Xây dựng quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn clostridium botulinum type e bằng phương pháp lamp

Xây dựng quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn clostridium botulinum type e bằng phương pháp lamp Xây dựng quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn clostridium botulinum type e bằng phương pháp lamp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHU THỊ HẢI ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN CLOSTRIDIUM

BOTULINUM TYPE E BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHU THỊ HẢI ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN CLOSTRIDIUM

BOTULINUM TYPE E BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAMP

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM BẢO YÊN

Hà Nội – Năm 2023

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến TS

Phạm Bảo Yên, người đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian

em làm thí nghiệm, định hướng giúp em giải quyết các khó khăn và giới thiệu cho em

thêm nhiều cơ hội học tập và nghiên cứu

Em xin trân trọng cảm ơn TS Lê Huy Hoàng, TS Nguyễn Thùy Trâm, ThS Tăng

Thị Nga, phòng Vi khuẩn kỵ khí Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và CN Đào Duy

Đạt nhà phân phối thiết bị LAMP ( Optigen) cùng toàn thể nhóm nghiên cứu đề tài “

Nghiên cứu sản xuất quy trình LAMP phát hiện nhanh gen độc tố của Clostridium

botulinum gây bệnh ngộ độc thịt” mã số 02/2021/ĐX đã cho phép em tham gia đề tài và

sử dụng một phần số liệu cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện và hoàn

thành luận văn này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS Trần Thị Minh Nguyệt đã quan tâm, động

viên, góp ý giúp em hoàn thành luận văn này Và em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập

thể sinh viên đang học tập và nghiên cứu trong Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ

Enzyme và Protein đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt thời gian em làm thí

nghiệm

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này, em cũng

xin cảm ơn đến các Thầy, Cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

đã tận tình giảng dạy em trong suốt quá trình học tập Phòng Enzyme học và Phân tích

hoạt tính sinh học - Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein -

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, phòng Vi khuẩn kỵ khí – Khoa Vi khuẩn - Viện

Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài này

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, tập thể sinh viên phòng 240T1

những người luôn sẵn sàng sẻ chia, giúp đỡ em trong học tập và cuộc sống, luôn bên

cạnh động viên, hỗ trợ em trong quá trình hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 1 tháng 3 năm 2023

Chu Thị Hải Anh

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu, chữ viết tắt Viết đầy đủ

( độc tố type E)

C botulinum Clostridium botulinum

(Trung tâm kiểm soát bệnh tật)

EDTA

ELISA

Ethylenediaminetetraacetic acid Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

(Phản ứng chuỗi Polymerase) TAE Tris-acetate-Ethylenediaminetetraacetic acid

WHO

LAMP

World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) Loop-mediated isothermal amplification ( Khuếch đại đẳng nhiệt vòng LAMP) RT-LAMP Reverse transcriptase LAMP

(Khuếch đại đẳng nhiệt vòng LAMP phiên mã ngược) NAAT Nucleic acid amplification test

( Khuếch đại axit nucleic)

emPCR Emulsion PCR

Tm Melting temperature

( Nhiệt độ nóng chảy)

Bst polymerase Bacillus stearothermophilus polymerase

NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia)

(Mồi vòng lặp xuôi)

LB Loop backward

( Mồi vòng lặp ngược) FIP Forward inner primer

(Mồi xuôi bên trong)

BIP Backward inner primer

( Mồi ngược bên trong)

( Giải trình tự thế hệ tiếp theo)

( Tia cực tím)

1.3: Độc tố botulinum

3.1.2: Trình tự và thông số bộ mồi

Hình 3.10: Kết quả phát hiện C.botulinum type E bằng phản ứng

Hình 3.13: Giới hạn phát hiện của phương pháp LAMP trong phát hiện gen độc tố của

vi khuẩn C botulinum type

Vi khuẩn Clostridium botulinum sản xuất độc tố thần kinh botulinum có độc tính

mạnh gây tử vong ở người với lượng nhỏ chỉ với 25-50 ng chất độc Độc tố botulinum

của Clostridium botulinum được phân loại thành bảy kiểu huyết thanh ký hiệu từ A đến

G và trên 40 kiểu phụ Tuy nhiên hệ thống này đã dần thay thế, dựa vào thông tin kiểu

gen và kiểu hình Clostridium botulinum được phân thành 4 nhóm khác nhau đánh số từ I-IV C.botulinum nhóm I là nhóm phân cắt protein và tạo ra độc tố phổ biến nhất là A

và B trong khi F ít gặp hơn cả Nhóm II không phân cắt protein và tạo ra độc tố B, E hoặc F Thông thường, nhóm I, II gây độc tố trên người, nhóm III gây bệnh trên động vật, nhóm IV thường không gây bệnh

Từ năm 2019 trở về trước Việt Nam chưa từng có báo cáo ca bệnh nào liên quan đến ngộ độc botulinum cho đến năm 2020 đến nay đã xuất hiện 4 vụ ngộ độc xảy rất nghiêm trọng gây tử vong ở người Điển hình là vụ ngộ độc thịt có liên quan đến pate chay với sự xuất hiện hơn 40 ca bệnh ở nhiều tỉnh thành trong cả nước như Nam Định, Quảng Ninh, Hà Nội và hai vụ ngộ độc thịt khác xảy ra vào tháng 3 năm 2021 tại hai

tỉnh Kon Tum (3 ca bệnh), Bình Dương (4 ca bệnh), v.v Clostridium botulinum type

E là loại phổ biến nhất trong môi trường nước ở phía bắc vùng cận bắc cực và ôn đới Trong thời gian 1973-1998, tổng cộng có 814 ca bệnh và trung bình hàng năm có

24 ca bệnh (khoảng 14-94 trường hợp) ngộ độc thực phẩm đã được báo cáo cho CDC ( 1 ); 236 (29%) trường hợp này xảy ra ở Alaska (CDC, 2003) và các ca bệnh đều được xác định là độc tố type E

Phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện BoNT là xét nghiệm sinh học trên chuột Bên cạnh đó, xét nghiệm miễn dịch ELISA, nuôi cấy và khuếch đại chuỗi polymerase cũng được sử dụng để phát hiện BoNT song tất cả các phương pháp này đều có nhược điểm chung là thời gian cho kết quả muộn, độ nhạy, độ chính xác không cao dẫn đến điều trị không kịp thời và làm tăng nguy cơ tử vong LAMP là một kỹ thuật khuếch đại axit nucleic diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt (trong khoảng 60-65˚C) Khi được tối ưu, phản ứng LAMP có thể đạt ngưỡng bão hòa với nồng độ khuôn từ vài bản sao với thời gian dưới 30 phút, cho phép phát hiện nhanh hơn với giới hạn phát hiện thấp hơn 100 lần so với PCR Trong phương pháp Nucleic acid amplification test, việc thiết lập đối chứng dương là một yêu cầu tiên quyết đối với phản ứng khuếch đại

Vì vậy, nhóm nghiên cứu đặt ra mục tiêu là xây dựng quy trình LAMP phát hiện

Clostridium botulinum type E bao gồm tổng hợp mẫu chuẩn plasmid chứa đoạn gen mã

hóa độc tố botulinum type E trong điều kiện ở Việt Nam chưa thể phân lập được vi

khuẩn Clostridium botulinum type E, đồng thời thiết kế bộ mồi và tối ưu phản ứng

LAMP cũng như thử nghiệm trên mẫu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1: Vi khuẩn Clostridium botulinum và ngộ độc botulinum

1.1.1: Đặc điểm vi khuẩn Clostridium botulinum

Clostridia bao gồm khoảng 180 loài, chi Clostridium là một trong những chi vi khuẩn

lớn nhất [18] Trong đó, Clostridium perfringens, gây ngộ độc thực phẩm, hoại tử khí

và viêm hoại tử; Clostridium tetani gây bệnh uốn ván và Clostridium sordellii gây nhiễm trùng dẫn đến tử vong sau phá thai Phổ biến hơn cả là Clostridium botulinum

gây ngộ độc thịt [18,64]

Vi khuẩn thuộc chi Clostridium thường được định nghĩa là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc,

có quá trình trao đổi chất không phụ thuộc vào oxy và có thể bị tiêu diệt khi tiếp xúc với oxy hoặc hình thành bào tử kháng thuốc nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng khi điều kiện trở nên thuận lợi Trong quá trình sinh trưởng sinh dưỡng, các loài clostridia sinh độc tố tạo ra độc tố Do đó, mặc dù các bào tử clostridia thường được phân lập từ môi trường

và các sản phẩm thực phẩm trong điều kiện kị khí trong khí quyển bình thường, sự nảy mầm của bào tử và sự phát triển sinh dưỡng và sự sản sinh độc tố của các loài sinh độc

tố chỉ xảy ra khi không có oxy [13]

C botulinum (C botulinum) là trực khuẩn kỵ khí tuyệt đối, có khả năng di động và

sinh bào tử Bào tử hình oval, ở gần đầu nên làm cho tế bào phồng lên Trên tiêu bản nhuộm gram, vi khuẩn bắt màu gram dương, có hình dạng thẳng hoặc hơi cong, kích thước chiều rộng 0,5 – 2 µm, chiều dài 1,6 – 22 µm, có nha bào ở gần tận cùng, thường đứng đơn và ít khi xuất hiện cặp đôi hoặc chuỗi ngắn [12]

Nội bào tử C.botulinum rất bền với áp lực môi trường như nhiệt độ và độ axit cao

có thể trở nên hoạt hóa trong môi trường yếm khí hay độ axit thấp (pH > 4,6), độ ẩm cao và ở nhiệt độ từ 40˚F đến 250˚F (4˚C đến 121˚C) [64] Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, bào tử cho phép vi khuẩn tồn tại trong một thời gian dài ở trạng thái không

hoạt động cho đến khi gặp điều kiện thuận lợi hơn C botulinum sẽ không phát triển

trong điều kiện axit (pH nhỏ hơn 4,6) do đó độc tố sẽ không được hình thành trong thực phẩm có tính axit (tuy nhiên, độ pH thấp sẽ không phân hủy bất kỳ độc tố nào được hình thành trước đó) Trong thực phẩm có hàm lượng axit thấp, khi độ pH không đủ axit để

ngăn cản sự phát triển của C botulinum , tuy nhiên, độ pH dưới mức tối ưu có thể góp

phần vào hệ thống bảo quản dựa trên sự kết hợp của các yếu tố ức chế Cạnh đó, các nội bào tử này rất bền với áp lực môi trường khác như nhiệt độ từ 4°C đến 121°C theo Sobel

và cộng sự 2004 cụ thể nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển và sản sinh độc tố của các chủng phân giải protein là gần 35°C , đối với các chủng không phân giải protein là 26-28°C Các loại B, E, F không phân giải protein có thể tạo độc tố ở nhiệt độ 3-4°C [15,64]

Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn C botulinum dưới kính hiển vi điện tử [81]

1.1.2: Phân loại vi khuẩn C.botulinum

Dựa vào đặc điểm huyết thanh, độc tố thần kinh của C botulinum được chia thành

8 kiểu huyết thanh kí hiệu từ A đến H có cấu trúc tương tự nhưng khác nhau về mặt

kháng nguyên [47] Các loại kháng nguyên của C botulinum được xác định bằng cách

trung hòa hoàn toàn độc tố của tạo ra bằng cách sử dụng kháng độc tố tương đồng Một

số chủng tiết ra hai loại độc tố, tức là Ba, Ab, Bf và Af (chữ in hoa biểu thị loại độc tố chính) Nói chung, các kiểu huyết thanh A, B, E có liên quan đến các trường hợp ngộ

độ lâm sàng ở người nhưng hiếm khi xảy ra kiểu huyết thanh F, trong số 8 kiểu huyết thanh thì A và B là độc nhất [78]

Dựa vào kiểu gen và kiểu hình C botulinum được chia làm 4 nhóm riêng biệt đánh

số từ I-IV [12] ( Hình 1.2)

Các chủng C botulinum nhóm I là nhóm phổ biến nhất, có khả năng phân giải

protein, đường hóa và sản xuất BoNT loại A, B và F [12,47]

Các chủng C botulinum nhóm II không phân giải protein, có mô hình chuyển hóa

carbohydrate khác với các nhóm không phân giải protein C, D và sản xuất BoNT loại

B, E, F, bên cạnh đó C botulinum nhóm II có mức độ phổ biến ít hơn so với C botulinum nhóm I [47]

Các chủng nhóm III sản xuất BoNT loại C và D không phân giải protein trên lòng trắng trứng đông tụ hoặc thịt và có một mô hình trao đổi chất chung khiến chúng khác biệt với các loại khác Trong đó độc tố loại C chủ yếu gây ngộ độc ở chim, độc tố D có thể gây ngộ độc ở các loài động vật khác nhau [69]

Các chủng nhóm IV cũng được xác định là Clostridium argentinense , tạo ra BoNT loại G, độc tố này thường không gây bệnh và Clostridium argentinense được báo cáo là

ít phổ biến hơn cả trong 4 nhóm [12,69]

Hình 1.2: Phân loại Clostridium botulinum [84]

1.2 Thực trạng ngộ độc

1.2.1: Trên thế giới

Botulinum toxin là một chất độc thần kinh được sản xuất từ C botulinum trong

điều kiện yếm khí và là nguyên nhân gây ngộ độc thịt Trường hợp ngộ độc thịt đầu tiên được cho là xảy ra vào năm 1735

Tại Hoa Kỳ trong 5 năm từ 2011 đến 2015, trung bình có 162 trường hợp ngộ độc hàng năm được báo cáo Tỷ lệ tương ứng của từng loại ngộ độc dao động từ 71% đến 88% đối với ngộ độc ở trẻ sơ sinh, 1% đến 20% đối với ngộ độc thực phẩm, 5% -10% đối với ngộ độc vết thương và 1% đến 4% đối với ngộ độc do nguyên nhân khác hoặc không rõ nguồn gốc Ngoại trừ các đợt bùng phát lớn, hiếm gặp (ví dụ: đợt bùng phát ngộ độc thực phẩm ở Ohio vào tháng 4 năm 2015 chỉ chiếm 27 trường hợp), tổng số trường hợp ngộ độc thịt vẫn tương đối ổn định trong 10 năm qua Năm 2018, các sở y

tế Hoa Kỳ đã báo cáo 242 trường hợp ngộ độc cho CDC Trong số đó, 162 (67%) trẻ sơ sinh, 61 (25%) vết thương, 18 (7%) do thực phẩm và 1 (<1%) khác, được chẩn đoán là

có khả năng bị xâm lấn đường ruột ở người trưởng thành Bệnh ngộ độc ở trẻ sơ sinh loại Bf rất hiếm gặp; trước đó, chỉ có 13 trường hợp ở Hoa Kỳ được báo cáo (7 ở California, 5 ở Texas, 1 ở New Mexico) [15,16]

Số liệu của Nhật Bản từ năm 1976-2006 đã báo cáo 20 trường hợp bệnh ngộ độc thịt [75] Ở miền bắc Thái Lan vụ dịch ngộ độc thịt xảy ra ngày 14/3/2006 là vụ lớn nhất cho đến nay với 209 người mắc bệnh [75] Trong đó 42 người suy hô hấp và 25 người được chuyển về 9 bệnh viện hiện đại để điều trị Trung Quốc cũng đã có những báo cáo

ca bệnh ngộ độc thịt lẻ tẻ [77]

1.2.2: Thực trạng ngộ độc trong nước

Tháng 8 năm 2020 trên phạm vi nhiều tỉnh thành trong cả nước đã có xuất hiện nhiều

ca nghi ngờ bệnh ngộ độc thịt đến khám và điều trị tại các bệnh viện (bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện bệnh Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, bệnh viện Chợ Rẫy, bệnh viện

Đa khoa Vĩnh Đức ở Quảng Nam) Điển hình là chùm ca bệnh là 2 vợ chồng ăn pate Minh Chay, xuất hiện triệu chứng tăng tiết đờm dãi, khó nuốt, khó thở, tê yếu 2 tay, sụp

mí mắt 2 bên, nhìn mờ và phải thở máy Tuy nhiên gần 2 tuần sau mẫu pate và mẫu phân bệnh nhân mới được gửi tới phòng Thí nghiệm Vi khuẩn Kỵ khí xét nghiệm (mẫu pate

dương tính với C botulinum độc tố B và mẫu phân âm tính với C botulinum) Việt Nam hiện cũng chưa sẵn có thuốc điều trị đặc hiệu (kháng độc tố C botulinum), bệnh nhân

phải chờ nhập thuốc từ nước ngoài, nên bệnh tình càng trầm trọng

1.3: Độc tố botulinum

Botulinum là một protein thuộc nhóm neurotoxin do vi khuẩn Clostridium botulinum tạo ra Có công thức phân tử là C6760 H10447N1743O2010S32, là chất độc gây chết người mạnh nhất từng được biết, với liều gây chết trung bình (LD50) ở người khoảng 1,3-2,1 ng/kg tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp và 10-13 ng/kg khi hít vào

Tất cả các chất độc thần kinh botulinum được sản xuất dưới dạng các chuỗi polypeptide đơn, hầu như không hoạt động với khối lượng phân tử khoảng 150 kDa với mức độ tương đồng trình tự axit amin cao giữa các chất độc các loại Chuỗi polypeptide bao gồm chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) lần lượt vào khoảng 100 và 50 kDa, được liên kết với nhau bằng liên kết disulfua Phức hợp chất độc thần kinh độc tố botulinum cũng được liên kết với nhiều loại protein không độc hại khác, cũng có thể có đặc tính ngưng kết hồng cầu [12]

Hình 1.3: Mô hình chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của độc tố botulinum [82]

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, chất độc thần kinh được hấp thụ vào máu và tuần hoàn bạch huyết, sau đó đưa chất độc đến các đầu dây thần kinh vận động, nơi nó ngăn chặn quá trình giải phóng chất dẫn truyền thần kinh Các triệu chứng lâm sàng điển hình của tất cả các dạng ngộ độc thịt bao gồm tê liệt cơ sọ, chẳng hạn như nhìn đôi và giãn đồng tử, nói lắp, khô miệng, khó nuốt và nói, liệt mặt Khi bệnh tiến triển, tê liệt tay

chân và rối loạn chức năng hô hấp trở nên rõ ràng Liệt cơ hô hấp có thể dẫn đến tử vong Sự phục hồi xảy ra khi các đầu dây thần kinh tạm thời mọc lên khi hoạt động khớp thần kinh của dây thần kinh ban đầu tái sinh Thời gian phục hồi có thể kéo dài vài tuần đến vài tháng và phụ thuộc vào lượng độc tố ăn vào và ở mức độ thấp hơn là vào loại độc tố được đề cập Độc tố loại A có xu hướng mạnh hơn loại B và E và gây bệnh lâu dài nhất [51, 21]

1.4: Vi khuẩn Clostridium botulinum type E

1.4.1: Đặc điểm của Clostridium botulinum type E

Clostridium botulinum type E là vi khuẩn gram dương kỵ khí hình que sinh bào

tử Do có đặc điểm kiểu hình, chẳng hạn như không có khả năng tiêu hóa casein,

nên được phân vào C botulinum nhóm II không phân giải protein Nhiệt độ tối thiểu

để tăng trưởng và sản xuất độc tố đã được báo cáo là 3,3˚C Tuy nhiên, trong một nghiên cứu gần đây, sự sinh trưởng và sản sinh độc tố được mô tả ở 3,0-3,2˚C Khoảng nhiệt độ 25-37˚C là tối ưu cho sinh trưởng Loại E chịu đựng nồng độ NaCl trong pha nước lên đến 5%, tương ứng với giá trị aW là 0,97 Độ pH tối thiểu cho

sự phát triển là 4,8, với mức tối ưu là 6,8 đến 7,0 Tuy nhiên, ảnh hưởng của pH phụ thuộc vào các thành phần tăng trưởng khác [31]

1.4.2: Cấu trúc độc tố type E

C botulinum loại E chiếm ưu thế trong môi trường nước Khác với các kiểu độc tố trên cạn của C botulinum trong sự sắp xếp của cụm gen độc tố thần kinh Theo nghiên cứu Kubota và cộng sự cho thấy ở chủng C botulinum Iwanai, các gen

orfx2 , orfx1 và p47 được sắp xếp tuần tự ở khu vực đầu của cụm gen độc tố thần kinh loại E Một phần orfx2 (676 bp) được tìm thấy ở khu vực đầu của cụm gen có cùng hướng với orfx1 , trong khi p47 nằm ngay phía trên của ntnh và có hướng ngược lại

với orfx2và orfx1[44] Chủng Clostridium butyricum sản sinh độc tố thần kinh loại

E BL6340 đã được chứng minh là giống hệt với C botulinum Iwanai trong cách sắp xếp

gen độc tố Cho đến nay, không còn trình tự nào của cụm gen độc tố thần kinh loại E nữa và trình tự của gen orfx2 hoàn chỉnh cũng như vùng ngược dòng của orfx2 trong các chủng loại E vẫn chưa được biết Các chủng loại A2 và F có các gen

orfx2 , orfx1 và p47 tương tự như các loại E nhưng có một gen điều hòa, botR , nằm giữa các gen orfx1 và p47 (Hình 1.4) [44, 40]

Trình tự nucleotide của bont/ E đã được công bố cho 36 chủng BoNT bao gồm một chuỗi nhẹ (∼50 kDa) và một chuỗi nặng (∼100 kDa), được liên kết với nhau bằng liên

kết disulfua [40] BoNT được tạo ra bởi các loại C botulinum khác nhau có chung cấu

trúc và trình tự tương đồng Chuỗi nhẹ là một metallicoprotease, trong khi các nửa đầu

C và N của chuỗi nặng được liên kết với sự liên kết đặc hiệu thần kinh và chuyển vị trí vào bào tương của tế bào thần kinh, tương ứng Bất kỳ biến thể nào trong trình tự axit amin trong các vùng chức năng này đều đủ để ảnh hưởng đến cấu trúc, chức năng và đặc tính kháng nguyên của phức hợp BoNT [40,44,45]

Hình 1.4: Sơ đồ biểu diễn cụm gen độc tố thần kinh ở các chủng C botulinum loại E,

A1 và A2 [80]

1.4.3: Phân bố và thực trạng ngộ độc type E

1.4.3.1: Phân bố C.botulinum type E

Trong các cuộc khảo sát được thực hiện ở Phần Lan, tỷ lệ nhiễm C botulinum type

E cao đã được phát hiện trong các mẫu trầm tích ở trang trại cá, nước ngọt và biển Baltic Không có kiểu huyết thanh nào khác được tìm thấy Tỷ lệ nhiễm loại E trong cá sống thay đổi từ 10 đến 40%, tùy thuộc vào loài cá được nghiên cứu Ở cấp độ bán lẻ, 5% sản phẩm thủy sản đóng gói chân không và 3% sản phẩm thủy sản đóng gói không hút chân không dương tính với bào tử loại E Và các phương pháp chế biến cá hiện tại

không đủ để loại bỏ các bào tử khỏi cá sống Một loạt các đợt bùng phát gần đây ở Bắc

Âu đã chứng minh nguy cơ ngộ độc gia tăng liên quan đến các sản phẩm thủy sản Bởi

vì chúng có thời hạn sử dụng dài, nhiều sản phẩm được phân phối trên toàn quốc và quốc tế, tạo điều kiện cho sự lây lan của mầm bệnh gây ô nhiễm thực phẩm đến một khu vực địa lý rất rộng và do đó làm phức tạp việc điều tra khả năng bùng phát ngộ độc thực

phẩm Đa dạng sinh học di truyền rộng rãi được quan sát thấy giữa C botulinum các

chủng phân lập loại E và việc sử dụng các phương pháp phân loại phân tử trong việc điều tra các vấn đề dịch tễ học do loại E gây ra Việc phân nhóm các chủng phân lập tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu ô nhiễm cả ở trang trại cá và trong ngành công nghiệp thực phẩm [80]

Trong nghiên cứu cứu Ying Chen và cộng sự năm 2007 có tổng số 33 chủng

clostridia sản sinh BoNT/E đã được phân tích Các chủng này bao gồm 14 chủng C botulinum loại E có nguồn gốc chủ yếu từ Phần Lan và 19 chủng C botulinum và C butyricum có trình tự bont /E có sẵn trong Ngân hàng gen Theo nghiên cứu này 33

chủng sản sinh độc tố botolinum type E có thể được phân loại thành 6 phân nhóm dựa

trên trình tự nucleotide của bont /E ( Hình 1.5) Năm chủng Phần Lan và bốn chủng C botulinum khác có nguồn gốc đa dạng đã hình thành phân nhóm E1 Tất cả các chủng này giống hệt nhau về trình tự gen bont /E, ngoại trừ C botulinum Beluga (số truy cập GenBank X62089 ), cho thấy sự khác biệt 1% Phân nhóm E2 chỉ bao gồm một chủng C botulinum E544 ( EF028404 ), trong khi phân nhóm E3 bao gồm sáu chủng C botulinum từ Phần Lan, Đức và Hoa Kỳ Ngoại trừ chủng 31-2570, các chủng trong phân nhóm E3 có gen bont /E giống nhau 100% Tất cả các chủng C butyricum hình

thành các phân nhóm E4 và E5, với E4 bao gồm ATCC 43755 (X62088 ), BL5262 ( AB088207 ) và BL6340 ( AB039264 ) Tiểu loại E5 là một nhóm thống nhất chứa 11

chủng C butyricum Một phân nhóm chưa được xác định trước đó được chỉ định là E6 bao gồm ba chủng C botulinum có nguồn gốc từ Phần Lan [80]

Hình 1.5: Sự đa dạng của độc tố type E [80]

Phân tích tương đồng của trình tự nucleotide và axit amin của BoNT/E trong và giữa sáu phân nhóm ( Hình 1.5) Các chủng trong một phân nhóm chỉ có 1% khác biệt về trình tự nucleotide và axit amin, trong khi sự khác biệt lần lượt là 1 đến 3% và 1 đến 5%

về trình tự nucleotide và axit amin, được quan sát thấy giữa bốn phân nhóm của C botulinum Giữa các phân nhóm C botulinum và C butyricum , sự khác biệt lần lượt là

2 đến 3% và 3 đến 6% trong trình tự nucleotide và axit amin đã được quan sát Ngoài

ra, hai phân nhóm C butyricum có sự khác biệt tương ứng là 3% và 5% trong trình tự

axit amin và nucleotide của chúng

Mức độ phổ biến trong môi trường

Type E là loại huyết thanh C botulinum phổ biến nhất trong môi trường nước ở

phía bắc vùng cận bắc cực và ôn đới Tỷ lệ mắc bệnh cao đã được xác định từ trầm tích biển vùng nước ven biển của Canada, Alaska, Greenland và Nga Khu vực Biển Baltic dường như có mức độ ô nhiễm cao nhất trong thế giới, với 81% đến 100%

các mẫu trầm tích dương tính với loại E Các trầm tích nước ngọt ở các khu vực khác nhau của thế giới, chẳng hạn như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Thụy Điển và Phần Lan, cũng được phát hiện chứa độc tố type E Các nghiên cứu được thực hiện ở Đức, Đan Mạch và Phần Lan đã cho thấy đáy trại nuôi cá hồi bị nhiễm trầm tích ở mức 29 đến 68% Có ý kiến cho rằng loại E trong môi trường biển có nguồn gốc lục địa và các bào

tử được mang ra biển trong nước thải ra từ các vùng đất rộng lớn kết luận rằng

Clostridium botulinum type E là một sinh vật sống dưới nước thực sự, vì rất ít bào

tử loại E được tìm thấy trong đất trên cạn Type E phát triển tốt trong xác cá, động vật

có vú và động vật không xương sống ở biển và những sinh vật này cũng mang bào tử trong ruột của chúng Nước là một yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến phân bố bào

tử qua môi trường biển [35,36,37]

Trong cá chưa chế biến

Các nhà khoa học đã chứng minh rằng cá tạp được xử lý không phù hợp để sử dụng

để làm thức ăn cho cá hồi nuôi vì có thể gây tổn thất nghiêm trọng do cá hồi nhiễm độc loại E [35] Năm1969, Houghtby và cộng sự đã báo cáo tỷ lệ nhiễm loại E thấp 1 và 7% trong cá hồi đánh bắt từ sông và vùng nước ven biển ở Alaska và Tây Bắc Thái Bình Dương của Hoa Kỳ

Năm 1965 theo một báo cáo của và cộng sự báo cáo rằng 54% cá trích đánh bắt từ vùng biển Na Uy dương tính với loại E Năm 1963 Johannsen và cộng sự đã báo cáo mức độ ô nhiễm là 81% đối với cá trích đánh bắt từ vùng biển ven biển Thụy Điển ở biển Baltic [38] Năm 1979, Huss và cộng sự đã nghiên cứu cá trích từ vùng biển ven biển Đan Mạch và chỉ tìm thấy 4% mẫu dương tính [35]

Các nghiên cứu về sự phổ biến của loại E ở cá hoang dã nước ngọt châu Âu còn hạn chế Các nghiên cứu duy nhất được thực hiện cho đến nay không phát hiện được bất kỳ loài cá nào bị nhiễm độc tố loại E Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chứng minh tỷ lệ

cá hồi nuôi ở môi trường nước ngọt bị ô nhiễm độc tố loại E với mức 7% ở Vương quốc Anh [11], 11% ở Na Uy [72], 65% ở Đan Mạch [35], và 16% ở Phần Lan [28]

Trong sản phẩm thủy hải sản chế biến

Mặc dù có bằng chứng đáng kể về việc cá tươi thường xuyên bị nhiễm C botulinum

E ở một số vùng, chỉ có một lượng nhỏ dữ liệu cập nhật liên quan đến tỷ lệ mắc bệnh

của sinh vật trong sản phẩm thủy sản Hầu hết các cuộc điều tra đã được thực hiện vào những năm 1960 và kể từ đó thực hành chế biến cá đã được hiện đại hóa và các quy định mới liên quan đến vệ sinh thực phẩm được ban hành

Tuy nhiên, một nghiên cứu của Heinitz và cộng sự đã không phát hiện được các mẫu dương tính trong bất kỳ sản phẩm nào trong số 201 sản phẩm lạnh và đóng gói chân không các sản phẩm bán lẻ cá và động vật có vỏ hun khói nóng ở các vùng khác nhau của Hoa Kỳ [30] Tương tự, không có mẫu nào trong số hàng trăm mẫu cá hun khói

nóng và lạnh thu được từ các cửa hàng bán lẻ ở vùng Toronto của Canada có chứa C botulinum [18]

Ở châu Âu, tỷ lệ lưu hành loại E chỉ được nghiên cứu ở Vương quốc Anh và một số

nước khu vực biển Baltic C botulinum không được phát hiện trong hơn 200 mẫu các

sản phẩm thủy sản đóng gói chân không được mua ngẫu nhiên từ các cửa hàng ở Anh [31] Trong một nghiên cứu khác, 0,8% trong số 646 mẫu cá trích hun khói lạnh được đóng gói chân không là bị ô nhiễm bởi loại E Trong một nghiên cứu gần đây hơn, tất

cả 82 mẫu chân không cá hồi và cá thu hun khói nóng được đóng gói mua từ các cửa

hàng bán lẻ ở Anh được âm tính với C Botulinum [23] Ở Thụy Điển, năm 1965

Johannsen và cộng sự đã nghiên cứu 144 mẫu cá trích hun khói nóng và phát hiện 4,2% dương tính với loại E [38] Lươn Thụy Điển hun khói xử lý ở 55˚ C trong 2 giờ và ở 60˚ C trong 30 phút vẫn bị nhiễm tạp chất bào tử loại E [1] Ở Đan Mạch, 5% cá hồi hun khói nóng được phát hiện là dương tính với loại E ngay sau khi xử lý không có thông tin có liên quan đến sự phổ biến của loại E trong các sản phẩm thủy sản của Phần Lan [36]

1.4.4: Thực trạng ngộ độc type E

1.4.4.1: Trên thế giới

Trong thời gian 1973-1998, tổng cộng có 814 ca bệnh và trung bình hàng năm có

24 ca bệnh (khoảng: 14-94 trường hợp) ngộ độc thực phẩm đã được báo cáo cho CDC; 236 (29%) trường hợp này xảy ra ở Alaska (CDC, dữ liệu chưa công bố, 2003) Mặc dù ngộ độc thịt là một bệnh hiếm gặp, nhưng biểu hiện của nó rất khác biệt

Ở Hoa Kỳ từ năm 1990 đến năm 1996, các đợt bùng phát ngộ độc thịt thường do loại A (44,6%), tiếp theo là loại E (35,7%) và loại B (12,5%) Năm tiểu bang miền Tây (California, Washington, Colorado, Oregon, và Alaska) đã chiếm hơn một nửa (53,8%)

tất cả các vụ bùng phát do thực phẩm được báo cáo kể từ năm 1950 Các báo cáo về ngộ độc thịt từ Alaska, với chỉ 0,2% dân số Hoa Kỳ, chiếm 39% các trường hợp ngộ độc thực phẩm trên toàn quốc từ năm 1990 đến 2000; 88% các trường hợp ở Alaska là ngộ độc thịt loại E theo Alaska từ năm 1947 đến năm 1974, có 46 trường hợp ngộ độc thịt với 13 trường hợp tử vong (28%) Tất cả 21 đợt bùng phát xảy ra ở ven biển Alaska, việc xác nhận kiểu huyết thanh trong phòng thí nghiệm đã được thực hiện trong 14 đợt bùng phát và tất cả đều thuộc loại E Gần đây hơn, từ năm 1990 đến năm 2000 đã có

103 trường hợp ngộ độc thịt ở Alaska với ba trường hợp tử vong Trong thập kỷ qua, ngộ độc thịt ở Alaska tiếp tục là một vấn đề riêng biệt đối với người Alaska bản địa [20]

Ở châu Âu đã ghi nhận các trường hợp ngộ độc lẻ tẻ xảy ra từ hải sản nhập khẩu

Có một đợt bùng phát ở Vương quốc Anh được báo cáo vào năm 1979, trong đó bốn người lớn tuổi đã ăn cá hồi đóng hộp từ Alaska Năm 1997, hai người Đức được chẩn đoán mắc bệnh ngộ độc thịt sau khi ăn cá thịt trắng Canada hun khói nóng nhập khẩu đã được bán trên thị trường Phần Lan Mẫu huyết thanh của một trong những bệnh nhân được xác định là ngộ độc loại E [9]

Châu Á, theo báo cáo của Trung tâm phân tích thông tin dịch tễ học Liên bang Nga trong 5 năm 1988–1992, đã có 1327 đợt bùng phát ngộ độc thịt, 2300 người bị ảnh hưởng và 182 người (7,9%) trong số đó đã tử vong [41] Cá là nguyên nhân gây ngộ độc ngộ độc thịt trong 24% trường hợp, với tỷ lệ tử vong là 14,4% Loại cá phổ biến nhất có liên quan là cá hun khói hoặc cá muối thuộc họ cá chép Ở Ấn Độ, một vụ dịch năm

1996 xảy ra tại một trường học ở nông thôn, nơi 34 học sinh bị ốm và ba học sinh tử vong vì ăn ''ladoo'', một loại ngọt làm từ bột mì (sevu) cùng với đậu phụ và sữa bơ 21 học sinh đã tiến bộ hơn trong 24 giờ tiếp theo chỉ rửa dạ dày và không dùng thuốc chống độc Hai sinh viên phải thở máy và được tiêm thuốc chống độc hóa trị ba và sống sót [17] Năm 2011, trường hợp đầu tiên ngộ độc type E ở Đài Loan được báo cáo là một người đàn ông 36 tuổi do ăn đậu phụ sấy khô hút chân không [47]

1.4.4.2: Tại Việt Nam

Ngày 31/03/2021 Bệnh viện Đa khoa Tỉnh Kon Tum cho biết một bệnh nhân nghi

ngộ độc Clostridium botulinum được đưa vào đây đã tử vong Hiện còn 3 bệnh nhân

đang điều trị nhưng bệnh viện chưa có thuốc đặc trị kháng độc tố C botulinum và tất cả đều được xác định do nhiễm độc tố vi khuẩn C botulinum type E theo kết quả PCR của

Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia

1.5: Các phương pháp phát hiện độc tố

Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nhức nhối không chỉ ở Việt Nam mà là vấn đề

chung của toàn cầu Độc tố botulinum được sản xuất bởi vi khuẩn C botulinum có thể

xuất hiện trong thực phẩm, và gây nên bệnh ngộ độc thịt sau khi ăn phải Thực tế lâm

sàng cho thấy bệnh ngộ độc thịt do độc tố thần kinh của C botulinum mang tính cấp

tính nặng, tiến triển nguy kịch rất nhanh, tỉ lệ tử vong và gây biến chứng rất cao [48] Các bác sỹ lâm sàng gặp nhiều khó khăn trong chẩn đoán bệnh ngộ độc thịt, do triệu chứng lâm sàng của bệnh dễ bị nhầm với các bệnh khác (liệt mềm cấp, tai biến mạch máu não v.v), các phương pháp cận lâm sàng như nuôi cấy phân lập vi khuẩn; phương

pháp phát hiện gen sinh độc tố của C botulinum hay phương pháp phát hiện độc tố của

vi khuẩn C botulinum đều chưa được thực hiện tại các bệnh viện Vi khuẩn C botulinum

là vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối, khó nuôi cấy phân lập Vi khuẩn này sinh độc tố thần kinh được xem là một trong những độc tố mạnh nhất, vì thế nó được xếp vào danh sách tác nhân nguy hiểm nhóm A và bị nghi ngờ sử dụng làm vũ khí sinh học nên lại càng khó

khăn hơn trong việc đặt mua hoặc chia sẻ chủng vi khuẩn C botulinum từ các hãng hay

tổ chức nghiên cứu quốc tế Vì vậy việc chẩn đoán nhanh, chính xác là điều kiện tiên quyết cứu sống người bệnh, giúp người bệnh phục hồi, giảm biến chứng Hiện nay, có

ba phương pháp xét nghiệm chính để chẩn đoán C botulinum bao gồm phương pháp

khuếch đại gen sinh độc tố sinh độc tố, xét nghiệm phát hiện độc tố, nuôi cấy phân lập

sinh vật trong mẫu bệnh phẩm , người ta sẽ sử dụng một đoạn mồi DNA tương ứng với căn nguyên vi sinh vật đó Sau vài giờ khuếch đại , đoạn gen tương ứng của vi sinh vật

sẽ được nhân lên hàng triệu bản và sẽ được phát hiện nhờ kỹ thuật điện di

1.5.1.2: Phương pháp LAMP

“LAMP" viết tắt của phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng là một phương pháp khuếch đại axit nucleic đơn giản, nhanh chóng, cụ thể và hiệu quả về chi phí được thiết kế và phát triển bởi Notomi và cộng sự [57] Trong LAMP, chuỗi mục tiêu được khuếch đại bằng cách sử dụng bốn hoặc sáu mồi khuếch đại sáu hoặc tám vùng riêng biệt trên gen đích Ngoài cặp mồi thông thường (F3-B3), cặp mồi tạo vòng lặp bên trong (forward và backward loop inner – FIP-BIP) và cặp mồi vòng lặp bổ sung (loop forward và backward – LF-LB) giúp khuếch đại trình tự đích với hiệu quả lên tới

109 bản sao trong vòng 30-60 phút ở khoảng nhiệt độ 60-65°C LAMP cho phép phát hiện nhanh, nhạy và cụ thể đối với mục tiêu đích Kỹ thuật LAMP dựa trên chu kỳ tự

động và hoạt động dịch chuyển chuỗi DNA cao qua trung gian Bst polymerase

từ Geobacillus stearothermophilus , trong điều kiện đẳng nhiệt

Hỗn hợp phản ứng liên quan đến phản ứng LAMP bao gồm hỗn hợp dNTP , Bst polymerase, thuốc nhuộm huỳnh quang, mồi và mẫu DNA Quá trình khuếch đại bắt đầu khi vùng F2 của FIP lai với vùng F2c của DNA đích và bắt đầu quá trình tổng hợp chuỗi bổ sung, tiếp theo là đoạn mồi F3 lai với vùng F3c của DNA đích và kéo dài, thay thế chuỗi bổ sung được liên kết với FIP Chuỗi bị dịch chuyển này tạo thành một vòng ở đầu 5' Sau đó, DNA sợi đơn này có vòng lặp ở đầu 5' sẽ đóng vai trò là khuôn mẫu cho BIP B2 lai với vùng B2c của mẫu DNA Quá trình tổng hợp DNA được bắt đầu dẫn đến sự hình thành mạch bổ sung và mở đầu vòng 5' Sau đó, B3 lai với vùng B3c của DNA đích và kéo dài, thay thế mạch bổ sung được liên kết BIP Điều này dẫn đến sự hình thành DNA hình quả tạ Các nucleotide được thêm vào đầu 3'-của F1 bởi Bst DNA polymerase, men này kéo dài và mở ra vòng lặp ở đầu 5' DNA hình quả tạ hiện được chuyển đổi thành cấu trúc vòng lặp gốc Cấu trúc này đóng vai trò là người khởi xướng chu trình LAMP, đây là giai đoạn thứ hai của LAMPsự phản ứng lại Các đoạn mồi vòng lặp cũng có thể được thêm vào để khuếch đại LAMP theo cấp số nhân Sản phẩm cuối cùng thu được là một hỗn hợp DNA vòng gốc với chiều dài thân khác nhau và các cấu trúc giống súp lơ khác nhau với nhiều vòng

Hình 1.6: Nguyên lý hoạt động của phương pháp LAMP [83]

Bên cạnh đó, độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện của phương pháp cũng được xác định qua các nghiên cứu Theo báo cáo năm 2015 của Norihisa Yamamoto và cộng

sự độ nhạy của LAMP đạt 88,6% trong nghiên cứu trên mẫu đờm lâm sàng trực tiếp để

phát hiện gen OXA-23 kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii Ví dụ

thành công khác khi sử dụng LAMP cho độ nhạy cao đạt mức tuyệt đối 100% trong một

nghiên cứu phát hiện nhanh Neisseria meningitidis trong dịch não tủy của nhóm nghiên

cứu DoKyung Lee và cộng sự công bố năm 2015

Để đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp LAMP, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thực hiện trên nhiều đối tượng khác nhau trước khi đưa ra kết luận “ LAMP có độ đặc hiệu cao” Theo một nghiên cứu trên 120 mẫu đờm được thu thập nhằm xác định

dương tính với vi khuẩn Acinetobacter baumannii của Norihisa Yamamoto và cộng sự

năm 2015 đã cho thấy độ đặc hiệu của LAMP là 92,1%, sử dụng phương pháp nuôi cấy như là tiêu chuẩn vàng để so sánh Tức là trong 120 mẫu thu thập có 76 mẫu được xác

định dương tính với vi khuẩn Acinetobacter baumannii theo phương pháp nuôi cấy, và

70 mẫu được xác định dương tính bằng LAMP

Xét nghiệm LAMP có triển vọng trong việc phát hiện mầm bệnh ở người và cho kết quả phát hiện phân tử chính xác Tuy nhiên ở LAMP còn một tiêu chí nữa mà các nhà khoa học đều rất quan tâm đó chính là giới hạn phát hiện của LAMP gấp nhiều lần so

với phương pháp khác là PCR hay real time PCR Cụ thể, một nghiên cứu được thực

hiện bởi Nzelu et al năm 2014 để phát hiện Leishmania [59] Trong nghiên cứu, họ đã

phát triển LAMP và thử nghiệm nó với 122 mẫu lâm sàng nghi ngờ Nghiên cứu cho thấy LAMP có hiệu quả để phát hiện 10 1 bản sao DNA Họ kết luận rằng LAMP mới

được phát triển là hữu ích khi mật độ ký sinh trùng Leishmania rất thấp, đặc biệt là trong

giai đoạn nhiễm trùng sớm Có một số công trình quan trọng khác được báo cáo về LAMP bao gồm Trichomonas viganalis [64], Necator Americanus [54] và Strongyloides stercoralis [74], và đã chỉ ra rằng LAMP nhạy hơn 1000 lần so

với PCR thông thường

Tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu về ứng dụng LAMP vào chẩn đoán nhiễm

độc tố C botulinum type E được công bố Trên thị trường chưa có bộ kit LAMP chẩn đoán C botulinum được thương mại hóa và ứng dụng trên lâm sàng

1.5.1.3: Vai trò và phân loại của các đối chứng trong NAAT

Vai trò của đối chứng

Đối chứng trong một phản ứng được dùng với mục đích xác thực kết quả và cho biết phản ứng liệu có xảy ra chính xác hay không Các đối chứng trong phản ứng PCR hoạt động như một biện pháp đảm bảo chất lượng giúp các nhà khoa học đưa ra kết luận về

sự thành công hay thất bại của thí nghiệm và cũng có thể giải thích khi các phản ứng thất bại hay gặp vấn đề trong quá trình diễn ra

Phân loại đối chứng

Kể từ khi được phát hiện vào những năm 1980, phản ứng chuỗi Polymerase đã được phát triển thêm và ngày nay được sử dụng làm nền tảng cho các kỹ thuật dựa trên PCR khác nhau được sử dụng trong chẩn đoán phân tử giữa các loài khác nhau và nhiều loại mẫu Các loại ứng dụng phổ biến nhất bao gồm khuếch đại gen, phân tích biểu hiện gen, phân tích biến thể Với lĩnh vực ứng dụng rộng rãi, vẫn còn một câu hỏi quan trọng và liên quan đến các đối chứng (đối chứng âm, đối chứng dương, nội sinh và ngoại sinh bên trong) và mục đích của chúng trong thử nghiệm PCR thời gian thực Trong xét nghiệm khuếch đại acid nucleic, việc sử dụng chứng dương và chứng âm là điều bắt buộc

Đối chứng dương

Định nghĩa: là DNA được cho vào phản ứng PCR để cho sản phẩm khuếch đại có kích thước và trình tự đúng giống hệt sản phẩm khuếch đại của DNA đích tách chiết được từ bệnh phẩm Thông thường chứng dương cho phản ứng PCR là dung dịch pha lõang ở nồng độ biết trước của plasmid có chèn đọan DNA đích hay các chủng chuẩn, chủng phân lập, mẫu DNA/RNA chuẩn, mẫu ADN nhân tạo

Vai trò:

 Kiểm tra độ nhạy của phản ứng PCR đang sử dụng xem có đạt không Phản ứng PCR được cho là đạt độ nhạy khi chứng dương cho kết quả dương tính phát hiện được bằng các phương pháp trên, và không đạt độ nhạy khi chứng dương cho kết quả âm tính

 Đối với PCR phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng điện di thì kết quả điện di sản phẩm PCR của chứng dương sẽ cho vạch điện di đúng kích thước mong đợi, nhờ vậy người đọc kết quả có thể dễ dàng so sánh với các vạch điện di sản phẩm PCR của mẫu bệnh phẩm để kết luận mẫu bệnh phẩm có kết quả dương tính (khi cho vạch điện

di trùng với kích thước vạch điện di của sản phẩm PCR của chứng dương) hay âm tính (khi cho vạch điện di không trùng với kích thước vạch điện di của sản phẩm PCR của chứng dương hay không có vạch điện di)

 Chứng minh PCR mix đang sử dụng là hoàn toàn tinh sạch không bị nhiễm các DNA ngoại lai

1.5.2: Các phương pháp dựa trên việc phát hiện protein

1.5.2.1: Thử độc trên chuột

Ngày nay, thử độc trên chuột vẫn được xem là phương pháp tiêu chuẩn vàng trong việc

phát hiện độc tố botulinum được sản xuất bởi vi khuẩn kị khí C botulinum Quy trình

chuẩn để phát hiện độc tố botulinum là xét nghiệm khả năng gây chết chuột [66, 58] Thử nghiệm dựa trên việc tiêm vào màng bụng chuột thí nghiệm mẫu được pha loãng trong dung dịch đệm phosphat Nếu mẫu chứa độc tố, chuột sẽ phát triển các dấu hiệu ngộ độc điển hình, bao gồm lông xù, yếu cơ và suy hô hấp Những triệu chứng này thường phát triển trong vòng một ngày sau khi tiêm nhưng có thể mất vài ngày mới xuất hiện

1.5.2.2: Xét nghiệm miễn dịch học

So với xét nghiệm trên chuột, xét nghiệm miễn dịch đơn giản về mặt kỹ thuật và nhanh chóng để thực hiện Mặc dù nhiều xét nghiệm cho kết quả nhanh, chẳng hạn như xét nghiệm miễn dịch phóng xạ, xét nghiệm khuếch tán gel, xét nghiệm ngưng kết hồng cầu thụ động và những ứng dụng ban đầu của xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) nhưng tất cả đều có độ nhạy hoặc độ đặc hiệu kém, những phát triển gần đây trong khuếch đại tín hiệu đã cho phép độ nhạy tương đương với độ nhạy của xét nghiệm sinh học trên chuột [3,39,68] Một nhược điểm của các xét nghiệm miễn dịch là thường không có sẵn các kháng thể chất lượng cao Ngoài các chất độc thần kinh

có hoạt tính sinh học, chất độc bị bất hoạt (ví dụ, sau khi xử lý nhiệt) có thể gây ra kết quả dương tính giả Hơn nữa, biến thể di truyền trong các kiểu huyết thanh khác nhau của chất độc thần kinh có thể dẫn đến giảm ái lực với các kháng thể đơn dòng, gây ra kết quả âm tính giả

1.5.3: Phương pháp nuôi cấy

Thử nghiệm sinh học trên chuột là phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện vi khuẩn C botulinum Ngoài ra, các cơ sở y tế sử dụng phương pháp chẩn đoán khác là nuôi cấy

C botulinum đòi hỏi điều kiện yếm khí nghiêm ngặt để phát triển Điều này tạo ra những thách thức cho công việc phân lập vi khuẩn trong phòng thí nghiệm Cạnh đó, C botulinum bao gồm các chủng khác biệt về mặt sinh lý, cản trở sự phát triển của chẩn đoán Việc phát hiện và phân lập C botulinum thông thường dựa trên việc nuôi cấy

trong môi trường kị khí và sau đó phát hiện độc tố botulinum trong dịch nuôi cấy nổi trên bề mặt bằng xét nghiệm sinh học chuột [48]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1: Vật liệu

2.1.1: Đối tượng

- Plasmid pUCIDT-AMP Golden gate chứa đoạn gen mã hóa độc tố botulinum type E

của vi khuẩn Clostridium botulinum được tổng hợp nhân tạo bởi công ty IDT và bảo

quản ở -20˚C

Hình 2.1: Sơ đồ mẫu chuẩn Plasmid pUCIDT-AMP GoldenGate

- 6 chủng cùng chi khác loài Clostridium bao gồm Clostridium perfingens ATCC 13124, Clostridium difficile ATCC 43593, Clostridium histolyticum ATCC 1940, Clostridium sporogenes ATCC 11437 , Clostridium sordellii ATCC 9714, Clostridium septicum ATCC 12464 được cung cấp bởi Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương được sử dụng để xác