Xây Dựng Quy Trình Real-Time Pcr Phát Hiện Tình Trạng Methyl Hóa Gen Sept9 Trong Máu Ngoại Vi, Hỗ Trợ Chẩn Đoán Sớm Ung Thư Đại Trực Tràng.pdf

Để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khuếch đại chọn lọc DNA bị methyl hóa gen SEPT9 thì phương pháp sử dụng là một yếu tố vô cùng quan trọng.. Kể từ khi kết hợp nhiều dấu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

BÙI THỊ HOÀI

XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN

TÌNH TRẠNG METHYL HÓA GEN SEPT9 TRONG MÁU

NGOẠI VI, HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ ĐẠI

TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Bùi Thị Hoài

XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN TÌNH

TRẠNG METHYL HÓA GEN SEPT9 TRONG MÁU NGOẠI VI, HỖ

TRỢ CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS BS Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược học quân sự - Học viện Quân Y, người thầy đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Đỗ Thị Phúc - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và anh chị Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào - Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y vì các thầy cô và anh chị đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài tại phòng Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các cô giáo trong bộ môn Di truyền học cùng các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình học tập

và nghiên cứu tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đã tài trợ cho nghiên cứu này thuộc đề tài mã số 07/2019/TN

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Tập đoàn Vingroup, Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VinBigdata) đã tài trợ học bổng cho tôi theo chương trình học bổng đào tạo thạc sĩ, tiễn sĩ trong nước với mã số VINIF.2020.Ths.97

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày 27 tháng 04 năm 2022 Học viên

Bùi Thị Hoài

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về ung thư đại trực tràng 3

1.1.1 Dịch tễ học 3

1.1.2 Mô bệnh học 5

1.1.3 Sàng lọc phát hiện sớm ung thư đại trực tràng 5

1.2 Methyl hóa DNA 8

1.2.1 Vai trò của dấu ấn methyl hóa DNA trong sàng lọc, chẩn đoán ung thư đại trực tràng 8

1.2.2 Các phương pháp phân tích methyl hóa DNA 11

1.3 Vai trò của dấu ấn methyl hóa gen SEPT9 trong sàng lọc, phát hiện sớm UTĐTT 16

1.3.1 Tổng quan về gen SEPT9 16

1.3.2 Mối liên hệ giữa gen SEPT9 và ung thư đại trực tràng 17

1.3.3 Tình trạng methyl hóa gen SEPT9 trong UTĐTT 18

1.3.4 Nghiên cứu và ứng dụng xét nghiệm phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong sàng lọc, phát hiện sớm ung thư đại trực tràng 19

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên liệu 25

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 25

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 25

2.2 Hóa chất và thiết bị 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 28

2.3.2 Thu thập, bảo quản mẫu 28

2.3.3 Tách chiết DNA tổng số 28

2.3.4 Xử lý mẫu DNA tổng số bằng phản ứng bisulfite 29

2.3.5 Phương pháp realtime PCR phát hiện dấu ấn methyl hóa gen SEPT9 29

2.3.6 Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện 30

2.3.7 Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu lâm sàng 31

2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu và sinh tin học 32

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Thiết kế quy trình realtime PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9 33

3.2 Tối ưu phản ứng Realtime PCR đặc hiệu khuếch đại chọn lọc gen SEPT9 bị methyl hóa 35

3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng Realtime PCR đặc hiệu 35

3.2.2 Tối ưu nồng độ mồi ngược (mồi Headloop) của phản ứng Realtime PCR đặc hiệu 37

3.2.3 Tối ưu nồng độ mồi xuôi của phản ứng Realtime PCR đặc hiệu 38

3.2.4 Tối ưu nồng độ probe của phản ứng Realtime PCR đặc hiệu 39

3.3 Tối ưu phản ứng tổng số khuếch đại đồng thời DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa gen SEPT9 41

3.3.1 Tối ưu nồng độ mồi của phản ứng tổng số 42

3.3.2 Tối ưu nồng độ DMSO phản ứng khuếch đại gen SEPT9 tổng số 43 3.4 Đánh giá hiệu quả khóa gen SEPT9 không bị methyl hóa của quy trình realtime PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9 45

3.5 Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình 49 3.5.1 Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn 49

3.5.2 Xác định ngƣỡng phát hiện của quy trình dựa trên bộ mẫu trộn

chuẩn 50

3.6 Khảo sát tình trạng methyl hóa gen SEPT9 trên mẫu mô bệnh phẩm 52

3.7 Đánh giá quy trình trên mẫu máu ngoại vi 54

KẾT LUẬN 57

KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nguyên lý phản ứng chuyển đồi DNA bằng bisulfite 12

Hình 1.2 Nguyên lý phương pháp HeavyMethyl [16] 14

Hình 1.3 Nguyên lý phương pháp Headloop PCR [70] 16

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 28

Hình 3.1 Nguyên lý realtime PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9 34

Hình 3.2 Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng Realtime PCR đặc hiệu 35

Hình 3.3 Kết quả tối ưu nồng độ mồi ngược phản ứng Realtime PCR đặc hiệu 37

Hình 3.4 Kết quả tối ưu nồng độ mồi xuôi phản ứng Realtime PCR đặc hiệu 38

Hình 3.5 Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng Realtime PCR đặc hiệu 39

Hình 3.6 Kết quả tối ưu nồng độ mồi phản ứng Realtime PCR tổng số 42

Hình 3.7 Kết quả tối ưu nồng độ DMSO phản ứng Realtime PCR tổng số 43

Hình 3.8 Phản ứng Realtime PCR kiểm tra DNA tổng số mẫu chuẩn bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa gen SEPT9 46

Hình 3.9 Phản ứng Realtime PCR đặc hiệu methyl hóa kiểm tra mẫu chuẩn DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa gen SEPT9 47

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm Realtime PCR tổng số và đặc hiệu trên gel agarose 2% 48

Hình 3.11 Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn 49

Hình 3.12 Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của quy trình dựa trên bộ mẫu trộn chuẩn 51

Hình 3.13 Kết quả phát hiện gen SEPT9 bị methyl hóa trong máu ngoại vi 56

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2 Các DNA methyl hóa đƣợc sử dụng nhƣ là dấu ấn tiềm năng cho phát

hiện UTĐTT [74] 9

Bảng 1.3 Độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong UTĐTT 21

Bảng 2.1 Thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu 26

Bảng 2.2 Hóa chất, vật liệu nghiên cứu 26

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng realtime PCR đặc hiệu 40

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR đặc hiệu 41

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng realtime PCR tổng số 44

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR tổng số 45

Bảng 3.5 Ngƣỡng phát hiện của quy trình dựa trên DNA bị methyl hóa gen SEPT9 49

Bảng 3.6 Ngƣỡng phát hiện của quy trình với tỉ lệ gen SEPT9 bị methyl hóa trong gen SEPT9 không bị methyl hóa 51

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tình trạng methyl hóa gen SEPT9 trên mẫu mô bệnh phẩm 53

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng phát hiện gen SEPT9 bị methyl hóa trên DNA mẫu mô bệnh phẩm pha loãng 54

Bảng 3.9 Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu lâm sàng 55

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 UTĐTT Ung thƣ đại trực tràng

2 PCR Polymerase Chain Reaction

3 SEPT9 Gen Septin-9

4 mSEPT9 Gen SEPT9 bị methyl hóa

5 DNA Deoxyribonucleic acid

11 FOBT Fecal occult blood tests (Xét nghiệm máu ẩn trong phân)

12 FIT Fecal immunochemical test (Xét nghiệm hóa miễn dịch

phân)

MỞ ĐẦU

Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới, đứng thứ ba ở nam giới và thứ hai ở nữ giới với trên 1,9 triệu trường hợp UTĐTT mắc mới năm 2020 [85] và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây

tử vong trên toàn thế giới Tại Việt Nam, UTĐTT là một trong 5 loại ung thư có tỉ

lệ mắc và tử vong cao nhất, xếp thứ 4 ở nam giới (sau ung thư gan, phổi, dạ dày) và xếp thứ 3 ở nữ giới (sau ung thư vú và phổi) Nếu được phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để thì tỉ lệ sống trên 5 năm đạt 80-90%, tuy nhiên, 60-70% người bệnh được phát hiện ở giai đoạn muộn của UTĐTT trong lần chẩn đoán đầu tiên [3, 60]

Do đó, các phương pháp giúp phát hiện sớm UTĐTT đã không ngừng được phát triển nhằm giúp giảm tỉ lệ tử vong do UTĐTT gây ra Nội soi và sinh thiết đại trực tràng được coi là tiêu chuẩn vàng trong sàng lọc, chẩn đoán UTĐTT Tuy nhiên đây

là một xét nghiệm với quy trình thực hiện phức tạp, nhiều bước chuẩn bị tạo ra tâm

lý ngần ngại của những người muốn tham gia các chương trình sàng lọc Do đó để nâng cao hiệu quả sàng lọc phát hiện sớm UTĐTT, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện theo hướng sử dụng xét nghiệm máu để phát hiện sớm UTĐTT dựa vào các chỉ thị sinh học (biomarker) đặc trưng của UTĐTT Các chỉ thị sinh học này có nguồn gốc từ khối u và lưu hành trong máu ngoại vi

Hiện tượng methyl hóa bất thường DNA [93] là những biến đổi xảy ra sớm trong quá trình phát sinh UTĐTT [17, 72] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh DNA methyl hóa đã được tìm thấy trong máu ngoại vi với tình trạng methyl hóa khác biệt giữa người khỏe mạnh và người bệnh UTĐTT [24, 55] Triển vọng của việc phát

hiện gen SEPT9 bị methyl hóa trong sàng lọc phát hiện sớm UTĐTT đã được các

nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và chứng minh [18, 55, 64, 96] Các nghiên cứu này đều cho kết quả khả quan với độ nhạy và độ đặc hiệu dao động trong khoảng 68-95,6% và 82-98,9%, tương ứng [18, 28, 40, 68, 87, 90, 96] Đồng thời

xét nghiệm phát hiện methyl hóa DNA của gen SEPT9 cũng đã được FDA phê

duyệt như một xét nghiệm máu đầu tiên trong sàng lọc UTĐTT vào tháng 4 năm

2016 với bộ kit thương mại Epi proColon® 2.0 Các thử nghiệm lâm sàng bước đầu cho thấy mặc dù Epi proColon® 2.0 có độ nhạy lên tới 80,6% và độ đặc hiệu là

96,9% nhưng độ nhạy phát hiện UTĐTT giai đoạn sớm I, II chỉ là 41,1% và 72% Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước được thực hiện nhằm

làm rõ tiềm năng của dấu ấn methyl hóa gen SEPT9 trong UTĐTT ở người Việt

Nam Mặt khác, chi phí cho một xét nghiệm sàng lọc UTĐTT sử dụng bộ kit Epi proColon® 2.0 rất cao (8-10 triệu VNĐ), do đó rất khó để áp dụng vào các chương trình sàng lọc UTĐTT tại Việt Nam Có lẽ vì thế xét nghiệm phát hiện methyl hóa

gen SEPT9 trong sàng lọc UTĐTT ở nước ta còn hạn chế mặc dù xét nghiệm này đã

khá phổ biến ở Mỹ và Châu Âu

Để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khuếch đại chọn lọc

DNA bị methyl hóa gen SEPT9 thì phương pháp sử dụng là một yếu tố vô cùng quan trọng Phương pháp phát hiện DNA bị methyl hóa của gen SEPT9 mà bộ kit

Epi proColon® 2.0 hiện đang áp dụng là phương pháp HeavyMethyl [16] Phương pháp này đã có nhiều nghiên cứu sử dụng để tối ưu và đánh giá hiệu quả phát hiện

DNA bị methyl hóa của gen SEPT9 [18, 28, 87, 96, 102] Trong khi đó, chưa có

nghiên cứu nào sử dụng phương pháp Headloop PCR để phát hiện methyl hóa gen

SEPT9 Vì thế, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu xây dựng quy trình phát hiện methyl hóa gen SEPT9 trong máu ngoại vi với độ nhạy cao giúp cải thiện

khả năng phát hiện sớm UTĐTT và giảm giá thành xét nghiệm Thành công của nghiên cứu hứa hẹn đưa ra được quy trình/bộ kit xét nghiệm máu phát hiện sớm UTĐTT với độ nhạy cao, chi phí thấp, giúp Việt Nam chủ động hơn trong sản xuất kit sàng lọc UTĐTT

Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về ung thư đại trực tràng

1.1.1 Dịch tễ học

 Ung thư đại trực tràng trên thế giới

Theo số liệu thống kê mới nhất của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (The International Agency for Research on Cancer - IARC) năm 2020 có 1,9 triệu

ca mắc mới (chiếm 10% trên tổng số ca mắc ung thư trên toàn thế giới), là loại ung thư phổ biến thứ 3 chỉ đứng sau ung thư phổi và ung thư vú Trong đó, có 935.000

ca tử vong (chiếm 9,4% trên tổng số ca mắc ung thư trên toàn thế giới), đứng thứ 2

về ngưỡng báo động nguy cơ tử vong cao chỉ sau ung thư phổi (1,8 triệu ca tử vong, chiếm 18%) [85] Tỉ lệ mắc cao nhất là ở Australia, New Zealand, châu Âu và Bắc

Mỹ, trong khi các nước châu Phi và Nam Á có tỉ lệ mắc thấp, cũng có thể do mật độ phân bố dân cư tại các vùng chưa đều nên các nước đang và đã phát triển thường cao hơn rất nhiều [9, 85]

Khi xét về giới tính, tỉ lệ mắc ở nam giới cao hơn nữ giới ở hầu hết các nơi trên thế giới Một số lý do có thể đánh giá khách quan nam giới luôn có tỉ lệ mắc cao hơn nữ giới là: do thói quen ăn uống không lành mạnh, ăn quá nhiều chất đạm,

mỡ sẽ làm tăng yếu tố sinh ung thư, làm tăng sản các tế bào biểu mô bất thường và phát triển thành ung thư Ngoài ra, thuốc lá là một tác nhân nguy cơ cao gây ung thư đại tràng cho cả hai giới, nhất là khi kết hợp với sử dụng rượu bia

UTĐTT có thể được coi là dấu hiệu của sự phát triển kinh tế xã hội Đánh giá xu hướng mắc và tử vong do UTĐTT Arnold và cộng sự (2017) [5] xác định 3

xu hướng liên quan đến mức độ phát triển: 1) tỉ lệ mắc và tử vong tăng trong thập

kỷ gần đây (bao gồm các nước Baltic, Nga, Trung Quốc và Brazil); 2) tỉ lệ mắc tăng nhưng tỉ lệ tử vong giảm (Canada, Vương quốc Anh, Đan Mạch và Singapore); và 3) tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong giảm (Hoa Kỳ, Nhật Bản và Pháp) Một số nước có tỉ lệ mắc thấp đang có xu hướng mắc UTĐTT tăng lên

Ngày nay, tỉ lệ tử vong do ung thư đại trực tràng giảm ở nhiều nước trên thế giới do quá trình sàng lọc sớm phát hiện dấu ấn ung thư trên tế bào, giảm các yếu tố

nguy cơ gây bệnh và cải thiện những phương pháp điều trị trước đây Tuy nhiên, ở các nước đang phát triển tỉ lệ tử vong vẫn tăng, bao gồm các nước ở Nam Mỹ, Đông

Âu và các nước đang phát triển do nguồn kinh tế còn hạn hẹp, kéo theo các phương pháp và công nghệ điều trị còn hạn chế [88] Hơn nữa, công nghệ sinh học ở đây còn chưa được quan tâm đề đầu tư phát triển nên quá trình sàng lọc phát hiện sớm các loại dấu ấn gây ung thư trên người còn hạn chế (thường là theo nhu cầu của người bệnh) và do chi phí để trả cho một xét nghiệm còn quá cao khiến cho căn bệnh UTĐTT càng gia tăng

 Ung thư đại trực tràng tại Việt Nam

Theo số liệu thống kê của Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization - WHO) năm 2020, tại Việt Nam có 16.426 ca mắc mới ung thư đại trực tràng, trong

đó có 8.887 nam, 7.539 nữ đứng thứ 5 trên tổng số ca mắc mới các bệnh ung thư thường gặp Ở nam giới, ung thư đại trực tràng đứng thứ 4 về tỉ lệ số ca mắc mới trên tổng các bệnh ung thư thường gặp, đứng thứ 2 về các bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa chỉ sau ung thư dạ dày (với 11.059 ca mắc mới) Trong khi đó, nữ giới với 7.539 ca mắc mới đứng thứ 3 sau ung thư vú (với 15.229 ca) và ung thư phổi (với 7.577 ca), và đứng thứ nhất các bệnh liên quan đến tiêu hóa UTĐTT đang có chiều hướng gia tăng, một phần do Việt Nam là một nước đang phát triển, nguồn kinh phí

để đầu tư cho các trang thiết bị, các phương pháp điều trị còn hạn hẹp Hai là, do nhịp sống của con người hiện đại đang chạy theo công việc, kéo theo đó là những thói quen sinh hoạt không lành mạnh như ăn đồ ăn nhanh nhiều dầu mỡ, đồ uống có

CO2, hút thuốc hay thức khuya làm ảnh hưởng quá trình đào thải và tái tạo chu trình

tế bào Ngoài ra, những người có tiền sử bị ung thư buồng trứng, polyps trực tràng

có kích thước từ 1 cm trở lên hoặc có tế bào trông không bình thường dưới kính hiển vi cũng có nguy cơ cao mắc ung thu đại trực tràng U nhung mao, viêm loét đại trực tràng mãn tính có nguy cơ ung thư từ 20-25% Ngoài ra, người ta đã nhận thấy rằng những người thừa cân, béo phì cũng rất dễ mắc UTĐTT [2]

Tỉ lệ tử vong do ung thư đại trực tràng đứng thứ 5 với 8.203 ca, trong đó đứng thứ 4 ở nam giới sau ung thư gan, ung thư phổi và ung thư dạ dày và đứng thứ

5 ở nữ giới sau ung thư vú, ung thư phổi, ung thư gan và ung thư dạ dày Cho thấy

tình trạng báo động về căn bệnh này, nên có những biện pháp khắc phục từ bên trong và những xét nghiệm tầm soát từ sớm để kiểm soát, điều trị dứt điểm trong thời gian ngắn khi bệnh mới ở gia đoạn đầu Khi đó, bệnh dễ dàng được loại bỏ mà không gây thương tổn cho các tế bào vùng khác, hơn nữa quá trình tái tạo tế bào cũng nhanh hơn, sự hồi phục của cơ thể cũng đảm bảo hơn khi chúng ta phát hiện bệnh ở những giai đoạn cuối vì ung thư là căn bệnh để lại nhiều hệ quả đi kèm như sức khỏe giảm sút, các tế bào chết đi gây ảnh hưởng chu trình của các tế bào khác hay sự di căn của chúng

1.1.2 Mô bệnh học

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một bệnh lý gây ra bởi sự hình thành các

tế bào ung thư trong các mô của đại tràng và trực tràng Ung thư đại trực tràng bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N gồm đoạn lên, đoạn ngang và đoạn xuống Trực tràng là phần ruột thẳng nối giữa đại tràng và hậu môn

Ung thư đại trực tràng thường phát triển chậm, trong khoảng thời gian 10 đến 20 năm Hầu hết bắt đầu bằng sự tăng trưởng không phải là ung thư gọi là polyp [71, 79] Loại polyp phổ biến nhất được gọi là polyp tuyến (adenomatous polyp hay adenomas) Mặc dù tất cả các polyp tuyến có khả năng trở thành ung thư nhưng ước tính ít hơn 10% sẽ tiến triển thành ung thư xâm lấn Khả năng polyp tuyến sẽ tiến triển thành ung thư tăng lên khi nó trở nên lớn hơn [79, 83]

Hơn 95% ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma), trong đó: 80% là ung thư biểu mô tuyến Liberkuhn (Liberkuhn adenocarcinoma); 18% là ung thư biểu mô tuyến nhầy (mucinous adenocarcinoma); hiếm gặp loại ít biệt hoá và loại không biệt hoá (anaplasic) [2]

1.1.3 Sàng lọc phát hiện sớm ung thư đại trực tràng

UTĐTT là một trong những bệnh ung thư có khả năng chữa khỏi cao nhất nếu được phát hiện và chẩn đoán sớm Vì UTĐTT phát triển chậm và ở giai đoạn đầu việc điều trị thường không phức tạp và có khả năng thành công cao [92] Các phương pháp sàng lọc UTĐTT chủ yếu được chấp nhận hiện nay bao gồm: xét nghiệm máu ẩn trong phân (Fecal occult blood tests - FOBT), xét nghiệm DNA

phân (FIT-DNA test hay stool DNA test), nội soi (Sigmoidoscopy /Colonoscopy) và một số phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác (CT, siêu âm…) [22]

Xét nghiệm máu ẩn trong phân giúp kiểm tra lượng máu nhỏ trong phân mà không thể nhìn thấy bằng mắt (người bị UTĐTT thường có một ít máu rỉ ra do ung thư phát triển và chảy vào phân, tuy nhiên một số bệnh lý khác cũng có hiện tượng này, ví dụ bệnh trĩ) Có 2 loại FOBT là gFOBT (guaiac FOBT) và FIT (Fecal immunochemical test) Đây là một công cụ sàng lọc không xâm lấn được sử dụng rộng rãi cho UTĐTT gFOBT hàng năm giúp giảm 33% tỉ lệ tử vong do UTĐTT sau 13 năm theo dõi và 32% sau 30 năm theo dõi [56, 77] Mặc dù, xét nghiệm này rất đơn giản và có chi phí thấp hơn các xét nghiệm khác nhưng nó có độ nhạy còn hạn chế (33-75%) và tỉ lệ kết quả dương tính giả còn cao [6] FIT đã cải thiện độ nhạy trong phát hiện UTĐTT với độ nhạy khoảng 71% và độ đặc hiệu khoảng 94% (sử dụng nội soi đại trực tràng làm tiêu chuẩn tham khảo) [48] Tuy nhiên, FIT có những hạn chế như: giá trị ngưỡng tối ưu không rõ ràng gây khó khăn cho việc đưa

ra kết luận dương tính hay âm tính với hemoglobin [101]; thời gian từ lúc lấy mẫu

đến khi phân tích mẫu kéo dài cũng làm giảm độ tin cậy của kết quả [94]

Nội soi là phương pháp tham chiếu hiện nay cho sàng lọc UTĐTT và được khuyến cáo thực hiện 5-10 năm một lần đối với những người có nguy cơ cao [69] Nội soi có độ nhạy phát hiện UTĐTT cao (>95%), nhưng đây là phương pháp gây xâm lấn nên có nhiều rủi ro cho người bệnh hơn so với các thử nghiệm khác như: thời gian chuẩn bị thủ thuật lâu, phức tạp; có thể gây chảy máu hoặc rách niêm mạc ruột và các vị trí khối u gần đầu đại tràng thường khó được phát hiện [82, 99] Tương tự như nội soi, các phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác (CT, siêu âm…) cũng cần thực hiện các bước chuẩn bị trước thủ thuật (làm sạch ruột, tiêm thuốc giảm co thắt, thuốc cản quang…) Mặc dù là phương pháp bán xâm lấn nhưng vẫn gây ra các tác dụng phụ cho người bệnh Hơn nữa, chưa có bằng chứng thực nghiệm

nào chứng minh phương pháp này giảm tỉ lệ mắc và tử vong do UTĐTT [53]

Phương pháp phát hiện bất thường DNA trong phân đã được nhiều nghiên cứu tiến hành và đánh giá với các đích DNA khác nhau [4, 35, 36, 52, 95, 103] Trong

đó nghiên cứu của Imperiale et al [35] năm 2014 cho thấy phát hiện đồng thời đột

biến gen KRAS, methyl hóa bất thường gen NDRG4 và BMP3 trong phân kết hợp

với FIT cho độ nhạy phát hiện UTĐTT cao nhất (92,3%) Xét nghiệm này đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration – FDA) chấp thuận trong sàng lọc UTĐTT với kit thương mại Cologuard®; Exact Science Corporation, Madison, WI, USA [22, 78] Mặc dù có độ nhạy cao hơn đáng

kể so với FIT (73,8%) nhưng FIT-DNA có độ đặc hiệu thấp hơn FIT (86,6% đối với FIT-DNA và 94,9% đối với FIT) [35] Điều này có nghĩa FIT-DNA có tỉ lệ kết quả

dương tính giả cao hơn Ngoài ra do kết hợp nhiều marker nên giá xét nghiệm cao

Từ những hạn chế trên của các phương pháp phát hiện và chẩn đoán UTĐTT hiện nay đặt ra yêu cầu cần có một phương pháp sàng lọc mới có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn và ứng dụng lâm sàng thuận tiện hơn Ngày nay, có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các chỉ thị phân tử cho UTĐTT có thể phát hiện trong máu ngoại vi, mở

ra tiềm năng ứng dụng trong sàng lọc và chẩn đoán UTĐTT với độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn, ít gây xâm lấn hơn [24, 97] Gần đây, xét nghiệm methyl hóa gen

SEPT9 trong máu ngoại vi đã được FDA phê duyệt trong sàng lọc UTĐTT [53] với

bộ kit thương mại Epi proColon® 2.0 Tuy nhiên, hiệu quả sàng lọc phát hiện sớm UTĐTT của dấu ấn này vẫn đang được nghiên cứu và đánh giá bước đầu trên các thử nghiệm lâm sàng nên chưa có số liệu thống kê cho thấy xét nghiệm này giúp giảm tỉ lệ tử vong do UTĐTT

Tại Việt Nam, việc sàng lọc, phát hiện người bệnh UTĐTT vẫn chủ yếu dựa trên nội soi đại trực tràng Chương trình sàng lọc sớm UTĐTT thông qua xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân (iFOBT) đã được bệnh viện Vinmec phối hợp cùng

Sở Y tế Hà Nội thực hiện Tính đến ngày 10 tháng 1 năm 2019 đã có 32.556 người được làm xét nghiệm, trong đó 1.972 người có kết quả dương tính, 783 người đã được nội soi đại trực tràng để kiểm tra chính xác kết quả Qua đó, 416 trường hợp

có polyps ở đại tràng, trực tràng (chiếm tỉ lệ 53%) và 34 trường hợp ung thư đại tràng, trực tràng (chiếm 4,4%) đã được phát hiện [1] Tuy nhiên, số lượng các chương trình sàng lọc sớm UTĐTT vẫn còn hạn chế Như vậy, đòi hỏi Việt Nam cần có những nghiên cứu, đánh giá để sớm áp dụng kỹ thuật mới, phát triển các xét nghiệm mới có độ nhạy và độ đặc điệu cao hơn để tầm soát sớm UTĐTT

1.2 Methyl hóa DNA

1.2.1 Vai trò của dấu ấn methyl hóa DNA trong sàng lọc, chẩn đoán ung thư đại

trực tràng

DNA methyl hóa có thể được phát hiện trong máu của người bệnh UTĐTT [18, 27, 30, 31, 62, 63, 87] với nhiều chỉ thị methyl hóa tương quan với UTĐTT đã được miêu tả và một vài trong số chúng cho thấy hứa hẹn trở thành chỉ thị để xác

định các cá nhân có nguy cơ cao với UTĐTT chẳng hạn: gen SEPT9 [18], ALX4 [20], NEUROG1 [30], APC [46]… đưa đến các chỉ thị sinh học tiềm năng và chính

xác trong phát triển các xét nghiệm máu không xâm lấm giúp sàng lọc, phát hiện sớm UTĐTT [11, 42] Mặt khác, các xét nghiệm phát hiện sự tăng cường methyl hóa vùng promoter đặc hiệu gen có thể có độ nhạy cao hơn các phân tích DNA vi vệ tinh (microsatellite analyses) và có thể có lợi thế hơn các phân tích đột biến [97] Bởi lẽ đó, phát hiện dấu ấn methyl hóa DNA lưu hành trong máu ngoại vi là một cách tiếp cận mới, đầy tiềm năng trong sàng lọc, phát hiện sớm ung thư đại trực tràng Cho đến nay, rất nhiều gen tăng cường methyl hóa đã được báo cáo trong UTĐTT, nhưng chỉ có một số ít được đưa vào xét nghiệm thương mại dựa trên máu

SEPT9 là một trong những gen được nghiên cứu rộng rãi nhất Công trình đầu tiên đánh giá SEPT9 bị methyl hóa trong huyết tương của người bệnh UTĐTT được

công bố năm 2008 [28, 55] Trong các báo cáo sơ bộ về nghiên cứu các kit xét

nghiệm SEPT9 cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện UTĐTT Sau khi

cải tiến phương pháp, sản phẩm thương mại thế hệ thứ nhất (Epi proColon 1.0, Epigenomics AG, Berlin) và sau đó là thế hệ thứ hai (Epi proColon 2.0), độ nhạy phát hiện đã tăng từ khoảng 60-70% lên khoảng 70-90%, trong khi độ đặc hiệu tăng

từ 80-90% lên trên 90% [81] Đáng chú ý, xét nghiệm Epi proColon thế hệ thứ hai cho thấy độ nhạy tốt hơn và độ đặc hiệu gần như tương đương với xét nghiệm máu

trong phân tiêu chuẩn dựa trên guaiac (gFOBT) [90] Hơn nữa, xét nghiệm SEPT9

thế hệ thứ hai cho thấy một lợi thế rõ ràng so với thử nghiệm gFOBT trong việc phát hiện UTĐTT bên phải với độ nhạy tương ứng là 94,4% và 50% Tuy nhiên,

SEPT9 bị methyl hóa ở cả thế hệ thứ nhất và thứ hai đã cho thấy độ nhạy hạn chế

trong việc phát hiện các u tuyến (27,4%), nhấn mạnh sự cần thiết phải cải thiện thêm xét nghiệm này trong sàng lọc dựa trên dân số [39]

Kể từ khi kết hợp nhiều dấu ấn sinh học trở thành một xu hướng trong phát hiện và sàng lọc UTĐTT, một số tác giả đã đánh giá hiệu quả chẩn đoán của xét

nghiệm SEPT9 cùng với các gen ứng cử viên methyl hóa dựa trên máu khác Sự kết hợp của SEPT9 với xét nghiệm methyl hóa mang lại độ nhạy 73,1% và độ đặc hiệu

92,3% [54] trong khi liên kết với TMEFF2 và ALX4, tăng cả độ nhạy (80,7%) và

độ đặc hiệu (90,0%) [29] Tanzer và cộng sự (2010) đã chứng minh rằng sự kết hợp

giữa SEPT9 với ALX4 cho độ nhạy 71% và độ đặc hiệu 95% đối với các u tuyến, điều này cho thấy SEPT9/ALX4 là một dấu ấn sinh học cho các tổn thương tiền ung

thư [87]

Ngoài SEPT9, vai trò của methyl hóa DNA trong phát hiện UTĐTT đã được nghiên cứu với một số gen bao gồm HJC1, CYCD2, PAX5, RB1, SRBC, NPY, PENK, WIF1, ALX4, HLFT, HPP1, MLH1, APC, CDK2, NGFR, FRP2, NEUROG1

và RUNX3 Các nghiên cứu đánh giá các dấu ấn sinh học huyết thanh hoặc huyết tương khác với SEPT9 cho thấy hiệu suất chẩn đoán khiêm tốn với độ nhạy khoảng 33% (SRBC) và 97% (CYCD2) và độ đặc hiệu khoảng 37% (CYCD2) và 100% (HLTF, HPP1 và MLH1), không dấu ấn nào trong số các ứng cử viên thể hiện sự

kết hợp tốt giữa độ nhạy và độ đặc hiệu [45]

Bảng 1.1 Các DNA methyl hóa được sử dụng như là dấu ấn tiềm năng

cho phát hiện UTĐTT [74]

Nghiên cứu DNA methyl hóa trong UTĐTT Dấu ấn trong

Kim và cộng sự

(2011)

ADHFE1, BOLL, SLC6A15, ADAMTS5, TFPI2, EYA4, NPY TWIST1, LAMA1, GAS7, MAEL, SFT2D3

Mô

Mitchell và cộng

sự (2014)

BCAT1, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2, GRASP, IKZF1, IRF4 SDC2 and SOX21

Máu

Roperch và cộng

sự (2013) NPY, PENK, WIF1

Mô và huyết thanh

Ahn và cộng sự

(2011)

WNT5A,SFRP1, SFRP2, hMLH1, p16, p14, MINT1, MINT2, MINT31 Mô

Lind và cộng sự

(2011) CNIP1, FBN1, INA, SNCA, MAL, SPG20 Mô

1.2.2 Các phương pháp phân tích methyl hóa DNA

Cho đến nay, số lượng bệnh ở người được tìm thấy có liên quan đến sự methyl hóa bất thường DNA ngày càng tăng [72] Nghiên cứu về sự methyl hóa DNA và vai trò của nó trong quá trình phát sinh khối u cũng trở thành một trong những vấn

đề nóng nhất trong ung thư học phân tử Vì thế, ngày càng nhiều công nghệ được phát triển để phân tích methyl hóa DNA Có nhiều phương pháp phân tích methyl hóa DNA đã được mô tả và hầu hết các phương pháp được biết đến cho tới nay đều dựa trên ba nguyên tắc: 1) Sử dụng enzyme cắt giới hạn nhạy cảm hoặc không nhạy cảm với methyl hóa; 2) Thay đổi trình tự DNA ở các vị trí Cytosine không bị methyl hóa bằng bisulfite; 3) Miễn dịch kết tủa DNA methyl hóa (Methylated DNA immunoprecipitation- MeDIP) bằng cách sử dụng kháng thể anti-methylcytidine hoặc protein bám DNA methyl hóa (methylated DNA binding protein – MBD) Bằng cách kết hợp một trong những nguyên tắc này với các kĩ thuật khác, một loạt các phương pháp tiếp cận nhằm phân tích methyl hóa trên một trình tự CpG đặc hiệu đến một lượng lớn trình tự của hệ gen và phù hợp với các nhu cầu nghiên cứu khác nhau đã được phát triển [41] Trong đó, các phương pháp phân tích methyl hóa DNA dựa trên nguyên tắc thay đổi trình tự DNA ở các vị trí Cytosine không bị methyl hóa bằng bisulfite được sử dụng rộng rãi nhất, đặc biệt là trong phân tích methyl hóa trình tự gen đặc hiệu

Phát hiện ra sự chuyển đổi DNA của sodium bisulphite đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứu về methyl hóa DNA vì nó phản ứng một cách có chọn lọc với các cytosine không methyl hóa và chuyển hóa chúng thành uracil trong khi cytosine methyl hóa không bị chuyển đổi [23, 86] Do thông tin di truyền ngoại gen của DNA được chuyển thành thông tin trình tự trên DNA nên DNA sau khi được biến đổi bằng bisulfite có thể được phát hiện bằng nhiều kĩ thuật như PCR, giải trình tự, các kĩ thuật lai, sử dụng ezyme cắt giới hạn Đây được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong phân tích methyl hóa DNA do tính đặc hiệu cao, đơn giản, dễ thực hiện

và tính linh động trong việc kết hợp với các phương pháp khác Quy trình này dựa vào các phản ứng hóa học của sodium bisufite (HSO3-) xảy ra trên sợi đơn DNA ở

pH thấp và nhiệt độ cao Phản ứng bisulfite bao gồm 3 bước: phản ứng bisulfite hóa chuyển Cytosine thành Cytosine sulphonate; phản ứng deamin hóa chuyển Cytosine sulphonate thành Uracil sulphonate và phản ứng loại bỏ nhóm sulphonate bằng kiềm để tạo ra Uracil (Hình 1.1) [8]

Hình 1.1 Nguyên lý phản ứng chuyển đồi DNA bằng bisulfite

(a) Các bước xử lý bisulfite Bước 1: Sulpho hóa Bước 2: Loại amin Bước 3: Loại sulpho của nhóm alkali Nhóm methyl trong C 5m giúp bảo vệ nhóm amino không bị loại (b) Kết quả minh họa DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl

hóa sau khi xử lý với bisulfite: Cytosine bị methyl hóa ( m C) được giữ nguyên là C;

Cytosine không bị methyl hóa biến đổi thành U [8]

Phần lớn các dữ liệu mới hiện nay phân tích methyl hóa DNA dựa trên việc biến đổi DNA với bisulfite, sau đó khuếch đại DNA cần phân tích với các cặp mồi đặc hiệu [13, 15] Nổi bật trong đó là phương pháp methylation-specific PCR (MSP) [32] Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay trong phân tích methyl hóa DNA đặc hiệu từng gen Phương pháp này sử dụng cặp mồi liên kết đặc hiệu với DNA bị methyl hóa hoặc DNA không bị methyl hóa nhờ vào sự khác biệt trong trình tự DNA methyl hóa và DNA không methyl hóa được tạo ra sau khi biến đổi DNA bằng bisulfite, do đó khuếch đại chọn lọc đoạn DNA bị methyl hóa hoặc DNA không bị methyl hóa cần phân tích Tuy nhiên, kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả vẫn có thể xảy ra khi sử dụng phương pháp này Do đó, để nâng cao độ đặc hiệu, một biến thể khác của MSP là MethyLight đã được phát triển Bên cạnh việc sử dụng mồi đặc hiệu trình tự đích MethLight sử dụng thêm probe có gắn huỳnh quang cũng có trình tự bổ sung đặc hiệu với DNA methyl hóa cần phân tích

để phát hiện tình trạng methyl hóa DNA [19] Nhờ vậy giảm hiện tượng dương tính giả hoặc âm tính giả xảy ra Một phương pháp khác không chỉ giúp phát hiện DNA methyl hóa mà còn giúp định lượng mức độ methyl hóa DNA dựa trên phân tích khác biệt nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR khuếch đại từ phản ứng Realtime PCR khuếch đại đồng thời DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa là MS-HRM (Methylation-sensitive high-resolution melting) [100] Mặc dù, MS-HRM giúp phát hiện nhanh DNA bị methyl hóa và có thể đạt độ nhạy 0.1% - 1% nhưng phương pháp yêu cầu cao trong tối ưu điều kiện phản ứng và khó áp dụng để phát hiện đồng thời nhiều đích DNA bị methyl hóa khác nhau

Để phân tích DNA methyl hóa trong các mẫu bệnh phẩm khó, với tỉ lệ DNA methyl hóa thấp (như mẫu máu) đòi hỏi phải nâng cao độ nhạy của các công nghệ phát hiện methyl hóa DNA Phương pháp HeavyMethyl [16] sử dụng mẫu dò khoá không kéo dài chuỗi để ngăn chặn khuếch đại DNA đích không mong muốn đã ra đời Mẫu dò khóa này có trình tự bổ sung với DNA đích không mong muốn và có vị trí bám chồng lớp với vị trí gắn mồi nhờ đó giảm thiểu hiện tượng khuếch đại chéo

và tăng cường khả năng khuếch đại đặc hiệu DNA đích Mẫu dò khóa này thường chứa gốc phosphate ở nucleotide cuối cùng đầu 3’ để mẫu dò khóa không bị kéo dài bởi DNA polymerase trong quá trình khuếch đại Với DNA bị methyl hóa, các mẫu

dò khóa (màu đen đậm) không bắt cặp được và mồi (mũi tên màu xám) có thể bắt cặp và khuếch đại trình tự đích Sự khuếch đại được phát hiện bằng đầu dò gắn huỳnh quang đặc hiệu methyl hóa (Hình 1.2A) Với DNA không được methyl hóa, các mẫu do khóa, ngăn chặn sự tiếp cận của các mồi bắt cặp vào trình tự đích, dẫn đến sản phẩm PCR không được tạo ra (Hình 1.2B) Nghiên cứu của tác giả Cottrell S.E và cộng sự năm 2004 [16] chỉ ra rằng độ nhạy phát hiện methyl hóa DNA của HeavyMethyl có thể lên tới 0,025% Tuy nhiên, mẫu dò khóa không kéo dài chuỗi đòi hỏi phải thay thế các nucleotide tự nhiên bằng các biến thể nucleotide thích hợp, dẫn đến tăng giá thành của các xét nghiệm phân tích methyl hóa DNA khi sử dụng phương pháp này

Hình 1.2 Nguyên lý phương pháp HeavyMethyl [16]

Bên cạnh đó, Headloop PCR [70] là một phương pháp khác cho phép phân biệt DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa với độ nhạy lên tới 0,01% - 0,001% Phương pháp này sử dụng mồi được thiết kế như một mẫu dò khóa có khả năng kéo dài (gọi là mồi Headloop PCR) để vừa ngăn chặn sự khuếch đại trình tự DNA không bị methyl hóa, vừa khuếch đại đặc hiệu DNA bị methyl hóa Mồi xuôi hoặc mồi ngược hoặc cả 2 mồi đều có thể được thiết kế như là mồi Headloop trong phản ứng PCR Cơ chế hoạt động của mồi Headloop được trình bày trong Hình 1.3

Hai trình tự DNA không bị methyl hóa (A) và DNA bị methyl hóa (B) có độ tương đồng cao trong trình tự, nhưng có một vài vùng trình tự khác nhau (ví dụ vùng đóng hộp) Mồi ngược R cũng như vùng trình tự đầu 3’ của mồi xuôi F (biểu thị bởi mũi tên đen của mồi xuôi F) bắt cặp bổ sung 100% với cả hai trình tự A và B Mồi Headloop (được biểu thị như mồi xuôi F) bao gồm 2 phần, phần trình tự đầu 3’ (mũi tên màu đen) có khả năng khuếch đại cả hai trình tự A và B và phần trình tự đầu 5’ (đuôi màu đỏ) có khả năng bắt cặp bổ sung với trình tự A Như vậy, sợi mới được tổng hợp bởi mồi F sẽ mang trình tự đuôi 5’ của mồi F (đuôi màu đỏ); và sợi mới được tổng hợp bởi mồi R sẽ mang trình tự bổ sung của đuôi 5’ ở mồi F Sau bước biến tính, do phần đầu 3’ của sợi mới tổng hợp bởi mồi R có trình tự bổ sung với trình tự A nên nó bị đóng vòng nội phân tử ở bước gắn mồi và đầu 3’ được kéo dài tạo thành cấu trúc kẹp tóc Vì hiện tượng đóng vòng nội phân tử xảy ra nhanh nên mồi R không thể bắt cặp và tổng hợp sợi mới, từ đó ngăn chặn sự khuếch đại DNA không bị methyl hóa Trong khi, với DNA bị methyl hóa (trình tự B) do mismatch trong trình tự nên hiện tượng đóng vòng nội phân tử này không xảy ra và DNA bị methyl hóa tiếp tục được khuếch đại Nếu mồi xuôi F được chọn là mồi Headloop, thì trình tự đuôi 5 ′ trên mồi F là trình tự bổ sung với sợi dương Nếu mồi ngược R

là mồi Headloop, thì trình tự đuôi 5 ′ trên mồi R là trình tự giống sợi dương Ngoài

ra, phương pháp này còn có thể áp dụng để phân biệt các trình tự có độ tương đồng cao như đột biến (đặc biệt là đột biến mất đoạn) hay phân biệt các loài có mức độ tương đồng cao trong trình tự khuếch đại Hiệu quả khóa trình tự nucleic acid không mong muốn của mẫu dò khóa có khả năng kéo dài chuỗi cũng đã được chứng minh trong nghiên cứu của tác giả Hồ Hữu Thọ và công sự (2015) [33] Mặc dù, phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng việc thiết kế mồi và tối ưu điều kiện phản ứng PCR là một thách thức

Hình 1.3 Nguyên lý phương pháp Headloop PCR [70]

1.3 Vai trò của dấu ấn methyl hóa gen SEPT9 trong sàng lọc, phát hiện sớm

UTĐTT

1.3.1 Tổng quan về gen SEPT9

Gen SEPTIN9 (SEPT9) là một gen trong 14 gen thuộc họ SEPTIN Gen SEPT9 nằm trên nhiễm sắc thể 17 ở cánh dài tại vị trí 25.3 (17q25.3), chứa 17 exon, dài 240 × 103 bp Đầu 5’ ở vùng điều hòa của gen SEPT9 có chứa nhiều Cytosine

phosphodiester Guanidine (đảo CpG), nơi mà sự methyl hóa DNA xảy ra chủ yếu

[81] Các nghiên cứu [57, 58, 81] đã chỉ ra SEPT9 có 18 bản phiên mã khác nhau

mã cho 15 chuỗi polypeptide, trong đó 2 bản phiên mã (SEPT9_v4 và v4*) mã hóa

cho cùng 1 chuỗi polypeptide

Gen SEPT9 mã hóa cho protein septin-9, một protein thuộc họ septins

Septins là một nhóm các protein gắn GTP (GTP-binding proteins) bảo tồn cao trong

sinh vật nhân chuẩn Septins liên quan đến nhiều quá trình sinh học như phân chia của tế bào chất, phân cực tế bào, vận chuyển bóng bào và tái cấu trúc màng Ở người, có tất cả 14 loại protein Septin từ SEPT1 đến SEPT14 Tất cả các protein Septin này có thể hình thành các phức hợp heterometric và liên quan đến sự hình thành các cấu trúc bậc cao như cấu trúc sợi – một phần của bộ khung xương tế bào [21, 73] Septins tham gia vào quá trình phân bào (bước phân chia tế bào chất - cytokenesis) Nghiên cứu về tế bào người cho thấy các protein Septin có thể hình thành cấu trúc bao vây các vi khuẩn gây bệnh để cố định và ngăn chúng xâm nhập các tế bào khác [81] Các protein Septin tồn tại dưới dạng heteromer gồm 6-8 tiểu đơn vị Dạng hexamer bao gồm 2 phân tử, mỗi phân tử được tạo thành từ 3 tiểu đơn

vị SEPT2, SEPT6 và SEPT7 Dạng octamer có thêm tiểu đơn vị SEPT9 Một số nghiên cứu cho thấy SEPT9 chiếm vị trí đầu, cuối trong phức hợp dạng octamer, đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tạo thành phức hợp và sự ổn định của octamer Nó cũng rất quan trọng trong sự tách rời các tế bào con trong suốt quá trình phân chia tế bào chất Do đó, quá trình phân chia tế bào chất có thể bị ảnh hưởng nghiêm trọng nếu SEPT9 bất thường hoặc không có SEPT9 Vì thế, vùng

promoter của gen SEPT9 bị methyl hóa có thể là một yếu tố dẫn đến UTĐTT [81]

Bên cạnh đó, protein septin-9 còn đóng vai trò như một protein ức chế khối u bằng cách điều hòa sự sinh trưởng của tế bào và ngăn chặn các tế bào phân chia không kiểm soát quá nhanh [67]

1.3.2 Mối liên hệ giữa gen SEPT9 và ung thư đại trực tràng

Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy gen

SEPT9 có liên quan đến khối u ác tính Peterson và các cộng sự (2008) [43] đã sử

dụng các nghiên cứu kết tủa miễn dịch và miễn dịch huỳnh quang để phân tích SEPT9_i1 và tìm ra nó tương tác với cả α và γ tubulin Các tế bào biểu hiện SEPT9_i1 đã biểu hiện những khiếm khuyết trong phân ly nhiễm sắc thể, khuếch đại trung thể, thiếu sót trong phân chia tế bào chất, từ đó chỉ ra SEPT9_i1 làm tăng

sự mất ổn định bộ gen trong quá trình hình thành khối u qua hai cơ chế phân tử: phân ly nhiễm sắc thể khiếm khuyết và phân chia tế bào chất không thành công Thêm vào đó, sự biểu hiện của con đường tín hiệu HIF [26], JNK [37] và Rho [10]

cũng có thể là cơ chế liên quan đến gen SEPT9 đóng vai trò trong sự tiến triển của

ung thư đại trực tràng (UTĐTT)

Khi sự methyl hóa diễn ra ở đảo CpG, gen có lượng lớn Cytosine (C) có gắn gốc methyl nằm ở đầu 5’ của vùng khởi đầu phiên mã (promoter) sẽ im lặng [12]; quá trình methyl hóa DNA được tích lũy dần dần trong một thời gian dài trên gen

im lặng sẽ có thể dẫn đến bất hoạt gen ức chế khối u Kinga Tóth và cộng sự (2011)

[89] đã chỉ ra mối tương quan mạnh mẽ giữa sự methyl hóa gen SEPT9 và sự giảm

biểu hiện của mRNA và protein SEPT9 trong UTĐTT Kinga Tóth nhận thấy rằng trong mô sinh thiết đại trực tràng, các tế bào biểu mô được vi phẫu bằng laser biểu

hiện của mRNA SEPT9 giảm trong quá trình tiến triển của bệnh ung thư đại trực tràng từ u tuyến đến ung thư biểu mô, và SEPT9 giảm biểu hiện rõ rệt trong UTĐTT

so với người khỏe mạnh Đồng thời nghiên cứu cũng cho thấy mức độ biểu hiện của

protein SEPT9 có tương quan thuận với mức độ biểu hiện của mRNA SEPT9 Khi demethyl hóa promoter gen SEPT9 trong dòng tế bào nuôi cấy HT29, nhóm nghiên

cứu nhận thấy biểu hiện tăng lên của mRNA và protein SEPT9 Đánh giá này đưa ra bằng chứng hỗ trợ cho quan điểm SEPT9 đóng vai trò như một gen ức chế khối u và

sự methyl hóa bất thường của nó có thể dẫn đến tiến triển bệnh lý từ lành tính đến

ác tính Đây được coi là một dấu hiệu trong quá trình sinh UTĐTT Đồng thời, sự

biểu hiện bất thường của gen SEPT9 trong người bệnh UTĐTT so với người khỏe

mạnh gợi ý một cách tiếp cận mới trong sàng lọc phát hiện sớm UTĐTT

1.3.3 Tình trạng methyl hóa gen SEPT9 trong UTĐTT

Nghiên cứu của Wasserkort và cộng sự (2013) [98] về tình trạng methyl hóa

gen SEPT9 trong các mô u tuyến, mô ung thư và các mô bình thường lân cận khối u

(cách khối u 1 cm và 10 cm) của người bệnh UTĐTT với mô sinh thiết của người

khỏe mạnh chỉ ra rằng: Cả 4 đảo CpG được phân tích trên gen SEPT9 đều không bị

methyl hoá trong mô bình thường của người khỏe mạnh ngoại trừ vùng dowstream của đảo CpG lớn nhất (đảo CpG 3-CGI3)

Trong các mô bệnh, có sự thay đổi lớn tình trạng methyl hóa ở một trong 4 đảo CpG được nghiên cứu Đó là đảo CpG 3 (CGI3), đặc biệt là vùng trung tâm của đảo này CGI3 tăng đáng kể mức độ methyl hóa (>80%, p<0,0001) trong các tế bào

biểu mô (epithelial cells) của mô u tuyến và mô ung thư Sự methyl hóa gen SEPT9

trong tế bào nền (stromal cells) cũng tăng ở các mô u tuyến và ung thư (≤50%, p<0,0001) Tuy nhiên, sự methyl hóa không tăng lên ở các tế bào nền của mô bình

thường gần khối u và sự tăng cường methyl hóa SEPT9 ở các tế bào nền chỉ xảy ra sau khi có sự tăng cường methyl hóa SEPT9 ở các tế bào biểu mô Những phát hiện này cho thấy rằng sự thay đổi tình trạng methyl hóa trên CGI3 của gen SEPT9 có

thể là một sự kiện sớm trong sự hình thành UTĐTT và có thể là một nguyên nhân trực tiếp dẫn đến UTĐTT

Hơn nữa, tình trạng methyl hóa trên CGI3 tăng dần từ vùng trung tâm đến vùng gần đầu 5’ của CGI3 chỉ được quan sát thấy trong các mẫu UTĐTT, trong khi

ở các mẫu u tuyến vùng gần đầu 5’ của CGI3 gần như không có hiện tượng methyl hóa Điều này chỉ ra rằng đây là một sự kiện tương đối muộn trong sự hình thành UTĐTT, nó phản ánh mức độ tiến triển của UTĐTT

Từ việc phân tích kết quả hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) cho thấy sự giảm đáng kể (p<0,01) mức độ biểu hiện của protein Septin-9 trong các

tế bào biểu mô của mô u tuyến và mô ung thư Do đó có thể suy đoán rằng sự tăng

cường methyl hóa CGI3 của gen SEPT9 trong u tuyến và UTĐTT trực tiếp dẫn đến

giảm mức độ biểu hiện protein Septin-9

1.3.4 Nghiên cứu và ứng dụng xét nghiệm phát hiện methyl hóa gen SEPT9

trong sàng lọc, phát hiện sớm ung thư đại trực tràng

Methyl hóa DNA không chỉ được nghiên cứu trong những khối u nguyên phát mà còn trong máu hay phân [50, 61] Điều thú vị hơn là dấu ấn methyl hóa trong mẫu phân có độ nhạy cao hơn so với các xét nghiệm di truyền phân tích dải đột biến gen [25, 38] Tuy vậy, sàng lọc UTĐTT sử dụng mẫu máu được ưu tiên hơn bởi quá trình lưu trữ và xử lý mẫu máu dễ hơn mẫu phân và người bệnh dường như chấp nhận xét nghiệm máu nhiều hơn [34] Đã có nhiều dấu ấn gen được tìm ra giúp phát hiện UTĐTT biểu hiện trong máu, trong đó điển hình là dấu ấn methyl

hóa gen SEPT9 Vào năm 2008, Catherine Lofton-Day và các cộng sự [55] đã công

bố nghiên cứu về dấu ấn methyl hóa DNA trên mẫu máu ngoại vi nhằm sàng lọc UTĐTT Nhóm nghiên cứu sử dụng enzyme cắt giới hạn để tìm ra các gen có sự

methyl hóa khác biệt rõ rệt trong mẫu mô UTĐTT và mẫu mô bình thường Tiếp đến, Catherine Lofton-Day và các cộng sự phân tích các mẫu mô sử dụng quy trình lựa chọn kết hợp giữa chip sinh học (microarray) và/hoặc phản ứng real-time PCR

để kiểm tra các dấu ấn có sự methyl hóa tối đa trong mô UTĐTT và khuếch đại tối thiểu trong các mô từ người khỏe mạnh và người bệnh mắc các bệnh khác Kết quả của nghiên cứu đã xác định được 56 gen có sự methyl hóa khác biệt rõ rệt và nhóm

nghiên cứu đã chọn ra được 3 dấu ấn tiềm năng: TMEFF2, NGFR và SEPT9 để

phân tích tình trạng methyl hóa trong huyết tương của 133 người bệnh UTĐTT và

179 người khỏe mạnh ở cùng độ tuổi Kết quả phân tích định tính chỉ ra SEPT9 là

dấu ấn nhạy nhất, được phát hiện trong 69% mẫu huyết tương UTĐTT, trong đó 30% người bệnh được phát hiện ở giai đoạn 1 (n = 20); 56% người bệnh được phát hiện ở giai đoạn 2 (n = 32); 45% người bệnh được phát hiện ở giai đoạn 3 (n = 47)

và 68% người bệnh được phát hiện ở giai đoạn 4 (n = 31) Trong khi đó, sự methyl

hóa gen TMEFF2 và NGFR được phát hiện thấy trong các người bệnh UTĐTT lần lượt là 65% và 51% Trên nhóm người khỏe mạnh, kết quả cho thấy SEPT9 và NGFR có độ đặc hiệu tương tự nhau lần lượt là 86% và 84%, TMEFF2 có độ đặc hiệu thấp nhất (69%) Do vậy, SEPT9 có thể giúp dự đoán sự hiện diện của UTĐTT chính xác hơn TMEFF2 (P<0,001) hay NGFR (P<0,01) Mặt khác, kết quả phân tích định lượng chỉ ra SEPT9 có nồng độ DNA methyl hóa cao hơn đáng kể so với NGFR (P<0,001) trong mẫu huyết tương của người bệnh UTĐTT Trong mẫu huyết tương của người khỏe mạnh, SEPT9 có nồng độ DNA methyl hóa thấp hơn TMEFF2 (P<0,01)

Sau khi xác nhận mSEPT9 trong máu ngoại vi là một chỉ thị ung thư tiềm

năng cho phát hiện UTĐTT, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để khẳng định xét

nghiệm methyl hóa SEPT9 là một xét nghiệm chính xác, nhanh và ít xâm lấn nhất

trong phát hiện UTĐTT [18, 28, 40, 68, 87, 90, 96] Các nghiên cứu này đều cho kết quả khả quan với độ nhạy và độ đặc hiệu dao động trong khoảng 48,2-95,6% và 82-98,9%, tương ứng [14, 28, 39, 40, 49, 55, 68, 87, 91] Sự khác biệt về độ nhạy và

độ đặc hiệu là do nhóm dân số lựa chọn, nhóm người bệnh và quy trình xét nghiệm thực hiện

Bảng 1.2 Độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm phát hiện methyl

hóa gen SEPT9 trong UTĐTT

Nghiên cứu

(năm)

Số ca nghiên cứu Độ

nhạy (%)

Độ đặc hiệu (%)

Phương pháp xét nghiệm

Tham khảo

(1/3 thuật toán)

HeavyMethyl [87]

(2/3 thuật toán) Warren và

HeavyMethyl [96]

(2/3 thuật toán)

(3/3 thuật toán) Toth và

2.0

[90]

(2/3 thuật toán) Lee và cộng

(meta-trước đó về vai trò của mSEPT9 trong máu ngoại vi trong UTĐTT 25 nghiên cứu

được chọn từ năm 2008 đến năm 2016 thực hiện trên 7 quốc gia bao gồm Mĩ, Trung Quốc, Đức, Hungary, Nga, Hàn Quốc và Đan Mạch Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng

độ nhạy và độ đặc hiệu chung của xét nghiệm lần lượt là 71% và 92%; tỉ lệ dương

tính của mSEPT9 cao hơn ở UTĐTT giai đoạn tiến triển (45% ở giai đoạn I, 70% ở

giai đoạn II, 76% ở giai đoạn III, 79% ở giai đoạn IV) [64] Và độ nhạy phát hiện đối với người Châu Á cao hơn các quốc gia khác Tháng 4 năm 2016, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã chấp nhận xét nghiệm phân tích

methyl hóa vùng promoter gen SEPT9 như một xét nghiệm máu đầu tiên cho sàng

lọc UTĐTT [97] với bộ kit thương mại Epi proColon®, Epigenomics

Mặc dù dấu ấn methyl hóa gen SEPT9 trong mẫu huyết tương cho độ nhạy

và độ đặc hiệu tốt giúp phát hiện UTĐTT, nhưng tính khả dụng trong lâm sàng của phương pháp này vẫn còn hạn chế Cụ thể, có một mức độ lớn sự không đồng nhất giữa các nghiên cứu có thể do nhiều nguyên nhân, đặc biệt là các yếu tố không liên quan đến khối u lên sự methyl hóa DNA, ví dụ như tuổi, giới tính, chủng tộc, mức

độ hoocmôn, chế độ ăn uống [51], lối sống (tiêu thụ cồn hay hút thuốc) [65] và các yếu tố môi trường khác Song và các cộng sự [80] đã tìm ra tỉ lệ phát hiện methyl

hóa gen SEPT9 cao ở những người bình thường và người bệnh ung thư trên 60 tuổi,

từ đó có thể thấy sự tăng methyl hóa gen SEPT9 có liên quan đến độ tuổi Thêm vào

đó, sự tăng của kết quả âm tính giả trong xét nghiệm methyl hóa SEPT9 có liên

quan đến tiểu đường, viêm khớp và xơ cứng động mạch (P<0,05) [66], điều này có

thể giải thích tại sao kết quả chẩn đoán xét nghiệm SEPT9 có khác biệt so với các

nghiên cứu trước đó

Giá cả cũng là một trong những giới hạn trong việc mở rộng quy mô ứng

dụng xét nghiệm methyl hóa gen SEPT9 Giá của một xét nghiệm methyl hóa SEPT9 ở châu Âu là khoảng 150 Euros, cao hơn đáng kể so với xét nghiệm phân

[14] Vì thế, xét nghiệm máu ẩn trong phân được ưu tiên chọn lựa nhiều hơn việc

xét nghiệm methyl hóa SEPT9 [44, 76] Ngoài ra, việc phát hiện polyp hay u tuyến

sử dụng phương pháp phân tích methyl hóa gen SEPT9 còn cho độ nhạy thấp chỉ

khoảng 35% [59], 20% [28] và 11,2% [14] Điều đó chỉ ra rằng dấu ấn sinh học này

là chưa đủ và chưa hiệu quả trong sàng lọc UTĐTT không biểu hiện ở người bệnh,

dù có khả năng phát hiện ở giai đoạn tiến triển (giai đoạn III và IV) của UTĐTT

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Để đánh giá hiệu quả của quy trình đã tối ưu, nghiên cứu sử dụng mẫu máu ngoại vi chống đông với K2/EDTA của nhóm UTĐTT và nhóm chứng khỏe mạnh

do Khoa Phẫu thuật Ống tiêu hóa (B2), Bệnh viện Quân Y 103 cung cấp, bao gồm:

- 25 mẫu của người bệnh UTĐTT

- 259 mẫu của người khỏe mạnh

Ngoài ra, để khảo sát tình trạng methyl hóa gen SEPT9 và đánh giá sơ bộ tiềm

năng của quy trình trong phát hiện UTĐTT, mẫu mô đúc nến vùi parafin (FFPE) của 6 người bệnh UTĐT, 2 người bệnh ung thư tuyến giáp và 1 người bệnh ung thư

dạ dày được sử dụng trong nghiên cứu Mẫu được cung cấp bởi Bộ môn - Khoa giải phẫu bệnh - Pháp y (C6), Bệnh viện Quân Y 103

Việc sử dụng các mẫu bệnh phẩm tuân theo các vấn đề đạo đức được thông qua bởi Hội đồng Y Đức Bệnh viện số 5984/QĐ-HVQY ngày 31/12/2020

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

G-block mang trình tự gen SEPT9 bị methyl hóa và không bị methyl hóa sau

khi xử lý bisulfite tổng hợp nhân tạo bởi công ty IDT được sử dụng như là bộ mẫu chuẩn cho quá trình tối ưu quy trình và đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng của quy trình tối ưu

Vùng trình tự được lựa chọn để tổng hợp bộ mẫu chuẩn là vùng trình tự

thuộc đảo CpG thứ 3 (CGI3) của gen SEPT9 mã hóa cho bản phiên mã SEPT9_v2,

liên quan chặt chẽ đến UTĐTT [98]

2.2 Hóa chất và thiết bị

Nghiên cứu được thực hiện và sử dụng các hóa chất, thiết bị tại Phòng Công nghệ Gen và Di truyền Tế bào, Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân Y

Bảng 2.1 Thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu

2 Hệ thống hút chân không QIAvac QIAGEN

Bảng 2.2 Hóa chất, vật liệu nghiên cứu

1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA tổng số

từ mẫu huyết tương, huyết thanh người bệnh

UTĐTT và nhóm chứng

QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit QIAGEN - Đức

2 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA tổng số

từ mẫu mô sinh thiết người bệnh UTĐTT

3 Hóa chất xử lý DNA

EZ DNA Methylation-Gold Kits Zymo Research – Mỹ

4 Hóa chất dùng trong phản ứng

Realtime-PCR

Mẫu dò khóa có thể kéo dài chuỗi IDT - Mỹ

Realtime PCR master mix SYBR Green Affymetric - Mỹ Realtime PCR master mix probe Affymetric - Mỹ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.3.2 Thu thập, bảo quản mẫu

Mô sinh thiết của các người bệnh được cố định bằng formalin và vùi parafin (FFPE) được bảo quản ở nhiệt độ phòng

Mẫu máu ngoại vi của các người bệnh và nhóm chứng khỏe mạnh: Lấy 8 -10

ml máu ngoại vi từ các người bệnh và người khỏe mạnh sử dụng chất chống đông EDTA và được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 3h Tại phòng thí nghiệm, tách phần huyết tương bằng ly tâm 5000 rpm trong thời gian 10 phút và chuyển sang tube nhựa polypropylen Phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng ở nhiệt độ -80oC cho mục đích phân tích gen bổ sung khi cần thiết Mẫu huyết tương và tế bào được bảo quản ở tủ âm -80°C đến khi phân tích

theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thể tích huyết tương được sử dụng để tách chiết DNA là 3 mL và thể tích DNA tách chiết thu được cuối cùng là 50 µL DNA sau khi tách chiết được bảo quản ở -80oC Nồng độ và chất lượng của mẫu DNA tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp đo phổ (Nanodrop)

 Tách chiết DNA từ mẫu mô người bệnh UTĐTT

Mẫu mô người bệnh UTĐTT là các mẫu mô FFPE dạng khối nến được tách

chiết sử dụng bộ Kit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) theo khuyến cáo của

nhà sản xuất Sử dụng máy mắt mô hoặc dao phẫu thuật để cắt các khối nến thành cát lát mỏng có độ dày 5 µm Từ 15-20 lát mô này sẽ được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo hướng dẫn của nhà sản xuất DNA sau khi tách chiết được hòa tan trong 50 µl đệm ATE và bảo quản ở -80oC

2.3.4 Xử lý mẫu DNA tổng số bằng phản ứng bisulfite

Sử dụng 20 μl DNA sau khi tách chiết làm đầu vào cho phản ứng chuyển đổi DNA bằng sodium bisulfite Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit

EZ DNA Methylation-Gold™ Kit (Zymo research) DNA sau khi qua các bước xử

lý được hòa tan trong 20 µl đệm TE 1x và bảo quản ở -80oC

2.3.5 Phương pháp realtime PCR phát hiện dấu ấn methyl hóa gen SEPT9

Để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR khuếch đại chọn lọc

DNA bị methyl hóa gen SEPT9 thì phương pháp sử dụng là một yếu tố vô cùng quan trọng Phương pháp phát hiện DNA bị methyl hóa của gen SEPT9 mà bộ kit

Epi proColon® 2.0 hiện đang áp dụng là phương pháp HeavyMethyl [16] Phương pháp này đã có nhiều nghiên cứu sử dụng để tối ưu và đánh giá hiệu quả phát hiện

DNA bị methyl hóa của gen SEPT9 [18, 28, 87, 96, 102] Trong khi đó, chưa có

nghiên cứu nào sử dụng phương pháp Headloop PCR để phát hiện methyl hóa gen

SEPT9 Vì thế, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp Headloop PCR cho phản ứng PCR khuếch đại chọn lọc DNA bị methyl hóa của gen SEPT9

(phản ứng đặc hiệu)

Bên cạnh đó, để đánh giá hiệu quả quá trình tách chiết, bisulfite và đánh giá

nồng độ gen SEPT9 trong mẫu, chúng tôi sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi được

thiết kế nhằm khuếch đại đồng thời DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl

hóa gen SEPT9 (phản ứng tổng số)

 Quy trình thực hiện phản ứng Realtime PCR:

+ Tiến hành đồng thời phản ứng realtime PCR khuếch đại chọn lọc DNA bị

methyl hóa gen SEPT9 (phản ứng đặc hiệu – phản ứng S) với phản ứng realtime PCR khuếch đại cả DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa gen SEPT9 (phản ứng tổng số - phản ứng T) đối với tất cả các mẫu DNA cần phân tích

+ Mỗi lần chạy luôn kèm theo các chứng âm không chứa khuôn DNA và chứng

dương DNA bị methyl hóa, DNA không bị methyl hóa gen SEPT9 Trong một lần

chạy, mỗi mẫu được chạy 02 lần lặp lại phản ứng đặc hiệu

+ Các phản ứng Realtime PCR được tiến hành trên hệ thống máy Rotor-Gene Q

với thể tích phản ứng là 20 µL và 5 µL DNA sau khi xử lý bisulfite được sử dụng làm khuôn Dữ liệu realtime PCR được thu thập bởi hệ thống Rotor-Gene Q và lưu trong máy tính sau đó sẽ được phân tích bằng phần mềm Rotor-Gene Q Software (hãng Qiagen)

2.3.6 Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện

Thí nghiệm xác định ngưỡng phát hiện của quy trình Realtime PCR phát

hiện methyl hóa gen SEPT9 được tiến hành với các bước thực hiện gồm: lựa chọn

nhóm mẫu và dải nồng độ tương ứng, pha dải nồng độ và thực hiện phản ứng

realtime PCR phát hiện methyl hóa gen SEPT9, tính toán xác định ngưỡng phát

hiện Quy trình đều được thực hiện trên 2 phản ứng: phản ứng tổng số (T) và nhóm phản ứng đặc hiệu (S) Trong đó, phản ứng T giúp đánh giá mẫu đầu vào để đảm bảo độ tin cậy của kết quả; ngưỡng phát hiện của quy trình được đánh giá dựa trên phản ứng S

Để xác định ngưỡng phát hiện của quy trình realtime PCR phát hiện methyl

hóa gen SEPT9, chúng tôi tiến hành thực hiện quy trình trên 2 nhóm mẫu là: bộ mẫu chuẩn DNA bị methyl hóa gen SEPT9 và bộ mẫu trộn chuẩn DNA bị methyl hóa gen SEPT9 trong mẫu nền DNA không bị methyl hóa gen SEPT9

 Xác định ngưỡng phát hiện dựa trên bộ mẫu chuẩn