(Khóa luận tốt nghiệp) Đóng Góp Vào Việc Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Hoạt Tính Sinh Học Của Cây Lan Kim Tuyến (Anoectochilus Roxburghii)

Ngày nay, các hợp chất có nguồn góc thiên nhiên được dùng làm thuốc chữa bệnh đã và đang được các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới quan tâm do ít tính độc và khả năng dung

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS LÊ MINH HÀ

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm

ơn tới:

-PGS.TS Lê Minh Hà, Phòng Hóa dược, Viện Hóa học các hợp chất

thiên nhiên — Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Người đã giao

để tài và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em

hoàn thành đề tài này

- Th.S Ngọ Thị Phương, Phòng Hóa dược, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên —- Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Người đã

cùng em trong suốt quá trình làm thực nghiệm, chỉ bảo hướng dẫn tận tình, giúp đỡ và cho em những kỹ năng làm thực nghiệm quý báu

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Hóa học — Trường

Đại học sư phạm Hà Nội 2, đã giúp đỡ em trong quá trình học tập cũng như hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em

trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, 05 tháng 05 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Vui

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CAC CHU VIET TAT

DANH MUC CAC BANG VA SO DO

DANH MUC CAC HINH VE

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu . 2¿-2++++222++++t2EEEEvrrtEEEkxrrrrrkrrrrrrrr 19

2.2 Phương pháp chiết thực vật -2¿+£©++z+2E+Eevczkererrserrrke 19 2.3 Phương pháp phân lập các hợp chất -:-z£©ssczz+++ 21 2.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 21

2.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký . . -cccccccccccee 22

2.3.3 Phân loại các phương pháp sắc ký . -c.cc 2 22

b Non 43+ Ả Ô 22 2.3.5 Sắc ký lớp mỏng, : 22+++222v2 2221112222211 re 24

2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ 25 2.5 Phương pháp thử hoạt tính sinh học . ¿-¿-++5+5+sccererxrrx 28

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM -22¿¿22222c22EExtrrtrrrrrrrrrrrrrree 29

3.1 Thu hái và xử lý mẫu -+¿©+++2E+++22Exrttrxxeerrxrerrrerrrrke 29

k2) 50079005: 88.7 7 29

km» —” Ò 29

3.2.2 Hóa chất . -::::22222 2 2221221111111 ri 29 3.3 Điều chế cặn chiết 2222 vvtn211 1111.121 29

3.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học . -¿c«5cS+Scscsrsrererersrerererer 30

3.5 Phân lập các chất từ cặn chiết tổng -ccc+cccvvcersrrreccee 31 3.6 Dữ kiện phổ của hai hợp chất phân lập được -+ 33

3.6.1 Dữ kiện phổ của hợp chất ASI -.ccc:c5222cvvvcccrrrrrrrrr 33 3.6.2 Dữ kiện phô của hợp chất AS2 -.cc:+cc5222cvvvcccrrrrrrrrr 33 CHƯƠNG 4: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN -2¿©22zc2ccsec+z 35

4.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt

DANH MUC CAC Ki HIEU, CAC CHU VIET TAT

EI-MS Electron Ionization Mass Spectra

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HETCOR Heteronuclear Correlation Spectroscopy

J Hằng số tương tac spin — spin

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐÒ

Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cặn AS/MeOH

Bảng 4.2: Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của cặn AS/MeOH

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân lập các chất sạch từ cặn chiết tổng AS/MeOH

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hinh 1.1: Lan Bulbophyllum eCchinỌ@4ÌHHH «5 ccsccexeeeeeeesreeeree 5 Hình 1.2: Lan Hồng thảo kén Dendrobium liHHi[ÏOTIHIM 555555 5+5+ 5 Hình 1.3: Lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis ccccccc5ccccccccccec 5 Hình 2.1: Mẫu cây Lan kim tuyén (Anoectochilus roxburghii) - 19

Hình 4.1: Cấu trúc hợp chất AS1 (daucosterol)

Hình 4.2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 'H-NMR của chất ASI 38

Hình 4.3: Phổ cacbon 'ÌC-NMR của chất AS] -52cccccccvccrex 38

Hình 4.4: Cấu trúc hợp chất AS2 (kinsenoside) - -cc¿+cccscce2 40 Hình 4.5: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 'H-NMR của chất AS2 40

Hình 4.6: Phổ cacbon '*C-NMR của chất AS2 -55ccccccccccrex 4I Hình4.7: Phổ HSQC của chất AS2 222c+222112E2121112221112 212.1 ce 41 Hình 4.8: PhO HMBC ctia chat AS2 csssssssssssssssssssssssnnssssessesseseeeeeeeeeeesssennes 42

DAT VAN DE

Từ xa xưa, con người da biết khai thác những loại cây cỏ, thảo mộc quanh mình để tạo ra các loại thuốc chữa bệnh khác nhau Thuốc Tây mới chỉ

ra đời cách đây vài thế kỉ Kể từ khi thuốc Tây ra đời đã có lúc sản phâm hóa

dược được chiếm ưu thế trên thị trường còn các cây thuốc, bài thuốc dân tộc

lại ít được quan tâm và hầu như không được coi trọng Tuy nhiên sau nhiều năm sử dụng, một số sản phẩm thuốc có có nguồn gốc tổng hợp đã bộc lộ những nhược điểm: gây ra những tai biến hoặc những tác dụng phụ có hại về lâu dài đối với sức khỏe con người mà phải hàng chục năm sau mới phát hiện ra Ngày nay, các hợp chất có nguồn góc thiên nhiên được dùng làm thuốc chữa bệnh đã và đang được các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế

giới quan tâm do ít tính độc và khả năng dung nạp tốt vào cơ thể sống

Tác dụng chữa bệnh của thảo mộc là do các hợp chất tự nhiên có ở trong

chúng quyết định Trong một loại cây cỏ có thể có rất nhiều thành phần hóa

học khác nhau nhưng chỉ có một số hợp chất là có tác dụng chữa bệnh Mỗi hợp chất lại có thể có tác dụng chữa trị các bệnh khác nhau, chính vì điều đó

làm cho tác dụng chữa bệnh của thuốc nam, thuốc đông y thật đa dạng Vì

vậy, khi khoa học phát triển đã hình thành lĩnh vực chuyên nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên Nhiệm vụ của các nhà khoa học làm nghiên cứu là tìm

ra các thành phần hóa học của cây cỏ, xác định xem thành phần nào có hoạt tính, nhằm sử dụng nguồn được liệu một cách khoa học và hiệu quả nhất, mặt

khác cũng tạo cơ sở đề bán tổng hợp và tổng hợp các loại thuốc mới có hiệu

lực tốt hơn

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nắng nhiều, mưa

nhiều, độ âm cao, mặt khác lại có điều kiện địa hình phức tạp Đó là những yếu

tố vô cùng thuận lợi cho thảm thực vật nhiệt đới phát triển Hệ thực vật Việt

Nam theo dự đoán của Giáo sư Phạm Hoàng Hộ có khoảng 12000 loài Theo

đánh giá của ông, đây là một trong những hệ thực vật có số loài phong phú nhất

thế giới [3] Đây là nguồn dược liệu quý đầy tiềm năng và triển vọng

Ho Lan (Orchidaceae) là họ thực vat da dang nhat cua Viét Nam, véi

tổng số 865 loài thuộc 154 chỉ Thông thường Lan được sử dụng làm cảnh

Ngoài ra, có nhiều loài Lan còn được sử dụng làm thuốc Chi Anoectochilus 6

Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài Lan kim tuyến

Anoectochilus roxburghii được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm

cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó [1] Hiện nay, Lan kim tuyến được xếp

trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cắm khai thác vì mục đích thương mại; và nhóm thực vật đang nguy cấp EN Ala,c,d trong sách đỏ

'Việt Nam năm 2007, phần thực vật [16, 17]

Do ý nghĩa to lớn của ho Orchidaceae là làm thuốc chữa bệnh cho con

người, tuy nhiên ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học của các cây thuốc họ này Vì vậy, mục tiêu của khóa

luận tốt nghiệp là tổng quan các tài liệu về họ Ørchidaceae và bước đầu nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Lan

kim tuyến (Anoectochilus roxburghii)

Nhiệm vụ cụ thể của khóa luận tốt nghiệp là:

e Tổng quan tất cả các tài liệu (trong và ngoài nước) về ho Orchidaceae,

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghii)

e Chiết tách và khảo sát hoạt tính sinh học các cặn chiết của cây Lan kim tuyến để tìm ra cặn chiết có hoạt tính

e Phân lập và tinh chế một số hợp chất sạch, xác định cấu trúc của các

chất đã được phân lập.

CHUONG 1: TONG QUAN

1.1 Vài nét về ho Orchidaceae

Họ Lan, hay họ Phong lan (Orchidaceae) 1a một họ thuộc lớp thực vật

một lá mầm - lớp Hanh (Liliopsida) va thuéc ngành Thực vật có hoa - thực vat Hat kin (Angipspermae = Magoliophyta)

Họ Phong lan là một trong những họ lớn nhất của giới Thực vat và phân

bố khắp nơi trên thế giới Lan thường mọc bám trên các cây cao trong rừng và

chủ yếu tìm thấy ở các khu rừng nhiệt đới Những loài như vậy thường được

gọi chung là phong lan Bên cạnh đó cũng có các loài mọc trong đất được gọi

là địa lan và có một số loài mọc trên đá gọi là thạch lan Vườn thực vật Hoàng

gia Kew (Vương quốc Anh) đã liệt kê 880 chỉ và gần 22.000 loài được chấp nhận, nhưng số lượng chính xác vẫn không rõ (có thể nhiều tới 25.000 loài) Số

lượng loài lan cao gấp 4 lần số lượng các loài động vật có vú hay hơn 2 lần số

lượng loài chim Nó chiếm khoảng 6 — 11% số lượng loài thực vật có hoa Khoảng 800 loài lan mới được bổ sung thêm mỗi năm Các chỉ lớn nhất là

Bulbophyllum (khoảng 2.000 loài, Epidendrum (khoảng 1.500 loài),

Dendrobium (khoang 1.400 loài) và Pleurothallis (Khoảng 1.000 loài) Họ này cũng bao gồm một số nhu chi Vanilla (chi c6 chtra chat vani), Orchis (chi điển hình) và nhiều loài được trồng phổ biến như Phalaenopsis hay Cattleya [15]

Theo các tác giả Trần Hợp (1998) [2] Nguyễn Tiến Bân (1997) [6], Võ Văn Chi — Dương Đức Tiến (1978) [14], Phạm Hoàng Hộ (1992) [7], Nguyễn Văn Chương, Trịnh Văn Thịnh (1991) [13] và Koopwitz (1986) [51], cay hoa lan thuộc họ lan (Orchidaceae), 6 trong lép don tu điệp, lớp 1 14 mam

(Monocotyledoneae), thudéc nganh ngoc lan — thyc vat hat kin Magnoliophyta,

phân lớp thành Lilidae, bộ lan Orchidales

Sự phân chia họ lan cũng khá phức tạp Theo truyền thống, các nhà khoa

học trước đây đều chia họ Phong lan làm 3 họ phụ khá minh bạch:

1 Orchidadeae

2 Cypripedioideae

3 Apostasioideae

Trong đó họ phụ lan (Orchidadeae) là phức tạp nhất, có nhiều giống

nhiều loài nhất, còn hai họ phụ kia mỗi loại chỉ có một tông

Gần đây do phân tích hóa học đầy đủ hơn và đi sâu vào đặc tính di

truyền, các nhà khoa học đã chia họ phong lan thành 6 họ phụ

Hình 1.1: Lan Bulbophyllum Hình 1.2: Lan Hoàng thảo kèn

Hình 1.3: Lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis

Đặc tính thực vật học của lan:

Theo tác giả Trần Hợp (1998) cây lan được mô tả như sau:

- Hoa lan thường có 3 cánh dài, 2 cánh bên và l cánh môi; hoa phong lan

có bầu hạ, thuôn kéo dài theo cuống

- Quả lan thuộc loại quả lan, nở ra theo 3- 6 đường nứt dọc, có dạng từ

quả dài đến dạng hình trụ ngắn phình ở giữa (ở đa số các loài)

- Hạt lan rất nhiều, nhỏ li tỉ, trọng lượng rất nhẹ

- Rễ lan có khả năng hấp thụ nước mưa chảy dọc trên vỏ cây, lấy được

nước lơ lửng trong không khí

- Lá lan mọc đơn độc, hoặc xếp dày ở gốc, hay xếp một cách đều đặn ở thân, trên củ giả; hình dạng màu sắc thay đồi nhiều (tùy từng loài)

- Thân rất ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá hoặc không

mang lá tùy thuộc vào từng loại lan M.E Pffiter (1882) da sắp xếp chúng vào

2 nhóm chính: đa thân (Sympodial) và đơn thân (Monopodial) [2]

+ Nhóm đơn thân gồm các chi: Dang huong (Aerides), Hồ điệp (Phalaennopsis), Phượng vi (Renanthera), Ngoc diém

(Rhynchostylis),

* Nhom da thân: đây là nhóm gồm những cây tăng trưởng liên tục

và có những kì nghỉ sau mùa tăng trưởng như: Chỉ lan Kiếm

(Cymbidium), Chi lan Hoang thao (Dendrobium)

Ở các loài lan sống phụ có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả (giả hành)

Củ giả rất đa đạng: Hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều đặn hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân gia [5]

Lan để làm dược liệu thuộc chủ yếu các chỉ: Anoectochilus, Bletilla,

Ephemerantha,ERIA, Galeola, Gastrodia, gymnadenia, habenaria, ludisia, Luisia, Nevilia và thunia [44].

Một số đại diện của chỉ hoàng thảo - Dendrobium Sw_ có giá trị làm

thuốc chữa sốt, ho, kém ăn, làm tăng tiết nước bọt và ngon miệng cũng như

kích thích dạ đày co bóp Ở Đài Loan, Hàn Quốc và Nhật Bản còn để điều trị

ra mô hôi ban đêm, đề bồi bổ cơ thể của người, để tăng cường thận và đề chữa

bệnh liệt đương [10, 44]

Cu cua Bletilla striata, duge goi 1a Baiji 6 Trung Quốc, đã được sử dụng

trong y học cô truyền dé điều trị tràn dịch phôi và ho lao Các loại thuốc được chế biến từ củ được sử dụng dé điều trị bệnh lao, ho ra máu, viêm dạ dày và

loét tá tràng, cũng như chảy máu, và nứt da chân và tay Bulbophyllum kwangtungense schlecht ti lau đã được sử dụng trong y học cô truyền Trung

Quốc như một loại thuốc bồ [44]

Ở Án Độ, Cypripedium parviflora được sử dụng rộng rãi như là thuốc

kích dục và hưng phấn bổ thần kinh Ở Mỹ, Vamilla plamifolia đã được sử dụng như thảo mộc hữu ích cho việc điều trị chứng cuồng loạn, sốt, liệt

dương, thấp khớp và tăng cường năng lượng của các hệ thống cơ bắp kể từ

thế kỷ 15 Encycha cirina, được sử dụng bởi người bản địa trên vết thương

nhiễm khuẩn đã được mô tả trong các tài liệu sớm nhất Laelia autumnal duge

ding cho diéu tri ho; Stanhopea hernandezii duge ding dé diéu tri bénh say

nang; Arpophyllum spicatum, Bletia catenulate và Epidendrum pastoris duoc dùng đề điều trị bệnh kiết ly Loài khác nhau của chi Cypripedium da duge sit dụng ở Bắc Mỹ bởi các dân tộc khác nhau đề làm thuốc an thần và căng thắng

thần kinh (Wilson, 2007) [44]

Ở châu Âu, Spiranthes diuretica được dùng có hiệu quả như một thuốc

lợi tiểu ở trẻ em Rễ của Epipaetis giganfea như một loại thuốc bổ để bồi bổ

cơ thể khi ốm nặng Epipaciis helleborine được đánh giá là một phương thuốc chữa bệnh gút trong đân gian châu Âu Thân rễ của nó cũng được sử dụng

như thuốc kích dục dưới dạng tiêm truyền hoặc thuốc sắc (Balzarini et al., 1992) Ré cua E latifolia đã được sử dung trong bénh thap khớp [44].

Ở Úc, củ của nhiều loài phong lan như Gastrodia sesamoides, Dendrobium

speciosum va loai Caladenia đã được sử dụng như lương thực cứu đói

(Bulpit, 2005) Nước sắc từ lá của Dendrobium aurantiacum da duoc sit

dụng để chữa bệnh tiểu đường Giả hành của Cymbidiun madidam được nhai

chữa bệnh kiết ly và hạt của nó đã được sử dụng như thuốc tránh thai Ngoài

ta, Cymbidium canaliculatum, Dendrobium teratfolum và Dendrobium

discolor đã được sử dụng để điều trị các bệnh khác nhau như bệnh ly, giảm đau và kiểm soát nắm ngoài da [44]

Tại châu Phi, một số loài thuộc chỉ Eufophia đã được sử dụng để ngăn

ngừa sảy thai và chữa bệnh vô sinh

Các quốc gia khác ở châu Á như Indonesia, Malaysia, Đài Loan,

Singapore, Việt Nam, Shri Lanka, Thái Lan, Myanmar, vv sử dụng hoa lan

trong y học cô truyền từ thời cổ đại cho đến ngày nay (Basu et al, 1971;

Kumar et al, 2000; Hernández-Romero et al, 2005; Luo et al, 2007) [44]

Từ các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, các loài thuộc các chi khác

nhau của họ Lan sử dụng rộng rãi trong hệ thống phác đồ chữa bệnh và điều

trị bệnh Nguyên nhân là do trong dịch chiết của chúng có chứa những chất có

được tính quan trọng Đó là alkaloid, flavonoid, stilebnoids, anthocyanins, triterpedoids, orchinol, hircinol, cypripedin, các dẫn xuất bibenzyl, phenanthrenes, Jibantine, nidemin và loroglossin có trong trong lá, giả hành,

rễ, hoa hoặc trong toàn bộ cây [44]

1.2 Vài nét về chỉ Anoecfochilus (chỉ Lan kim tuyến)

Trên thế giới chỉ Anoectochilus gdm khoảng 40 loài, phân bố chủ yếu ở

khu vực Australia và vùng nhiệt đới của châu Á như: Sri Lanka, Malaysia, Án

Độ, Nhật Bản, phía Nam Trung Quốc, các đảo Nam Thái Bình Dương 20 loài

trong số đó đã được tìm thấy từ phía Tây Nam đến phía Nam của Trung Quốc

[30, 43, 45].

Tại Việt Nam, chỉ Lan kim tuyến Anoecfochilus hiện thông kê được 12

loài, chúng được phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh từ Bắc tới Nam (Nguyễn

Tiến Bân, 2005) [1]

Tên của chỉ — “4noecfochils” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp

“anoiktos” (mở) và “chilos” (môi) ám chỉ hoa với môi nồi bật (cánh giữa

của hoa) khi nở [46]

Các loài Lan kim tuyến không chỉ được con người khai thác làm cảnh

mà còn được dùng để làm thuốc

Có thể liệt kê đôi nét về thành phần và hoạt tính của các cây thuộc chỉ

Anoecfochilus như sau:

Cây thuốc chính của chỉ này được mệnh danh là “Vua của các loại thuốc”

hay “cỏ vàng” là Anoectochilus formosanus, Anoectochilus koshunensis va Anoectochilus roxburghii, thường được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp, tiểu đường, bệnh tìm, viêm phổi, viêm gan mãn tính và cấp tính, viêm thận và

một số bệnh khác [45]

- Theo Aiko Ito va cong sự, một hợp chat glucoside mdi 14 3-(R)-3-B-D-

glucopyranosyloxybutanolide (kinsenoside) cùng với đồng phân của nó và một glucoside thơm dị vòng là J-D-glucopyranosyl-3-pyridinemethanol

(nicoloside) và 26-methylstigmasta-5,22,25,(27)-trien-3B-ol đã được phân lập

từ A koshunensis Cấu trúc của các hợp chất này đã được làm sáng tỏ bằng các dữ liệu phổ cộng hưởng từ và quang phô [37,38]

- Theo nghiên cứu của Yang Zhang và các cộng sự hợp chất 3- (R) -3-B-

D-Glucopyranosyloxybutanolide (kinsenoside) đã được phân lập từ ba loài khác nhau của chỉ Anoecrochilus Nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng hợp chất kinsenoside có tác dụng bảo vệ tế bào gan trên chuột được gây nhiễm độc bang CCl, và hợp chất này còn sở hữu nhiều tác dụng quan trọng khác đã

được thử nghiệm trên chuột như hoạt tính hạ huyết áp, chống viêm, chống tăng đường huyết, bảo vệ mạch máu [42].

- Li-Chan Yang và cộng sự cũng nghiên cứu: Arabinogalactan(AG) một

dẫn xuất từ Anoecfochilus formosanus, một polysaccharide có nguồn gốc từ

một nguồn thực vật, có thể làm giảm loãng xương trên thực nghiệm in vivo va

in viro và có khả năng miễn dịch tự nhiên và có hoạt tính kháng ung thư

AG do đó có thể được sử dụng cho các liệu pháp miễn dịch ung thư Thử nghiệm này cũng được C.-C Tsenga và cộng sự của mình nghiên cứu, đối với những con chuột mang khối u, sau khi uống dịch chiết nước của A

fOrmosanus trong 12 ngày liên tiếp, tỷ lệ ức chế khối u là 23,8% và 40,5% ở liều tương ứng là 50 và 10 mg/1 con chuột Kết quả này cho thấy A

formosanus rat c6 gid tri tiém nang trong điều trị ung thư ở người [32, 35, 36]

- Theo nhom tac gia nguoi Nhat Ban Du XM , Anoectochilus formosanus gồm các hợp chất - (3R)-3-(beta-D-glucopyranosyloxy)butanolide

(kinsenoside; 1), (3R)-3-(beta-D-glucopyranosyloxy)-4-hydroxybutanoic acid

isopropyl-beta-D-glucopyranoside (4), (R)-3.4-dihydroxybutanoic acid gamma-lactone (5), 4-(beta-D-glucopyranosyloxy) benzyl alcohol (6), (6R,9S)-9-(beta-D-glucopyranosyloxy)megastigma-4,7-dien-3-one (7), and (3R)-3-(beta-D-glucopyranosyloxy)-4-hydroxybutanolide (8) [41]

- Rễ, thân, lá của A ƒormosanus đã được sử dụng làm chất nền cho quá trình lên men lactic Hoạt tính chống oxy hóa của A ƒormosanus đã được tìm

thấy là 61-78% A formosanus được sử dụng là chất lên men lactic mới trong

sản xuất thực phẩm chức năng [39]

- Theo các tài liệu đã được công bó, dịch chiết xuất từ A ƒornosanus có tác

dụng bảo vệ gan, chống rối loạn chức năng gan, viêm gan, chống viêm, chống

kích hoạt khối u, cao huyết áp, tiểu đường, rối loạn tim mạch, [33, 39]

10

1.3 Giới thiệu về cây Lan kim tuyến (Anoeetochilus roxburghii)

1.3.1 Đặc điểm hình thái và phân bố của cây Lan kim tuyến

Lan kim tuyến còn được gọi là Kim tuyến liên, Mộc sơn thạch tùng, lá

Gắm hay lan gắm Trong quyền các Cây cỏ Việt Nam, GS Phạm Hoàng Hộ

gọi là Giải thuỳ [3]

Tên khoa học của Lan Kim tuyến 1a Anoectochilus roxburghii Wall ex

Lindl hay cén 1a Anoectochilus setaceus Blume [3,8]

Lan kim tuyén là một loài địa lan cé chdi dài; thân cao 10-20 cm Lá có

phiến xoan, đài 3-4 cm, màu nâu trừ ở giữa vàng xanh và gân hường Chùm

thưa, cao 5-7 cm, hoa 4-10, hường hường, phiến hoa dài 6 mm, môi dai 1,5

cm, mang 6-8 ria mỗi bên, dau ché hai, mong hinh quan, dai 7 mm, noan sao

3 mm, xanh [3]

Lam kim tuyến là cây thân cỏ, mọc ở đất, thân trên đất mọng nước,

mang các lá mọc xoè sát đất; có thân rễ mọc dài,thường có màu xanh trắng,

đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẫn, không phủ lông Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng Thân khí sinh mang nhiều

long, các lóng có chiều dài khác nhau Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ

2-4 lóng, trung bình là 2,87 Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23

cm Mùa hoa tháng 10-12 Mùa quả chín tháng 12-3 năm sau [4]

Đó là đặc điểm chung về hình thái của cây Tuy nhiên việc nhận dạng

loài lan dược liệu quý này về mặt hình thái bên ngoài rất khó khăn Gần đây,

việc xác định loài bằng chỉ thị ADN đặc biệt hữu dụng để phân biệt với các

loài khác khi mà những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ

cơ sở đề định danh hoặc phân biệt loài

Theo nghiên cứu của Vũ Thị Huyền Trang và các cộng sự đã nhận dạng Lan kim tuyến từ một số mẫu thu thập ở Vườn Quốc gia Tam Đảo và núi

Ngọc linh, tỉnh Kontum thông qua các chỉ thị tiềm năng ở lục lạp là matK và

11

psbA-trnH và ở gen nhân là ITS Sự kết hợp giữa hai chỉ thị này đã phân biệt

được Lan kim tuyến với các loài khác trong chỉ Anoectochilus của nó [8]

Lan kim tuyến phân bố chủ yếu ở rừng nhiệt đới, các thung lũng 4m ướt;

ở độ cao100-1600 m, điển hình như các nơi: Án Độ, Trung Quốc, Nepal, Bhutan, Bangladesh, Myanmar, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Nhật Bản [46]

Phân bố ở nước ta: Sapa, Tam Đảo Quảng Trị, Bình Trị Thiên, Gia

Lai Kon-Tum [3]

1.3.2 Một số bài thuốc dân gian sử dụng cây Lan kim tuyến

Trong y học dân gian cây lan kim tuyến đã được sử dụng từ rất lâu đời đặc biệt là ở Trung Quốc Người ta dùng cả cây tươi hoặc khô để sắc uống Liều dùng khoảng 20g tươi hoặc 5g khô trong ngày Dùng ngoài dưới dạng cả cây tươi giã nát, đắp chỗ vết thương sưng đau

Tài liệu: “ Khảo cứu về cây thuốc Kim tuyến liên” của Đài Loan có viết

về giá trị y học cây này như sau:

-Ông Tả Tả Mộc Thuấn, học giả người Nhật nghiên cứu về Trung y công bố (1924): Kim tuyến liên là một trong những cây thuốc quý trong dân

gian, toàn thân cây thuốc được dùng để tăng cường sức khỏe, chủ trị bệnh

phổi, di tỉnh, xuất tỉnh sớm, yếu gan, yếu tỳ và chữa các vết thương đo rắn

cắn Còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt

- Ông Sơn Điền Kim Trị công bồ (1932): người dân tộc miền núi thường

dùng Kim tuyến liên sắc uống đề trị đau ruột, đau bụng, sốt cao, đấp bên

ngoài để trị các chỗ sưng vết thương hoặc bị rắn cắn

- Sách Thanh thảo gia đình tự liệu pháp của ông Trần Đào Thích có viết:

trẻ em hay khóc ding Kim tuyến liên sắc uống sẽ khỏi

- Sách Khoa học quốc dược quyên 1 kỳ 2 (1958) của ông Tạ A Mộc và

Trần Kiến Đào đăng tải trong tạp chí Đài Loan dân gian được dụng thực vật

có nói đến Kim tuyến liên như là một trong những được thảo quý giá, giúp bổ

máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phôi và nóng gan

12

- Trong báo cáo điều tra (1964) của mình, ông Cam Vĩ Tùng đã phát biểu: Kim tuyến liên là một vị thuốc hết sức quý giá trong các tiệm thuốc Bắc

Đài Loan Nó là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh

huyết, bồ phi, giải trừ u uất, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, chủ trị lục

phủ ngũ tạng đấy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đau lá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn, suy thận

- Theo Trung y sư Lâm Minh Quyền, dược tính của Kim tuyến liên giống như cây Nhất điểm hoàng: hạ sốt, giải nhiệt, trừ u uất, phiền muộn, trị

ho khan, đau ngực, đau họng, sắc uống với nước đường

- Trung y sư Trịnh Mộc Vinh có nói: trong đơn thuốc trị đau lá lách của mình, ông dùng Kim tuyến liên, Chỉ tử, rễ Đạm trúc diệp, mỗi loại 20 phân sắc uống sẽ khỏi

- Đơn thuốc của ông Khưu Tải Phúc có dùng Kim tuyến liên 20 phân,

sắc uống bằng nước đường làm mát máu nhuận phổi, trị bệnh phôi

- Đơn thuốc của ông Diệp Hải Ba có dùng Kim tuyến liên 20 phân sắc

uống bằng nước đường làm mát máu trị bệnh cao huyết áp

- Đơn thuốc của 3 ông Vương Chánh Hùng, Hà Thiên Tống, Trần Binh Diêu dùng Kim tuyến liên 20 phân hầm với thịt nạc trị thổ huyết, bệnh phổi

- Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiên cứu cây thuốc thực vật thành phố Gia Nghĩa tuyên bố: Kim tuyến liên tiêu

đờm, giải độc, chỉ huyết, hạ huyết ap, tro tim, loi tiểu, trị bệnh đái đường,

chữa viêm gan, trị mụn đùng cây tươi sắc uống [20]

1.3.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Lan kim tuyến

Trên thế giới các nghiên cứu về thành phần hóa học của lan kim tuyến có thể khái quát qua các công trình nghiên cứu của các tác giả sau:

- Năm 2005, Chunnian He và các cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất từ

cặn chiết CHCI; của Anoectochilus roxburghii, chúng được xác định là p-

13

hydroxybenzaldehyde (1), ferulic acid (2), quercetin (3), daucosterol (4), va cirsilineol (5) [21]

- Năm 2007, Huang L và cộng sự đã sử dụng sắc ký lỏng khối phổ LC-

MS để xác định sự có mặt các axit oleanolic và acid ursolic, là hai hợp chất

hoat tinh sinh hoc quan trong trong Anoectochilus roxburghii [28]

- Nam 2008, Zhong Yao Cai va các cộng sự đã phân lập và tìm ra được mười hợp chất là: beta-D-glucopyranosyl- (3R) -hydroxybutanolide

(Kinsenoside) (1), acid stearic (2), palmitic acid (3), beta-sitosterol (4) va acid succinic (5), p- benzaldehyde hydroxy (6), daucosterol (7), methyl 4-beta-D-

glucopyranosyl-hutanoate (8); p-hydroxy axit cinnamic (9) va o-hydroxy phenol

(10) tir Anoectochilus roxburghii Céc hop chat này được phân lập và tỉnh chế

bằng sắc kí cột với gel silica, Macroporous và Sephadex LH-20, và cấu trúc của chúng đã được xác định bởi dữ liệu vật lý và quang phổ của chúng [26]

Theo các nghiên cứu Kinsenoside và hai hợp chất mới sorghumol acyl esters là sorghumol 3-OZp-coumarate và sorghumol 3-OEP-coumarate, một alkaloid mới là anoectochine cùng với một triterpenoid đã biết là sorghumol

đã được phân lập từ các bộ phận của cây Anoectochilus roxburghii Cấu trúc

của chúng đã được thiết lập bởi các nghiên cứu quang phổ chỉ tiết gồm các

phổ một chiều và hai chiều NMR ((1)H- (1)H COSY, HSQC và HMBC) [27]

Ergosterol và stigmasterol là phytosterol rất phô biến Chúng là hai hợp chất sterol chính được tìm thấy trong Anoecfochilus roxburghii và đã được

chứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học Huang L và các cộng sự đã phát

triển thành công phương pháp sử dụng sắc ký ngược dòng (HSCCC) để tách và

tỉnh chế hai phytosterol này Hệ dung môi hai pha gồm n-hexane-ethylacetate-

butanol-metanol-nước (3,5: 0,3: 0,5: 2,5: 0,3, v / v); tốc độ quay là 900 rpm;

tốc độ dòng chảy của giai đoạn thấp là 1,5 ml/phút Khoảng 36,5 mg ergosterol

và 43,6 mg stigmasterol thu được từ 100 g của A roxburghii [25]

14

Theo nghiên cứu mới nhất của Qing Liu va cac cộng sự năm 2014, ba

dẫn xuất 3-hydroxybutanolide mới, có tên kinsenbenol (1), kinsendioside A

(2) và kinsendioside B (3), và một glucoside flavonoid mới đã được phân lập

từ Anoectochilus roxburghii [3l]

Như vậy trên thế giới cũng đã có một số nghiên cứu thành phần hóa học

của cây Lan kim tuyến Tuy nhiên, số lượng công trình vẫn còn rất hạn chế

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về Lan kim tuyến cũng chưa nhiều, chủ yếu

các công trình thiên về hướng nhân giống, trồng và đặc điểm hình thái của

cây như công trình nghiên cứu: Đặc điểm hình thái, phân bố của loài lan Kim tuyến Anoecfochilus setaceus blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc và Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi In Vitro loài Lan kim tuyến

Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl của Phùng Văn Phê và các cộng sự [9.4] Cho đến nay chưa có công trình nào được nghiên cứu và công bố một cách có hệ thống, đầy đủ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây

Lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii

1.3.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây Lan kim tuyến

Lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii là loài lan được liệu quý được

sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường, cao huyết áp, bệnh tim, viêm phổi,

viêm gan cấp và mãn tính, viêm thận và các bệnh khác [8]

Theo Nguyễn Tiến Bân (2005), Lan Kim Tuyến là một loại thảo dược có

giá trị kinh tế cao và khả năng chữa trị các bệnh ung thư, chống tăng huyết áp,

lưu thông khí huyết, kháng khuẩn [1]

Theo tài liệu của Đài Loan, cây Lan kim tuyến là một loại cây thuốc nổi tiếng vô cùng quý giá có bán tại các tiệm thuốc Bắc hoặc dùng trong nhân

dân Cây Lan kim tuyến có tác dụng: tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu

thông Cây thuốc có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm phế quản, viêm

gan mạn tính Ngoài ra còn dùng chữa thần kinh suy nhược, chữa ho khan,

15

đau họng, cao huyết áp, suy thận, chữa di tính, đau lưng, phong thấp, làm tiêu

đờm, giải độc, giải nhiệt [20]

Anoectochilus roxburghii là một loại thảo được truyền thống của Trung

Quốc được sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường và một số bệnh khác

Anoectochilus roxburghii polysaccharose (ARP) là thành phần chính của Anoectochilus roxburghii có tác dụng điều trị đái tháo đường ở chuột bị tiểu

đường gây ra bởi chế độ ăn giàu chất béo và streptozotocin Thử nghiệm hai

liều ARP (100 hoặc 300 mg/kg) mỗi ngày một lần trong 25 ngày với những

con chuột mắc bệnh tiều đường đồng thời so sánh với những con chuột không được điều trị đái tháo đường, ARP (100 hoặc 300 mg/kg) gây ra sự sụt giảm đáng kể nồng độ glucose máu và một sự gia tăng đáng kể hàm lượng glycogen trong gan Đồng thời, những thay đổi trong chuyền hóa lipid được

thể hiện qua sự sụt giảm TC (cholesterol toàn phần) trong huyết thanh, TG

(triglyceride) và nồng độ LDL-C (cholesterol có tỉ trọng phân tử thấp) ở chuột

bị tiểu đường Ngoài ra, kiểm tra mô bệnh học cho thấy khi đùng ARP (100 hoặc 300 mg/kg) làm cải thiện đáng kể tuyến tụy và chức năng gan [22]

Tác dụng bảo vệ của phenol va polysaccharides phan lập từ

Anoectochilus roxburghii về các hoạt tính chống oxy hóa trong gan bị tôn thương trên chuột bị xử lý bằng CCl¿ cũng được nghiên cứu So với chuột

bình thường, hợp chất phenol va polysaccharides phân lập từ Anoecfochilus roxburghii gây ra sự sut giam dang ké (p <0,05) glutamate oxalate transa-

Minase (GOT) va glutamate pyruvate transaminase (GPT) và một sự gia tăng

đáng kể (p <0,05) trong hoạt động của các chất chống oxy hóa enzyme trong

gan của những con chuột được xử lý bằng CCL, [29]

Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Le Li, chuột bị bệnh tiểu đường gây ra bởi chế độ ăn giàu chất béo và liều thấp streptozotocin được chữa trị bằng Anoectochilus roxburghii polysaccharose (ARP) theo đường uống với liều

16

lượng ARP (100, 300 mg/kg) mỗi ngày một lần, liên tiếp 15 ngày Kết quả cho thấy, so với những con chuột mắc bệnh tiểu đường, khi điều trị bằng ARP gây

ra giảm đáng kể mức độ glucose trong mau va cải thiện trọng lượng cơ thể của

chuột bị tiểu đường Ngoài ra, ARP ức chế yếu tố gây viêm bao gồm cả khối u

yếu tố hoại tử ơ (TNE-ø), protein hoá hướng động té bao don nhan-1 (MCP-1),

FN (Fibronectin) cing nhu MMP (matrix metalloproteinases) 2/9 Hơn nữa,

viéc kiém tra m6 bénh hoc cho thay giảm rõ ràng hư hại về cấu trúc mao mạch

sau khi dùng ARP [40]

Các tác dụng hạ đường huyết và chống oxy hóa của các chiết xuất nước

từ Anoectochilus roxburghii ở chuột bị tiểu đường gây ra bởi alloxan cũng

được nghiên cứu So với chuột bị tiểu đường được điều trị, uống hàng ngày

các chiết xuất nước từ A.roxburghii ở 0,5 hoặc 2 g/kg trong 14 ngày gây ra sự giảm đáng kế (p <0,05) mức độ glucose trong máu Ngoài ra, các chiết xuất nước từ A.roxburghii gây ra một sự gia tăng đáng kể (p <0,05) trong hoạt động của các chất chống oxy hoá enzym và các nồng độ vitamin E trong gan

và thận của chuột bị tiêu đường Kết quả cho thấy rằng chiết xuất nước cla A roxburghii sở hữu hoạt tính hạ đường huyết và hoạt tính chống oxy hóa sau khi uống hàng ngày trên chuột bị bệnh tiểu đường do alloxan gây ra [24]

Năm 2012, trong nghiên cứu của mình, J Xu cho rằng: Một số loài của chỉ Anoecfochilus được sử dụng làm thuốc dân gian đề giải độc, xua tan gió, loại bỏ hoi 4m va tăng huyết áp [30]

Với liều 15 mg/kg trọng lượng cơ thẻ, hợp chất kinsenoside, một thành

phần có hàm lượng cao trong Anoectochilus roxburghii da thể hiện các hoạt

tính chống tăng đường huyết đáng kể ở chuột tiểu đường gây ra bởi

streptozotocin [34]

Liu ZL và các cộng sự đã tiến hành thử nghiệm in vivo trên chuột bị tiểu

đường gây ra bởi streptozotocin, hợp chất kinsenoside (50 và 100 mg/kg) làm

17

giảm đáng kể mức độ glucose máu và cholesterol đồng thời làm tăng cường sức đề kháng Trong các thử nghiệm in vitro, kinsenoside (20 và 50 mg/mL)

làm thay đổi rõ rệt trên các chất ức chế sinh hóa khác nhau (nitric oxide (NO),

dehydrogenase lactic (LDH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT))

trong các tế bào nội mô mạch máu rốn của người (HUVEC9$) bi hư hỏng bởi

mức độ glucose cao (35 mM) và làm phục hồi cấu trúc nội mô mạch máu Các tác dụng bảo vệ mạch máu của kinsenoside được suy đoán là do ức chế

sự oxy hóa và giảm các yếu tố hạt nhân kappa B (NF-kB) mức độ biểu hiện

mRNA trong diéu kién nồng độ glucose cao Hơn nữa, kiểm tra mô bệnh học, bao gồm nhuộm hematoxylin-eosin (H & E), nhuộm Masson trichrome (Masson), và nhuộm định kỳ Schiff-methenamine (PASM), có sự cải thiện về

hình thái và chức năng của những thay đổi về tiểu đường trong động mạch

chủ trên chuột sau khi điều trị bằng kinsenoside (20 và 50 mg/mL) Những kết quả này chỉ ra rằng kinsenoside có thể là một tác nhân đầy hứa hẹn cho việc điều trị các bệnh mạch máu tiểu đường [23]

Trong một số các nghiên cứu khác, hợp chất kinsenoside đã được chứng

minh là có tác dụng ức chế sản sinh các chất trung gian gây viêm [48], bảo vệ

gan [49], bảo vệ thành mạch đối với người bị tiểu đường [50], hạ đường

huyết, điều trị cao huyết áp [34]

18

CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là toàn cây Lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii Cây Lan kìm tuyến được thu hái tại Konkray, Kon tum, vào tháng

1 năm 2015 được Tiến sĩ Nguyễn Văn Dư — Viện Sinh thái và tài nguyên sinh

vật giám định Mẫu tiêu bản số AS 01/2014 được lưu tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên — Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1: Mẫu cây Lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghii) 2.2 Phương pháp chiết thực vật [18]

Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi đẻ lấy các chất tan ra khỏi

mẫu thực vật Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là các dịch chiết Tùy thuộc vào tính phân cực của chất cần tách, ta lựa chọn dung môi chiết,

bắt đầu từ những dung môi hydrocacbon nhẹ đối với những chất ít phân cực

đến những dung môi phân cực hơn nhe dietyl ete, axeton, etanol kể cả nước

đối với những chất phân cực

Quá trình chiết có thể được phân loại theo các tiêu chí khác nhau:

- Theo nhiệt độ: chiết nóng và chiết nguội (ở nhiệt độ thường)

19

- Theo chế độ làm việc: chiết gián đoạn, chiết liên tục, chiết bán liên tục

- Theo chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha: chiết ngược dòng,

chiết xuôi dòng, chéo đòng

- Theo áp suất làm việc: chiết ở áp suất thường (áp suất khí quyền), áp

suất giảm (áp suất chân không), áp suất cao (làm việc có áp lực)

- Theo trang thai làm việc của hai pha: chiết ngâm hoặc ngắm kiệt

- Theo các biện pháp kĩ thuật đặc biệt: phương pháp siêu âm, phương

pháp tạo dòng xoáy, phương pháp vi sóng

Với qui mô phòng thí nghiệm, thông thường sử dụng hai phương pháp chiết sau:

Chiết gián đoạn: quá trình chiết gián đoạn có hiệu quả thấp hơn so với

chiết liên tục Trong quá trình này mẫu rắn được ngâm vào dung môi thích

hợp trong một thời gian (có thể khuấy, lắc, siêu âm ), sau đó dịch chiết được

tách ra bang lang gan, loc, li tam Ba lai được chiết tiếp bằng dung môi mới

Các dịch chiết được gộp lại và cho bay hơi (thường đưới áp suất giảm) nhằm

thu được các cặn chiết (cao chiết)

Chiết liên tục: Quá trình chiết liên tục được thực hiện trong một thiết bị

riêng, thường sử dụng bộ chiết Soxhlet Nguyên tắc làm việc của hệ thống

chiết Soxhlet: một lượng dung môi nhất định được cho trong bình cầu và đun

nóng cho bay hơi, hơi dung môi được ngưng tụ thành các giọt dung môi ấm sẽ

ngắm vào mẫu dược liệu, hòa tan chất và dịch chứa chất hòa tan được xi

phông đưa xuống bình cầu chứa dung môi Quá trình được lặp lại như vậy cho

tới khi chiết hết được chất cần lấy ra khỏi mẫu

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, bao gồm: nhiệt độ,

thời gian, độ mịn của dược liệu, khuấy trộn Tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể mà lựa chọn các yếu tố này sao cho phù hợp để thu được hiệu quả tốt nhất

20

- Nhiệt độ: khi tăng nhiệt độ thì độ hòa tan của chất cần tách vào dung môi tăng do hệ số khuếch tán tăng và độ nhớt dung môi giảm Tuy nhiên,

trong một số trường hợp nhiệt độ tăng lại gây ra một số bất lợi như: tăng khả

năng hòa tan tạp, làm phân hủy một số chất kém bền nhiệt, dung môi dé bay

hơi bị hao hụt

- Thời gian: nếu thời gian chiết xuất ngắn sẽ không chiết được hết hoạt

chat trong được liệu nhưng nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều

chat sẽ đễ bị hòa tan, mặt khác gây ra bết dính làm giảm hiệu quá chiết

- Khuấy trộn: khuấy trộn làm tăng khả năng tiếp xúc giữa dược liều và

dung môi, đo đó làm tăng hiệu quả chiết xuất

2.3 Phương pháp phân lập các hợp chất

Để tiến hành phân lập các chất từ dịch chiết thực vật, chúng tôi dùng

phương pháp sắc ký

2.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký [19]

Phương pháp sắc ký là phương pháp phân tách các chất trong hỗn hợp bằng cách đùng môi trường động (pha động) đưa hỗn hợp từ từ đi qua môi

trường có bề mặt phát triển (pha tĩnh) Các chất khác nhau có ái lực khác nhau

đối với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo

hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình

hấp phụ, giải hấp Hệ quả là các chất có ái lực lớn đối với pha tĩnh sẽ chuyển

động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất có tương tác yếu hơn

21

2.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký [19]

Cơ sở của phương pháp sắc ký chủ yếu chính là hiện tượng hấp phụ -

giải hấp phụ của các chất khi pha động chuyển động qua pha tĩnh Đó là

nguyên nhân dẫn đến sự phân bó khác nhau của các chất đối với pha động và pha tĩnh

Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng

chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc chất khí là áp suất riêng phần) được gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt

Langmuir:

n= n bC/(1+bC)

n: luong chat bi hap phy lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

?t„: lượng chất cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ

nào đó

b: hằng số

C: nồng độ

2.3.3 Phân loại các phương pháp sắc ký [18]

Có nhiều cách phân loại các phương pháp sắc ký:

- Theo cơ chế hoạt động của sắc ký: hap phụ, phân bó, trao đổi ion

- Theo ban chất của pha tĩnh: sắc ký pha thuận, sắc ký pha dao, dianion, Sephadex

- Theo tinh chất của pha tĩnh và pha động: sắc ký lỏng — ran, sc ky lỏng

~ lỏng, sắc ký khí — lỏng, sắc ký khí — rắn

- Theo quá trình sắc ký chia làm hai dạng: dạng cột va dang bản phẳng

2.3.4 Sắc ký cột

Cột sắc ký thường là những ống thủy tỉnh có đường kính d = 0,5 — 5cm,

độ dài I = 20 — 100em nạp đầy chất hấp phụ và pha động Pha động dịch

2

chuyển dưới tác dụng của trọng lực Tốc độ chuyển động của pha động được

điều chỉnh nhờ khóa lắp phía đưới cột [19]

Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường hay pha đảo

YMC, ODS, Dianion

- Silica gel pha thường có công thức hóa học SiO2.xH2O, là chat phân cực, trên bề mặt có chứa các nhóm hydroxyl, thường có tính axit nhẹ gần như trung tính Tính hấp phụ của silica gel do có nhóm OH trên bề mặt quyết định

Nhóm OH chính là trung tâm hấp phụ Đối với sắc ký cột pha thường, các

chất ít phân cực ra trước còn các chất phân cực hơn ra sau

- Silica gel pha đảo thường 1a silica gel được ankyl hóa, tạo ra các gốc ankyl mach dai dé tang tính không phân cực của silica gel Các gốc ankyl đưa vào thường là octyl hay octadexyl Đối với sắc ký cột pha dao, các chất phân

cực hơn ra trước còn các chất ít phân cực hơn ra sau

Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột thủy tỉnh) Độ mịn

của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Độ mịn của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm Trong một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tường tắc cột (dung môi

không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất (áp suất trung bình —

MPC, hoặc áp suất cao — HPLC)

Tỉ lệ chiều cao cột (L) so với đường kính cột (D), L/D phụ thuộc vào yêu

cầu tách tức là phụ thuộc vào lượng chất va chat cu thé

Tỉ lệ giữa quãng đường di của chất cần tách so với quãng đường đi của

dung môi là R¿, với mỗi chất khác nhau sẽ có R; khác nhau Nhờ sự khác nhau

về R; này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp

23

Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa các chất

lên cột bằng phương pháp khác nhau:

- _ Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến nhất là tắm chất với

silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột

- Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiéu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhi cột khô Theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp

vào cột khi còn khô, sau đó đùng que mềm gõ nhẹ lên thành cột đề dua chat

hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy đề rửa giải

- Cách 2: Nhôi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hào tan trong dung môi

chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần vào cột đến khi

đủ lượng cần thiết

> Những lưu ý:

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để có bọt khí trong cột (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu suất tách) và cột không được nứt, gãy, đò Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu

quả tách Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả quả tách Còn

nếu tốc độ chảy quá thấp thì sẽ kéo đài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến

độ công việc

2.3.5 Sắc ký lớp móng

Về bản chất, đây là loại sắc ký lỏng — rắn mà pha tĩnh rắn được trải thành

lớp mỏng trên bán kính, nhựa hay kim loại Các bản phẳng này có đặc điểm là trong suốt với tia tử ngoại (đến 320 mm) Giọt dung dịch mẫu nghiên cứu được nhỏ trên đường xuất phát cách ria ban 3 — 8 mm, con ria ban duge nhúng vào dung môi thích hợp Dung môi này đóng vai trò như một pha động trong sắc ký cột Dưới tác dụng của lực mao quản, dung môi sẽ chuyên động

24

đọc theo lớp hấp phụ và vận chuyển các chất với các vận tốc khác nhau đưa

đến việc tách các cấu tử Sự khuếch tán các chất trong lớp hấp phụ vừa theo

chiều đọc vừa theo chiều ngang Vì các đặc điểm kỹ thuật đó mà phương pháp sắc ký lớp mỏng còn có các tên gọi khác là: phương pháp giọt, phương pháp sắc ký dải, phương pháp sắc ký bề mặt, phương pháp sắc ký cột mở [19]

Đại lượng đặc trưng của sắc ký lớp mỏng là R/R;= X;/X: Trong đó:

- X¡ là khoảng cách từ đường xuất phát đến tâm của vét sắc ký

- X; 1A khoảng cách từ đường xuất phát đến mức dung môi sau cùng

Theo định nghĩa, R; là đại lượng đặc trưng cho hệ sắc ký lớp mong Rg

phải không phụ thuộc vào nồng độ và các yếu tố khác Tuy nhiên thực nghiệm chứng minh R¿ đo được không đủ lặp lại Nó chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố

như: chất lượng và tính hoạt động của chất hấp phụ, độ ẩm chất hấp phụ, chất lượng dung môi và các yếu tố khác đó là những yếu tô rất khó kiểm soát

Thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột Ngoài

SKIM còn dùng dé điều chế thu chất trực tiếp bằng sử dụng bản SKLM điều

chế (bản được tráng sẵn silica gel đày hơn) Sau khi chạy sắc ký người ta cạo

riêng phan silica gel có chứa chất tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt

Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất phát

hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng H;SO¿ 10% trong côn

2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ

Các phương pháp hóa lý hiện đại đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ Trong đó phải kể đến các phương

pháp phổ như: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và một phương

pháp đóng vai trò chìa khóa trong xác định cấu trúc là phổ cộng hưởng từ hạt

nhân

Phổ hồng ngoại (Infrared speciroscopy, IR)

25