Tiểu luận môn học hóa – sinh thực phẩm Đề tài Ứng dụng của enzyme cellulase trong công nghiệp thực phẩm

Nguồn gốc enzyme Cellulase Enzyme Cellulase được thu nhận từ các nguồn khác nhau: - Từ động vật đó là dịch tiết dạ dày bò hay các nhóm thân mềm: ốc sên … - Từ thực vật: trong hạt ngũ cốc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÀI TIỂU LUẬN

Môn học: Hóa – Sinh thực phẩm

ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE

TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Cán bộ giảng dạy: PGS.TS Nguyễn Thị Lâm Đoàn

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thanh Bình – 21002351

Lê Tùng Anh – 21002349

Đỗ Quang Huy – 21002378 Ngô Minh Ninh – 21002403

Võ Nguyễn Minh Quốc – 21002414

Chu Sỹ Thạch – 21002418 Ngô Bảo Ngọc – 2100

Hà Nội – 2023

Mục lục

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống đều do các protein đặc biệt xúc tác, các protein này gọi là enzym Enzym có trong mọi tế bào sống, vì vậy chúng cũng được gọi là các chất xúc tác sinh học Enzym có một vai trò đặc biệt quan trọng đối với cơ thể, nếu không có enzym thì mọi chuyển hóa trong cơ thể

sẽ bị đình trệ và con người không thể sống được Ngoài ra, enzym còn có những vai trò vô cùng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm…

Mục tiêu

Đề tài tổng quan về enzyme cellulase, ứng dụng của enzyme trong thực phẩm.

Nội dung

Bài tiểu luận thực hiện một số nội dung như sau:

1 Giới thiệu chung, nguồn gốc, cơ chế hoạt động

2 Nguồn thu nhận enzyme: từ vi sinh vật, từ thực vật và từ động vật

3 Từ cơ chế hoạt động -> ứng dụng vào lĩnh vực trong cntp như thế nào??

NỘI DUNG

PHẦN I: TỔNG QUAN VỀ ENZYME CELLULOSE

1 Giới thiệu chung

Cellulase là thành phần cơ bản của tế bào thực

vật vì vậy nó có mặt trong mọi loại rau quả,

nguyên liệu, phế liệu của các ngành trồng trọt,

lâm nghiệp

Cellulase có khả năng thủy phân cellulose

thành đường

Người và động vật không có khả năng phân hủy cellulose, nó có vai trò chất độn, có giá trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa Chế phẩm cellulase thường dùng để:

+ Tăng chất lượng thực phẩm, thức ăn gia súc

+ Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật

>> Enzyme cellulase đã được nghiên cứu rất lâu trên thế giới Đây là enzyme được ứng dụng rất rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase

2 Nguồn gốc enzyme Cellulase

Enzyme Cellulase được thu nhận từ các nguồn khác nhau:

- Từ động vật đó là dịch tiết dạ dày bò hay các nhóm thân mềm: ốc sên …

- Từ thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen

- Từ vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men

3 Cấu trúc của enzyme cellulase

Hinh 1: Cấu trúc không gian Cellulase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các

axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptit -CO-NH Ngoài ra, trong cấu trúc

còn có những phần phụ khác

Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glucoside trong cellulose

Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể

Công thức cấu tạo cơ chất cellulose của enzyme cellulase như sau:

Hình 2: Cấu trúc của cơ chất cellulose Cellulose là polysaccharide cấu tạo nên tế bào thực vật Đây là hợp chất hữu

cơ có nhiều nhất trong tự nhiên Cellulose có cấu trúc mạch thẳng, dạng sợi, được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết beta (1,4) glycoside (ở tinh bột

là cấu hình alpha) do đó trong không gian nó vẫn ở mạch thẳng

Trong quá trình phân hủy cellulose có xu tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose Điều này chứng tỏ CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong Cenllulose tinh thể

4 Tính chất

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethylcellulose (HEB) Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucoside trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc

Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau

Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5 Nhiệt

độ tối ưu từ 40-50 độ C Hoạt tính cellulose bị phá hủy hoàn toàn ở 80 độ C trong 10-15 phút

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellulose

và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulose còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ

Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30-11-Kda

5 Phân loại

Dựa vào đặc điểm cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành 3 loại

• 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

• 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

• β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

6 Cơ chế hoạt động

6.1 Cơ chế 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

Endoglucanase

Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của chuỗi

cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc

Hình 4: Cơ chế hoạt động của Exoglucanase

Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu, không khử của chuỗi

cellulose để tạo thành cellulose

6.3 Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

β-glucosidase

Enzyme này thủy phân gốc β- D- glucoside không khử ở đầu tận cùng để giải

phóng ra β- D- glucose

7 Hoạt lực của enzyme cellulase

Thủy phân của cellulose phải có sự tham gia của cả 3 loại enzyme cellulase như: endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Thiếu 1 trong 3 loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng

Các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose

Cơ chế tác động của 3 loại cellulose như sau:

• Đầu tiên endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4 glucoside và tạo ra các mạch tự do

• Tiếp đó exoglucanase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành

• Kết quả tác động của endoglucanase và exoglucanase tạo ra các cell oligo saccharic mạch ngắn, cellobiose, glucose B-glucosidase thủy phân tiếp và tạo thành glucose

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulose trong điều tự nhiên thường bị tác động bởi các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển rất yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ xảy ra rất chậm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzyme ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lượng enzyme một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệ enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau

Quá trình thủy phân cellulose chỉ có thể tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ 3 loại enzyme cellulase Mỗi loại vi sinh vật chỉ có khả năng

sinh tổng hợp ưu việt 1 loại enzyme Vì thế cần phải khai thác enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật

8 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của enzyme cellulase

8.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp một enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp Sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme thường bị kìm hãm ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme Hoạt tính của enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme là vào khoảng 40-50

- Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính

- Ở nhiệt độ thấp dưới OOG hoạt tính của enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp

8.2 Ảnh hưởng của pH

Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm, hoặc acid

- Ví dụ: pH lên hoạt tính endoglucanase từ chủng nấm ưa acid A.terreus M11, Gao

và cộng sự cho rằng enzyme này có khả nǎng hoạt động trong giải pH 2-5, trong dó

pH = 2 là tốt nhất

8.3 Ảnh hưởng của ion kim loại

Các ion KL có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzym Các ion KL nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme

- Ví dụ: ion Ca2+ làm tăng hoạt tăng hoạt tính của enzyme cellulase của Baccillus

sp D04 lên 40% so với đối chứng, còn Mg2+ làm giảm nhẹ ( hoạt tính còn lại 92%)

và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính của enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với đối chứng)

Ngoài ra các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau

- Ví dụ: các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và các axeton đều ức chế hoạt động của cellulase đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33 - 63%

PHẦN II: NGUỒN THU NHẬN ENZYME CELLULASE

1 Nguồn thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lượng enzyme , một yếu tố quan trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của hệ enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau

Quá trình thủy phân cellulase chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ các loại enzyme cellulase trong hệ enzyme cellulase Mỗi loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp ưu việt một loại enzyme Chính vì thế

ta phải khai thác enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật

Vi sinh vật phân hủy lignocellulose:

>> Enzyme Cellulase thường được tổng hợp mạnh mẽ từ các nhóm nấm mốc như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma , nhiều vi khuẩn và xạ khuẩn cũng có khả năng tổng hợp cellulase cao

Ví dụ về quá trình nuôi cấy một số chủng vi sinh vật

Vi khuẩn: Tối ưu hóa sản xuất cellulase từ vi khuẩn phân lập từ đất

Cách nuôi cấy và sản xuất vi khuẩn tổng hợp enzyme cellulase: Tối ưu hóa sản xuất Cellulase từ vi khuẩn phân lập từ đất (pH, nhiệt độ, nguồn carbon, nitơ)

Các bước thực hiện:

Bước 1: Sàng lọc và phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn sinh cellulase được phân lập từ đất bằng phương pháp đĩa đổ pha loãng hoặc phương pháp đĩa trải trên môi trường thạch CMC Các đĩa được ủ ở 45, 50 và 55°C trong 24 giờ Để hình dung vùng thủy phân, các đĩa được làm ngập trong dung dịch nước 0,1% Congo đỏ trong 15 phút và được rửa bằng 1 M NaCl [17] Để chỉ ra hoạt động cellulose của các sinh vật, người ta đo đường kính của vùng trong suốt xung quanh các khuẩn lạc trên thạch CMC (carboxymethyl cellulose) Bên cạnh đó, một phương pháp xét nghiệm định lượng hơn đã được sử dụng để xác định hoạt tính cellulose của chủng vi khuẩn được chọn trong môi trường lỏng

Bước 2: Nhận dạng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn được xác định giả định bằng phương pháp kiểm tra hình thái và một số đặc điểm sinh hóa Các thông số được nghiên cứu bao gồm hình thái khuẩn lạc, phản ứng gram, hình thành nội bào tử, sản xuất catalase, phản ứng VP, sản xuất indole, thủy phân tinh bột, sử dụng citrate và thủy phân gelatine

Bước 3: Môi trường sản xuất enzyme

Môi trường sản xuất chứa (g/L) glucose 0,5 gm, peptone 0,75 gm, FeSO4 0,01 gm, KH2PO4 0,5 gm và MgSO4 0,5 gm Các bình được khử trùng trong nồi hấp ở 121°C trong 15 phút, và sau khi làm mát, bình được cấy vi khuẩn nuôi cấy qua đêm Môi trường đã cấy được ủ ở 37°C trong tủ ấm shaker trong 24h Vào cuối giai đoạn lên men, môi trường nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 15 min để thu được dịch chiết thô, được dùng làm nguồn enzyme

Bước 4: Xét nghiệm enzyme

Hoạt độ cellulase được đo Hỗn hợp bao gồm 0,2 mL dung dịch enzyme thô cộng với 1,8 mL 0,5% carboxymethyl cellulose (CMC) trong dung dịch đệm natri photphat 50 mM (pH 7) được ủ ở 37°C trong bể nước lắc trong 30 phút Phản ứng kết thúc bằng cách thêm 3 mL thuốc thử DNS (dùng để xác định hàm lượng đường khử) Màu sắc sau đó được phát triển bằng cách đun sôi hỗn hợp trong 5 phút

→ Đo hoạt độ của enzyme

Bước 5: Tối ưu hóa quy trình để sản xuất Cellulase tối đa

pH: Bình chứa canh thang chứa nồng độ tối ưu của chất nền và nguồn carbon được lấy và độ pH của canh thang được điều chỉnh thành 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 và 11,0 trong các bình khác nhau sử dụng 1 N HCl và 1 N NaOH và khử trùng Các nền văn hóa được cấy và ủ ở nhiệt độ cụ thể Vào cuối thời gian ủ, dịch lọc nuôi cấy không

có tế bào thu được và được sử dụng làm nguồn enzyme

Nhiệt độ: Môi trường sản xuất ở pH 7 được cấy chủng vi khuẩn chọn lọc đã phát triển qua đêm Nước dùng được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 35, 40, 45, 50,

55 và 60°C trong 24h Vào cuối thời gian ủ, dịch lọc nuôi cấy không có tế bào thu được và được sử dụng làm nguồn enzyme

Nguồn Carbon: Ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau như tinh bột, glucose, maltose, lactose và fructose ở nồng độ từ 1 đến 5% đã được kiểm tra trong môi trường sản xuất

Nguồn Nitơ: Các nguồn nitơ khác nhau như chiết xuất nấm men, peptone, urê và amoni sunfat đã được kiểm tra về tác động của chúng đối với việc sản xuất enzyme bằng cách thay thế 0,5% peptone trong môi trường sản xuất

>> Kết quả thu nhận: Các vi sinh vật được phân lập và có khả năng sản xuất ra

enzyme cao là Pseudomonas fulorescens, E coli, Bacillus subtilis, và Serratia marscens

- Nhiệt độ 400C, pH=10, glucose là nguồn carbon và ammonium sulphate là nguồn nitơ Tại đó, Pseudomonas fulorescens là vi sinh vật có khả năng tạo ra sản lượng cellulase tối đa nhất

- Ảnh hưởng của các yếu tố:

Hình

Hình

Hình

PHẦN III: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE TRONG CÔNG

NGHỆ THỰC PHẨM

Sản xuất và chế biến thực phẩm đã trở thành mối quan tâm lớn của nhân loại

do biến đổi khí hậu, đô thị hóa và dân số ngày càng tăng Cần sản xuất ra thực phẩm

có kết cấu, mùi vị, màu sắc đẹp hơn, thuận tiện cho việc đóng gói và tiêu dùng

Enzyme có thể đóng một vai trò quan trọng để đạt được nhiều mục tiêu trên trong lĩnh vực thương mại Tuy nhiên, ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm vẫn chưa được thừa nhận rộng rãi Cellulase từ vi khuẩn (Paenibacillus

và Bacillus) và nấm (Trichoderma và Aspergillus) có tiềm năng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm

Có nhiều ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm, bao gồm làm mềm trái cây, làm trong công nghiệp rượu, chiết xuất dầu ô liu, chiết xuất Carotenoid, làm bánh, trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây, ngành thức ăn chăn nuôi,

1 Ngành công nghiệp rượu

Có những nghiên cứu cho thấy rằng ứng dụng của cellulase để thu được rượu vang chất lượng tốt

Trong tự nhiên, hầu hết các loại đường tồn tại dưới dạng hemicellulose và cellulose

Do đó, sinh khối cellulose có thể được sử dụng để sản xuất cồn

Vật liệu sinh học cellulose có thể được chuyển đổi thành đường có thể lên men nhờ enzyme cellulase; đường sau đó được men chuyển thành rượu

Việc sử dụng cellulase trong sản xuất rượu vang mang lại nhiều lợi ích

+ Chất lượng và độ ổn định của rượu vang được nâng cao

+ Độ trong, màu sắc tốt hơn và cải thiện quá trình ngâm

+ Cellulase cũng làm giảm độ nhớt của dịch ép

Mùi thơm của rượu vang có thể được tăng cường bằng cách sử dụng β-glucosidase thông qua quá trình thủy phân tiền chất glycosyl hóa thành glucose và aglycones Một endoglucanase dung nạp ethanol từ Aspergillus niger được phân lập từ máy lên men rượu bởi Xue et al, enzyme ổn định ở nhiệt độ cao và pH axit

(Trong hoạt động của enzyme phân giải cellulose, endoglucanase đóng vai trò nổi bật trong việc khởi xướng và duy trì quá trình thủy phân Endoglucanase phân cắt ngẫu nhiên polymer cellulose thành đường nhỏ hơn và polysacarit oligomeric Đặc tính và định lượng hoạt động của endoglucanase rất quan trọng đối với ngành công nghiệp và trong nghiên cứu tổng thể về sự phân hủy cellulose.)