Mục đích nghiên cứu
Mục đính nghiêm cứu của luận văn gồm:
- Khảo sát thành phần hóa học của cao Et40A điều chế từ rễ cây Dương đầu – Olax imbricata
- Xác định cấu trúc hóa học hợp chất tinh khiết được phân lập từ cao phân đoạn
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu
- Đề tài nghiên cứu đã góp phần tìm hiểu thông tin về thành phần hoá học của cây Dương đầu Ý nghĩa thực tiễn:
Đề tài luận văn nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng cho các nghiên cứu về việc phân lập các hợp chất thiên nhiên từ cây Dương đầu, góp phần vào hiểu biết sâu sắc hơn về tiềm năng dược lý của loài cây này.
Đề tài luận văn tập trung vào việc khám phá tiềm năng phân lập nhiều hợp chất mới từ các loại cao chiết chế biến từ cây Dương đầu, mở ra hướng nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực dược liệu.
Nghiên cứu về cây Dương đầu sẽ tạo nền tảng cho việc phát triển các sản phẩm chiết xuất từ thực vật, mang lại hiệu quả chữa bệnh trong tương lai Việc khai thác tiềm năng của cây Dương đầu không chỉ góp phần vào y học cổ truyền mà còn mở ra hướng đi mới cho ngành dược phẩm hiện đại Sự phát triển này hứa hẹn sẽ mang lại những giải pháp điều trị hiệu quả và an toàn cho người bệnh.
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Dương đầu - Olax imbricata Roxb
Họ Dương đầu (Olacaceae) phân bố rộng rãi trên toàn cầu, chủ yếu ở các khu rừng nhiệt đới, ôn đới ấm và vùng xavan, với khoảng 25 chi và 250 loài Chi Olax có khoảng 40 loài, chủ yếu tập trung ở rừng nhiệt đới Châu Á như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Myanmar, Malaysia, Philippines, Việt Nam, Ấn Độ, Đài Loan và Sri Lanka Ngoài ra, chúng cũng xuất hiện ở một số nước Châu Phi như Nigeria, Sierra Leone, Ghana, Senegal, Zaire và một phần ở Nam Phi Tại Việt Nam, cây dương đầu Olax imbricata Roxb được tìm thấy ở vùng núi Đakrông (khu bảo tồn thiên nhiên Đakrông) tỉnh Quảng Trị, và phân bố ở các tỉnh Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng và Phú Yên.
Cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb.) thuộc họ Dương đầu (Olacaceae), được mô tả lần đầu tiên vào năm 1820 bởi William Roxburgh Cây còn được biết đến với các tên gọi khác như Dương đầu kết lợp, cây cát lộ, và dây mao trật Phân loại khoa học của cây Dương đầu được trình bày trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1 Phân loại cây Dương đầu theo khoa học
Phân loại Tên khoa học Tên Việt Nam
Loài Olax imbricata Dương đầu kết lợp
Olax là một chi cây thường xanh, cao từ 2 đến 6 mét, thuộc loại cây bụi đứng với thân gỗ có màu nâu và cành non màu xám Loài cây này thường thấy ở dạng dây leo và phân bố rộng rãi trong các khu rừng nhiệt đới thường xanh Hình ảnh cây Dương đầu được minh họa trong Hình 1.1 dưới đây.
Hình 1.1 Hình ảnh cây Dương đầu (Olax imbricata) (Nguồn Internet)
Cây Dương đầu Olax imbricata có đặc điểm lá xếp đối so le, lá hình trứng hoặc elip thuôn dài, chóp tròn, dài từ 5 – 10 cm Hoa mọc thành chùm nhỏ, có ba nhị ở kẽ lá hoặc đầu cành, màu trắng hoặc hơi vàng, với cánh hoa dài 8 – 10 mm và kích thước bông hoa từ 1,5 – 2,5 cm Quả của cây có hình cầu hoặc dạng trứng ngược, được bao bởi đài hoa cùng lớn lên với quả Thời gian cây ra hoa từ tháng 4 đến tháng 10.
2] Hình ảnh các bộ phận của cây Dương đầu được trình bày trong Hình 1.2 dưới đây.
Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Dương đầu
Các loài cây thuộc chi Olax trong họ Olacaceae được sử dụng rộng rãi trên toàn cầu để chữa bệnh và bảo vệ sức khỏe Chúng có tác dụng chữa trị các vết loét, bệnh ngoài da, chống viêm, kháng khuẩn và chống nhiễm trùng Ngoài ra, những loài cây này còn được dùng để phòng ngừa một số bệnh phụ khoa và hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường.
Nghiên cứu về hoá thực vật của loài Olax imbricata đã chỉ ra sự hiện diện của nhiều nhóm hợp chất quan trọng như polyphenolic, flavonoid, glycoside, saponin, tannin, alkaloid và các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hoá, kháng khuẩn Tuy nhiên, tài liệu nghiên cứu về cây Dương đầu vẫn còn hạn chế, vì vậy phần tổng quan này sẽ cung cấp thông tin chi tiết hơn về các thành phần hoá học đã được công bố trong chi Olax, bao gồm các nhóm hợp chất tự nhiên.
In 1981, researchers Forgacs P and Provost J isolated a triterpenoid saponin compound named olaxoside from the methanol extract of the leaves, roots, and bark of the Olax andronensis, Olax glabriflora, and Olax puttacorum species The chemical structure of olaxoside is identified as (3β)-28-(β-D-glucopyranosyloxy)-28-oxoolean-12-en-3-yl-(1→4)-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-glucopyranosiduronic acid.
Năm 2011, M I Sule và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học của cao chiết acetone từ lá cây Olax mannii Oliv, phát hiện sự hiện diện của các hợp chất như coumarin, steroid, triterpenoid, saponin, acid béo, tannin, tinh dầu dễ bay hơi và flavonoid Nhóm tác giả đã phân lập thành công hai hợp chất triterpenoid là glutinol và rhoiptelenol.
Năm 2018, David Pertuit và cộng sự đã phân lập bốn triterpenoid saponin từ cao chiết methanol 80% của rễ và vỏ cây Olax obtusifolia Các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp 1D NMR, 2D NMR và MS, bao gồm: 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic acid, 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester, và 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-.
D-glucuronopyranosyloleanolic acid (6) và 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D- glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucuronopyranosyloleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (7) [6]
Vào năm 2019, nhóm nghiên cứu của Huong T M Nguyen đã phân lập một sesquiterpenoid khung tropolone từ rễ cây Olax imbricata, cụ thể là hợp chất (2R)-6-hydroxy-2-(1-hydroxy-1-methyl)ethyl-9-methylbicyclo[5.4.0]undeca-5,8,10(11)-triene-7-one (8) Ngoài ra, nhóm cũng đã phát hiện ba dẫn xuất 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, bao gồm (2R)-6-hydroxy-2-(1-hydroxy-1-methyl)ethyl-8-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene (9), (2R,11S)-(1,2-dihydroxy-1-methyl)ethyl-8-methyl-5-O-β-D-glucopyranosyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene (10) và (2R,11R)-(1,2-dihydroxy-1-methyl)ethyl-8-methyl-5-O-β-D-glucopyranosyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene (11).
Nhóm nghiên cứu của Vo Thi Nga đã tiếp tục công trình phân lập cao chiết xuất methanol và thành công trong việc phân lập ba hợp chất triterpenoid glycoside, bao gồm: 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-6′-O-ethyl-β-D-glucuronyl oleanolic acid, spergulacin, và oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranoside.
Mavundza và đồng nghiệp ở Nam Phi đã phân lập ra được ba acid béo từ cao chiết dichloromethane của vỏ cây Olax dissitiflora, gồm santalbic acid (15), exocarpic acid
(16), octadec-9,11-diynoic acid (17) vào năm 2016 [9]
Năm 2018, Vo Thi Nga và cộng sự đã phân lập ba hợp chất béo từ cao chiết ethyl acetate của rễ cây Olax imbricata, bao gồm (E)-henicos-7-en-9-ynoic acid, (E)-henicos-7-en-9-ynoylglycerol và 7,8,9,10-tetrahydroxyhexadeca-4,10-diynoic acid.
Năm 2020, nhóm nghiên cứu dược học do R Majumder dẫn đầu đã thực hiện phân tích định tính bằng phương pháp GC-MS, phát hiện sự hiện diện của hợp chất phytol trong cao chiết methanol từ lá cây Olax psittacorum.
Năm 2015, F B.C Okoye và nhóm nghiên cứu của mình đã phân lập thành công 17 flavonoid glycoside là kaempferol 3-O-α-L-arabinofuranosyl-7-O-α-L- rhamnopyranoside (22), kaempferol 3,7-O-α-L-dirhamnopyranoside (23), kaempferol 3-
The study identifies various flavonoid glycosides derived from the leaves of Olax mannii, specifically focusing on compounds such as quercetin 3,7-O-α-L-dirhamnopyranoside, kaempferol derivatives, and morin glycosides These compounds include kaempferol 7-O-α-L-rhamnopyranoside, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside, and quercetin-3-O-β-galactopyranoside, among others The extraction was performed using ethyl acetate and n-butanol fractions from a methanol extract of the plant, highlighting the rich phytochemical profile of Olax mannii.
Năm 2016, F B.C Okoye và cộng sự đã nghiên cứu chiết n-butanol từ methanol của lá cây Olax mannii, trong đó họ đã phân lập được hai hợp chất kaempferol triglycoside mới: kaempferol 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→2)-α-L-arabinofuranoside]-7-O-α-L-rhamnopyranoside và kaempferol 3-O-[α-L-apiofuranosyl(1→2)β-D-galactopyranoside]-7-O-α-L-rhamnopyranoside.
Vào năm 2015, nhóm nghiên cứu của S T M Huynh đã thành công trong việc phân lập và xác định cấu trúc hai hợp chất phenolic, bao gồm 1-O-(4-hydroxy-2,6-dimethoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranose (41) và 1-O-(4-hydroxy-2-methoxyphenyl)-6-O-(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl)-β-D-glucopyranose (42), từ cao chiết methanol của rễ cây Olax imbriata.
Năm 2018, nhóm nghiên cứu của S T M Huynh đã tiếp tục nghiên cứu trên rễ cây Olax imbriata và phân lập được ba hợp chất phenolic glycoside, bao gồm 1-(3,4-dihydroxyphenyl)-8-(4-hydroxy-3-O-β-D-glucopyranosylphenyl)oct-5-ol-4-one và (4E)-1-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-(3-hydroxy-4-O-β-D-glucopyranosylphenyl)hept-4-ene-6-ol-3-one.
In 2023, Bienvenu Tsakem and colleagues successfully isolated a gallocatechin glycoside, specifically (2R,3S) 4'-O-methyl-gallocatechin-3-O-α-ʟ-rhamnopyranoside, along with two dihydromyricetin glycosides, (2R,3R) 4'-O-methyl-dihydromyricetin-3-O-α-ʟ-rhamnopyranoside and (2R,3S) 4'-O-methyl-dihydromyricetin-3-O-α-ʟ-rhamnopyranoside, from the n-butanol soluble fraction of the bark of Olax subscorpioidea Oliv.
1.2.4 Nhóm alkaloid và các hợp chất có chứa nitrogen
Nhóm nghiên cứu của P P Thumfort đã sử dụng các phương pháp phân tích HPLC, GC-MS và NMR để định danh một hợp chất tự nhiên mới, được gọi là S-ethenylcysteine.
(49) từ cao chiết ethanol của rễ cây Olax phyllanthi vào năm 1993 [17]
Công dụng và dược tính các loài thuộc chi Olax
1.3.1 Công dụng trong dân gian Ở miền tây Châu Phi, vỏ và rễ cây Olax viridis được nghiền thành bột dùng để chữa các vết loét, chống viêm nhiễm và điều trị các bệnh hoa liễu và nhiễm trùng ngoài da [19] Ở Bắc Nigerin, rễ cây Olax viridis được sử dụng trong điều trị bệnh mất ngủ, giúp giải nhiệt, chữa bệnh tiêu chảy, điều trị đau đầu và sốt, cành của cây còn được dùng chữa đau răng; vỏ cây được áp dụng cho các vết loét và là một phương thuốc cho bệnh sốt thương hàn [1]
Cây Dương đầu Olax imbricata nổi bật với các tác dụng như kháng oxi hóa, chống viêm, kháng khuẩn và phòng ngừa nhiễm trùng, đặc biệt là trong việc hỗ trợ điều trị một số bệnh phụ khoa Tại miền Bắc Thái Lan, cộng đồng người Mien (Yao) đã sử dụng Olax imbricata như một loại thảo dược trong các nghi thức tắm sau sinh.
Loài Olax gambecola ở thung lũng Nyong, Cameroon được người dân địa phương sử dụng để chưa bệnh u nang buồng trứng và sốt rét [20]
Trong các bộ lạc ở quận Theni, Western Ghats, Nam Ấn Độ, lá của loài Olax scandens được sử dụng buộc lên trán để trị bệnh đau đầu Người Munda, một trong những thổ dân bản địa ở Ấn Độ, nấu chín lá Olax scandens như một loại thảo mộc và quả của nó có thể ăn được Tại quận Chin, Myanmar, Olax scandens được sử dụng như một phương thuốc truyền thống để lọc máu và điều trị các bệnh như sốt, đậu nhỏ, sởi, bệnh đường ruột và gan.
PGS TS Nguyễn Thị Hoài đã tiến hành nghiên cứu về bộ dữ liệu cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều, tập trung vào tác dụng chống ung thư Một trong những phát hiện quan trọng là cây Dương đầu Olax imbricata, có tiềm năng trong việc hỗ trợ điều trị ung thư.
Roxb được dùng theo kinh nghiệm người dân tộc Pako dùng lá và cành nhỏ sắc uống chữa khối u ở ngực sưng đau, đau dạ dày [24]
1.3.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học
1.3.2.1 Hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn
Nghiên cứu của Forgacs P và Provost J (1981) về chiết xuất methanol từ lá, rễ và vỏ cây của các loài Olax andronensis, Olax glabriflora và Olax puttacorum cho thấy chúng có tác dụng kháng viêm mạnh mẽ và hiệu quả nhuận tràng.
Nghiên cứu của Ajali U và Okoye FBC về chiết xuất vỏ và rễ cây Olax viridis đã chỉ ra rằng loài này có tiềm năng kháng viêm và kháng khuẩn đáng kể.
Năm 2014, Olusegun A.A và các cộng sự đã nghiên cứu tác nhân chống nhiễm trùng từ chiết xuất lá cây Olax Subscorpioidea trên chuột Kết quả cho thấy chiết xuất này có khả năng ức chế đáng kể tần suất và thời gian cơn đau do thần kinh và viêm nhiễm, chứng minh rằng Olax Subscorpioidea có tác dụng giảm đau mạnh mẽ, cả qua trung gian và ngoại vi, từ đó khẳng định giá trị của nó trong việc kiểm soát cơn đau.
Nghiên cứu năm 2016 của Temidayo D Popoola và cộng sự đã khảo sát ba loại cây bản địa, gồm Garcinia kola Heckel (vỏ, thân), Uvaria chamae P Beauv (rễ) và Olax subscorpioidea Oliv (rễ), với mục đích đánh giá khả năng giảm đau và chống viêm trên mô hình động vật Kết quả cho thấy Garcinia kola có tiềm năng trong việc giảm đau và chống viêm hiệu quả.
Uvaria chamae không có tác dụng đáng kể trong việc giảm đau do formalin, trong khi Olax subscorpioidea cho thấy khả năng ức chế hiệu quả ở cả hai giai đoạn của thử nghiệm Tương tự, trong mô hình phù nề tai do xylene, Garcinia kola và Uvaria chamae không cho thấy tác dụng ức chế đáng kể, nhưng Olax subscorpioidea đã làm giảm tình trạng phù nề một cách rõ rệt.
Năm 2016, Aniel Kumar Owk và Mutyala Naidu Lagudu đã tiến hành nghiên cứu về hoạt tính kháng vi khuẩn và các hoạt chất có trong rễ cây Olax scandens Kết quả nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ rễ cây này có tiềm năng trong việc điều trị các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc như Staphylococcus và Pseudomonas.
Escherichia và một số vi khuẩn và nấm gây bệnh khác [29]
Năm 2017, Saidi Odoma và cộng sự đã nghiên cứu cơ chế dược lý của dịch chiết butanol từ lá cây Olax subscorpioidea trong việc giảm đau và chống viêm, sử dụng mô hình đau do acetic acid Mô hình thử nghiệm này, do acetic acid gây ra, là một phương pháp cổ điển để nghiên cứu đau và viêm hóa học Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng có sự tham gia của các con đường opioidergic, serotonergic và nitric oxide trong cơ chế tác động của dịch chiết này.
L-arginine trong tác dụng giảm đau của phần dịch chiết butanol lá cây Olax subscorpioidea [30]
Nghiên cứu của R Majumder và các cộng sự năm 2020 đã chỉ ra rằng dịch chiết từ loài Olax psittacorum có khả năng kháng viêm, giảm đau và chống loét trong niêm mạc miệng, đồng thời thể hiện đặc tính ức chế TNF-α trong mô hình tế bào RAW 264.7.
Nghiên cứu năm 2020 của Mujeeb Anzar Abdul và cộng sự về tổng hợp vật liệu nano bạc đồng (Ag – Cu NCs) từ cao chiết lá cây Olax scandens cho thấy tiềm năng kháng khuẩn vượt trội so với các hạt nano bạc đơn kim, với hoạt tính chống vi khuẩn cao hơn đáng kể đối với các chủng vi sinh nhạy cảm và kháng thuốc.
1.3.2.2 Hoạt tính kháng oxi hóa
Chiết xuất metanol thô từ loài Olax nana (ON-Cr) đã được phân tích định tính và xác định dấu vân tay bằng HPLC-DAD Tiềm năng chống oxy hóa của ON-Cr được đánh giá thông qua các phương pháp như DPPH, ABTS và thử nghiệm bắt gốc tự do hydro peroxide (H2O2), theo nghiên cứu của Muhammad Ovais và cộng sự năm 2018.
Năm 2019, R Majumder và nhóm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxi hóa của dịch chiết nước từ thân và quả loài Olax psittacorum Kết quả cho thấy dịch chiết này có tiềm năng đáng kể trong việc chống lại vi khuẩn và các gốc tự do, chứng minh hiệu quả của loài Olax psittacorum trong việc bảo vệ sức khỏe.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
Rễ Dương đầu, thuộc loài Olax imbricata Roxb (họ Olacaceae), được thu hái tại huyện Đông Hòa, tỉnh Phú Yên, Việt Nam vào tháng 8 năm 2020 Việc xác định loài này được thực hiện bởi ông Hoàng Xuân Lâm từ Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Dược liệu Hữu cơ Miền Trung Mẫu thực vật được ký hiệu UTE-A002 và hiện đang được lưu giữ tại Khoa Công nghệ Hoá học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh.
Rễ cây sau khi thu hái cần được xử lý bằng cách loại bỏ các phần sâu bệnh, rửa sạch và phơi ráo Tiếp theo, rễ sẽ được chặt nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ 60 – 70 độ C Cuối cùng, rễ được xay nhuyễn thành bột, sử dụng làm nguyên liệu cho nghiên cứu.
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) silica gel pha thường: TLC Silica gel 60 F 254 (MERCK, Đức)
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) silica gel pha đảo: TLC Silica gel 60 RP–18 F254 S (200μm) (MERCK, Đức)
Sắc ký cột (SKC) silicagel pha thường: Silica gel 60 (0,040–0,063 mm); (MERCK, Đức)
Sắc ký cột (SKC) silicagel pha đảo: Silica gel pha đảo RP-18 60 (0,040-0,063 mm); (MERCK, Đức)
Thuốc thử hiện vết trên SKLM: dung dịch vanilin/H 2 SO 4 10%, pha trong ethanol
Nước cất hai lần khử ion
Chloroform (CHCl 3 ) 99,99% (SOL PURE, Việt Nam)
Methanol (MeOH) 99,99% (SOL PURE, Việt Nam)
Acid sulfuric (H2SO4) (CHEMSOL, Việt Nam)
Acid formic (HCOOH) (CHEMSOL, Việt Nam)
Ethanol (EtOH) (CHEMSOL, Việt Nam)
– Dung môi dành cho hệ thống HPLC:
Cân kỹ thuật và cân phân tích (Precisa, Thuỵ Sỹ)
Tủ hút (Esco, Nhật Bản)
Máy cô quay (Yamamoto, Nhật Bản)
Buồng soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm (Pháp)
Bể rung siêu âm (Hettich, Đức)
Cột sắc ký các kích cỡ
Các dụng cụ thủy tinh khác (Isolab, Đức)
Máy cộng hưởng từ hạt nhân AVANCE III HD 1 H NMR (500 MHz) và 13 C NMR
(125 MHz), (BIOSPIN, BRUKER, Thụy Sỹ) Thực hiện tại Phòng phân tích Trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu được trình bày trong Hình 2.1 dưới đây:
Thực nghiệm
2.3.1 Điều chế cao tổng và các cao thành phần
Nhóm khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Thực phẩm khoá 17 đã thực hiện việc điều chế cao tổng và các cao thành phần, như được trình bày dưới đây.
Rễ cây Dương đầu (Olax imbricata) nặng 50 kg sau khi thu hái được làm sạch và sấy khô ở nhiệt độ 60 – 70°C, sau đó xay thành bột Bột nguyên liệu 7 kg được chiết xuất bằng phương pháp trích nóng với ethanol trong hệ thống đun hồi lưu.
Quá trình gom dịch trích và thu hồi dung môi dưới áp suất thấp bắt đầu với việc thu được 1,5 kg cao thô EtOH Tiếp theo, cao EtOH thô được hòa tan trong n-hexane, từ đó thu hồi được 600 g cao n-hexane Phần không tan trong n-hexane được hòa tan trong MeOH, và sau khi loại bỏ dung môi, thu được 750 g cao MeOH Sơ đồ quy trình điều chế cao tổng và các cao thành phần được trình bày trong Hình 2.2.
Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao tổng và cao thành phần
2.3.2 Điều chế các cao phân đoạn từ cao Methanol
Các thành viên trong nhóm khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ Hóa học K18 đã tiến hành điều chế các cao phân đoạn từ cao thô MeOH Quá trình tách phân đoạn được thực hiện trên cột Diaion HP-20 với 750 g cao MeOH, nhằm tạo ra các phân đoạn đơn giản hơn.
Với các hệ dung môi EtOH-H2O có độ phân cực giảm dần với các tỉ lệ lần lượt là (2:8)
→ (4:6) → (6:4) → (8:2) → (96:4) rồi xả cột bằng dung môi acetone Kết quả thu được
Bài viết đề cập đến năm phân đoạn chính: Et20, Et40, Et60, Et80, Et96 và Ace Sơ đồ quy trình điều chế các cao phân đoạn từ cao MeOH được minh họa trong Hình 2.3.
Hình 2.3 Sơ đồ quy trình điều chế các cao phân đoạn từ cao MeOH
2.3.3 Khảo sát phân đoạn Et40
Từ phân đoạn Et40 (65,33 g) điều chế từ cao MeOH như trình bày trên tiến hành SKC silica gel CHCl3 – MeOH (60:40 → 0:100) thu được 3 phân đoạn là Et40.1 (11,52 g), Et40.2 (50,43 g) và Et40.3 (1,35 g)
Từ kết quả SKLM, phân đoạn Et40.2 (50,43 g) đã được chọn để phân tách bằng SKC silica gel với dung môi CHCl3 – MeOH theo tỷ lệ 95:5 đến 0:100 Kết quả phân tách thu được sáu phân đoạn từ Et40.2.1 đến Et40.2.6 với khối lượng lần lượt là 1,45 g, 5,54 g, 2,83 g, 8,57 g, 9,52 g và 12,69 g.
Phân đoạn Et40.2.6 (12,69 g) được tách bằng SKC silica gel sử dụng hệ dung môi Chloroform:Methanol:Nước:acid formic (C:MeOH:W:Af) với độ phân cực tăng dần từ 9:3:0,5:0,2 đến 6:3:0,5:0,1, cho kết quả 12 phân đoạn Khóa luận tốt nghiệp này tập trung khảo sát thành phần hóa học của phân đoạn Et40.2.6.5, được ký hiệu là Et40A (2,52 g) Quy trình khảo sát phân đoạn Et40 được thể hiện trong Hình 2.4.
Hình 2.4 Sơ đồ quy trình khảo sát phân đoạn Et40
2.3.4 Thực nghiệm khảo sát phân đoạn Et40A
Khảo sát phân đoạn Et40A đã được thực hiện bằng các kỹ thuật sắc ký, bao gồm SKLM, SKC silica gel pha đảo RP-18, SKC silica gel pha thường và sắc ký lọc gel Sephadex LH-20.
2.3.4.1 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là kỹ thuật phân tích định tính, giúp tách các chất trong hỗn hợp và xác định sơ bộ số lượng chất Kỹ thuật này cũng hỗ trợ tìm hệ dung môi phù hợp trước khi thực hiện sắc ký cột để phân lập hợp chất Ngoài ra, SKLM còn được sử dụng để theo dõi quá trình triển khai sắc ký cột.
Trong khóa luận tốt nghiệp này, chúng tôi sử dụng SKLM silica gel pha thường hoặc silica gel pha đảo RP-18 tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể SKLM silica gel pha thường tương tác mạnh với các chất phân cực nhờ các nhóm hydroxyl trên bề mặt silan, giữ chúng lại và khiến các chất có độ phân cực yếu hơn di chuyển nhanh hơn với Rf lớn hơn Ngược lại, SKLM silica gel pha đảo RP-18, với pha tĩnh là silan có các nhóm hydroxyl thay thế bằng mạch hydrocarbon dài 18 carbon, tương tác mạnh với các chất kém phân cực, giữ chúng lại trong pha tĩnh, do đó các chất có độ phân cực cao hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và có Rf lớn hơn.
Triển khai SKLM bắt đầu bằng việc hòa tan mẫu thử trong một lượng dung môi thích hợp Sau đó, sử dụng ống vi quản để chấm mẫu lên vạch xuất phát trên tấm SKLM và tiến hành giải ly trong cốc với hệ dung môi đã chọn Trong quá trình này, hơi dung môi di chuyển qua tấm SKLM, khiến các cấu tử trong mẫu thử di chuyển với tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào ái lực của chúng với dung môi và chất hấp phụ trên tấm SKLM.
Để hiện vết trên SKLM, sau khi giải ly, tấm SKLM cần được làm khô dung môi và soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm để ghi nhận các vết hấp thụ ánh sáng tử ngoại Tiếp theo, tấm SKLM được hiện vết bằng cách nhúng vào dung dịch thuốc thử vanilin/H2SO4 10% pha trong ethanol và sau đó được hơ nóng.
Trong khóa luận tốt nghiệp này, hệ dung môi phổ biến cho SKLM silica gel thường là C:MeOH:W:Af, trong khi pha đảo sử dụng MeOH:W có thể có hoặc không có acid formic (Af) Tỷ lệ các thành phần trong các hệ dung môi này được điều chỉnh tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể.
2.3.4.2 Kỹ thuật sắc ký cột
Sắc ký cột là phương pháp hiệu quả để phân lập các hợp chất hóa học từ hỗn hợp, thông qua việc di chuyển của chúng qua cột với tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào khả năng hấp phụ với chất hấp phụ và dung môi rửa giải Quy trình thực hiện kỹ thuật này bao gồm hai bước chính: nhồi cột và cân bằng cột.
Để thực hiện sắc ký cột silica gel pha thường, trước tiên cần nạp mẫu vào cột, sau đó triển khai cột với hệ dung môi phù hợp Tiếp theo, hứng các phân đoạn ra khỏi cột và theo dõi tiến trình triển khai cột Cuối cùng, gom các phân đoạn giống nhau bằng kỹ thuật SKLM.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát thành phần hoá học phân đoạn Et40A
Việc khảo sát phân đoạn Et40A được thực hiện qua nhiều giai đoạn, với mỗi giai đoạn thực hiện theo quy trình cơ bản như sau:
Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của phân đoạn được thực hiện thông qua kỹ thuật SKLM với silica gel pha thường và silica gel pha đảo RP-18, sử dụng các hệ dung môi khác nhau Mục tiêu của nghiên cứu là xác định điều kiện tối ưu cho việc triển khai SKC.
- Tiến hành triển khai sắc ký cột với điều kiện đã chọn qua khảo sát
- Thu gom các phân đoạn sau khi triển khai SKC dựa vào SKLM
- Chọn lựa phân đoạn tiềm năng để tiến hành tiếp tục khảo sát
Quy trình cơ bản này được thực hiện liên tục cho đến khi đạt được hợp chất tinh sạch Quá trình khảo sát thành phần hóa học của phân đoạn Et40A diễn ra qua 09 giai đoạn (1)-(9), như được thể hiện trong Hình 3.1 Dưới đây là kết quả khảo sát phân đoạn Et40A qua từng giai đoạn.
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình khảo sát phân đoạn Et40A
3.1.1 Khảo sát phân đoạn Et40A
Phân đoạn Et40A là hỗn hợp có độ phân cực cao, do đó, khi khảo sát sắc ký lớp mỏng (SKLM), cần sử dụng hệ dung môi kết hợp giữa một dung môi có độ phân cực trung bình với methanol (MeOH) và nước Theo kinh nghiệm, việc bổ sung dung dịch acid formic trong quá trình khảo sát giúp cải thiện độ sắc nét và tách biệt của vết Kết quả khảo sát SKLM của phân đoạn Et40A được trình bày trong Hình 3.2.
RP1 NP1 MeOH:WAf C:MeOH:W:Af
Hình 3.2 Kết quả khảo sát SKLM phân đoạn Et40A
Kết quả khảo sát SKLM cho thấy rằng với hệ dung môi C:MeOH:W:Af (6:2:0,5) (NP1), các vết trên bản SKLM silica gel pha thường xuất hiện gần nhau Ngược lại, với bản SKLM silica gel pha đảo RP-18 và hệ dung môi MeOH:WAf (8:2) (RP1), các vết hiện lên rõ ràng hơn.
Rf của từng vết có khoảng cách tương đối lớn, do đó quyết định triển khai phân đoạn Et40A sử dụng SKC silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH:WAf theo tỷ lệ 8:2.
Mặc dù đã triển khai SKC silica gel pha đảo RP-18, chi phí cho SKLM pha đảo vẫn cao Do đó, cần theo dõi tiến trình rửa giải SKC bằng SKLM pha thường với hệ dung môi C:MeOH:W:Af (6:2:0,5).
Kết quả triển khai SKC trên phân đoạn Et40A cho thấy đã thu được 07 phân đoạn nhỏ, với hình ảnh kết quả SKLM được trình bày trong Hình 3.3 Phân đoạn 1, 2, 3 có các vết giống nhau được gom thành phân đoạn Et40A.1, trong khi phân đoạn 5, 6, 7 cũng có các vết tương tự và được hợp nhất thành phân đoạn Et40A.3 Tổng cộng, SKC trên phân đoạn Et40A đã thu được ba phân đoạn chính: Et40A.1 (0,6 g), Et40A.2 (0,0182 g) và Et40A.3 (1,1 g).
Kết quả triển khai sắc ký cột phân đoạn Et40A được trình bày trong Hình 3.3
Hình 3.3 Kết quả SKC silica gel RP-18 phân đoạn Et40A
Nhận thấy phân đoạn Et40A.3 có khối lượng (1,1 g) và kết quả hiện vết trên SKLM rõ ràng, khả thi nên chọn phân đoạn này để tiếp tục khảo sát
3.1.2 Khảo sát phân đoạn Et40A.3
Thực hiện SKLM khảo sát phân đoạn Et40A.3 bằng SKLM silica gel pha thường và silica gel pha đảo (Hình 3.4)
Hình 3.4 Kết quả khảo sát SKLM phân đoạn Et40A.3
Kết quả khảo sát cho thấy rằng hệ dung môi MeOH:WAf với tỷ lệ (9:1) (RP2.1) tạo ra khoảng cách giữa các vết nhỏ, trong khi hệ dung môi MeOH:WAf với tỷ lệ (8:2) (RP2.2) cho khoảng cách giữa các vết rộng hơn Các vết xuất hiện ở nửa dưới bản, cho thấy rằng hệ dung môi này là lựa chọn phù hợp.
Thực hiện SKC silica gel pha đảo RP-18 phân đoạn Et40A.3 (1,1 g) với hệ dung môi MeOH:WAf (85:15)
Theo dõi tiến trình SKC bằng hệ dung môi C:MeOH:W:Af (6:3:0,5:0,1) (NP2.2) đã thu được 7 phân đoạn từ Et40A.3.1 đến Et40A.3.7, với khối lượng các phân đoạn lần lượt là 0,0298 g, 0,0576 g, 0,7564 g, 0,1537 g, 0,0789 g, 0,071 g, và 0,0431 g (Hình 3.5).
Kết quả từ SKLM cho thấy phân đoạn Et40A.3.2 có sự hiện diện của một vết, chứng tỏ đây là phân đoạn tiềm năng Đồng thời, phân đoạn Et40A.3.3 cũng được xác định là tiềm năng để tiếp tục khảo sát Qua SKLM pha đảo với hệ dung môi MeOH:WAf (85:15) (RP2.3), SKC đã phân tách hiệu quả, cho thấy việc tách được 2 phân đoạn đơn giản hơn, như thể hiện trong SKLM (RP2.3).
Hình 3.5 Kết quả SKC phân đoạn Et40A.3
3.1.3 Khảo sát phân đoạn Et40A.3.2
Mẫu phân đoạn Et40A.3.2 chỉ có một vết duy nhất trên SKLM và hòa tan tốt trong dung môi MeOH, do đó, hệ dung môi 100% MeOH được lựa chọn để thực hiện sắc ký lọc gel (sephadex LH-20) nhằm tinh sạch hợp chất.
Theo dõi cột sắc ký bằng SKLM với hệ dung môi C:MeOH:WAf (6:3:0,5) cho thấy sự hiện diện của một chất có Rf và màu sắc giống nhau, thu được mẫu HK6 (39 mg) Tiếp theo, tiến hành SKLM với silica gel pha đảo RP-18 và silica gel pha thường, sử dụng nhiều hệ dung môi có độ phân cực khác nhau như ACN:WAf (1:1) và các tỉ lệ khác của C:MeOH:WAf, để đảm bảo hợp chất phân tách là sạch Kết quả cho thấy tất cả các hệ dung môi khảo sát đều cho một vết tại mẫu HK6, bước đầu xác định được hợp chất đã tinh chế và tiến hành đo phổ.
Hình 3.6 Kết quả SKC sephadex LH-20 phân đoạn Et40A.3.2
3.1.4 Khảo sát phân đoạn Et40A.3.3
Kết quả khảo sát từ phân đoạn Et40A.3.3 cho thấy hệ dung môi C:MeOH:WAf (6:3:0,5) (NP4) đã tách các vết một cách rõ ràng, với khoảng cách Rf giữa các vết tương đối xa (Hình 3.7).
Hình 3.7 Kết quả khảo sát SKLM phân đoạn Et40A.3.3
Tiến hành SKC silica gel pha thường phân đoạn Et40A.3 với hệ dung môi C:MeOH:WAf
(6:3:0,5) (NP4) để Kết quả phân tách thu được ba phân đoạn là Me.3.1 (0,4802 g), Me.3.2 (0,2106 g) và Me.3.3 (0,0831 g)
Theo dõi SKC bằng SKLM với hệ dung môi (6:3:0,5) C:MeOH:WAf cho thấy phân đoạn Me3.1 (0,4802 g) có tiềm năng cao để tiếp tục khảo sát Kết quả phân tách SKC silica gel pha thường của phân đoạn Et40A.3.3 được trình bày trong Hình 3.8.
Hình 3.8 Kết quả SKC silica gel pha thường giai đoạn 4
3.1.5 Khảo sát phân đoạn Me3.1
Kết quả từ SKC silica gel pha thường phân đoạn Et40A.3.3 cho thấy rằng hệ dung môi C:MeOH:WAf (6:3:0,5) giúp tách phân đoạn Me3.1 một cách khả thi Mục tiêu là tách và lấy vết chính ở phía dưới trong mẫu phân đoạn Me3.1.
Tiến SKC phân đoạn Me3.1 bằng SKC silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là (6:3:0,5) C:MeOH:WAf