Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và sàng lọc 09 tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa bằng kỹ thuật real time pcr taqman probe

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và sàng lọc 09 tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh phụ khoa bằng kỹ thuật real time pcr taqman probe

TỔNG QUAN

Tổng quan về bệnh phụ khoa

1.1.1 Bệnh viêm phụ khoa và tình hình nhiễm bệnh phụ khoa

Bệnh phụ khoa nói chung là những bệnh liên quan đến đường sinh sản của phụ nữ bao gồm các bệnh viêm âm đạo do vi khuẩn (Bacterial vaginosis - BV), bệnh lây truyền qua đường tình dục (Sexually Transmitted Diseases – STDs) hay bệnh khác như viêm lộ tuyến cổ tử cung, u xơ tử cung Bệnh phụ khoa được coi là bệnh nhiễm trùng phổ biến [57, 97] Tỉ lệ nhiễm bệnh ở các vùng, các quốc gia là khác nhau, tỉ lệ nhiễm bệnh ở nước đang phát triển cao gấp 20 lần các nước phát triển Riêng vùng Đông Nam Á có khoảng 150,5 triệu người mắc các bệnh này Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, khí hậu nóng và ẩm là những yếu tố thuận lợi cho các tác nhân vi sinh vật gây bệnh phát triển Theo báo cáo từ các đơn vị Da liễu của các tỉnh, mỗi năm có khoảng 300.000 người bị mắc các bệnh lây nhiễm quan đường tình dục [1, 7, 93]

Có nhiều tác nhân vi sinh vật gây nhiễm trùng đường âm đạo, bao gồm các loài vi khuẩn, virus, ký sinh trùng, và nấm Viêm âm đạo do vi khuẩn là nhiễm trùng âm đạo nội sinh gây ra bởi nhiều loài hơn 30 loài, đặc trưng bởi sự thay đổi thành phần của hệ vi sinh vật âm đạo Bệnh gây ra do sự thay thế Lactobacillus spp - nhóm vi khuẩn có lợi của âm đạo, dẫn đến tình trạng phát triển quá mức các khuẩn yếm khí như G vaginalis, M hominis, M genitalium [75] Viêm âm đạo do vi khuẩn có thể có triệu chứng hoặc không có triệu chứng Khoảng 50% phụ nữ có triệu chứng và cảm thấy âm đạo khó chịu với các triệu chứng điển hình như tiết dịch, ngứa và tăng pH âm đạo [15, 83] Trên thế giới, viêm âm đạo do vi khuẩn là bệnh phổ biến trong các bệnh lý nhiễm trùng đường sinh dục ở phụ nữ trong độ tuổi sinh sản Viêm âm đạo gặp ở tất cả các chủng tộc người Tỷ lệ nhiễm BV cao trên toàn cầu, dao động từ 23% đến 29% giữa các khu vực (Châu Âu và Trung Á, 23%; Đông Á và Thái Bình Dương, 24%; Châu Mỹ Latinh và Caribê, 24%; Trung Đông và Bắc Phi, 25 %; châu Phi cận Sahara, 25%; Bắc Mỹ, 27%; Nam Á, 29%) Ở Bắc Mỹ, phụ nữ da đen và gốc Tây Ban Nha có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn đáng kể (lần lượt là 33% và 31%) so với các nhóm chủng tộc khác (da trắng, 23%; Châu Á, 11%; p 4,5 5,0 đến 6,0 Điều trị và phòng ngừa các bệnh phụ khoa

Các tác nhân vi sinh vật gây bệnh phụ khoa phổ biến ở Việt Nam

Dựa trên các nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm các tác nhân vi sinh vật chính gây bệnh đường sinh dục trên thế giới và trong nước [3, 12, 63, 88, 93], chúng tôi tổng hợp và lựa chọn 09 mầm bệnh phụ khoa phổ biến nhất tại Việt Nam bao gồm (i) vi khuẩn G vaginalis, N gonorrhoeae, C trachomatis, M hominis, M genitalium; (ii) virus

Human alphaherpesvirus type 1 và 2; nấm C albicans và trùng roi T vaginalis

1.2.1 Tác nhân vi khuẩn và tình hình nhiễm khuẩn ở đường sinh dục a) Gardnerella vaginalis và tình hình nhiễm G vaginalis ở đường sinh dục

Vi khuẩn Lactobacillus Gram (+) chiếm khoảng 90% trong môi trường âm đạo Lactobacilli là lợi khuẩn tạo nên một môi trường axit làm hạn chế sự phát triển có hại của vi trùng và vi khuẩn Ngược lại, Gardnerella vaginalis là một loại “hại khuẩn”, kị khí cư trú trong hệ vi sinh vật âm đạo của phụ nữ bình thường Viêm âm đạo do Gardnerella xảy ra mật độ của vi khuẩn Gardnerella như G mobiluncus, G vaginalis phát triển quá mức trong âm đạo, “đàn áp” và gây ra sự “thiếu hụt” của các chủng Lactobacilli [4, 75] Tác nhân gây viêm âm đạo này có khả năng gây bệnh khi có sự hiện diện của 20% tế bào biểu mô âm đạo bị bao phủ bởi G vaginalis (Hình 1.1) G vaginalis có thể lây nhiễm qua đường quan hệ tình dục hoặc truyền từ người bệnh sang người khỏe mạnh do dùng chung quần áo, khăn tắm, bồn tắm Thói quen thụt rửa âm đạo hay sự thay đổi nội tiết tố khi mang thai khiến âm đạo ẩm ướt cũng tạo điều kiện cho vi khuẩn tấn công do mất cân bằng môi trường âm đạo Ở phụ nữ đã thực hiện phẫu thuật ở cổ tử cung như nạo thai, cắt bỏ cổ tử cung hay mắc các bệnh viêm vùng chậu cũng có nguy cơ mắc bệnh cao hơn [60]

Hình 1.1 Gardnerella vaginalis liên kết với tế bào biểu mô âm đạo [60]

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới mỗi năm có hơn hàng triệu phụ nữ trên toàn thế giới mắc các bệnh phụ khoa, trong đó có hơn 13% số phụ nữ bị viêm âm đạo do Gardnerella được thăm khám và chẩn đoán Vì thế có thể nói viêm âm đạo do

Gardnerella là bệnh khá phổ biến, âm thầm nhưng nguy hiểm [93] Tại Việt Nam, nghiên cứu của Viện Da liễu Quốc Gia (2012) tại 5 tỉnh trong cả nước năm 2011 cho kết quả là ở nội thành Hà Nội có 41,5% phụ nữ bị nhiễm trùng phụ khoa, trong đó do vi khuẩn chiếm 25,6%, do nấm chiếm 15,3% Vùng ngoại thành Hà Nội có tới 59,6% phụ nữ bị nhiễm trùng phụ khoa, trong đó nhiễm nấm cao nhất 39,9%, do G vaginalis là 18,9%, các vi khuẩn khác chiếm tỷ lệ thấp hơn, tỷ lệ nhiễm cả hai căn nguyên là 15,7% Vùng ven biển Thái Bình có 56,9% phụ nữ bị nhiễm trùng, trong đó cao nhất là do nấm C albicans 28,6%, do G vaginalis khá cao 26,8%, do vi khuẩn khác có tỷ lệ thấp hơn, do lậu cầu 0,3%, nhiễm 2 căn nguyên trở lên là 21,7% Vùng chiêm trũng

Hà Nam có 58,4% phụ nữ bị nhiễm trùng đường sinh sản, trong đó cao nhất là do nấm C albicans 38,7%, do G vaginalis 18,7%, do vi khuẩn khác có tỷ lệ thấp hơn

[12] Nghiên cứu khác của Nguyễn Quang Thông và cộng sự (2019) trên 1228 phụ nữ đã kết hôn, tuổi từ 18-49 tại Cần Thơ nhằm xác định tỷ lệ nhiễm trùng đường sinh dục Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm trùng đường sinh dục là 58,6% Tác nhân gây nhiễm trùng đường sinh dục ở phụ nữ phổ biến là G vaginalis (24,3%), nấm Candida (20,4%), N gonorrhoeae (6,3%), C trachomatis (5,7%) và Trichomonas vaginalis (3,5%) Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ cao, nhất là nhiễm khuẩn âm đạo do G vaginalis [10] Nghiên cứu của Nguyễn Minh Thư (2018) trên 300 nam giới cho thấy 72,9% nhiễm STI và viêm đường tiết niệu, trong đó G vaginalis là vi khuẩn gây bệnh phổ biến nhất (45,7%) Tỷ lệ nhiễm đơn và đa tác nhân với G vaginalis tương đương nhau, lần lượt là 49% và 51% [82]

Viêm âm đạo do G vaginalis gây ra thường không có triệu chứng hoặc có triệu chứng không điển hình như sốt, đau bụng dưới và tăng lượng bạch cầu, âm đạo có mùi khó chịu, dịch âm đạo có màu vàng hoặc trắng, pH lớn hơn 5.0 Mặc dù không có nhiều biến chứng, nhưng nó được coi là một yếu tố nguy cơ như: vô sinh, thai ngoài tử cung, sinh non và bệnh viêm vùng chậu Người nhiễm G vaginalis bị suy giảm miễn dịch có thể tăng nguy cơ nhiễm N gonorrhoeae, C trachomatis, HSV-1, HSV-2, HIV Trong chẩn đoán, tuf gene thường được sử dụng làm gen mục tiêu cho các nghiên cứu về định tính và phát sinh loài vì nó được phân bố phổ biến và ở hầu hết các vi khuẩn Gram dương Gen này mã hóa yếu tố kéo dài Tu, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein, giúp tạo điều kiện kéo dài polypeptide từ ribosome và aminoacyl-tRNA trong quá trình dịch mã Vì vậy thường được lựa chọn để phân biệt giữa các loài có quan hệ gần gũi với nhau cũng như giữa các phân loài, trình tự DNA mang lại độ nhạy và độ chính xác cao [93] b) Neisseria gonorrhoeae và tình hình nhiễm N gonorrhoeae ở đường sinh dục

Neisseria gonorrhoeae (lậu cầu) là song cầu khuẩn Gram âm Chúng thường xuất hiện theo cặp (Telococci), giống như hình dạng của hạt cà phê (Hình 1.2) Các chủng Neisseria không hình thành bào tử, có khả năng di chuyển, và thuộc nhóm hiếu khí Trong số 11 loài Neisseria có khả năng tồn tại trong cơ thể con người thì chỉ có hai loài: N gonorrhoeae là tác nhân gây bệnh lậu còn N meningitidis là một trong những nguyên nhân gây viêm màng não [11, 73]

Hình 1.2 Ảnh nhuộm Gram mẫu viêm phụ khoa do nhiễm N gonorrhoeae [73]

Như những tác nhân lây qua đường tình dục khác, lậu cầu chủ yếu được lây từ hoạt động quan hệ tình dục không an toàn với người nhiễm bệnh hoặc người mang vi khuẩn lậu dù không có triệu chứng Lậu cầu không chỉ gây bệnh ở cơ quan sinh dục mà còn gây nên tình trạng nhiễm lậu cầu hầu họng, đặc biệt ở những người quan hệ tình dục đường miệng Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới WHO năm 2019, hàng năm trên toàn cầu có khoảng 87 triệu trường hợp mới mắc bệnh lậu Theo thống kê khu vực Đông và Đông Nam Á có 29 triệu trường hợp Dựa trên dữ liệu về tỷ lệ lưu hành từ năm 2009 đến năm 2016 về tỉ lệ người mắc bệnh lậu, ước tính toàn cầu là 0,9% (95% UI: 0,7-1.1) ở phụ nữ và 0,7% (95% UI: 0,5 -1.1) ở nam giới [93, 108]

Tại Việt nam, theo báo cáo hàng năm có hơn 3.000 trường hợp, tuy nhiên theo ước tính thực tế thì có khoảng vài chục ngàn trường hợp mỗi năm Nghiên cứu tỷ lệ mắc bệnh lậu ở một số đối tượng tại Hà Nội năm 2003 cho thấy phụ nữ mại dâm là 3%, nam thanh niên khám tuyển nghĩa vụ quân sự là 2% và bệnh nhân nam đến khám các bệnh lây truyền qua đường tình dục là 2,5% Bệnh hay gặp ở các đô thị, vùng đông dân cư [11]

Người là vật chủ duy nhất của lậu cầu Lậu cầu tồn tại rất ngắn ngoài cơ thể người khoảng vài giờ, ở nhiệt độ lạnh và khô vi khuẩn lậu chết nhanh Tuy nhiên người ta có thể nuôi cấy được lậu từ nhà vệ sinh bị nhiễm số lượng lớn trong vòng 24 giờ (đây là quan điểm cổ điển về sự lây truyền qua tiếp xúc) Cách thức lây truyền chính của vi khuẩn lậu cầu (khoảng 90%) là do tiếp xúc trực tiếp qua đường niêm mạc với những người mắc bệnh lậu qua đường quan hệ tình dục, ngoài ra 10% lây nhiễm do các con đường khác, lậu mắt ở trẻ em lây qua tiếp xúc với bộ phận sinh dục người mẹ khi sinh, thậm chí còn lây gián tiếp qua vật dụng chưa được tiệt trùng sạch như đồ lót, bàn chải đánh răng, khăn tắm, dao cạo râu [53] Khi phụ nữ mang thai nhiễm vi khuẩn này, nếu như sinh thường và không có các biện pháp can thiệp sẽ có khả năng cao lây cho con 70% phụ nữ nhiễm N gonorrhoeae nhưng không có triệu chứng hoặc triệu chứng không điển hình như tiểu buốt, tiết dịch từ âm đạo, chảy máu âm đạo giữa chu kì, huyết trắng hoặc vàng và có mùi hôi Các biểu hiện thường nhẹ và không đáng chú ý khiến các triệu chứng dễ bị bỏ qua ở giai đoạn này Nếu không được điều trị, trường hợp nặng vi khuẩn lậu có thể lan tràn đến tử cung và vòi trứng gây viêm vùng chậu, vô sinh hoặc sẩy thai Bệnh có thể được điều trị bằng thuốc kháng sinh, tuy nhiên khả năng tái phát cao do các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tang [89] Trong chẩn đoán, a porA pseudogene thường được sử dụng để phát hiện N gonorrhoeae bởi có trình tự bảo thủ cao, mức độ phổ biến và tính đa hình di truyền của gen này quan sát trên 87 chủng N gonorrhoeae khác nhau b) Chlamydia trachomatis và tình hình nhiễm C trachomatis ở đường sinh dục

Chlamydia trachomatis là một loại vi khuẩn Gram âm thuộc chi Chlamydia – một nhóm ký sinh trùng nội bào bắt buộc của các tế bào nhân chuẩn C trachomatis có bộ gen rất nhỏ (1,04 Mb) phù hợp với lối sống nội bào của nó Ở các chủng C trachomatis, gen trpA và trpB mã hóa các đơn vị chức năng của enzym tổng hợp tryptophan, enzym này tổng hợp tryptophan từ indole ngoại sinh Các gen này cũng thường là được lựa chọn làm gen đích để chẩn đoán [106] Mặc dù tác động chính của C trachomatis là trên đường sinh dục nữ, nhưng nó cũng là nguyên nhân nhiễm trùng ở nam giới và trẻ em Ở nam giới khoảng 4 đến 10% nhiễm C trachomatis mà không có triệu chứng Việc kiểm soát bệnh gây ra bởi C trachomatis gặp khó khăn do khoảng 70 đến 80% phụ nữ và lên tới 50% nam giới nhiễm bệnh mà không có kiến thức về các triệu chứng Tiến triển của bệnh và biểu hiện lâm sàng của nhiễm C trachomatis là do sự phối hợp giữa huỷ hoại tổ chức tế bào do C trachomatis nhân lên và đáp ứng viêm của tổ chức tế bào với vi khuẩn này, đồng thời với các chất hoại tử do tế bào bị phá huỷ Mỗi thể vùi (hình cầu nhỏ màu đỏ cạnh nhân màu tím) khi giải phóng ra hàng trăm thể nhiễm trùng, như vậy sẽ có rất nhiều tế bào lân cận bị nhiễm (Hình 1.3).Nhiễm C trachomatis có thể đồng nhiễm với N gonorrhoeae, U urealyticum, M genitalium, T vaginalis và HSV [110]

Hình 1.3 Hình thái của C trachomatis ở giai đoạn nhân lên trong tế bào [110]

C trachomatis lây truyền qua dịch tiết và màng nhầy của niệu đạo, cổ tử cung, trực tràng, kết mạc và hầu họng của người bị nhiễm bệnh C trachomatis chủ yếu chỉ lây truyền khi quan hệ tình dục không bảo vệ qua âm đạo, hậu môn hay đường miệng và còn có thể lây truyền từ mẹ sang con Trong quá trình chuyển dạ vi khuẩn này có thể lây truyền theo chiều dọc và gây viêm kết mạc và viêm vòi trứng ở trẻ sơ sinh (khoảng 65% trẻ sơ sinh bị lây từ người mẹ có nhiễm khuẩn) Quan hệ đồng tính cũng có nguy cơ lây nhiễm C trachomatis khi quan hệ tình dục qua đường miệng hoặc hậu môn [23]

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính hàng năm có khoảng 90 triệu trường hợp nhiễm C trachomatis mới Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn này ở người lớn tại Nam Thái Bình Dương là 73%, Papua New Guinea là 20%, Nhật Bản 7,0%, Việt Nam 2,3%, Senegan 7,0% [23] Ở Việt Nam, một nghiên cứu về tỉ lệ người nhiễm C trachomatis tại Hà Nội năm 2003 cho thấy tỷ lệ nhiễm ở phụ nữ có thai là 1,5%, người khám STD là 1,5%, gái mại dâm là 5,0% [9] Kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Thu Hà và cộng sự

(2005) ở 380 phụ nữ từ 18- 49 tuổi ở nội thành Hà Nội chỉ ra tỷ lệ mắc nhiễm trùng đường sinh dục rất cao chiếm 62,1%, trong đó viêm âm đạo do vi khuẩn chiếm chủ yếu với tỷ lệ 50%, do C trachomatis là 45,8%, nấm C albicans là 31,8% và thấp nhất là T vaginalis là 3,8% C trachomatis là nguyên nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng với một số biến chứng nghiêm trọng do phần lớn bệnh nhân nhiễm bệnh không có triệu chứng Phụ nữ khi mắc bệnh thường có triệu chứng không điển hình như sốt, đau bụng dưới, khó thở, tiết dịch âm đạo bất thường hoặc chảy máu và có thể đau khi quan hệ tình dục Nếu không được điều trị đúng và kịp thời có thể dẫn đến bệnh viêm vùng chậu, mang thai ngoài tử cung, vô sinh và đau vùng chậu mãn tính [3] c) Mycoplasma v à tình hình nhiễm Mycoplasma ở đường sinh dục

Các phương pháp chẩn đoán các tác nhân gây bệnh phụ khoa

Hiện nay có nhiều phương pháp, xét nghiệm chẩn đoán STI như: nhuộm Gram, soi tươi trên kính hiển vi, nuôi cấy phân lập, xét nghiệm phát hiện kháng nguyên, xét nghiệm huyết thanh học, và các phương pháp sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử như PCR, real-time PCR, hay phản ứng lai DNA sử dụng đầu dò gắn enzyme xúc tác cho cơ chất [77]

1.3.1 Các phương pháp vi sinh Để có các liệu pháp điều trị tốt nhất, cách tiếp cận đầu tiên là phải chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh Các phương pháp để chuẩn đoán BV phổ biến như tiêu chuẩn Amsel, hay các tiêu chí Nugent dựa trên các triệu chứng lâm sàng như màu, mùi dịch âm đạo, và các phương pháp vi sinh thông thường như soi trực tiếp,nuôi cấy phân lập [91]

Dựa trên hình thái, cách sắp xếp cũng như tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram âm hay Gram dương Một số tác nhân vi sinh vật có thể phát hiện khi soi trên kính hiển vi Ví dụ G vaginalis, N gonorrhoeae và T vaginalis có thể phát hiện trực tiếp qua soi tươi hoặc nhuộm Gram Nhiễm G vaginalis chỉ được khẳng định khi có sự hiện diện hơn 20% của tế bào biểu mô âm đạo (Clue cells) bị bao phủ bởi vi khuẩn gây bệnh Bạch cầu hay tế bào mủ được khảo sát bằng vật kính x10 (< 25 tế bào/VT (+): Bình thường; 25 - 100 tế bào/VT (++): Theo dõi và nhận định kèm các tác nhân khác; >100 tế bào/VT (+++): Bất thường ) (Hình 1.8) [4]

Hình 1.8 Hình ảnh tế bào Clue cells dưới kính hiển vi: (A) soi tươi; (B) nhuộm

Gram (B) và (C) G vaginalis bao phủ tế bào biểu mô âm đạo [4]

Ngoài ra, nấm C albicans, trùng roi T vaginalis, virus HSV-1/HSV-2 cũng có thể phát hiện bằng soi trực tiếp Phương pháp vẫn được sử dụng thường quy tại các bệnh viện tại Việt Nam cho một số tác nhân gây bệnh với ưu điểm là không tốn kém, nhanh chóng và đơn giản dễ thực hiện Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp thường không cao (từ 38% đến 82%) do phụ thuộc rất nhiều vào việc lấy mẫu, kinh nghiệm của người quan sát và mẫu cần được giữ ẩm là điều quan trọng Để có kết quả tối ưu, khi chỉ định xét nghiệm thông thường sẽ phối hợp theo nhóm các kỹ thuật chứ không chỉ dừng lại ở một kỹ thuật đơn lẻ Đặc biệt đối với phương pháp soi, các mẫu cần được lấy từ gốc của tổn thương Điều này có thể khó khăn và khiến bệnh nhân đau đớn và không phát hiện được người bệnh có mức độ nhẹ [4] Một nhược điểm khác khi quan sát dưới kính hiển vi là thiếu tính đặc hiệu do không thể phân biệt được HSV-1 và HSV-2 Trên thực tế, các phương pháp này chỉ đánh giá sự xuất hiện của tác nhân gây bệnh, mà không xác định được chính xác từng loài, cũng như không cho phép định lượng chính xác lượng mầm bệnh trên một đơn vị mẫu [17]

Nuôi cấy, phân lập vi sinh vật được cho là “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Đây cũng là phương pháp để làm kháng sinh đồ nhằm xác định khả năng kháng thuốc, từ đó lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân Ưu điểm của phương pháp này là chỉ cần có môi trường nuôi cấy thích hợp nhưng nhược điểm là nhiều tác nhân STI nuôi cấy khó, đòi hỏi môi trường đặc biệt và tốn nhiều thời gian do vi khuẩn mọc chậm, dẫn tới thời gian chờ đợi kết quả lâu và chậm trễ trong việc điều trị Trong số 09 tác nhân STI, một số tác nhân có thể phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy điển hình như C albicans, T vaginalis, N gonorrhoeae Cụ thể, C albicans có thể phát hiện trên nuôi trường thạch máu hoặc Sabouraud – Dextrose agar dựa trên hình thái khuẩn lạc có màu kem, mịn, dạng tế bào hình tròn đến hỡnh bầu dục khoảng 4 đến 8 àm và và cần ớt nhất 2 ngày 4 để xỏc định cỏc loài

Hình 1.9 Hình thái khuẩn lạc C albicans trên Sabouraud – Dextrose agar sau 48 giờ [94]

Nuôi cấy trên môi trường Diamond’s TYI cho phép phát hiện T vaginalis trong phạm vi 10 2 khuẩn lạc/mL Kỹ thuật này đòi hỏi phải tiền xử lý mẫu bằng kháng sinh, sử dụng môi trường Diamond’s TYI làm môi trường chuyển, sau đó là truyền qua nuôi cấy tế bào [42]

Nuôi cấy cũng là phương pháp xét nghiệm mang lại những hiệu quả cao trong việc chẩn đoán bệnh lậu N gonorrhoeae cũng như xác định khả năng kháng kháng sinh của lậu cầu hiện nay là đáng báo động Do đặc tính vi khuẩn lậu không chịu được khô, nên sau khi lấy mẫu bệnh phẩm cần đưa ngay vào môi trường nuôi cấy phù hợp: Thayer–Martin (TM) medium, modified Thayer–Martin medium (MTM), Martin–Lewis (ML) medium, New York City (NYC) medium, GC–Lect (GC–L) medium; môi trường nóng, độ ẩm > 90%, 5-7% CO2 tại nhiệt độ 36 o C [98]

1.3.2 Phương pháp miễn dịch học

Xét nghiệm miễn dịch là kỹ thuật dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên với kháng thể tạo nên phức hợp kháng nguyên - kháng thể Nhờ đặc tính kết hợp rất đặc hiệu này mà xét nghiệm miễn dịch có thể xác định các tác nhân gây bệnh, hoặc xác định kháng nguyên hoặc kháng thể nếu một trong hai phân tử đã biết.

Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (Direct immunofluorescence assay - DFA) được sử dụng rộng rãi có thể trả kết quả trong 60-90 phút Xét nghiệm DFA có độ đặc hiệu cao đối với nhiễm HSV và N gonorrhoeae Phát hiện và định lượng kháng thể IgM kháng HSV-1 và HSV-2; hoặc kháng thể IgG và IgA của C trachomatis; kháng thể IgG kháng lại kháng nguyên enolase của C albicans trong huyết thanh hoặc huyết tương dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA) cũng đã được sử dụng là một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán virus, vi khuẩn cho kết quả chẩn đoán sớm trong quá trình nhiễm bệnh, rất hữu ích để điều trị cho bệnh nhân [28] Ngoài ra, việc phát hiện kháng thể IgA còn thích hợp để theo dõi điều trị Vì việc phát hiện kháng thể IgA đặc hiệu có thể chỉ định tình trạng nhiễm cấp và được coi là một chỉ số quan trọng do thời gian tồn tại của IgA rất ngắn và chỉ tồn tại khi có sự kích thích của kháng nguyên Kháng thể IgG là chỉ điểm cho đáp ứng miễn dịch dương tính với tác nhân cũng như tình trạng nhiễm cấp, mạn tính hay nhiễm khuẩn trong quá khứ Xét nghiệm này có hiệu quả với quy mô sàng lọc lớn, không đòi hỏi vi khuẩn còn sống, rẻ tiền hơn nuôi cấy và yêu cầu kỹ năng xét nghiệm vừa phải Tuy vậy nó có nhược điểm là không sử dụng được với nhiều loại mẫu lấy từ đại tràng, cơ quan hô hấp và âm đạo do giảm độ nhạy và độ đặc hiệu với các mẫu này, được sử dụng sàng lọc quần thể có tỷ lệ dương tính thấp (≤ 5%) [5]

1.3.3 Phương pháp sinh học phân tử

Trong lĩnh vực truyền nhiễm, chẩn đoán phân tử thường được sử dụng để phát hiện, sàng lọc nhanh, định loại, định lượng, xác định tính kháng thuốc của tác nhân gây bệnh, chủ yếu là virus và vi khuẩn Phương pháp này mang lại nhiều ưu điểm trong việc chẩn đoán, xác định tác nhân gây bệnh với thời gian thực hiện nhanh và độ chính xác cao, khắc phục nhược điểm của các phương pháp vi sinh và miễn dịch Các kỹ thuật phổ biến nhất được phát triển là PCR, DNA mini chip và real-time PCR

Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp) là quá trình tạo nhiều bản sao một đoạn DNA mục tiêu, được thực hiện bằng cách sử dụng các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt Sau đó, sử dụng điện di gel agarose để kiểm tra kích thước sản phẩm PCR, giúp xác định sự có mặt hoặc vắng mặt của tác nhân gây bệnh Tuy nhiên, nghiên cứu của Nguyễn Nam Thắng và cộng sự (2016) mặc dù khẳng định độ nhạy và độ đặc hiệu cao của phương pháp PCR, nhưng không đưa ra số liệu cụ thể Trong khi đó, nghiên cứu của Mahony và cộng sự (1995, 1997) đã phát triển kỹ thuật PCR đa đích để phát hiện đồng thời tác nhân bệnh với độ đặc hiệu 100% và độ nhạy cao (92,3% đối với N gonorrhoeae), so với độ nhạy thấp hơn của phương pháp nuôi cấy.

84,6%, độ nhạy của C trachomatis là 100% trong khi phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme có độ nhạy 81,8% [66, 67] Mặc dù các xét nghiệm PCR thường có kết quả độ chính xác, độ nhạy cao hơn các phương pháp vi sinh, hoá sinh, và miễn dịch như đã đề cập ở trên, phương pháp này không được áp dụng nhiều cho việc chẩn đoán tại bệnh viện Lý do chủ yếu là sau khi có sản phẩm PCR phải thực hiện thêm nhiều thao tác chạy điện di và nhuộm gel để kiểm tra sự xuất hiện của băng PCR đặc hiệu mới kết luận âm tính hay dương tính dẫn đến chậm trễ trong chẩn đoán kết quả Ngoài ra, vấn đề nhiễm sản phẩm PCR ngược lại vào các master mix (amplicon carrier over) gây ra hiện tượng dương tính giả do các sản phẩm PCR sau điện di nhiễm vào không khí, nguồn nước, hoá chất và dụng cụ, áo bảo hộ trong phòng thí nghiệm

Kỹ thuật DNA mini chip phối hợp giữa phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu cho từng tác nhân sử dụng mồi gắn biotin sau đó tiến hành phản ứng lai với các probe đặc hiệu gắn trên mini chip Kỹ thuật này được áp dụng khá phổ biến cho sàng lọc đa tác nhân gây bệnh trong một mẫu bệnh phẩm Một vài nhóm nghiên cứu và hãng sản xuất đã phát triển các kit phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh đường âm đạo Có thể kể đến là chip “GenoFlow STD array test kit”của hãng Diagcor phát hiện được 11 tác nhân gây bệnh gồm C trachomatis, N gonorrhoeae, M genitalium, U Urealyticum,

U parvum, T vaginalis, M hominis, HPV type 6, HPV type 11, HSV-1 và HSV-2 có độ nhạy và độ chính xác cao, hiện đang áp dụng tại nhiều đơn vị y tế, trong đó có tại Bệnh viện Da liễu Trung ương Tuy nhiên chi phí của DNA mini chip khá cao (khoảng 2 triệu đồng/xét nghiệm) nên người bệnh có thu nhập thấp và trung bình thường không có điều kiện chi trả cho xét nghiệm này [14]

Kỹ thuật Real-time PCR là phương pháp chẩn đoán phân tử với độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao và thời gian thực hiện nhanh Phương pháp này kết hợp hai quá trình diễn ra đồng thời: khuếch đại DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng DNA được tạo thành Độ đặc hiệu của Real-time PCR phụ thuộc vào hóa chất theo dõi phản ứng khuếch đại và dụng cụ kiểm tra tín hiệu Để phát hiện đặc hiệu tác nhân gây bệnh, cần xác định gen đích làm mục tiêu để thiết kế mồi và đầu dò nhân bản đặc hiệu Trong các nghiên cứu, các gen đích thường được lựa chọn là các gen đặc trưng hoặc gen có trình tự bảo thủ cao.

Đối tượng nghiên cứu

Mẫu tham chiếu dùng cho xây dựng phương pháp real-time PCR:

- Đánh giá độ đặc hiệu của mồi, đầu dò và khả năng bắt cặp chéo với các tác nhân khác Tổng cộng 39 mẫu tham chiếu gồm (i) 10 chủng chuẩn vi sinh vật ATCC/VTCC và (ii) 29 mẫu DNA tham chiếu trong đó:

(i) 03 chủng chuẩn STI là G vaginalis ATCC 14018, N gonorrhoeae VTCC

19424, C albicans ATCC 14053; 07 chủng chuẩn của các loài vi khuẩn gây bệnh/lợi khuẩn cư trú phổ biến ở âm đạo (không phải là STIs) là Echerichia coli VTCC 12272, Lactobacillus accidophilus VTCC 12284, L plantarum VTCC

10936, L casei VTCC 10411, L rhamnosus VTCC 11354, Bacillus subtilis VTCC

Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp chủng vi khuẩn B clausii VTCC 11111 từ Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) của viện này và từ Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật Hoa Kỳ (ATCC).

(ii) 29 mẫu DNA tham chiếu trong đó có 14 HPV genotypes nguy cơ cao và thấp

16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68; và 12 mẫu DNA Control dương tính với 12 tác nhân và các DNA tham chiếu thu thập từ bộ sưu tập DNA của Khoa Vi sinh, Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội và Vircell Microbiologists (Tây Ban Nha)

- Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy và độ tương đồng của kỹ thuật real-time PCR xây dựng với các bộ kit thương mại có chứng chỉ xét nghiệm CE-IVD: 136 mẫu dịch phết âm đạo dương tính hoặc âm tính với 9 STI, được cung cấp bởi các nhóm nghiên cứu tại Khoa Vi sinh, Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Da liễu Trung ương và Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội

Mẫu thử nghiệm dùng đánh giá tính ứng dụng của phương pháp real-time PCR:

535 mẫu bệnh phẩm (bao gồm tăm bông phết âm đạo và mẫu dịch phụ khoa đã xử lý) của các bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội và Bệnh viện Bạch Mai được thu thập từ tháng 12/2020 đến tháng 7/2022

Chọn mẫu thuận tiện và bảo quản theo quy trình thường quy tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội và Bạch Mai Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân như sau: phụ nữ, tuổi từ 18–66, sống ở miền Bắc Việt Nam, có các triệu chứng lâm sàng điển hình của nhiễm trùng âm đạo, mức độ viêm nặng, thể hiện qua mật độ bạch cầu cao Tiêu chuẩn loại trừ là các bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu và có các vấn đề rối loạn tâm thần Các thông tin thu thập về mẫu bệnh phẩm bao gồm: họ tên, tuổi, giới tính, các triệu chứng lâm sàng, mật độ bạch cầu Hồ sơ của bệnh nhân được mã hóa thành số và bảo mật, các thông tin chỉ dùng cho nghiên cứu.

Hóa chất và thiết bị

- Tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm sử dụng bộ sinh phẩm QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Đức) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất

The real-time PCR reaction used the master mix TOPreal™ qPCR 2XPreMIX from Enzynomics in South Korea The forward and reverse primers for the real-time PCR reaction were obtained from Phù Sa Biochem in Can Tho, Vietnam, while the probe was purchased from Integrated DNA Technologies (IDT) in the USA.

- Sản phẩm PCR của gDNA khuếch đại đặc hiệu các tác nhân được nhân dòng vào vector pTOPv2 sử dụng bộ sinh phẩm nhân dòng TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics, Hàn Quốc) hoặc được tổng hợp và nhân dòng vào vector pUC19 sử dụng dịch vụ của hãng Phù Sa Biochem (Cần Thơ, Việt Nam)

- Đánh giá độ tương đồng của phương pháp xây dựng so với kit thương mại nhập ngoại có chứng chỉ CE-IVD Chúng tôi lựa chọn 3 bộ kit thương mại sau:

+ Allplex TM CT/NG/MG/TV Assay(Seegene Inc, Seoul, Hàn Quốc): 100 test/bộ + Allplex™ Vaginitis Screening Assay (Seegene Inc, Seoul, Hàn Quốc): 100 test/bộ

+ Allplex™ Essential Assay (Seegene, Seoul, Hàn Quốc): 50 test/bộ

- Ngoài ra, các hoá chất khác được mua của các hãng có uy tín như Merck, Enzynomics… đảm bảo cho các nghiên cứu trong sinh học phân tử

Hệ thống máy ly tâm hiệu Eppendorf, máy gia nhiệt, máy vortex hiệu IKA và máy spin down hiệu Eppendorf được sử dụng trong quá trình xử lý mẫu bệnh phẩm để tách, ly trích các thành phần hoặc pha chế hỗn hợp phản ứng (thường được gọi là master mix) để chuẩn bị cho quá trình chạy PCR.

- Máy Nanodrop (Thermo Scientific) nhằm xác định nồng độ DNA plasmid và DNA của mẫu bệnh phẩm, đảm bảo lượng khuôn đầu vào cho phản ứng real-time PCR

- Hệ thống máy LightCycler ® 96 Instrument (Roche Diagnostics, Đức) do công ty ANABIO R&D đặt máy tại PTNTĐCENP và CFX 96 (Bio-Rad, Mỹ) đặt tại bệnh viện Nhi Trung ương được sử dụng trong các phản ứng real-time PCR

- Ngoài ra, các vật tư tiêu hao và thiết bị khác đạt chuẩn trong sinh học phân tử.

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thiết kế mồi và probe nhân đoạn gen đích của 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa và gen nội chuẩn β-actin

Dựa trên cơ sở dữ liệu nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm các tác nhân gây bệnh viêm phụ khoa và trao đổi với các trưởng khoa xét nghiệm về nhu cầu xét nghiệm thực tế tại các bệnh viện tại Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn 9 tác nhân gây bệnh viêm phụ khoa phổ biến tại Việt Nam, bao gồm vi khuẩn như Gardnerella vaginalis (GV), Neisseria gonorrhoeae (NG), Chlamydia trachomatis (CT), Mycoplasma hominis (MH).

5 Mycoplasma genitalium (MG); virus 6 Human alphaherpesvirus type 1 (HSV-1);

7Human alphaherpesvirus type 2 (HSV-2); nấm 8 Candida albicans (CA); và trùng roi 9 Trichomonas vaginalis (TV) Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự genome của các chủng thuộc cùng một loài tác nhân gây bệnh với các trình tự genome của các tác nhân khác để tìm ra vùng gen đích bảo thủ của từng tác nhân bằng phần mềm SnapGen v3.2.1 (San Diego, CA, Hoa Kỳ) và trình tự nucleotide DNA thu thập trên NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) Thông tin của gen đích cho từng tác nhân gây bệnh và kênh huỳnh quang được thiết kế cho từng probe phát hiện gen đích được trình bày ở Bảng 2.1, trong đó mỗi master mix phát hiện đồng thời 03 tác nhân gây bệnh và 01 gen nội chuẩn và sự lựa chọn tác nhân tương ứng với từng kênh huỳnh quang không là ngẫu nhiên mà đã được tối ưu để đảm bảo hiệu suất khuếch đại trong phản ứng multiplex real-time PCR

Bảng 2.1 Thông tin vùng trình tự gen đích dùng để nhân bản đặc hiệu 09 tác nhân vi sinh vật liên quan tới viêm nhiễm phụ khoa

TT Tên tác nhân Viết tắt Gen đích Kênh huỳnh quang

1 Gardnerella vaginalis GV tuf FAM

2 Neisseria gonorrhoeae NG PorA pseudo HEX

3 Chlamydia trachomatis CT trp Cy5

4 Gen nội chuẩn IC β-actin Texas Red

1 Human alphaherpesvirus type 1 HSV-1 UL27 FAM

2 Candida albicans CA RPR1 HEX

4 Gen nội chuẩn IC β-actin Texas Red

1 Mycoplasma hominis MH 16S rRNA FAM

2 Human alphaherpesvirus type 2 HSV-2 UL27 HEX

3 Mycoplasma genitalium MG mg219 Cy5

4 Gen nội chuẩn IC β-actin Texas Red

Các bộ mồi và đầu dò oligonucleotide tại các vị trí bảo thủ cao nhân bản đặc hiệu đoạn gen đích của từng tác nhân với các kích thước tương ứng được thiết kế dựa vào cơ sở dữ liệu trình tự DNA gen đích của các tác nhân gây viêm phụ khoa đã lựa chọn, sử dụng công cụ IDT’s Primer Quest (IDT, USA) kết hợp với phần mềm SnapGen v3.2.1 (San Diego, CA, Hoa Kỳ) Mỗi đầu dò của từng tác nhân được gắn huỳnh quang ở đầu 5′ với 5'-FAM (Fluorescein), 5'-HEX (Hexachloro-fluorescein) hoặc 5'-Cy5 (Cyanine) Đầu dò của gen nội chuẩn β-actin được gắn huỳnh quang 5’- ROX /Texas Red (Carboxy-X-rhodamine) được sử dụng làm gen nội chuẩn để kiểm soát phản ứng và ngăn kết quả âm tính giả Chúng tôi lựa chọn 4 kênh màu huỳnh quang FAM, HEX, Cy5 và Texas Red này vì tính phổ biến của chúng trong quá trình tổng hợp theo thứ tự và bước sóng phát xạ của chúng được phân tách tốt dưới bốn kênh quang học của hệ thống real-time PCR, chẳng hạn như Light Cycler 96/480 (Roche Diagnostics, Đức), CFX96 Touch Real-Time PCR (Bio-Rad, USA) và 7500- Fast Real-time PCR (Thermo Fisher Scientific, USA) Các hệ thống máy này thường được sử dụng trong các bệnh viện từ tuyến cơ sở đến tuyến trung ương tại Việt Nam Điều này giúp đảm bảo khả năng ứng dụng của xét nghiệm trong nhiều môi trường lâm sàng ở một quốc gia có thu nhập trung bình và thấp Điểm mới của nghiên cứu đó là đầu dò gắn huỳnh quang dùng phát hiện đặc hiệu các tác nhân được thiết kế cải tiến có thêm gắn chất dập tắt huỳnh quang ZEN hoặc TAO ở trình tự nucleotit thứ 9 tính từ đầy 5’của đầu dò, nằm giữa trình tự của probe ngoài quencher-dye ở đầu 3’ để giúp thu hẹp khoảng cách giữa đầu phát huỳnh quang và chất dập tắt huỳnh quang, làm giảm tín hiệu nền của donor-dye (FAM, HEX, Cy5) khi probe chưa gắn vào trình tự gen đích, nhờ đó giúp giảm tín hiệu nền và tăng độ nhạy của xét nghiệm Nhiệt độ nóng chảy của mồi và probe được tính toán bằng công cụ Oligo Analyzer Tools (Online, IDT), Oligo Analyzer (https://www.idtDNA.com/calc/analyzer) Bên cạnh đó, các bộ mồi được thiết kế cần tối ưu có thể phát hiện được nhiều chủng vi sinh vật của cùng một loài và và đảm bảo kích thước đoạn gen nhân bản dưới 200 bp, nhằm giúp khuếch đại tín hiệu tốt qua mỗi chu kỳ real-time PCR

2.4.2 Tạo các mẫu chuẩn dương và chuẩn âm chứa trình tự gen đích của 09 tác nhân gây bệnh và 01 gen nội chuẩn

Tạo mẫu chuẩn dương Để tạo các mẫu chuẩn dương, chúng tôi sử dụng các trình tự mồi xuôi và mồi ngược đã thiết kế đặc hiệu để nhân bản đoạn gen đích của từng tác nhân phản ứng PCR với khuôn là DNA của các mẫu dịch phết niệu đạo/cổ tử cung dương tính với lần lượt 09 tác nhân Thành phần các phản ứng PCR nhân đoạn gen đích đặc hiệu cho các tác nhân được mô tả chi tiết trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần master mix phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu cho từng tác nhân gây bệnh

STT Húa chất Thể tớch/phản ứng (àl)

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 1 chu kỳ biến tính ban đầu 95 o C trong 10 phút;

35 chu kỳ khuếch đại: 95 o C trong 20 giây, 60 o C trong 30 giây và 72 o C trong 20 giây;

1 chu kỳ kéo dài cuối cùng: 72 o C trong 3 phút Sản phẩm PCR khuếch đại gen đích đặc hiệu của lần lượt 09 tác nhân được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,5% chụp ảnh dưới tia UV bước sóng 302 nm bằng hệ thống Gel Doc XR

Lựa chọn phương pháp tạo chuẩn dương là nhân dòng vào vector pTOP TA V2 (cho các tác nhân GV, NG, CT, HSV-1, CA, TV, MH) sử dụng bộ sinh phẩm nhân dòng TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics, Hàn Quốc) hoặc đặt hàng hãng Phù

Sa Biochem (Cần Thơ, Việt Nam) tổng hợp gen nhân tạo (cho các tác nhân HSV-2,

MG và gen nội chuẩn β-actin Thành phần phản ứng nhân dòng được trình bày trong Bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nhân dòng

STT Thành phần Thể tớch/phản ứng (àl)

Sản phẩm nhân dòng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút giúp tăng cường quá trình tiếp nhận DNA Tiếp theo, sản phẩm được đưa vào dòng tế bào có khả năng biến nạp E coli DH5-α Quá trình biến nạp này tuân theo một quy trình cụ thể để đảm bảo hiệu quả chuyển gen thành công.

- Bước 1: Cho 6 àL sản phẩm ligate vào 100àL tế bào khả biến, ủ trờn đỏ 10 phút

- Bước 2: Sốc nhiệt ở điều kiện 42 o C trong 45 giây, rồi đặt nhẹ nhàng lên đá lạnh trong 2 phút

- Bước 3: Bổ sung 800 àL LB lỏng, để tĩnh ở 37 o C trong 30 phỳt

- Bước 4: Nuôi lắc trong 30 phút

- Bước 5: Lấy 100 àL dịch cấy trải lờn đĩa LB cú bổ sung khỏng sinh, cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG đã chuẩn bị

- Đặt đĩa cấy trong tủ ấm 37 o C qua đêm hoặc trong khoảng 16 - 18 giờ để mọc lên khuẩn lạc

Các khuẩn lạc có màu trắng được lựa chọn để tiếp tục sàng lọc bằng phản ứng colony- PCR sử dụng cặp mồi khuếch đại đoạn gen đích đặc hiệu và cặp mồi vector M13 để tìm ra khuẩn lạc tái tổ hợp Các khuẩn lạc tái tổ hợp sau đó được nuôi lắc trong ống fancol 15ml chứa môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicillin 50mg/mL trong 16 - 18 tiếng Sau đó tinh sạch plasmid từ dịch nuôi cấy bằng kit tinh sạch ANAPURE PLASMID MINI KIT (Việt Nam) Plasmid sau khi tinh sạch được kiểm tra lại bằng real-time PCR và PCR sử dụng mồi vector M13, rồi điện di trên gel agarose 1,5% để kiểm tra kích thước và giải trình Sanger DNA sequencing plasmid tái tổ hợp bằng mồi vector M13 để khẳng định chắc chắn plasmid tái tổ hợp (chứng dương) đã mang đoạn gen đích của các tác nhân gây bệnh Thành phần phản ứng PCR được trình bày như Bảng 2.4

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra plasmid mang đoạn gen đích

STT Húa chất Thể tớch/phản ứng (àl)

Các plasmid đạt tiêu chuẩn sẽ được tinh sạch và định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (A260) trên máy Nano Drop Dựa vào nồng độ DNA plasmid đo được bằng nhân dòng gen và đặt tổng hợp gen từ đó tính được số bản sao của plasmid theo công thức:

Số bản sao = ng × 6,22 × 10 23 chiều dài × 10 9 × 660 Trong đó:

• ng: khối lượng phân tử DNA (plasmid), đơn vị là ng

• 6,022.10 23 : hằng số Avogadro’s là số lượng phân tử trong mỗi mol vật chất

• Chiều dài: chiều dài của đoạn DNA gồm chiều dài plasmid tái tổ hợp + đoạn chèn (đơn vị là bp)

Sau khi xỏc định được nồng độ plasmid (bản sao/àl), tiến hành pha loóng theo cơ số 10 tạo dải nồng độ pha loóng 10 8 – 1 bản sao/àl Cỏc plasmid pha loóng được dùng làm khuôn cho phản ứng real-time PCR để xác định giới hạn phát hiện (LOD) và độ lặp lại, độ tái lặp của phương pháp Kết quả chu kì ngưỡng (Ct) của các plasmid sau đó được dùng để dựng đường chuẩn cho phương pháp

Nuclease-Free Water được sử dụng làm đối chứng âm cho phản ứng real-time PCR

2.4.3 Xây dựng và tối ưu phương pháp real-time PCR phát hiện 09 tác nhân gây bệnh phụ khoa Để phát hiện đồng thời 09 tác nhân gây viêm phụ khoa trên hệ thống máy bốn kênh màu, chúng tôi đã tạo 3master mix, mỗi master mix cho phép phát hiện 03 tác nhân và 01 gen nội chuẩn/phản ứng x 3 phản ứng/xét nghiệm theo thứ tự: 01- GV/NG/CT/IC, 02- HSV-1/CA/TV/IC và 03- MH/HSV-2/MG/IC được pha chế với thể tớch 20 àL/phản ứng, sau đú 5 àL DNA khuụn được bổ sung cho mỗi phản ứng Phương pháp chúng tôi xây dựng là multiplex real-time PCR, với 4 cặp mồi xuôi, mồi ngược và đầu dò của 3 tác nhân đích và 01 gen nội chuẩn trong cùng một phản ứng nên rất dễ xảy ra hiện tượng cạnh tranh tín hiệu huỳnh quang giữa các đầu dò hoặc sự bắt cặp dimer giữa mồi - mồi, mồi - probe, probe - probe Thành phần của phản ứng multiplex real-time PCR với các cặp mồi và đầu dò với các nồng độ khác nhau được thử nghiệm để lựa chọn nồng độ tối ưu nhất, đảm bảo tín hiệu khuếch đại từng tác nhân trong các master mix là tương đương nhau sao cho tín hiệu huỳnh quang khuếch đại các gen đích ổn định EPF khoảng từ 1,0 – 2,5 Nội chuẩn (IC) được chúng tôi bổ sung trực tiếp vào thành phần master mix và tối ưu tín hiệu huỳnh quang EPF từ 0,2 – 0,4 với nồng độ khoảng 10 4 bản sao/phản ứng (Ct ~ 28-30) để không ảnh hưởng đến hiệu suất khuếch đại gen đích mà vẫn kiểm soát tốt hoạt động của master mix Thành phần công thức master mix đã được chúng tôi thử nghiệm tại các dải nồng độ như ở Bảng 2.5 dưới đây

Bảng 2.5 Thành phần multiplex real-time PCR Master mix

STT Thành phần Đơn vị/ nồng độ

Nồng độ trong mỗi phản ứng

2 Mồi xuụi (mỗi tỏc nhõn) 100 àM 0,05 – 0,1 200 - 400 nM

3 Mồi ngược (mỗi tỏc nhõn) 100 àM 0,05 – 0,1 200 – 400 nM

4 Đầu dò (mỗi tỏc nhõn) 10 àM 0,01-0,1 10- 40 nM

5 Mồi xuụi IC 100 àM 0,01 – 0,05 40-200 nM

6 Mồi ngược IC 100 àM 0,01 – 0,05 40 - 200nM

7 Đầu dò IC 10 àM 0,5 – 1,0 200-400 nM

Dựa trên tính toán nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi và đầu dò của 09 tác nhân mục tiêu bằng phần mềm Oligo Analyzer Tools (Online, IDT), Oligo Analyzer (https://www.idtDNA.com/calc/analyzer) Chúng tôi đã thử các nhiệt độ gắn mồi khác nhau là 60, 61, 62°C Phản ứng multiplex real-time PCR nhân bản đặc hiệu 03 tác nhân vi sinh vật và 01 gen nội chuẩn trong 1 ống phản ứng × 3 ống/xét nghiệm được thực hiện trên hệ thống máy LightCycle 96 (Roche Diagnostics, Đức) với tổng thời gian cho một lần chạy là 1 giờ 12 phút và chu trình nhiệt được trình bày ở Bảng 2.6

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex real-time PCR

Giai đoạn Nhiệt độ ( o C) Thời gian Số chu kì lặp lại

Biến tính ban đầu 95 10 phút 1

Gắn mồi và 45 kéo dài

60 – 62 (Sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang được đo ở cuối mỗi chu kỳ)

2.4.4 Đánh giá độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện và độ lặp lại, độ tái lặp của phương pháp real- time PCR Taqman Probe Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu của xét nghiệm real-time PCR được xác định bằng cách đánh giá sự khuếch đại đặc hiệu đối với 09 tác nhân mục tiêu và việc tạo ra các phản ứng không đặc hiệu/phản ứng bắt cặp chéo của mồi, probe đối với các tác nhân khác không thuộc

09 loài hướng đến Các loài này là các virus, vi khuẩn phổ biến lây nhiễm hoặc cư trú tại âm đạo phụ nữ bao gồm: 14 HPV genotype nguy cơ cao (HPV genotype 16, 18,

31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68); và 07 chủng chuẩn vi khuẩn không thuộc 09 STI mục tiêu có thể có mặt ở âm đạo (B subtilis, B clausii, L acidophilus,

Giới hạn phát hiện Để xây dựng đường chuẩn của phương pháp, chúng tôi tiến hành pha loãng plasmid chuẩn dương của 09 tác nhân 10 lần để tạo dải nối tiếp từ 10 8 đến 10 2 bản sao/àL và thực hiện phản ứng real-time PCR sử dụng khuụn đầu vào là cỏc plasmid chuẩn dương của 09 chuẩn dương đã tạo được LoD cho từng tác nhân trong xét nghiệm được xác định bằng cách pha loãng các plasmid chuẩn dương mang gen đích của 9 tác nhân ở các nồng độ thấp hơn là 50, 10, 5 và 1 bản sao/phản ứng Đối với mỗi nồng độ, chúng tôi thực hiện lặp lại 20 lần Sau khi hoàn tất các chu kỳ gia nhiệt, giới hạn phát hiện của phản ứng (LoD) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất có thể được phát hiện trong 95% số lần lặp lại dương tính của plasmid Điều đó thực sự có ý nghĩa với một xét nghiệm real-time PCR, tránh bỏ sót các bệnh nhân có tải lượng vi sinh vật thấp và giúp chẩn đoán sớm các tác nhân STI Độ lặp lại và độ tái lặp Độ lặp lại và độ tái lặp của xét nghiệm real-time PCR được đánh giá bằng cách xác định hệ số biến thiên (CV) theo công thức sau: CV = σ/μ × 100, trong đó CV là tỷ lệ của độ lệch chuẩn (σ) với giá trị trung bình (μ) của chu kỳ ngưỡng (Ct) để khuếch đại tín hiệu đặc hiệu cho từng tác nhân trong số 09 STI Plasmid DNA tái tổ hợp ở nồng độ 50 bản sao/phản ứng được sử dụng để đánh giá độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp Độ lặp lại được đánh giá thông qua biến thiên giá trị Ct của 6 mẫu lặp lại trong một lần thực hiện Độ tái lặp được đánh giá thông qua sự thay đổi giá trị Ct của 18 mẫu lặp lại trong ba lần thực hiện (n = 6 × 3 = 18)