Phát hiện người mang gen bệnh Β thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger

Phát hiện người mang gen bệnh Β thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger Phát hiện người mang gen bệnh Β thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger

/

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Nguyễn Phan Long

PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH -THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN SANGER

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

/

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Phan Long

PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN BỆNH -THALASSEMIA BẰNG

KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN SANGER

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS.BS Trần Vân Khánh - Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa Kỹ thuật Y học, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại Học Y Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và định hướng đề tài, cách tư duy và cách làm việc khoa học Đó là những góp ý hết sức quý báu không chỉ trong quá trình thực hiện luận văn này mà còn là hành trang tiếp bước cho tôi trong quá trình học tập và làm việc sau này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, người đã truyền đạt những kiến thức khoa học vô cùng quý báu cho tôi suốt trong suốt quá trình học tập

và nghiên cứu, dành nhiều tâm sức đào tạo, động viên, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thị Phương tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã luôn quan tâm, động viên, chỉ dạy, chia sẻ kiến thức và kinh nghiệm để em có thể hoàn chỉnh luận văn này

Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn đến tập thể các thầy, cô trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nói chung và Bộ môn Hóa sinh và sinh học phân tử nói riêng Các thầy, cô là những người dìu dắt giúp tôi có được các kiến thức khoa học cần thiết

Cuối cùng, tôi xin dành những lời cảm ơn nồng ấm tới gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn dành cho tôi những tình cảm chân thành nhất, luôn hỗ trợ tôi trong suốt quãng thời gian học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng 04 năm 2023

Học viên

Nguyễn Phan Long

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ tiếng Việt Tên đầy đủ tiếng Anh

ARMS Hệ thống đột biến nhân bản Amplification mutation system

dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate Dideoxynucleoside triphosphate EDTA Axit ethylene diamine tetraacetic Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

HBB Tiểu đơn vị Beta của hemoglobin Hemoglobin subunit Beta

HPFH Di truyền huyết sắc tố thai nhi Hereditary persistance of fetal

hemoglobin

IDA Bệnh thiếu máu do thiếu sắt Iron deficiency anemia IVS Vùng Intron (Trình tự can thiệp) Intervening sequence

MCV Thể tích hồng cầu trung bình Mean Corpuscular Volume MCH Lượng huyết sắc tố trung bình Mean Corpuscular Hemoglobin

PCR Phản ứng chuỗi Polymerase Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các dạng đột biến gây bệnh β-thalasemia thường gặp ở Việt Nam 16

Bảng 2: Đột biến phổ biến của β-thalassemia, thể bệnh và phân bố theo dân tộc 16

Bảng 3: Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 29

Bảng 4: Thành phần 1 phản ứng PCR 31

Bảng 5: Thành phần 1 phản ứng PCR giải trình tự gen 32

Bảng 6: Kết quả tách chiết DNA từ 50 mẫu nghiên cứu 34

Bảng 7: Kết quả thống kê các đột biến trên gen HBB 45

Bảng 8: Mối liên quan giữa đột biến và một số chỉ số huyết học 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Số trẻ em sinh ra mắc β-thalassemia mỗi năm trên thế giới 4

Hình 2: Kết quả điện di huyết sắc tố ở người trưởng thành mắc β-thalassemia thể trung gian 6

Hình 3: Kết quả điện di huyết sắc tố ở người trưởng thành mang gen β-thalassemia 6

Hình 4: Sơ đồ cơ chế bệnh β-thalassemia 8

Hình 5: Hình ảnh phết tế bào máu ngoại vi ở bệnh nhân β-thalassemia thể nhẹ với hình ảnh hồng cầu nhỏ nhược sắc 10

Hình 6: Cấu trúc họ gen β-globin 11

Hình 7: Cấu trúc gen HBB 12

Hình 8: Phân bố đột biến bệnh β-thalassemia trên thế giới 15

Hình 9: Biểu đồ sàng lọc người bệnh β-thalassemia 18

Hình 10: Minh hoạ kỹ thuật ARMS-PCR 20

Hình 11: Minh họa phản ứng GAP-PCR 21

Hình 12: Các bước trong phản ứng lai ngược dot blot 23

Hình 13: Cấu trúc của Deoxynucleotide (dNTP) và Dideoxynucleotide (ddNTP) 24

Hình 14: Phương pháp giải trình tự gen Sanger bằng máy tự động 26

Hình 15: Vị trí khuếch đại của các cặp mồi HBB-AB và CD trên gen HBB 29

Hình 16: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen chứa exon 1 và 2 với cặp mồi AB 36

HBB-Hình 17: HBB-Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen exon 3 với cặp mồi HBB-CD 36

Hình 18: Hình ảnh giải trình tự đột biến CD26 (mẫu bệnh nhân β2) 37

Hình 19: Hình ảnh giải trình tự đột biến CD17 (mẫu bệnh nhân β1) 38

Hình 20: Hình ảnh giải trình tự đột biến CD41/42 (mẫu bệnh nhân β7) 39

Hình 21: Hình ảnh giải trình tự đột biến CD95 (mẫu bệnh nhân β43) 39

Hình 22: Hình ảnh giải trình tự đột biến CD35 (mẫu bệnh nhân β50) 40

Hình 23: Hình ảnh giải trình tự đột biến CD71/72 (mẫu bệnh nhân β37) 41

Hình 24: Hình ảnh giải trình tự đột biến IVS-I-1 (mẫu bệnh nhân β18) 41

Hình 25: Hình ảnh giải trình tự đột biến IVS-II-654 (mẫu bệnh nhân β11) 42

Hình 26: Hình ảnh giải trình tự đột biến -28 (mẫu bệnh nhân β5) 43

Hình 27: Hình ảnh giải trình tự đột biến -88 (mẫu bệnh nhân β43) 43

Hình 28: Hình ảnh giải trình tự đột biến CD17/CD26 (mẫu bệnh nhân β47) 44

1.2 Cơ sở di truyền của β-thalassemia 3

1.3 Biểu hiện lâm sàng của bệnh 4

2.5 Chăm sóc toàn diện và điều trị biến chứng 11

3 Đột biến họ gen β-globin và gen HBB 11

3.1 Khái quát về về họ gen β-globin và gen HBB 11

3.2 Phương pháp xác định đột biến gen HBB 17

3.2.1 Phương pháp sàng lọc 17

3.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen HBB 19

3.2.2.1 Phương pháp Multiplex ARMS-PCR (Multiplex Amplification Refractory Mutation System – Polymerase Chain Reaction) 19

3.2.2.2 Kỹ thuật GAP-PCR 21

3.2.2.3 Kỹ thuật MLPA 21

3.2.2.4 Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse Dot Bloting) 22

3.2.2.5 Kỹ thuật giải trình tự Sanger 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu 28

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 28

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 28

2.3 NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 28

2.3.1 Nguyên liệu 28

2.3.2 Hoá chất 28

2.3.3 Trình tự các mồi 29

2.3.4 Thiết bị 29

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.4.1 Tách DNA từ máu toàn phần 30

2.4.2 Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA 30

2.4.3 Khuếch đại gen HBB bằng phương pháp PCR 31

2.4.4 Điện di DNA trên gel agarose 32

2.4.5 Giải trình tự gen 32

2.4.6 Xử lý số liệu 33

2.5 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 34

3.1 Đặc điểm của nhóm mẫu nghiên cứu 34

3.2 Xác định hàm lượng và độ sạch của các mẫu tách chiết DNA 34

3.3 Khuếch đại 3 exon của gen HBB 35

MỞ ĐẦU

-thalassemia (Beta-thalassemia) là một bệnh rối loạn di truyền do đột biến gen

ở tiểu đơn vị beta của hemoglobin (Haemoglobin subunit beta - HBB) Đoạn gen này

dài 1606 bp nằm trên cánh ngắn NST số 11 và các đột biến ở vùng gen này gây suy giảm tổng hợp chuỗi -globin [62] Sự suy giảm này làm thay đổi quá trình sản xuất haemoglobin (Hb) trong máu Tuỳ vào mức độ chuỗi -globin suy giảm, bệnh được chia thành 2 trường hợp: 0

(không có chuỗi -globin được tổng hợp), + (-globin được tổng hợp ít) Có hơn 350 đột biến gây bệnh -thalassemia đã được tìm ra, trong

đó phổ biến là đột biến do thay đổi một nucleotide, mất hoặc thêm nucleotide dẫn tới lệch khung đọc [28] Ở Việt Nam, có 9 đột biến được phát hiện trong quần thể, phổ biến nhất là đột biến CD17, đột biến CD26(HbE), CD42, và CD95 [14] Trong số các bệnh lý haemoglobin là -thalassemia, haemoglobin E và -thalassemia thì -

thalassemia là bệnh lý thường gặp nhất, trong đó tỉ lệ người mang gen bệnh thalassemia thay đổi từ 1,5 - 25%, tập trung hầu hết ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam [19] Những người có kiểu gen dị hợp tử thường không có biểu hiện lâm sàng

và chỉ được phát hiện thông qua xét nghiệm công thức máu Việc người mang kiểu gen dị hợp tử kết hôn và sinh con là nguyên nhân chủ yếu làm gia tăng tỷ lệ người mang allele gây bệnh trong cộng đồng Chính vì thế, việc xét nghiệm, phát hiện những người mang allele gây bệnh -thalassemia để tư vấn tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh, chẩn đoán di truyền tiền làm tổ có vai trò rất quan trọng, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng Gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử như multiplex ARMS-PCR, lai điểm ngược đã được sử dụng phổ biến, phương pháp này là loại giúp xét nghiệm sàng lọc nhanh chóng, chi phí rẻ, tuy vậy, các kỹ thuật này chỉ phát hiện được

các đột biến phổ biến đã biết trước Với hơn 350 đột biến gen HBB đã được công bố

thì kỹ thuật giải trình tự Sanger là phương pháp hiệu quả nhất để phát hiện toàn diện các đột biến đã biết cũng như đột biến mới [9] Xuất phát từ thực tế nêu trên, nghiên

cứu của luận văn này được thực hiện với mục tiêu: Xác định đột biến trên gen HBB

bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger ở những người có nguy cơ mang đột biến

gen gây bệnh và nhận xét mối liên quan giữa một số chỉ số cận lâm sàng với các dạng đột biến phát hiện được

Sự suy giảm này làm thay đổi quá trình sản xuất hemoglobin (Hb) trong máu [55]

Thalassemia là một trong những bệnh di truyền phổ biến do đột biến trên 2 gen

α-globin (HBA1 / HBA2) nằm trên nhiễm sắc thể số 16 và β-α-globin (HBB) nằm trên

nhiễm sắc thể số 11 [7,49] Dựa vào nguyên nhân đột biến ở gen α-globin hay

β-globin (HBB), bệnh được chia làm 2 nhóm là α-thalassemia và β-thalasemia

1.2 Cơ sở di truyền của β-thalassemia

-thalassemia do đột biến ở gen HBB gây nên thiếu hụt sự tổng hợp chuỗi

β-globin của Hb (được cấu thành từ hai tiểu đơn vị α-β-globin và hai tiểu đơn vị β-β-globin, viết tắt là α2β2) Tuỳ vào mức độ thiếu hụt β-globin mà bệnh được phân ra β+

thalassemia (β-globin được tổng hợp ít, khoảng 10%), và β0

thalassemia (không có β-globin được tổng hợp), ngoài ra còn có thể β++

thalassemia còn được gọi là thể in lặng (Silent) Bệnh hiện diện ở Địa Trung Hải, vùng Trung Đông, Viễn Đông cũng như ở bờ biển bắc Phi và Nam Mỹ Tần suất mang gen bệnh cao nhất được báo cáo ở Cyprus (14%), Sardinia (10,3%) và Đông Nam Á Do sự di cư của con người và kết hôn giữa các nhóm dân tộc khác nhau khiến bệnh xuất hiện ở hầu hết các quốc gia trên thế giới Người ta ước tính rằng khoảng 1,5% dân số toàn cầu (80 - 90 triệu người) là người mang gen bệnh β-thalassemia [19] Mỗi năm có khoảng 60.000 - 70.000 trẻ em sinh ra bị bệnh -thalassemia trên toàn thế giới trong đó có Việt Nam [4]

Tại Việt Nam, β-thalassemia thường gặp nhất trong các bệnh lý hemoglobin

và thường gặp là β-thalassemia, hemoglobin E và α-thalassemia, trong đó tỉ lệ người mang gen bệnh thalassemia thay đổi từ 1,5 - 25%, tập trung hầu hết ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam [7,19] Theo các nghiên cứu [7], ở Việt Nam, đột biến β0thalassemia phổ biến hơn nhiều so với đột biến β+ thalassemia β-thalassemia là bệnh

lý di truyền, người mang allele gây bệnh β-thalassemia thừa hưởng một allele bệnh từ cha hoặc mẹ Những người này không có biểu hiện gì về lâm sàng, họ phát triển trí tuệ và thể lực bình thường Những người mang allele gây bệnh trong quá trình sinh sống sẽ không phát triển thành bệnh Việc phòng bệnh β-thalassemia cần được thực hiện tại thời điểm kết hôn và sinh con Nếu 2 người cùng mang allele gây bệnh kết hôn với nhau, con sinh ra sẽ có xác suất 25% ở mức độ nặng, 50% mang gen bệnh và 25% bình thường

1.3 Biểu hiện lâm sàng của bệnh

1.3.1 Thể nặng (Major)

Là thể có kiểu gen đồng hợp tử β0/β0 Bệnh còn được gọi là bệnh thiếu máu Cooley do Thomas Cooley là người đầu tiên mô tả triệu chứng lâm sàng của bệnh vào năm 1925 -thalassemia thể nặng là thể không tổng hợp được β-globin do cả 2

allele HBB đều bị đột biến Ở kiểu gen β0/β0, điện di huyết sắc tố cho kết quả tỷ lệ HbA1 (một loại Hb thường gặp ở người trưởng thành, cấu thành từ 2 chuỗi α và 2 chuỗi β - α2β2) gần như bằng 0, HbF – Hb thai nhi - cấu thành từ 2 chuỗi α và 2 chuỗi

Hình 1: Số trẻ em sinh ra mắc β-thalassemia mỗi năm trên thế giới [12]

γ - α2γ2 chiếm tỷ lệ 95 - 98% và HbA2 (một loại Hb chỉ tìm thấy một lượng nhỏ ở người trưởng thành) chiếm 2 - 5% [18]

Triệu chứng điển hình của người mắc β-thalassemia thể nặng là chậm phát triển, xanh xao, vàng da, cơ bắp kém phát triển, gan lách to, xương thay đổi do sự mở rộng của tuỷ xương Những người này nếu không trải qua quá trình điều trị bằng các đợt truyền máu sẽ tử vong trong 5 năm đầu đời Tuy nhiên, những người đã trải qua quá trình truyền máu có thể xuất hiện triệu chứng liên quan đến tồn ứ sắt Ở trẻ em, hậu quả của tồn ứ sắt bao gồm chậm lớn, không thuần thục sinh dục Ở người lớn thường dẫn đến xơ gan, đái tháo đường và suy tuyến cận giáp, tuyến giáp, tuyến yên

và ít phổ biến hơn là tuyến thượng thận, bệnh cơ tim giãn và loạn nhịp tim là những biến chứng chính Kể cả khi được truyền máu, chỉ có 50-65% số bệnh nhân sống được đến hơn 35 tuổi ở các nước phát triển [7]

1.3.2 Thể trung gian (Intermedia)

Kiểu gen quy định thể trung gian có thể là kiểu gen β+/β+ (cả 2 allele HBB đều

tổng hợp β-globin ở mức độ thấp) hoặc β+/β0

(1 allele HBB tổng hợp β-globin ở mức độ thấp và 1 allele HBB không tổng hợp được β-globin) Một số bệnh nhân

thalassemia thể trung gian không có triệu chứng cho đến khi trưởng thành và có thể

bị thiếu máu vừa phải và không cần truyền máu thường xuyên, trong khi những bệnh nhân khác có triệu chứng từ khi trẻ 2 tuổi Sản xuất hồng cầu ở những bệnh nhân mắc chứng β-thalassemia thể trung gian có thể đủ để duy trì lượng hemoglobin từ 6 – 7 g/dL mà không cần truyền hồng cầu Các đặc điểm lâm sàng chính có thể có ở bệnh nhân thalassemia thể trung gian là phì đại tủy hồng cầu với quá trình tạo máu ở tủy

và ngoài tủy kèm theo các biến chứng (loãng xương, khối mô hồng cầu chủ yếu ảnh hưởng đến lá lách, gan, hạch bạch huyết, ngực, cột sống với biến dạng xương và những thay đổi điển hình trên khuôn mặt) và sỏi mật Gãy xương và bất thường về xương xảy ra do sự mở rộng của tủy xương hồng cầu và gan lách to do tan máu hoặc tạo máu ngoài tủy [50] Xét nghiệm huyết sắc tố ở người mang kiểu gen β+/β+, β+/β0cho thấy HbA chiếm tỷ lệ khoảng 10 – 30%, HbF chiếm khoảng 70 – 90% và HbA2

chiếm tỷ lệ khoảng 2 – 5% trong khi người bình thường có HbA khoảng 96 – 98%, HbA2 khoảng 2 – 3%, HbF khoảng 0,4 – 1% [7,18]

β-9 – 12 g/dL Điện di hemoglobin (Hình 3) cho thấy lượng HbA bình thường hoặc giảm nhẹ, tăng HbA2 và HbF có thể trong giới hạn bình thường hoặc tăng nhẹ [3,7]

Hình 2: Kết quả điện di huyết sắc tố ở người trưởng thành mắc β-thalassemia

thể trung gian [7]

Hình 3: Kết quả điện di huyết sắc tố ở người trưởng thành mang gen

β-thalassemia [7]

1.3.4 Thể kết hợp với HbE (HbE/β-thalassemia)

HbE-β-thalassemia là một bệnh thiếu máu huyết tán ở Đông Nam Á HbE là hemoglobin bất thường do đột biến ở CD26 làm biến đổi bộ 3 mã hoá Glutamine thành Lysine Ở Ấn Độ, HbE xuất hiện phổ biến với tỷ lệ mắc bệnh từ 7-50% ở vùng Đông Bắc Ấn Độ và 1-2% ở Tây Bengal [18] HbE có thể không có ý nghĩa lâm sàng nhưng sự tương tác của HbE với β-thalassemia tạo ra nhiều triệu chứng đa dạng, có thể từ nhẹ đến nặng tuỳ thuộc vào đột biến tương tác với đột biến tạo hemoglobin bất thường HbE HbE-β-thalassemia thể nặng có mức độ hemoglobin dao động từ 4 – 5 g/dL Các mức độ HbE-β-thalassemia thể nhẹ và trung bình tương ứng với nồng độ hemoglobin dao động từ 9 – 12 g/dL và 6 – 7 g/dL [18] HbE-β-thalassemia thể nặng khi hết hợp với thể bệnh β0

-thalassemia và có chỉ số HbF từ 50-70%, còn lại là HbE Thể dị hợp tử kết hợp HbE với β+

-thalassemia thường cho triệu chứng nhẹ hơn, và thể bệnh nhẹ nhất là khi kết hợp với những đột biến β+

-thalassemia như -28(A>G), CD19(G>A) mặc dù một số bệnh nhân bị đột biến IVS-I-5(G>C) và IVS-II-654(C>T)

có thể có triệu chứng nặng như HbE-β0

-thalassemia [35]

1.4 Cơ chế bệnh sinh

Các triệu chứng của β-thalassemia liên quan đến sự tổng hợp β-globin bị thiếu

hoặc không tổng hợp được β-globin do đột biến trên gen HBB Chuỗi α-globin bị dư

thừa dẫn đến sự hình thành các thể vùi dạng kết tủa, vì vậy quá trình tạo hồng cầu không hiệu quả và thời gian tồn tại của hồng cầu bị rút ngắn Khả năng tổng hợp hemoglobin bào thai (HbF) tương đối cao là một yếu tố điều chỉnh di truyền chính đối với mức độ nghiêm trọng của bệnh, với tính đa hình trong các gen khác cũng có một vai trò quan trọng Thừa sắt thứ phát do tăng cường hấp thu và truyền hồng cầu gây ra sự gia tăng sắt ở gan và trong các mô khác, dẫn đến rối loạn chức năng nội tiết

và tim [39] Sơ đồ cơ chế bệnh β-thalassemia được trình bày ở Hình 4

1.5 Chẩn đoán

1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng

-thalassemia dựa vào việc đo chỉ số tế bào hồng cầu trong máu cho kết quả thiếu máu giảm sắc tố vi mô (Microcytic hypochromic anemia) Điện di huyết sắc tố cho thấy lượng HbA giảm và lượng HbF tăng sau 12 tháng tuổi với mức độ nghiêm

trọng của thiếu máu Việc xác định các nguyên nhân gây bệnh trong gen HBB bằng

xét nghiệm di truyền phân tử có thể chuẩn đoán chính xác đối với những người có nguy cơ ở độ tuổi dưới 12 tháng tuổi có kết quả sàng lọc dương tính hoặc nghi ngờ thiếu máu giảm sắc tố vi mô không rõ nguyên nhân với các tế bào máu có kích thước

và hình dạng khác nhau (Anisopoikilocytosis) và các tế bào hồng cầu có nhân trên phết máu ngoại vi β-thalassemia thể nặng được nghi ngờ ở trẻ sơ sinh hoặc trẻ em

Hình 4: Sơ đồ cơ chế bệnh β-thalassemia [17]

dưới 2 tuổi với các phát hiện sàng lọc sơ sinh hoặc lâm sàng như sau: Thiếu máu vi mô nghiêm trọng, vàng da nhẹ, gan lách to β-thalassemia thể trung gian được nghi ngờ ở những người độ tuổi muộn hơn với các phát hiện lâm sàng tương tự nhưng mức độ nhẹ hơn, không cần điều trị truyền máu thường xuyên β-thalassemia thể nhẹ thường không có triệu chứng lâm sàng nhưng đôi khi có biểu hiện thiếu máu nhẹ [20]

1.5.2 Chẩn đoán huyết học

Các chỉ số huyết sắc tố cho thấy thiếu máu vi hồng cầu β-thalassemia thể nặng đặc trưng bởi nồng độ Hb giảm (< 7 g/dL), thể tích trung bình tế bào hồng cầu trong máu (MCV – Mean Corpuscular Volume) trong khoảng từ 50 – 70 fL (femtolitter)

và lượng huyết sắc tố trung bình trong một tế bào hồng cầu của cơ thể (MCH – Mean Corpuscular Hemoglobin) trong khoảng từ 12 – 20 pg (picogram) β-thalassemia thể trung gian được đặc trưng bởi nồng độ Hb trong khoảng 7 – 10 g/dL, MCV trong khoảng 50 – 80 fL và MCH trong khoảng 16 – 24 pg β-thalassemia thể nhẹ đặc trưng bởi sự sụt giảm MCV và MCH với HbA2 tăng [20]

1.5.3 Phết tế bào máu ngoại vi

Người bị bệnh cho thấy những thay đổi về hình thái của hồng cầu như thiếu máu vi mô tế bào, giảm sắc tố, không đồng nhất kích thước giữa các tế bào hồng cầu, tăng bạch cầu (tế bào dài, có hình giọt nước mắt) Số lượng nguyên bào hồng cầu liên quan đến mức độ thiếu máu tăng lên rõ rệt sau khi cắt lách Người mang mầm bệnh

có sự thay đổi hình thái hồng cầu ít nghiêm trọng hơn so với những người bị bệnh Nguyên bào hồng cầu thường không được nhìn thấy [20] Việc phết máu ngoại vi được coi là một phương pháp sàng lọc quan trọng đối với bệnh nhân β-thalassemia Tuy nhiên, kết quả phết tế bào máu ngoại vi chỉ có thể gợi ý một số loại bệnh tan máu bẩm sinh do các nguyên nhân thiếu máu khác như thiếu máu thiếu sắt (IDA – Iron Deficiency Anemia) hoặc thiếu máu do viêm Chuẩn đoán bằng phết tế bào máu ngoại

vi không thể xác định cụ thể một loại bệnh tan máu bẩm sinh cụ thể chỉ dựa trên hình thái hồng cầu [41]

2 Điều trị bệnh thalassemia

Biện pháp chính để điều trị bệnh thalassemia hiện nay là truyền máu và thải sắt Ngoài ra còn một số biện pháp điều trị khác như cắt lách, ghép tủy, tùy thuộc vào tình trạng cụ thể của bệnh [20]

2.1 Truyền máu

Biện pháp điều trị bằng truyền máu thường xuyên là phương thức điều trị truyền thống đối với bệnh nhân bị β-thalassemia thể nặng Phương pháp này được ra đời vào những năm 1960 Trước khi phương pháp này ra đời, bệnh nhân tử vong vì thiếu máu nặng ở độ tuổi rất trẻ Do bị thiếu máu mạn tính, bệnh nhân cần phải truyền máu định kỳ để duy trì nồng độ huyết sắc tố từ 90 -100g/L (đối với nhóm nặng phụ thuộc truyền máu) Khoảng cách giữa các lần truyền máu là 2 – 5 tuần Chế phẩm máu là khối hồng cầu, không dùng máu toàn phần

Hình 5: Hình ảnh phết tế bào máu ngoại vi ở bệnh nhân β-thalassemia thể nhẹ

với hình ảnh hồng cầu nhỏ nhược sắc [30]

2.2 Thải sắt

Thừa sắt là nguyên nhân hàng đầu gây tổn thương nội tạng Tình trạng dư thừa sắt xảy ra rất phổ biến ở những bệnh nhân truyền máu trong thời gian dài Các loại thuốc thải sắt dạng uống hiện có phần nào bị hạn chế bởi tính sẵn có, khả năng cung cấp và các vấn đề an toàn Mục đích của điều trị bằng phương pháp thải sắt nhằm chống quá tải sắt, hạn chế biến chứng tới các cơ quan trong cơ thể Bệnh nhân cần phải dùng thuốc thải sắt cả đời

2.3 Cắt lách

Liệu pháp cắt lách được chỉ định khi bệnh nhân tăng nhu cầu truyền máu, lách

to gây cản trở sinh hoạt hàng ngày của người bệnh hoặc gây đau, giảm bạch cầu hoặc tiểu cầu do cường lách

2.4 Ghép tế bào gốc

Ghép tế bào gốc là phương pháp điều trị hiện đại, có thể chữa khỏi bệnh, tuy nhiên khả năng có người phù hợp HLA là rất thấp và chi phí điều trị cho liệu pháp tế bào gốc vô cùng tốn kém Hơn nữa, nếu bệnh nhân đã bị nhiễm sắt nặng tại gan, tim,… thì tỷ lệ thành công thấp

2.5 Chăm sóc toàn diện và điều trị biến chứng

Liệu pháp chăm sóc toàn diện mục đích để phòng ngừa và hạn chế các biến chứng, nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh Điều trị biến chứng bệnh tuỳ thuộc vào biểu hiện của bệnh như rối loạn đông máu, xơ gan, loãng xương,…

3 Đột biến họ gen β-globin và gen HBB

3.1 Khái quát về về họ gen β-globin và gen HBB

Họ gen β-globin nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 11, có độ dài 60

kb gồm 5 gen chức năng là ε / Gγ / Aγ / δ / β (Hình 5) [41] Phần trước của gen

Hình 6: Cấu trúc họ gen β-globin [10]

(Upstream) là vùng kiểm soát locus (Locus Control Region - LCR) bao gồm 5 vị trí siêu nhạy với DNase I (Hypersensitive DNAse I - HS DNAse I) được đánh số từ HS1

- 5 phân bổ từ vị trí 6 kb đến 20 kb ở vùng 5’ của gen ε LCR đóng vai trò một vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen HBB bằng cách duy trì trạng thái nguyên nhiễm sắc và hoạt động như một chất tăng cường quá trình phiên mã gen; nếu không có

vùng LCR, mức độ biểu hiện gen thấp [58]

Gen HBB dài 1606 nucleotide bao gồm 3 exon và 2 intron mã hoá cho protein

β-globin dài 146 amino acid Vùng promoter có trình tự đặc hiệu để gắn với enzyme RNA polymerase và các yếu tố điều hoà phiên mã Promoter có chức năng kiểm soát

hoạt động phiên mã của gen Trong cấu trúc của gen HBB, vùng promoter kéo dài từ

vị trí -95 đến vị trí -26 của gen (nghĩa là nằm trước vị trí của mã mở đầu mã hóa cho methionin lần lượt 95 và 26 nucleotide), các trình tự đặc hiệu như hộp TATA (ở vị trí -28 đến vị trí -31), hộp CCAAT (vị trí -35 đến vị trí -76) giúp ribosome nhận biết đúng vị trí khởi đầu dịch mã, làm tăng hiệu quả phiên mã Có 2 vùng Intron (Intervening Sequence - IVS) ở giữa CD30 – 31 của exon 1 và 2 và CD104 – 105 của Exon 2 và 3 Vùng IVS1 có độ dài 122 – 130 nucleotide và vùng IVS2 có độ dài 850 – 904 nucleotide (Hình 6) [42]

Có hơn 200 đột biến gây bệnh β-thalasemia đã được tìm ra trong đó đột biến phổ biến là thay đổi một nucleotide, mất hoặc thêm oligonucleotide dẫn tới lệch khung [10].Các đột biến phổ biến trên thế giới được miêu tả ở Bảng 2 Các đột biến gây bệnh β-thalasemia gồm các nhóm chính như sau:

Hình 7: Cấu trúc gen HBB [10]

Đột biến vùng promotor và 5’UTR: Là đột biến bảo thủ ở vùng trước vị trí

bắt đầu phiên mã 100 nucleotide bao gồm hộp CACCC, CCAAT và ATAA và 50 nucleotide ở vùng không phiên mã đầu 5’ (5’ UTR) đã được phát hiện ở một số nhóm

dân tộc khác nhau Các đột biến promoter gen HBB ở hộp CCAAT gây ra kiểu hình

β-thalassemia thể nhẹ với sự thiếu hụt tương đối nhỏ trong sản xuất β-globin và sự mất cân bằng nhẹ chuỗi globin Các đột biến ở vùng khởi động (Promotor) làm giảm khả năng tổng hợp β-globin so với bình thường [21] Một số đột biến nhẹ đến mức không xuất hiện bất kỳ biểu hiện nào, bất thường duy nhất là sự mất cân bằng tổng hợp chuỗi β-globin Các đột biến không gây ra biểu hiện nào ngoại trừ đột biến -101C>T được tìm thấy khá nhiều ở khu vực Địa Trung Hải, nơi mà đột biến đó tương tác với các đột biến gây thể bệnh nặng hơn để tạo ra các dạng thể bệnh β-thalassemia nhẹ hơn Các đột biến khác bao gồm những đột biến trong 5’UTR như CAP +1A>C, các đột biến khác bao gồm các thay thế base đơn và các mất đoạn nhỏ phân bố dọc theo đoạn dài của 50 bp đã được xác định Như trong đột biến −101C > T, các thể dị hợp tử đối với loại đột biến này là "im lặng" (Slient), kiểu hình cực kỳ nhẹ được phát hiện trong thể đồng hợp tử đột biến +1A>C cho các giá trị huyết học của người mang gen bệnh thalassemia Ngoài ra còn có đột biến -29A>G cho biểu hiện bệnh cực nhẹ ở người da đen nhưng lại cho biểu hiện bệnh nặng ở người Trung Quốc Nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt này chưa được nghiên cứu nhưng có thể liên quan đến nguồn gốc nhiễm sắc thể khác nhau mà ở đó các đột biến rõ ràng giống hệt nhau phát sinh

hoặc do sự đa hình đơn C-T ở vị trí -158 của gen γG-globin (vị trí Xmn1- Gγ) có

tương tác đến việc tăng sản xuất HbF Vị trí Xmn1- Gγ có trong trình tự mang đột biến -29A>G ở người da đen nhưng lại không có ở trình tự mang đột biến -29A>G ở người Trung Quốc [59]

Đột biến ảnh hưởng đến quá trình cải biến mRNA: Các đột biến tại các

điểm cắt nối làm giảm hiệu quả của quá trình cắt nối bình thường ở các mức độ khác nhau và tạo ra kiểu hình β-thalassemia từ nhẹ đến nặng Đột biến ở vùng tiếp giáp giữa exon và intron làm cho quá trình cắt nối bị thay đổi tạo ra mRNA không có chức năng, bị phân huỷ ngay trong tế bào [21] Đột biến ở vị trí 5 vùng IVS1 làm biến đổi

nucleotide G>C/T/A làm giảm đáng kể sự liên kết ở vị trí cho đột biến so với bình thường Các đột biến dường như hoạt hoá 3 vị trí cắt nối ẩn, 2 ở Exon 1 và 1 ở vùng IVS1 Mặt khác, sự thay thế C cho T ở nucleotide liền kề - intron 1 ở vị trí 6, chỉ ảnh hưởng nhẹ đến quá trình nối RNA bình thường mặc dù nó kích hoạt ba vị trí cho khó hiểu giống như đã thấy ở đột biến IVS1-5 Mặc dù đột biến IVS1-6T>C thường liên quan đến bệnh β-thalassemia nhẹ hơn, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong một số trường hợp, các đột biến rõ ràng giống hệt nhau có thể gây mức độ nghiêm trọng; và một lần nữa, điều này có lẽ liên quan đến nhiễm sắc thể mà trên đó các đột biến đã phát sinh Ngoài ra còn có các đột biến ở vùng intron 2 như IVS2-654C>T, IVS2-705T>G, IVS2-745C>G 4 đột biến ở exon 1 có liên quan đến việc hoạt hoá các vị trí cắt thay thế 3 trong 4 đột biến biến đổi vị trí cắt từ CD24 tới CD27 để giống trình

tự cắt AAGGTGAGT Đột biến CD24(GGT>GGA) là đột biến “im lặng”, đột biến CD26(GAG>AAG) và CD27(GCC>TCC) dẫn tới tạo ra hemoglobin bất thường lần lượt là HbE và Hb Knossos Tương tự đột biến CD19A>G hoạt hoá vị trí cắt nối kéo dài từ CD17 tới CD19 dẫn tới tạo hemoglobin bất thường Hb Malay [59]

Đột biến gây ảnh hưởng tới sự tổng hợp mRNA (phiên mã): Đột biến ở vị

trí bộ 3 mở đầu ATG tạo thể bệnh β0

-thalassemia Một đột biến khác là đột biến chèn

45 nucleotide ở giữa vị trí -22 và +23 làm ảnh hưởng đến bộ 3 mở đầu phiên mã Các đột biến khác là đột biến thay thế nucleotide làm thay đổi nucleotide A,T hoặc G của bộ 3 ATG Về lý thuyết, các mRNA mã hoá cho β-Globin có thể được bắt đầu phiên

mã ở các codon xuôi dòng (downstream) tiếp theo ở các codon 21, 22 hoặc 55 Tuy nhiên, các đột biến thay thế ở codon mở đầu phiên mã được dự đoán sẽ dẫn đến kết thúc sớm quá trình phiên mã mRNA tạo ra mRNA không hoạt động và phân huỷ ngay trong tế bào Ngoài ra còn có đột biến vô nghĩa chiếm khoảng một nửa số đột biến β-thalassemia là kết quả của việc tạo bộ 3 kết thúc sớm bằng cách đột biến chèn hoặc xoá một hay vài nucleotide Đột biến điển hình là đột biến CD39(CAG > TAG) Đây

là đột biến phổ biến thứ 2 của β-thalassemia xuất hiện chủ yếu ở người dân sống ở vùng Địa Trung Hải và hầu hết xuất hiện ở những người mắc β-thalassemia ở Sardina Các đột biến lệch khung và vô nghĩa đều gây ra thể bệnh β0

-thalassemia đều dẫn đến

quá trình kết thúc sớm phiên mã ở exon 1 và 2 Ở trường hợp dị hợp tử, không có chuỗi β-globin nào được tạo thành từ allele đột biến, dẫn đến không có triệu chứng điển hình Ngược lại, mRNA đột biến tương tác với các đột biến tạo sự kết thúc ở

trình tự sau đó trên gen HBB ở Exon 3 và không trải qua quá trình phân huỷ tạo các

chuỗi β-globin bất thường, các chuỗi β-globin bất thường này sẽ kết hợp cùng với các chuỗi α-globin tạo hồng cầu kém hiệu quả dẫn đến biểu hiện nặng Những đột biến dạng này thường di truyền trội, trái hẳn với di truyền lặn – một di truyền điển hình của β-thalassemia [59]

Đột biến mất đoạn: Đột biến mất đoạn trên gen HBB rất hiếm ngoại trừ đột

biến xoá 619 bp ở đầu 3’ gen HBB, đây là đột biến phổ biển ở cộng đồng người Sind

và Punjab ở Pakistan Một nhóm các đột biến mất đoạn khác (β-thalassemia phức

hợp), ngoài gen HBB, còn liên quan đến gen δ-globin (δβ0

Ở Việt Nam, đột biến phổ biến nhất là đột biến CD17(A>T) làm bộ 3 AAG

mã hoá Lysine thành bộ 3 kết thúc TAG, CD41/42 làm mất -TTCT ở 2 bộ 3 mã hoá Phenylalanine TTCTTT, ngoài ra còn có đột biến ở CD95 thêm Adenine vào bộ 3 AAG Cả 3 đột biến nêu trên đều làm biến đổi amino acid thành bộ 3 mã hoá kết thúc

hoặc làm lệch khung đọc tạo sản phẩm β-globin không bền vững, bị phá huỷ ngay

trong tế bào tạo thể bệnh β0 Đột biến ở codon 95 còn được biết đến là đột biến Việt Nam (Vietnamese mutation) [20] Đột biến CD26 làm bộ 3 GAG thành AAG tạo ra hemoglobin bất thường HbE Có 8 loại đột biến gây bệnh β-thalasemia thường gặp ở người Việt Nam, các đột biến được miêu tả ở Bảng 1 [54]

Bảng 1: Các dạng đột biến gây bệnh β-thalasemia thường gặp ở Việt Nam [54]

Kiểu đột biến Biến đổi c.DNA Vị trí đột biến Thể bệnh

Bảng 2: Đột biến phổ biến của β-thalassemia, thể bệnh và phân bố theo dân tộc [11]

Địa trung Hải

++

3.2 Phương pháp xác định đột biến gen HBB

3.2.1 Phương pháp sàng lọc

Thông thường, các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán bệnh thalassemia và HbE bao gồm xét nghiệm sàng lọc và xét nghiệm khẳng định Các xét nghiệm sàng lọc ban đầu là những kỹ thuật đơn giản và chi phí tương đối thấp, có thể chỉ ra khả năng mắc bệnh thalassemia Các xét nghiệm này cần ít chuẩn bị mẫu nhất, nhanh chóng và có thể không cần thiết bị đo đạc đặc biệt Điều này sẽ dẫn đến chi phí thấp và phân tích thông lượng mẫu cao Tuy nhiên, các xét nghiệm sàng lọc không thể cung cấp thông tin về loại bệnh thalassemia chính xác của những người dương tính Các mẫu dương tính cần thử nghiệm khẳng định thêm trong khi các mẫu âm tính

β-có thể được loại bỏ khỏi các xét nghiệm phức tạp và tốn kém hơn

Các phương pháp sàng lọc gồm: Chẩn đoán tiểu sử của người xét nghiệm xem gia đình có ai bị mắc bệnh β-thalassemia không, các triệu chứng lâm sàng của người bệnh như vàng da, mệt mỏi,…

Xét nghiệm cận lâm sàng người mang gen bệnh: Điện di huyết sắc tố bao gồm các chỉ số máu như giá trị thể tích hồng cầu trung bình (Mean Corrospular Volume - MCV), lượng huyết sắc tố trung bình có trong một tế bào hồng cầu của cơ thể (Mean Corrospular Hemoglobin - MCH), các huyết sắc tố trong cơ thể như HbA1, HbA2, HbF và các huyết sắc tố bất thường như HbE Giá trị cut-off cho MCV và MCH lần lượt là 80 fL và 27 pg [56] Nếu MCV < 80 fL được gọi là hồng cầu nhỏ và MCH <

27 pg được gọi là hồng cầu nhược sắc, ngoài ra các chỉ số hồng cầu bất thường như HbE, HbF, HbA2 tăng lên và HbA1 giảm

Hình 9: Biểu đồ sàng lọc người bệnh β-thalassemia [12]

DCIP: Dichlorophenol Indophenol, HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography )

3.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen HBB

Với sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có nhiều phương pháp giúp xác định các loại đột biến gây bệnh β-thalassemia: Phương pháp giải trình tự gen Sanger, ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System – Polymerase Chain Reaction), lai điểm ngược (Reverse dot blot), GAP-PCR và MLPA dùng để

phát hiện các đột biến mất đoạn trên gen HBB Về cơ bản, các phương pháp trên đều

dựa trên cơ sở khuếch đại đoạn gen nghi ngờ mang gen đột biến bằng kỹ thuật PCR

3.2.2.1 Phương pháp Multiplex ARMS-PCR (Multiplex Amplification Refractory Mutation System – Polymerase Chain Reaction)

Nguyên tắc của kỹ thuật ARMS-PCR là sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng loại allele bình thường và đột biến Khi sử dụng các cặp mồi chỉ phát hiện được allele đột biến thì sẽ phát hiện được người mang allele đột biến Khi sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho 2 allele bình thường và đột biến thì sẽ phát hiện được trạng thái đột biến đồng hợp – dị hợp Mồi bình thường sẽ không gắn vào DNA có đột biến và mồi đột biến sẽ không gắn vào DNA bình thường Trên thực tế, có thể kết hợp nhiều cặp mồi, mỗi cặp mồi đặc hiệu cho một đột biến, để xác định loại đột biến của từng mẫu bệnh phẩm khi phân tích đồng thời nhiều mẫu bệnh phẩm Lúc đó kỹ thuật này được gọi là ARMS-PCR đa mồi (Multiplex ARMS-PCR) Sản phẩm của kỹ thuật ARMS-PCR đa mồi là tổ hợp của các băng DNA có kích thước khác nhau, mỗi băng sẽ tương ứng với một loại đột biến Sản phẩm ARMS-PCR đa mồi được quan sát bằng điện di agarose Kỹ thuật ARMS-PCR phù hơp để phát hiện các đột biến điểm, cho phép phân biệt được giữa mẫu không bị đột biến, mẫu đột biến đồng hợp và dị hợp Đây là kỹ thuật nhanh, ít tốn kém, không yêu cầu mồi đánh dấu và hệ thống phát hiện phực tạp Tuy nhiên, kỹ thuật ARMS-PCR chỉ có thể phát hiện được các đột biến phổ biến, đã biết rõ, các đoạn mồi suy biến có thể gắn vào các vị trí khác trong hệ gen tạo sản phẩm không đặc hiệu, do đó cần phải kết hợp với các phương pháp chẩn đoán phân tử khác như giải trình tự gen [29]

Kỹ thuật ARMS-PCR đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện

đột biễn trên gen HBB Năm 2012 tại Thái Lan, Thedsawad và cộng sự đã sử dụng

kỹ thuật ARMS-PCR để phát hiện 19 đột biến gây bệnh -thalassemia trong đó phổ biến nhất là đột biến CD41/42, CD17, -28, IVS-II-654, IVS-I-5 [57] Kỹ thuật này cũng đã được áp dụng thành công để phát hiện các đột biến mất đoạn 619 bp, CD8/9 [36] Năm 2017 tại Saudi Arabia, Abuzenadah và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để sàng lọc và xác định các đột biến gây bệnh -thalassemia hiếm gặp: -87, đột biến codon mở đầu, CD15, FSC16, FSC20/21, CD27, IVS-I-130 và IVS-II-

837 [6] Tại Việt Nam năm 2014, Trần Vân Khánh và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định đồng thời 9 đột biến gây bệnh -thalassemia cho kết quả 39/52 trường hợp mang đột biến chiếm tỷ lệ 75% [5]

Hình 10: Minh hoạ kỹ thuật ARMS-PCR [66]

tự ADN vùng biên [1] Các sản phẩm PCR được điện di và so sánh kích thước với thang chuẩn DNA và băng của chứng dương để xác định đột biến của mẫu Ứng dụng của phương pháp GAP-PCR dùng để phát hiện, sàng lọc nhanh một số mất đoạn của β-thalassemia như Hb Lepore, δβ-thalassemia, HPFH (Di truyền huyết sắc tố thai nhi – Hereditary persistance of fetal hemoglobin), mất đoạn 619 bp

3.2.2.3 Kỹ thuật MLPA

Khuếch đại đa đầu dò (Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification - MLPA) là một xét nghiệm ghép kênh để phát hiện các biến thể số lượng bản sao của trình tự DNA bộ gen Kỹ thuật MLPA được mô tả lần đầu tiên vào năm 2002 bởi Schouten J P và cộng sự, đây là phiên bản mới của phản ứng PCR, trong đó nhiều đoạn DNA đích được khuếch đại chỉ bằng 1 cặp mồi [48] Trong MLPA, trình tự đích được khuếch đại, mà là một đầu dò lai với trình tự mục tiêu, thường là trong một exon Đầu dò gồm hai nửa đầu dò, đầu dò 5’MLPA và đầu dò 3’MLPA Ngoài vị trí dành riêng cho gen đích, đầu dò còn chứa các vị trí mồi chung và trình tự nhồi Trong bước đầu

Hình 11: Minh họa phản ứng GAP-PCR với đột biến xoá đoạn Filipino với

sản phẩm PCR (màu cam), đoạn DNA bị mất (màu đen) [33]

tiên của quy trình MLPA, DNA đích được biến tính và các đầu dò MLPA được lai với gen đích Cả đầu dò 5’MLPA và đầu dò 3’MLPA lai với các chuỗi mục tiêu liền kề ngay lập tức mà không có khoảng cách Đầu dò 3’MLPA được phosphoryl hóa và do

đó, đầu dò 5’MLPA và đầu dò 3’MLPA có thể được nối thành một oligonucleotide lớn hơn Bước này chỉ có thể thực hiện được khi cả hai mồi được lai chính xác và không có khoảng cách với các mục liền kề của chúng Sau khi ligase, đầu dò hoàn chỉnh thu được được khuếch đại bằng PCR với các mồi được đánh dấu huỳnh quang liên kết với các vị trí phổ quát (Universal) của đầu dò hoàn chỉnh Việc tách các sản phẩm khuếch đại được thực hiện bởi điện di mao quản với tín hiệu huỳnh quang được phát hiện Với MLPA, hơn 40 trình tự gen khác nhau có thể được phân tích trong một thử nghiệm Mỗi đầu dò khác nhau tùy theo độ dài đoạn đệm [61] Do đó, các DNA riêng lẻ thu được cũng khác nhau về độ dài và cách nhau bởi điện di mao quản Nếu gen có đột biến xoá đoạn thì probe sẽ không lại được với gen, vì vậy probe đó sẽ không được khuếch đại Nếu gen

có đột biến lặp đoạn thì tín hiệu probe ở vùng đột biến sẽ có tín hiệu cao hơn so với bình

thường Với kỹ thuật MLPA, một số đột biến xoá đoạn mới trong locus α- và β-globin

đã được xác định như đột biến mất 1357 bp ở bệnh nhân người Đài Loan mắc thalassemia trong nghiên cứu của Huang và cộng sự [26] Kỹ thuật MLPA được coi là

β-kỹ thuật có độ nhạy cao để phát hiện các đột biến xoá đoạn và lặp đoạn

3.2.2.4 Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse Dot Bloting)

Lai điểm ngược (Reverse dot bloting – RDB) là một kỹ thuật để cố định các đầu dò oligonucleotide dành riêng cho alen trên màng nylon thay vì các mẫu DNA riêng lẻ Đây là một phương pháp không sử dụng đồng phóng xạ Ở định dạng này, nhiều cặp đầu dò ASO đột biến và bình thường được phát hiện trên các dải màng nylon Đối với mỗi xét nghiệm chẩn đoán, một dải phản ứng (Strip) chứa nhiều oligonucleotide bình thường và đột biến, được lai với một mẫu DNA cụ thể để sàng lọc nhiều đột biến [29] Các xét nghiệm lai ngược liên quan đến việc khuếch đại và đánh dấu trình tự DNA quan tâm, tiếp theo là lai giữa amplicon được đánh dấu với oligonucleotide (được gọi là các đầu dò) cố định trên màng [52] Các xét nghiệm RDB là một kỹ thuật có thể phát hiện đồng thời nhiều đa hình và có thể xác định tính không đồng nhất (Heterogeneity) trong

các gen; chính vì lý do này mà RDB đã được sử dụng thành công cho một số rối loạn

di truyền ở người Mảng DNA dựa trên màng cho các xét nghiệm RDB được chế tạo dễ dàng và mảng thăm dò trên dải phản ứng cũng đáp ứng nhu cầu xác định song song một

số đa hình của các gen quan tâm Việc xác định tín hiệu lai trong các xét nghiệm RDB rất đơn giản và hiệu quả, có thể quan sát được trực tiếp bằng mắt thường thông qua phản ứng tạo màu [28] Với ưu điểm nổi bật cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phương pháp lai điểm ngược đã được sử dụng trong phát hiện đột biến β-thalassemia Tuy nhiên, xét nghiệm RDB chỉ có thể phát hiện được những đột biến đã biết rõ, được thiết kế trong bộ kit xét nghiệm RDB và đòi hỏi phải có trình độ cao để tạo lập và đánh giá chất lượng của bộ kit

Hình 12: Các bước trong phản ứng lai ngược dot blot [28]

Với ưu điểm cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phương pháp RDB đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện đột biến β-thalassemia Kỹ thuật RDB đã được phát triển để sử dụng ở một số quốc gia Năm 1995, nghiên cứu của Sutcharitchan và cộng sự sử dụng RDB để phát hiện 14 đột biến gây bệnh β-thalassemia và các đột biến HbS, HbC ở những người Mỹ gốc Phi [53] Năm 1999 ở Thái Lan nghiên cứu của Winichagoon và cộng sự đã sử dụng RDB để xác định 10 đột biến phổ biến và 14 đột biến ít phổ biến để chẩn đoán trước sinh cho 105 thai phụ có nguy cơ sinh con mắc bệnh [65] Ở Việt Nam, năm 2016, kỹ thuật này cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu của Nguyen và cộng sự để phát hiện

3 đột biến gây bệnh là CD17, CD26 và CD41/42 [38]

3.2.2.5 Kỹ thuật giải trình tự Sanger

Giải trình tự gen là phương pháp xác định trình tự sắp xếp của 4 loại nucleotide

A, C, G, T trong phân tử DNA Năm 1977, Frederick Sanger cùng cộng sự đã phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme với nguyên lý: Sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) là một phân tử nhân tạo, có cấu trúc tương tự như phân tử deoxynucleotide (dNTP) tuy nhiên ở carbon số 3 của đường deoxyribose không phải là nhóm hydroxyl (-OH) để dừng việc tổng hợp mạch bổ sung do không hình thành được liên kết photphodiester [24]

Dựa trên nền tảng của kỹ thuật Sanger cổ điển, ngày nay các phòng xét nghiệm thường sử dụng phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động Kỹ thuật Sanger cải tiến sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang thay cho việc đánh dấu phóng xạ như trước đây đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn Mỗi loại ddNTP được gắn một màu có bước sóng phát xạ huỳnh quang khác nhau cho phép thực hiện giải trình tự trong một phản ứng duy nhất Hệ thống điện di mao quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độ đỉnh tín hiệu (Peak) trong biểu đồ Từ biểu đồ của các đỉnh tín hiệu này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với nhau và phân tích thành trình tự của các đoạn DNA [48] Phương pháp giải trình tự Sanger có khả năng phân tích đoạn DNA trên 1 kb, tất cả các đột biến hay đa hình của DNA đều có thể được xác định [1]

Ưu điểm của phương pháp này là phản ứng giải trình tự gen có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di một , từ đó tiết kiệm thời gian và công sức của người thực hiện kỹ thuật Hơn nữa, với nguyên lý trên, hầu hết các đột biến trên gen sẽ được phát hiện mà các kỹ thuật khác không phát hiện được, điều này dẫn đến ứng dụng vượt trội của phương pháp Sanger so với Multiplex ARMS-PCR là phát hiện ra những đột biến mới Tuy nhiên chi phí cao hơn so với các kỹ thuật giải trình

tự gen bằng các phương pháp khác và không được sử dụng cho những đoạn DNA quá dài [60] Giải trình tự DNA Sanger được sử dụng rộng rãi cho các mục đích nghiên cứu như: Nhắm mục tiêu các vùng gen nhỏ hơn trong số lượng mẫu lớn hơn, giải trình tự các vùng biến đổi, xác nhận kết quả từ các nghiên cứu giải trình tự thế

hệ tiếp theo (NGS), xác minh trình tự plasmid, đoạn chèn, đột biến, đánh dấu HLA, xác định kiểu gen của các marker vi vệ tinh, và xác định các biến thể di truyền gây bệnh đơn lẻ Giải trình tự chuỗi DNA cho phép phân tích trình tự nucleotide của gen hoặc vùng gen một cách chính xác

Với ưu điểm có thể phát hiện được tất cả các đột biến mà các phương pháp khác không phát hiện được, phương pháp giải trình tự gen Sanger được sử dụng để tiến hành xác định đột biến gen Hiện nay phương pháp được tiến hành trên máy tự động với bộ hoá chất đi theo kit và sử dụng mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngược) của từng cặp mồi tương ứng trước đó của phản ứng PCR Do đó, yếu tố quyết định đến kết quả giải trình tự gen là trình tự mồi và sản phẩm PCR trước đó Kết quả giải trình tự gen tốt phải có hình ảnh các đỉnh rõ nét, tín hiệu nền thấp và có độ chính xác và độ tin cậy cao Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger hiện đóng vai trò quan trọng trong việc

phát hiện các đột biến điểm gây bệnh -thalassemia trên gen HBB nói riêng và các

bệnh lý di truyền khác nói chung Phản ứng giải trình tự chỉ thực hiện trong một ống nghiệm duy nhất với 4 loại nucleotide được đánh dấu huỳnh quang riêng biệt, chỉ

Hình 14: Phương pháp giải trình tự gen Sanger bằng máy tự động [48]