên kết hydro, liên kết ion, lực Van der Waals và tương tác tĩnh điện [35] Thông qua khả năng bảo vệ protein khỏi sự biến tính do nhiệt có thể đánh giá khả năng kháng viêm của cao chiết[36]
Hoạt tính kháng viêm được xác định dựa trên giá trị IC50 (giá trị nồng độ mẫu có khả năng ức chế albumin đạt 50%), Giá trị IC50 của mẫu càng nhỏ chứng tỏ hoạt tính kháng viêm của mẫu càng mạnh
Trong bài luận văn này tiến hành khảo sát khả năng kháng viêm của các mẫu cao chiết thông qua khả năng ức chế sự biến tính albumin trứng dưới tác dụng của nhiệt độ.
Hoạt tính kháng sỏi
Sỏi thận là một bệnh thường gặp và hay tái phát do sự kết tủa tạo thành sỏi của một số chất có trong nước tiểu ở đường tiết niệu trong điều kiện sinh hoá nhất định Sỏi gây tắt đường tiết niệu, gây nhiễm khuẩn và suy thận ảnh hưởng đến sức khoẻ và tính mạng người bệnh
Cấu trúc của một viên sỏi thận bao gồm hai thành phần là: Chất Muco-protein có tác dụng như chất keo kết dính các tinh thể với nhau để tạo sỏi và tinh thể của các chất như: Calci, Oxalat, Photphate, Magie, Urat, Cystine….[37]
Sỏi thận có 4 dạng: sỏi Calcium oxalate và sỏi calcium phosphate hoặc là hỗn hợp sỏi thận của cả hai loại tinh thể (chiếm 85%), sỏi struvite, sỏi uric acid và hiếm nhất là sỏi cysteine[38] Sỏi nếu có kích thước nhỏ có thể có thể tự động đào thải ra ngoài nhưng với kích thước lớn sẽ gây tắt nghẽn đường tiết niệu gây đau đớn cho người bệnh [39]
Ngày nay, trong y học thường dùng biện pháp phẫu thật hay dùng laser công suất cao để phá vỡ sỏi[40] Tuy nhiên các biện pháp này khá tốn kém và bệnh có khả năng tái lại Trong dân gian lưu truyền, chuối Chân voi được xem như một bài thuốc nam chữa các bệnh viêm nhiễm, tiểu đường, sỏi thận,…Xuất phát từ thực tiễn đó thí nghiệm khảo sát khả năng kháng sỏi của chuối chân voi được thực hiện nhằm hướng tới tạo ra sản phẩm có dược tính phòng và điều trị bệnh
1.6.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng sỏi
Mô phỏng quá trình hình thành và phát triển sỏi trong cơ thể người từ lúc hạt sỏi còn nhỏ mới hình thành đến giai đoạn sỏi bắt đầu phát triển lớn dần Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng sỏi trên mẫu cao chuối Chân voi được tiến hành thông qua ba thí nghiệm[41]
1.6.2.1 Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành hạt nhân tinh thể calcium oxalate
Do phần trăm calcium oxalate chiếm phần lớn trong thành phần sỏi người Nên trong bài luận văn này tiến hành mô phỏng quá trình hình thành hạt nhân tinh thể calcium oxalate bằng cách cho canxi clorua tác dụng với natri oxalate Dung dịch mẫu cao chiết chuối Chân voi được cho vào trước khi sự hình thành tinh thể bắt đầu diễn ra Và sau đó sử dụng máy quang phổ hấp thụ UV-Vis đo độ đục ở bước sóng 620 nm để xác định khả năng ức chế sự hình thành hạt nhân tinh thể
1.6.2.2 Khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của tinh thể calcium oxalate Để thực hiện thí nghiệm này cần chuẩn bị trước tinh thể calcium oxalate đã hình thành ổn định Dung dịch mẫu cao chiết chuối Chân voi được cho vào tinh thể calcium oxalate sau đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 620 nm để xác định khả năng ức chế kết tụ và phân tán của tinh thể
1.6.2.3 Khảo sát khả năng làm giảm trọng lượng sỏi thận ở người
Thí nghiệm này được tiến hành thực hiện trên sỏi người Bằng cách ngâm sỏi người trực tiếp vào dung dịch mẫu cao chiết và theo dõi khối lượng sỏi trước và sau khi ngâm để chứng minh hoạt tính kháng sỏi của từng mẫu cao
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu- Hoá chất- Thiết bị
Trái và củ chuối Chân voi được lấy từ vườn Quốc gia Bù Gia Mập tỉnh Bình Phước Làm sạch, loại bỏ bùn đất tách riêng phần vỏ, quả và củ chuối sau đó sấy khô
Hình 2.1 Chuối chân voi được thu hái từ vườn quốc gia Bù Gia Mập
Hình 2.2 Chuối sau khi được làm sạch và sấy khô
Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng
STT Thiết bị - Dụng cụ STT Thiết bị - Dụng cụ
1 Bể điều nhiệt (Memmert, Đức) 8 Tủ sấy (Memmert, Đức)
2 Bể siêu âm (Hettich, Đức) 9 Cân phân tích 4 số (Precisa, Thụy
3 Dụng cụ thủy tinh: beaker, erlene, pippet, ống đong, ( Duran, Đức) 10 Máy đo độ hấp thu quang UV-Vis
4 Hệ thống cô quay chân không
(Yamamoto, Nhật Bản) 11 FT-IR (Jasco, Nhật Bản)
5 Máy ly tâm (Hettich, Đức) 12 Cân kỹ thuật 2 chữ số (Precisa, Thụy
6 Cân phân tích 4 số (Precisa, Thụy) 13 Micropipette (Winlab, Đức)
Bảng 2.2 Hoá chất sử dụng
STT Tên hóa chất Số CAS Nơi sản xuất
11 Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O) 10039-32-4
22 Albumin Fraction V heat shock 9000-70-8 Canada
Nội dung nghiên cứu
Cao trích được điều chế băng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ehtanol 70 o
Khảo sát thành phần hoá học
Các nhóm chức có trong cao trích được định tính bằng các phản ứng hoá học đặc trưng, kết hợp với quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) Sau đó thực hiện các thí
13 nghiệm để định lượng polyphenol, flavonoid, saponin có trong từng mẫu cao trích.
Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ, phòng thí nghiệm Hóa Phân tích ở Trường Đại Học Sư phạm Kỹ Thuật Thành phố Hồ Chí Minh
- Tách thành 5 phần: Vỏ, thịt, hạt, nguyên trái, củ
- Xay thành bột (d≈ 0,1cm) Điều chế cao trích Định tính
- Định tính bằng phản ứng hóa học
- Định tính bằng FT-IR
Khảo sát thành phần hoá học
Khảo sát hoạt tính sinh học
- Khả năng ức chế gốc tự do DPPH
- Khả năng khử sắt FRAP
Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá
Khảo sát hoạt tính kháng viêm
Khảo sát hoạt tính kháng sỏi
- Ức chế tạo mầm tinh thể
- Ức chế phát triển tinh thể
- Khả năng làm tan sỏi người Định lượng
Khảo sát hoạt tính sinh học
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá được thực hiện bằng hai phương pháp là: ức chế gốc tự do DPPH và khả năng khử Fe 3+
- Hoạt tính kháng viêm được xác định dựa trên khả năng ức chế sự biến tính albumin của từng mẫu cao trích
- Hoạt tính kháng sỏi được thực hiện bằng ba phương pháp là: khảo sát khả năng ức chế sự hình thành hạt nhân tinh thể, khảo sát sự ức chế phát triển tinh thể và khảo sát khả năng làm tan sỏi người.
Phương pháp nghiên cứu
Mục tiêu: trích ly các thành phần hoá học có trong củ và chuối chân voi
Hình 2.4 Sơ đồ điều chế cao trích
Mẫu sau khi được làm sạch và sấy khô được tách riêng thành năm phần (củ, hạt, thịt, vỏ, nguyên trái) sau đó được xay nhỏ bằng máy xay và tiến hành ngấm kiệt trong dung
Tách riêng thành 5 phần: củ, hạt, thịt, vỏ, nguyên trái
15 môi ethanol 70 o với tỉ lệ mẫu và dung môi là 1:5 tiến hành siêu âm 1h sau đó thay dung môi mới Thực hiện cho đến khi dịch chiết nhạt màu Tiến hành lọc toàn bộ dịch chiết bằng giấy lọc, sau đó đem đi cô quay chân không ở nhiệt độ 50 o C với tốc độ quay 90 vòng/phút thu được cao chiết.Các mẫu cao được kí hiệu như bảng 2.3
Bảng 2.3 Mã hoá các mẫu cao bằng kí hiệu
STT Tên mẫu Ký hiệu
Xác định hiệu suất của quá trình trích ly Được tính theo công thức sau : H= m 1 (1−𝑤) m
H: hiệu suất trích ly (%) m1: khối lượng cao trích thu được (g) m2: khối lượng nguyên liệu ban đầu đem trích ly (g)
Xác định độ ẩm Độ ẩm của mẫu được xác dựa trên tiêu chuẩn TCVN 8900 – 2:2012 với thông số đánh giá dựa trên phần trăm hàm lượng ẩm theo khối lượng Độ ẩm nguyên liệu được xác định bằng phương pháp sấy đối lưu ở 105 o C Khối lượng ẩm tách ra sau quá trình sấy được tính toán dựa trên sự chênh lêch giữa khối lượng của mẫu trước khi sấy và khối lượng của mẫu sau khi sấy hoàn tất Công thức:
X = m 1 - m 2 m 1 ×100 Trong đó: m1, m2 lần lượt là khối lượng của đĩa petri chứa mẫu trước và sau khi sấy
2.3.2 Xác định thành phần hoá học
2.3.2.1 Phân tích định tính các nhóm chức bằng những phản ứng đặc trưng
Khảo sát sự hiện diện của các nhóm chức có trong từng mẫu cao dựa trên phản ứng đặc trưng của chúng với các mẫu thử và quan sát hiện tượng Nguyên tắc và phương pháp thực hiện được trình bày ở bảng 2.4
Bảng 2.4 Định tính các nhóm chức bằng phản ứng đặc trưng
STT Nhóm chức Nguyên tắc Phương pháp Hiện tượng TLTK
1 Saponin Định tính tạo bọt
- Hút 0,5 mL dịch chiết đậm đặc vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,0 mL nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái và lắc mạnh theo chiều đứng của ống nghiệm trong 1 phút
- Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả
Lớp bọt bền sau 15 phút
Cho 2 mL dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt FeCl3 vào Xuất hiện màu xanh đen
3 Alkaloid Phản ứng với thuốc thử Boucharda
- Hút 2 mL dịch chiết vào ống nghiệm cho vài giọt thuốc thử boucharda vào lắc đều
- Thuốc thử Bouchardat: hòa tan 2 g I2 và 4 g KI trong 10 mL nước, lắc và để yên cho tan rồi thêm nước cho đến 100 mL)
Kết tủa màu nâu đỏ
Lấy một ít cao chiết vào ống nghiệm Thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc
Phản ứng Cyanidin: cho 2 mL dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi nhỏ từ từ 4-5 giọt acid HCl đặc Đun nóng trên bếp cách thủy sau vài phút
Xuất hiện màu tím đỏ thì phản ứng dương tính
7 Acid hữu cơ Phản ứng với tinh thể
Cho 1 mL dịch chiết vào một ống nghiệm, thêm vài tinh thể
Phản ứng dương tính khi xuất hiện bọt khí
Thuốc thử: 1 mL anhydrid acetic,
1 mL chloroform để lạnh ở 0 o C, thêm vài giọt acid sulfuric đặc
Xuất hiện màu xanh lục, hồng, cam , đỏ và màu bền là phản ứng dương tính
2.3.2.2 Phân tích định tính bằng quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)
Các tín hiệu phổ FTIR đặc trưng để nhận biết các nhóm chức được trình bày ở bảng 2.5
Bảng 2.5 Các tín hiệu đặc trưng nhận biết các nhóm chức
STT Hợp chất Liên kết Độ hấp thu (cm -1 ) TLTK
4 Tannin C - OH và nhóm caboxylic 1183.55 - 1284.81
C – H (dao động ngoài mặt phẳng) 600 – 900
C – H (dao động trong mặt phẳng) 1000 – 1200
Nguyên tắc: FTIR là viết tắt của hồng ngoại biến đổi Fourier là loại quang phổ phổ biến trong tổng hợp hữu cơ, khoa học polyme, kỹ thuật hóa dầu, công nghiệp dược phẩm và
18 phân tích thực phẩm Hoạt động theo nguyên tắc khi bức xạ hồng ngoại (IR) đi qua một mẫu, một số bức xạ bị hấp thụ Bức xạ đi qua mẫu được ghi lại Do các phân tử khác nhau có cấu trúc khác nhau tạo ra các quang phổ khác nhau nên quang phổ có thể được sử dụng để xác định và phân biệt các nhóm chức và các phân tử[49]
Lấy một lượng nhỏ mẫu cao trích nghiền với một lượng khoảng 10 mg KBr sao cho vừa đủ để tạo thành một viên nén Nghiền hỗn hợp cẩn thận và rãi đều nó trong khuôn thích hợp Nén khuôn có hỗn hợp và tiến hành đem đo, vùng quét sóng nằm trong khoảng
Dựa vào sự đặc trưng về số sóng, độ truyền qua, hình dạng của từng nhóm chức, kết hợp với các tài liệu tham khảo được trình bày ở bảng 2.5 để nhận diện các nhóm hợp chất tự nhiên
2.3.2.3 Xác định tổng hàm lượng polyphenol
Nguyên tắc: dung dịch cao chiết sẽ phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu trong môi trường kiềm Thuốc thử sẽ oxy hoá các hợp chất polyphenol có trong mẫu cao chiết tạo ra các acid heteroply màu xanh da trời có hấp thu bước sóng cực đại ở 765 nm[50] Chuẩn bị mẫu
- Dung dịch thuốc thử folin-ciocalteu ( rút 20 mL folin-ciocalteu định mức lên 100 mL)
- Na2CO3 10% (hoà tan 10 g Na2CO3 định mức lên 100 mL bằng nước cất)
- Dung dịch cao chiết 100 ppm (hoà tan 0,2 g cao chiết định mức lên 10 mL, sau đó hút 0,5 mL dung dịch vừa thu được và định mức lên 100 mL)
- Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự mẫu thử nhưng thay Vmẫu bằng Vethanol
Quy trình xác định tổng hàm lượng polyphenol được trình bày cụ thể ở hình 2.5
Tiến hành đo mật độ quang của mẫu tại bước sóng 765 nm Mỗi mẫu lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình đem nội suy với đường chuẩn acid gallic được xây dựng với dãy
19 nồng độ là 1; 2; 5; 10; 20 mg/mL đường chuẩn thu được có dạng y= 0,096x + 0,0365 (R 2 = 0,998) Từ đó suy ra nồng độ polyphenol có trong mẫu
Tồng hàm lượng polyphenol theo phầm trăm chất khô (mg GAE/g DW) tính dựa trên đường chuẩn của acid gallic được tính theo công thức
TPC: Hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW)
C: nồng độ polyphenol tính từ đường chuẩn (mg/mL)
Vm: Thể tích mẫu gốc (mL) m: Khối lượng mẫu (g) wm: Độ ẩm mẫu (%) d: Hệ số pha loãng
Hình 2.5 Quy trình xác định tổng hàm lượng polyphenol
2.3.2.4 Xác định tổng hàm lượng flavonoid
Nguyên tắc: flavonoid tác dụng với AlCl3 tạo phức màu vàng Tổng hàm lượng flavonoid tỷ lệ thuận với cường độ màu Cường độ màu được xác định bằng cách đo độ hấp thu cực đại tại bước sóng 550 nm[51]
1,3 mL dung dịch mẫu thử
Phối trộn, để yên 5 phút Để nhiệt độ phòng 30 phút 0,7 mL Na2CO3 10% Đo độ hấp thu = 765 nm
- Pha dung dịch AlCl3, NaNO2, NaOH (10%)
- Dung dịch cao chiết 200 àg/mL ( hoà tan 0,2 g cao chiết định mức lờn 10 mL, sau đú hút 1 mL dung dịch vừa thu được và định mức lên 100 mL)
- Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự mẫu thử nhưng thay Vmẫu bằng Vethanol
Quy trình thực hiện xác định tổng hàm lượng flavonoid được trình bày cụ thể ở hình 2.6
Hình 2.6 Quy trình xác định tổng hàm lượng Flavonod
Mẫu được đo độ hấp thu quang tại bước sóng 550 nm Mỗi thí nghiệm thực hiện lặp lại
3 lần và lấy giá trị trung bình
Hàm lượng tổng flavonoid theo phần trăm mẫu thử (mg CAE/g DW) được xác định dựa vào đường chuẩn catechin được xây dựng với dãy nồng độ từ 0,4 mg/mL đến 100 mg/mL đường chuẩn thu được có dạng y= 0,0196x + 0,0056 (R 2 = 0,999)
Tồng hàm lượng flavonoid theo phầm trăm chất khô (mg CAE/g DW) tính dựa trên đường chuẩn của catechin được tính theo công thức
1000 L NaOH Đo độ hấp thu = 550 nm
TFC – Hàm lượng flavonoid tổng số (mg CAE/g chất khô)
C - nồng độ flavonoid tính từ đường chuẩn (μg/mL)
Vm - thể tích mẫu gốc (mL) m - khối lượng mẫu (g) wm - độ ẩm mẫu (%)
2.3.2.5 Xác định tổng hàm lượng saponin
Nguyên tắc: saponin được oxy hóa bằng axit sulfuric với vanilin, tạo ra màu đỏ tím đặc biệt được đo ở bước sóng 572 nm[52]
- Dung dịch cao chiết 2400 àg/mL ( hoà tan 0,012 g mẫu cao chiết định mức lờn 5 mL)
- Vanilin 8% ( hoà tan 0,8 g vanilin định mức lên 10 mL)
- Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự mẫu thử nhưng thay Vmẫu bằng Vethanol
Tồng hàm lượng saponin theo phầm trăm chất khô (mg OAE/g DW) được tính dựa trên đường chuẩn acid oleanolic Được xõy dựng với dóy nồng độ từ 1 àg/mL đến 200 àg/mL đường chuẩn thu được có dạng y= 0,0169x - 0,0304 (R 2 = 0,998)
TSC: Hàm lượng saponin tổng số (mg OAE/g DW)
C: nồng độ saponins tính từ đường chuẩn (mg/L)
Vm: Thể tích mẫu (mL) m: Khối lượng mẫu (g) wm: Độ ẩm mẫu (%) d: Hệ số pha loãng
Quy trình thực hiện xác định tổng hàm lượng saponin được trình bày ở hình 2.7
Hình 2.7 Quy trình xác định tổng hàm lượng saponin
2.3.3 Xác định hoạt tính sinh học
2.3.3.1 Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH
Xử lí số liệu
Những số liệu thu được từ các thí nghiệm được tính toán, xử lý thống kê ANOVA và so sánh theo tiêu chuẩn kiểm định LSD của Fisher trên phần mềm phân tích thống kê Statgraphics Centurion XV.I
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả điều chế cao trích
Các mẫu sau quá trình ngâm dầm với lượng nguyên liệu ban đầu như nhau, được tiến hành cô quay chân không điều chế cao trích Khối lượng cao trích thô thu được ở các mẫu có sự khác nhau
Dựa vào bảng kết quả cho thấy hiệu suất thu được ở các mẫu là khác nhau mẫu EG-PE có hiệu suất trích ly cao nhất với 39,00% tiếp theo là mẫu EG-BB (24,15%), mẫu EG-S (14,40%), mẫu EG-P (13,40%) và thấp nhất là mẫu EG-F với 10,70% Sự khác biệt này chịu tác động bởi nhiều yếu tố như: tính chất vật liệu, thời gian, điều kiện ngâm mẫu,…
Ngoài ra, các mẫu cao trích thu được có độ ẩm khác nhau Độ ẩm lớn nhất ở mẫu EG-P với 28,50% và thấp nhất ở mẫu EG-F với 13,30% Chi tiết về kết quả điều chế cao trích được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả điều chế cao trích
Kí hiệu Độ ẩm(% ) Hiệu suất
Định tính và định lượng thành phần hoá học
3.2.1 Kết quả phân tích định tính
3.2.1.1 Phân tích định tính bằng những phản ứng đặc trưng
Bằng cách tiến hành các phản ứng hoá học đặc trưng của các nhóm chức đã bước đầu xác định được sự hiện diện của các hợp chất trong từng mẫu cao trích, kết quả được trình bày ở bảng 3.2
Từ kết quả cho thấy, cả năm mẫu cao đều chứa các nhóm chức: saponin, polyphenol, alkaloid, flavonoid, acid hữu cơ Các thí nghiệm định tính caroten đều cho kết quả âm tính ở cả năm mẫu Mẫu EG-S và EG-BB cho kết quả dương tính rõ ràng ở nhiều thí nghiệm định tính các nhóm chức, bước đầu dự đoán là mẫu mạnh chiếm hàm lượng các
33 nhóm chức nhiều Mẫu EG-P và EG-PE đa phần cho hiện tượng ít, nhẹ vừa đủ để nhận biết sự hiện diện của các nhóm chức, từ đó dự đoán đây là mẫu yếu
Polyphenol và flavonoid là hợp chất quan trọng có khả năng chống oxy hoá vô cùng hiệu quả, giúp bảo vệ cơ thể chống lại nhiều loại bệnh khác nhau Nhận thấy các mẫu cao trích đều chứa polyphenol và flavonoid, từ đó cho thấy tiềm năng ứng dụng của của chúng trong tương lai
Bảng 3.2 Kết quả định tính nhóm chức bằng phản ứng hoá học đặc trưng
Nhóm hợp chất EG-S EG-P EG-PE EG-BB EG-F
Dấu (-) biểu thị cho kết quả âm tính với thuốc thử với chất tương ứng cần định tính có mặt trong cao; (±) Nghi ngờ kết quả, (+): kết quả thể hiện ít, nhẹ, (++): kết quả rõ ràng đủ nhận biết, (+++) biểu thị cho kết quả thử có màu sắc rõ và phản ứng ngay lập tức 3.2.1.2 Phân tích định tính bằng phổ hồng ngoại FT-IR
Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) là một công cụ dùng để xác định các nhóm chức, cơ sở nhận danh của phương pháp này là dựa trên số sóng của các nhóm chức, từ đó giúp dự đoán các nhóm hợp chất có trong cao trích Nhìn chung, kết quả phân tích phổ FTIR của các mẫu đều có các tín hiệu tương tự nhau Điều này cho thấy các mẫu đều có các nhóm chức giống nhau Các tín hiệu phổ ở các mẫu cao được trình bày trong bảng 3.3 và phụ lục 1.2a- 1.2e
Từ kết quả phổ FTIR cho thấy xuất hiện các đỉnh hấp thu trong khoảng 700 – 900 cm -1 có thể do dao động biến dạng của liên kết C−H của vòng phenolic Đỉnh hấp thu nằm trong khoảng 1300-1000 cm -1 là tín hiệu dao động của dãn liên kết C–O đây là liên kết có trong nhóm saponin và polysacharide [43] Liên kết C–N được tìm thấy thông qua tín hiệu của đỉnh hấp thu tại 1250 cm -1 dự đoán có nhóm amide Đỉnh hấp thu tại 1400-1450cm -1 là tín hiệu của liên kết CH3 trong lipid và protein Các đỉnh hấp thu nằm khoảng 1500-1600 cm -1 và 1620 cm -1 lần lượt là tín hiệu của liên kết C=C trong vòng
34 thơm và alkene Các đỉnh hấp thu nằm khoảng 2100-2300 cm -1 là tín hiệu của liên kết C≡N và C≡C liên quan đến hợp chất ankyne và nitrile Tín hiệu ở 1650-1700 cm -1 là tín hiệu của C=O liên quan đến hợp chất có chứa như acid cacboxylic, amino acid, alkaloid
[43] Tín hiệu dạng mũi rộng của đỉnh hấp thu nằm trong khoảng 3600 – 3200 cm -1 là của liên kết O–H đây là tín hiệu của nhóm OH đặc trưng của các nhóm hợp chất polyphenol, saponin, flavonoid, tanin [6, 59]
Vậy từ phương pháp phân tích phổ FTIR ta có thể dự đoán nhóm chức có trong các mẫu cao trích là polyphenol, flavonoid, amino acid, saponin, polysaccharide và alkaloid
Bảng 3.3 Số sóng của các đỉnh hấp thu trong phổ FT-IR
STT Liên kết Số sóng của các đỉnh hấp thu (cm -1 )
EG-S EG-BB EG-P EG-PE EG-F
3.2.2 Kết quả phân tích định lượng
3.2.2.1 Tổng hàm lượng polyphenol (TPC)
Polyphenol được xem như nhóm chất tiềm năng, có lợi cho sức khoẻ được dùng như chất chống oxy hoá, kháng khuẩn, chống nấm, kháng virut, chống viêm, bảo vệ thận…[60]
Dựa trên kết quả thực nghiệm đạt được cho thấy hàm lượng poyphenol ở các mẫu cao trích có sự khác biệt đáng kể (p < 0,05), ba mẫu EG-BB; EG-P; EG-F không có sự khác biệt đáng kể vê hàm lượng polyphenol Hàm lượng tổng polyphenol có trong các mẫu cao trích, nhận thấy trong mẫu cao EG-BB chứa hàm lượng polyphenol cao nhất với 27,15 mg GAE/g và thấp nhất là mẫu EG-P với 10,15 mg GAE/g DW Kết quả tổng hàm lượng polyphenol có trong từng mẫu cao trích được trình bày ở bảng 3.4
So sánh với nghiên cứu về loài cùng chi Ensete đã được công bố, tổng polyphenol của loài E.gilletii là 157,64 mg GAE/g DW [3] Từ đó cho thấy TPC của loài chuối Chân voi tương đối thấp hơn so với các loài cùng chi
Một nghiên cứu về thành phần các hợp chất có trong đậu nành cho kết quả tổng polyphenol có trong hạt đậu là 2,82 mg GAE/g DW [61], thấp hơn mẫu hạt (EG-S) 4,5 lần So sánh kết quả TPC của quả chuối Chân voi với một loài cùng họ là Musa sinensis hàm lượng polyphenol có trong bột quả Musa sinensis giai đoạn xanh (6,85 mg GAE/g DW), giai đoạn chưa chín (3,74 mg GAE/g DW), giai đoạn chín mùi (5,85 mg GAE/g DW)[8] nhìn chung vẫn thấp hơn so với mẫu nguyên trái (EG-F) của chuối Chân voi
Bảng 3.4 Kết quả tổng polyphenol của các mẫu cao trích
STT Mẫu Ký hiệu Tổng hàm lượng polyphenol (TPC, mg GAE/g DW)
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình "±" độ lệch chuẩn (với n=3) Những chữ cái a, b trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p0,05)về các giá trị TPC của những mẫu cao theo kiểm định LSD
3.2.2.2 Tổng hàm lượng flavonoid (TFC)
Hoạt tính kháng oxy hoá
3.3.1 Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Từ kết quả hoạt tính ức chế gốc tự do của năm mẫu cao trích ở bảng 3.7 cho thấy mẫu cao hạt (EG-S) cho hoạt tính mạnh nhất tiếp sau đó là mẫu củ (EG-BB), nguyên trái (EG-F), vỏ (EG-PE) và thấp nhất là mẫu thịt (EG-P)
Mẫu EG-S và EG-BB cú hoạt tớnh mạnh do đú được khảo sỏt ở nồng độ từ 1-20 àg/mL Tại nồng độ 1 àg/mL cả hai mẫu cho giỏ trị I% xấp xỉ nhau là 9,19% và 9,57% Tuy nhiờn đến nồng độ 20 àg/mL mẫu EG-S lại cho hoạt tớnh mạnh hơn với giỏ trị I% là 87,35% so với mẫu EG-BB (I%= 65,50%) Mẫu EG-F có hoạt tính trung bình nên được khảo sỏt ở dóy nồng độ từ 10-100 àg/mL Mẫu EG-P và EG-PE cú hoạt tớnh yếu được khảo sỏt trong khoảng nồng độ từ 100-500 àg/mL Tại nồng độ 100 àg/mL mẫu EG-F đã ức chế được 89,78% trong khi EG-PE ức chế 39,59% và mẫu EG-P chỉ ức chế được 20,74%
Ngoài ra, khả năng ức chế gốc tự do của các mẫu cao trích còn được xác định dựa vào giỏ trị IC50 Mẫu cú hoạt tớnh mạnh nhất là mẫu EG-S với giỏ trị IC50 là 4,82 àg/mL xấp xỉ với chất đối chứng dương là acid galic được biết đến là chất chống oxy hoá mạnh có
IC50 là 5,5 àg/mL.Từ đú cú thể xỏc định khả năng ức chế gốc tự do mạnh của mẫu EG-S Tiếp theo là mẫu EG-BB (IC50= 7,67 àg/mL), mẫu EG-F (IC50= 31,41 àg/mL), mẫu EG-PE (IC50= 127,27 àg/mL) và mẫu cú hoạt tớnh yếu nhất là mẫu EG-P (IC50= 254,81 àg/mL) Kết quả xỏc định khả năng chống oxy hoỏ của cỏc mẫu cao bằng phương pháp ức chế gốc tự do tương thích với các thí nghiệm định lượng tổng polyphenol và flavonoid trước đó Hàm lượng TPC, TFC của mẫu EG-S, EG-BB cao hơn nhiều so các mẫu còn lại, mà polyphenol và flavonoid được chứng minh có khả năng chống oxy hóa vô cùng hiệu quả[64] Do đó giá trị IC50 của mẫu EG-S và EG-BB trong thí nghiệm này thấp hơn các mẫu còn lại đáng kể Kết quả phần trăm ức chế ở từng nồng độ và giá trị IC50 của các mẫu cao được thể hiện bảng 3.7 và phụ lục 5.1-5.2e
Bảng 3.7 Phần trăm ức chế gốc tự do và IC50 của các mẫu cao trích
Phần trăm ức chế (I%) IC 50
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình "±" độ lệch chuẩn (với n=3) Những chữ cái a-e trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p0,05) về các giá trị I% của những mẫu cao theo kiểm định LSD
Tra cứu loài cùng chi là E.superbum hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH được công bố có giá trị IC50 là 67,51 μg/mL từ đó nhận thấy khả năng chống oxy hoá của E.superbum yếu hơn mẫu hạt và mẫu củ chuối Chân voi
Chứng dương được sử dụng là acid gallic cú IC50 là 5,50 àg/mL xấp xỉ với mẫu EG-S có IC50 là 4,82 μg/mL Từ đó cho thấy hoạt tính kháng oxy hoá mạnh của chuối Chân voi
3.3.2 Khả năng khử với Fe 3+
Một phương pháp khác để đánh giá khả năng chống oxy hoá ngoài phương pháp thử khả năng ức chế gốc tự do DPPH là phương pháp phân tích năng lực khử với Fe 3+ (Frap) Dựa trên khả năng cho e của chất chống oxy hoá để khử Fe 3+ về Fe 2+ Chất chống oxy hoá có năng lực khử càng mạnh thì độ hấp thu quang đo được càng lớn
Ba mẫu EG-S (hạt chuối), EG-BB (củ chuối), EG-F (nguyên trái) được tiến hành khảo sỏt ở cỏc nồng độ trong khoảng từ 1-100 àg/mL, tuỳ vào độ mạnh yếu của từng mẫu mà thực hiện ở cỏc dóy nồng độ khỏc nhau Tại nồng độ 10 àg/mL mẫu EG-S cú khả năng khử Fe 3+ tốt nhất cho độ hấp thu quang là 0,4096, sau đó là mẫu EG-BB (Abs= 0,2880) và mẫu EG-F (Abs= 0,2227) Hai mẫu EG-P (thịt chuối) và EG-PE (vỏ chuối) có hoạt tớnh yếu hơn được khảo sỏt ở cỏc nồng độ trong khoảng từ 100-1000 àg/mL Tại 100 àg/mL mẫu EG-PE cho độ hấp thu quang là 0,2264 lớn hơn so với EG-P là 0,1803 từ đó cho thấy khả năng khử Fe 3+ của mẫu EG-PE mạnh hơn mẫu EG-P
Ngoài ra, khả năng khử sắt của các mẫu cao trích còn được xác định dựa vào giá trị EC50 là giá trị cho thấy nồng độ mẫu để đạt độ hấp thu quang là 0,5 giá trị này càng nhỏ thì hoạt tớnh càng mạnh Mẫu EG-S cú hoạt tớnh mạnh nhất với giỏ trị EC50 là 13,05 àg/mL sau đú là mẫu EG-BB ( EC50= 29,38 àg/mL), mẫu EG-F (EC50= 51,73 àg/mL), mẫu EG-PE (EC50= 229,25 àg/mL) và yếu nhất là mẫu EG-P với giỏ trị EC50 là 557,14 àg/mL
Tra cứu giỏ trị EC50 của trà xanh là 9,88 àg/mL[65] từ đú nhận thấy khả năng chống oxy hoá của trà xanh mạnh hơn các mẫu cao chiết chuối Chân voi Tuy nhiên so với mẫu cao khụ của trỏi khổ qua cú EC50= 341,76 àg/mL[66] thỡ hoạt tớnh chống oxy hoỏ của các mẫu cao chuối Chân voi lại mạnh hơn đáng kể
Kết quả phân tích khả năng khử Fe 3+ của các mẫu cao trích được trình bày ở bảng 3.8 và phụ lục 6.1- 6.2e Từ bảng kết quả cho thấy, tương tự với phương pháp ức chế gốc tự do DPPH, mẫu EG-S vẫn cho thấy khả năng chống oxy hoá mạnh nhất và yếu nhất là mẫu EG-P
Chứng dương sử dụng trong phương pháp này là vitamin C- một chất kháng oxy hoá mạnh cú giỏ trị EC50 là 13,15 (àg/mL) Giỏ trị EC50 của mẫu EG-S xấp xỉ với chứng dương từ đó cho thấy mẫu có khả năng chống oxy hoá mạnh
Bảng 3.8 Kết quả phân tích khả năng khử Fe 3+ của các mẫu cao trích
(àg/ml) Độ hấp thu quang (Abs) EC 50
13,05 Độ hấp thu quang (Abs)
29,38 Độ hấp thu quang (Abs)
557,14 Độ hấp thu quang (Abs)
229,25 Độ hấp thu quang (Abs)
51,73 Độ hấp thu quang (Abs)
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình "±" độ lệch chuẩn (với n=3) Những chữ cái a, b trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p0,05)về các giá trị Abs của những mẫu cao theo kiểm định LSD
Kết quả chi tiết phần trăm ức chế biến tính albumin và IC50 của các mẫu cao được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9 Phần trăm ức chế sự biến tính albumin và IC50 của các mẫu cao trích
Phần trăm ức chế (I%) IC 50
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (với n=3) Những chữ cái từ a-e trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt đáng kể (p0,05)về các giá trị I% của những mẫu cao theo kiểm định LSD
Hoạt tính kháng sỏi
3.4.1 Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành hạt nhân tinh thể Calcium oxalate
Sỏi hình thành được phải có nhân Nhân là những dị vật (chỉ không tiêu, mảnh cao su ống dẫn lưu, mảnh kim khí), tế bào thoái hóa, tế bào mủ, xác vi khuẩn, tổ chức hoại tử, khối máu hóa giáng,…[38] các hạt nhân to dần do sự kết dính giữa các hạt nhân nhỏ để tạo thành các hạt lớn hơn
Từ kết quả đo quang ở bước sóng 620 nm cho thấy, nồng độ mẫu cao chiết càng cao thì mẫu càng đục và có độ hấp thu quang càng lớn Kết quả đo độ hấp thu được trình bày ở bảng 3.11 và hình 3.1 Dự đoán lý do độ đục ở các mẫu tăng là do hiện tượng tán sỏi Khi hạt nhân tinh thể vừa được hình thành trong dung dịch chứa mẫu cao chiết pha loãng, hạt nhân tinh thể bị phân tán thành các hạt có kích thước nhỏ hơn làm tăng độ đục của dung dịch Mẫu control được thực hiện tương tự cho kết quả có độ đục nhỏ hơn so với các dung dịch có mặt của các mẫu cao chiết[67, 68] Để chứng minh cho giả thuyết trên, thí nghiệm đo kích thước hạt có trong mẫu control và ở từng nồng độ của mẫu cao chiết được thực hiện Kết quả cho thấy mẫu control có kích thước hạt lớn nhất là 5466-5631 nm và giảm dần khi tăng nồng độ cao chiết, khi nồng độ mẫu là 10 àg/ml hạt cú kớch thước là 2620-2571 nm và ở 100 àg/ml là 2567-
2605 nm Nhận thấy khi có mặt của mẫu cao kích thước hạt giảm đáng kể, tuy nhiên lại không thay đổi nhiều khi tăng nồng độ của cao trích Chứng dương được sử dụng trong thí nghiệm này là cyston- thuốc hỗ trợ điều trị sỏi thận được thực hiện tương tự và cho
43 kết quả tương tự các mẫu cao, nhưng ở cyston khả năng làm giảm kích thước hạt khi tăng nồng độ có sự khác biệt lớn Kết quả đo kích thước hạt được trình bày ở bảng 3.10
Ngoài ra ở các nồng độ của mẫu còn được đo độ đa phân tán được trình bày ở bảng 3.10 Nhìn chung ở các nồng độ, các hạt trong dung dịch phân bố tương đối đồng đều khi có độ đa phõn tỏn đều nhỏ hơn 0,5 riờng ở nồng độ 10 àg/mL của cyston mẫu đa phõn tỏn không đồng đều khi có độ đa phân tán lên đến 0,9877-1,000
Bảng 3.10 Kết quả đo kích thước hạt và độ hấp thu của mẫu EG-S và chứng dương trong phản ứng ức chế tạo mầm
(àg/ml) Lần đo Kớch thước hạt (nm)
Mẫu 2 5631 3830 2633 Độ đa phân tán
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát khả năng ức chế sự hình thành của tinh thể Calcium oxalate của các mẫu cao trích
(àg/ml) Độ hấp thu quang
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình "±" độ lệch chuẩn (với n=3) Những chữ cái a-f trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt đáng kể (p0,05)về các giá trị Abs của những mẫu cao theo kiểm định LSD
Hình 3.1 Kết quả khảo sát khả năng ức chế sự hình thành của tinh thể Calcium oxalate của các mẫu cao trích
3.4.2 Khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của tinh thể Calcium oxalate
Sau khi mầm tinh thể đã được hình thành ổn định tiến hành cho mẫu vào dung dịch tinh thể để thực hiện khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của tinh thể Calcium oxalate
Xét độ hấp thu quang ở nồng độ 660 nm của dung dịch ở các nồng độ từ control đến 250 àg/mL nhận thấy cỏc mẫu dung dịch độ hấp thu quang tăng sau đú giảm dần, kết quả chi tiết được trình bày ở bảng 3.13 và hình 3.2 Dự đoán lý do có sự thay đổi độ hấp thu này là do hiện tượng tán sỏi thành hạt có kích thước nhỏ, cho đến khi hạt đạt kích thước siêu nhỏ thì xảy ra quá trình tiêu sỏi[38, 67] Để chứng minh cho giả thuyết đó tiến hành đo kích thước hạt của mẫu và chứng dương thu được kết quả như bảng 3.12
Từ kết quả đo kích thước hạt cho thấy mẫu EG-S có khả năng kháng sỏi tốt Kích thước hạt đo được ở mẫu control là 7703-7388 nm, ở nồng độ mẫu 10 àg/mL giảm cũn 3582-
3686 nm đến nồng độ 250 àg/mL kớch thước hạt chỉ cũn 719- 969 nm so với nước cất (612 nm) thì không chênh lệnh nhiều từ đó cho thấy khả năng tán sỏi và tiêu sỏi tốt của mẫu Chứng dương cyston cũng được đo kớch thước hạt, tuy nhiờn ở nồng độ 250 àg/mL
Nồng độ (àg/ml) Đ ộ hấp thu (A bs)
Kết quả khảo sát ức chế sự hình thành hạt nhân tinh thể
EG-S EG-BB EG-P EG-PE EG-F
45 thì đường kính hạt còn 1358- 1409 nm lớn hơn so với kích thước hạt của mẫu EG-S ở cùng nồng độ
Thí nghiệm đo độ đa phân tán cũng được thực hiện ở các nồng độ của mẫu và được trình bày ở bảng 3.12 Từ kết quả cho thấy dung dịch ở các nồng độ có độ đa phân tán tương đối thấp riờng mẫu EG-S ở nồng độ 250 àg/ml cú độ đa phõn tỏn là 0.5644-0.6682 cũn lại đều nhỏ hơn 0,5 Qua đó nhận thấy sự phân tán tương đối đồng đều của các dung dịch đem đo
Bảng 3.12 Kết quả đo kích thước hạt và độ đa phân tán của mẫu cao và chứng dương trong phản ứng ức chế phát triển tinh thể
Mẫu (àg/mL) Lần đo Kớch thước hạt (nm)
Mẫu 4 7388 3073 2107 1409 Độ đa phân tán
Bảng 3 13 Kết quả khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của tinh thể Calcium oxalate của các mẫu cao trích
(àg/mL) Độ hấp thu quang
Dữ liệu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình "±" độ lệch chuẩn (với n=3) Những chữ cái a-d trong cùng một hàng thể hiện sự khác biệt đáng kể (p0,05) về độ hấp thu quang theo kiểm định LSD
Dựa vào kết quả đo độ hấp thu ở bảng 3.13 và hình 3.2 cho thấy khả năng kháng sỏi của mẫu cao hạt (EG-S), mẫu củ (EG-BB) và nguyên trái (EG-F) mạnh diễn ra cả hai quá trỡnh là tỏn sỏi và tiờu sỏi Ở mẫu EG-S, quỏ trỡnh tỏn sỏi diễn ra ở nồng độ 10-50 àg/mL làm cho độ hấp thu tăng và ở nồng độ từ 100-250 àg/mL là quỏ trỡnh tiờu sỏi làm cho độ hấp thu giảm Giả thuyết này tương quan với kết quả đo kích thước hạt được trình bày trước đó khi nồng độ càng tăng thì kích thước hạt càng giảm Mẫu EG-BB bắt đầu cú hiện tượng tiờu sỏi ở nồng độ 10 àg/mL qua đú dự đoỏn khả năng khỏng sỏi của mẫu EG-BB tốt hơn mẫu EG-S Mẫu EG-P đến tận nồng độ 250 àg/mL mới xuất hiện hiện tượng tiêu sỏi qua đó cho thấy khả năng kháng sỏi trung bình của mẫu Trong khi đó mẫu cao thịt (EG-P), vỏ (EG-PE) chỉ xảy ra quá trình tán sỏi, cho thấy mẫu chưa đủ mạnh để làm tiêu sỏi
Hình 3.2 Kết quả khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của tinh thể Calcium oxalate của các mẫu cao trích
3.4.3 Khảo sát khả năng làm giảm trọng lượng sỏi thận ở người
Từ kết quả cho thấy cả năm mẫu cao đều có khả năng làm tan sỏi người Tuy nhiên khả năng làm tan sỏi ở các mẫu có sự khác biệt Từ kết quả trình bày phần trăm tan sỏi người được trình bày ở bảng 3.14 cho thấy Nhìn chung các mẫu đều có % giảm sỏi tăng khi tăng nồng độ thử Trong thời giam đầu từ ngày 1 đến ngày 5 phần trăm tan sỏi của các
Kết quả khảo sát ức chế sự phát triển của tinh thể
EG-S EG-BB EG-P EG-PE EG-F
47 mẫu ở các nồng độ tăng dần, riêng mẫu EG-P (thịt) trong khoảng nồng độ từ 10-150 àg/mL trong khoảng thời gian đầu khối lượng sỏi gần như khụng giảm, ở nồng độ
