Nghiên Cứu Sử Dụng Dòng Chuột Icr Thay Thế Dòng Chuột Balbc Ứng Dụng Trong Kiểm Định Công Hiệu Vắc Xin Viêm Gan B.pdf

Các kĩ thuật kiểm tra công hiệu hiện tại đang sử dụng là phương pháp In vitro và hoặc In vivo đánh giá tính sinh miễn dịch của vắc xin trên động vật thí nghiệm.. Trước kia, ở thử nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐỖ LINH TRANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG DÒNG CHUỘT ICR THAY THẾ DÒNG CHUỘT BALB/c ỨNG DỤNG TRONG KIỂM ĐỊNH

CÔNG HIỆU VẮC XIN VIÊM GAN B

HÀ NỘI- NĂM 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Bùi Thị Việt Hà

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn đầu tiên em xin được trân trọng gửi tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN, cô đã tạo điều kiện tận tình giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Lý, Trưởng khoa - Khoa Kiểm định vắc xin Vi rút - Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế (NICVB) Cô đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến ban lãnh đạo, các anh các chị đồng nghiệp tại các khoa Kiểm định vắc xin Vi rút, Vi khuẩn, Khoa Động vật thực nghiệm, các cán bộ, công chức, viên chức ở NICVB đã nhiệt tình, quan tâm, hỗ trợ tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình nghiên cứu Em cảm ơn các anh, các chị vì cả sự nghiêm khắc dành cho em, truyền dạy cho em những bài học từ kinh nghiệm nhiều năm tích lũy trong công việc

Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy, các cô trong Bộ môn Vi sinh vật học cùng các thầy, cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Hà Nội, ngày 18 tháng 10 năm 2023 Học viên

Đỗ Linh Trang

14 ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay Xét nghiệm miễn dịch 7

5 HBcAg Hepatitis B core antigen Kháng nguyên lõi 6

6 HBeAg

Hepatitis B envelope

17 HBsAb

Hepatitis B Surface Antibody Kháng thể bề mặt viêm gan B 5

8 HBsAg Hepatitis B surface antigen

Kháng nguyên bề mặt của virus

viêm gan B 1

9 HBsAgL

Hepatitis B surface antigen

110 HBsAgM

Hepatitis B surface antigen

111 HBsAgS

Hepatitis B surface antigen

312 HBV Hepatitis B Virus Vi rút viêm gan B

413 HCC HepatoCellular Carcinoma Ung thƣ biểu mô tế bào gan

114 HRP Horseradish Peroxidase Enzym peroxidase cải ngựa

115 NICVB

Nationnal Institute for Control of Vaccine and

Biologicals

Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế 8

16 OD Optical density Mật độ quang học 2

17 SD Standard deviation Độ lệch chuẩn 9

18 SVP Subviral particles Các hạt nhỏ hơn virus 1

120 VLP Virus like particle Hạt giống virus

121 WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

1.1 Các loại kháng nguyên của vi rút Viêm gan B 3

1.2 Vắc xin Viêm gan B 5

1.2.1 Lịch sử và sự phát triển của vắc xin viêm gan B 5

a Trên thế giới 5

b Tại Việt Nam (Vabiotech) 7

1.2.2 Cơ chế sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng vi rút Viêm gan B 7

1.2.3 Cơ chế hoạt động của vắc xin 10

1.3.4 Chất bổ trợ trong vắc xin HBV tái tổ hợp 11

1.3 Kiểm tra chất lượng vắc xin vắc xin HBsAg 12

1.3.1 Kiểm tra chất lượng của vắc xin viêm gan B 12

1.3.2 Các phương pháp kiểm tra công hiệu hiện nay 13

1.3.3 Phương pháp kiểm tra công hiệu áp dụng cho vắc xin Viêm gan B 13

1.4 Các mô hình động vật sử dụng trong thử nghiệm đánh giá công hiệu vắc xin Viêm gan B 16

1.5 Thẩm định thử nghiệm 18

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên vật liệu 23

2.1.1 Động vật thí nghiệm 23

2.1.2 Sinh phẩm và hóa chất 23

2.1.3 Vắc xin 23

2.1.4 Dụng cụ và trang thiết bị 23

2.1.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Thiết kế thí nghiệm 25

2.2.2 Quy trình thí nghiệm 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Đánh giá tính sinh miễn dịch trên chuột của vắc xin Viêm gan B và dò tìm độ pha phù hợp gây đáp ứng miễn dịch 32

3.1.1 Đánh giá bộ kít kiểm tra công hiệu vắc xin viêm gan B trên động vật thí nghiệm 32

3.1.2 Đánh giá tính sinh miễn dịch trên dòng chuột Swiss của vắc xin Viêm gan B Gene Hbvax 34

3.1.3 Đánh giá tính sinh miễn dịch trên dòng chuột ICR của vắc xin viêm gan B 35

3.2 Xác định giá trị sử dụng của quy trình: “Kiểm định công hiệu in vivo vắc xin Viêm gan B đối với dòng chuột ICR” 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Khung đọc mở của gen HBV 8 4

Hình 2: Quy trình sản xuất vắc xin Viêm gan B tái tổ hợp 21 8

Hình 3: Minh họa cơ chế hoạt động của kháng nguyên kháng thể trong vắc xin [18] 10

Hình 4: Kháng nguyên bề mặt viêm gan B 11

Hình 5: Quy trình các bước kiểm tra công hiệu b ng phương pháp in vivo 15

Hình 6: Mẫu chuẩn quốc gia Viêm gan B và vắc xin Gene HBvax 23

Hình 7: Các bước thiết kế trong thí nghiệm 25

Hình 8: Độ đặc hiệu trong thẩm định 26

Hình 9: Kết quả dò liều lần 1 trên chuột ICR 37

Hình 10: Kết quả dò liều lần 2 trên chuột ICR 39

Hình 11: Kết quả dò liều lần 3 trên chuột ICR 41

Hình 12: Kết quả tương quan công hiệu vắc xin mẫu chuẩn trong 6 lần thẩm định 56

Bảng 6: Cách pha lo ng vắc xin thử nghiệm và mẫu chuẩn Quốc gia 28

Bảng 7: Sơ đ bố trí thử nghiệm miễn dịch ELISA 29

Bảng 8: Đánh giá chất lƣợng bộ kit trong các thử nghiệm dò liều 33

Bảng 9: Kết quả ELISA kiểm tra công hiệu vắc xin Gene HBvax trên dòng chuột Swiss 34

Bảng 10: Kết quả đáp ứng miễn dịch của dòng chuột Swiss 35

Bảng 11: Kết quả ELISA dò liều lần 1 công hiệu vắc xin Gene HBvax trên dòng chuột ICR 36

Bảng 12: Kết quả dò liều lần 1 đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR 37

Bảng 13: Kết quả ELISA dò liều lần 2 công hiệu vắc xin Gene HBvax trên dòng chuột ICR 38

Bảng 14: Kết quả dò liều lần 2 đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR 39

Bảng 15: Kết quả ELISA dò liều lần 3 công hiệu vắc xin Gene HBvax trên dòng chuột ICR 40

Bảng 16: Kết quả dò liều lần 3 đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR 41

Bảng 17: Liều miễn dịch trên dòng chuột sử dụng cho vắc xin Viêm gan B của một số nhà sản xuất và NICVB 43

Bảng 18: Đánh giá chất lƣợng bộ kit trong các thử nghiệm thẩm định 45

Bảng 19: Kết quả xác định độ đặc hiệu 46

Bảng 20: Đánh giá kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR của vắc xin viêm gan B (Thẩm định lần 1) 48

Bảng 21: Đánh giá kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR của vắc xin viêm gan B (Thẩm định lần 2) 49

Bảng 22: Đánh giá kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR của vắc xin viêm gan B (Thẩm định lần 3) 50

Bảng 23: Đánh giá kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR của vắc xin viêm gan B (Thẩm định lần 4) 51

Bảng 24: Đánh giá kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR của vắc xin viêm gan B (Thẩm định lần 5) 52

Bảng 25: Đánh giá kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR của vắc xin viêm gan B (Thẩm định lần 6) 53

Bảng 26: Tổng hợp kết quả đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR với vắc xin Viêm gan B 53

Bảng 27: Kết quả trung bình cá thể cho đáp ứng miễn dịch của từng độ pha qua 6 lần thẩm định 54

Bảng 28: Tổng kết kết quả tương quan vắc xin trên mẫu chuẩn qua 6 lần thẩm định 55

DANH MỤC PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM

Phụ lục 1: Kết quả Probit-Analysis dò liều 1 Phụ lục 2: Kết quả ELISA mẫu chuẩn dò liều 1 Phụ lục 3: Kết quả ELISA vắc xin dò liều 1 Phụ lục 4: Kết quả Probit-Analysis dò liều 2 Phụ lục 5: Kết quả ELISA mẫu chuẩn dò liều 2 Phụ lục 6: Kết quả ELISA vắc xin dò liều 2 Phụ lục 7: Kết quả Probit-Analysis dò liều 3 Phụ lục 8: Kết quả ELISA mẫu chuẩn dò liều 3 Phụ lục 9: Kết quả ELISA vắc xin dò liều 3 Phụ lục 10: Kết quả Probit-Analysis thẩm định 1 Phụ lục 11: Kết quả ELISA mẫu chuẩn thẩm định 1 Phụ lục 12: Kết quả ELISA vắc xin thẩm định 1 Phụ lục 13: Kết quả Probit-Analysis thẩm định 2 Phụ lục 14: Kết quả ELISA mẫu chuẩn thẩm định 2 Phụ lục 15: Kết quả ELISA vắc xin thẩm định 2 Phụ lục 16: Kết quả Probit-Analysis thẩm định 3 Phụ lục 17: Kết quả ELISA mẫu chuẩn thẩm định 3 Phụ lục 18: Kết quả ELISA vắc xin thẩm định 3 Phụ lục 19: Kết quả Probit-Analysis thẩm định 4 Phụ lục 20: Kết quả ELISA mẫu chuẩn thẩm định 4 Phụ lục 21: Kết quả ELISA vắc xin thẩm định 4 Phụ lục 22: Kết quả Probit-Analysis thẩm định 5

Phụ lục 23: Kết quả ELISA mẫu chuẩn thẩm định 5 Phụ lục 24: Kết quả ELISA vắc xin thẩm định 5 Phụ lục 25: Kết quả Probit-Analysis thẩm định 6 Phụ lục 26: Kết quả ELISA mẫu chuẩn thẩm định 6 Phụ lục 27: Kết quả ELISA vắc xin thẩm định 6 Phụ lục 28: H sơ vắc xin Shanvac B

Phụ lục 29: H sơ vắc xin Hep B Phụ lục 30: H sơ vắc xin SII Phụ lục 31: H sơ vắc xin Euvax B

Phụ lục 32: Kết quả công hiệu in vivo vắc xin viêm gan B trên dòng chuột BALB c

2018-2022 (NICVB) Phụ lục 33: Hình ảnh tiêm ổ bụng chuột Phụ lục 34: Hình ảnh lấy máu tim chuột Phụ lục 35: Bản sơ khảo quy trình chuẩn công hiệu in vivo vắc xin Viêm gan B

MỞ ĐẦU

Hiện nay, vi rút viêm gan B vẫn được coi như một mối đe dọa lớn đến sức khỏe toàn cầu với tỷ lệ tử vong cao bởi đó là nguyên nhân dẫn đến suy gan, xơ gan và ung thư gan Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2015, ước tính có khoảng 887.220 người tử vong do HBV và 257 triệu người đang sống chung với bệnh viêm gan B mạn tính, trong đó có khoảng 10,5% đ phát hiện bệnh và 16,7% số người biết được điều trị Nhưng con số ấy không dừng lại, với 1,5 triệu ca nhiễm mới mỗi năm, thế giới hiện có hơn 2 tỷ người nhiễm bệnh với 400 triệu ca viêm gan B mạn tính

Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ người nhiễm vi rút viêm gan B cao, chiếm tới 20% dân số Bệnh có thể xảy ra với bất kỳ đối tượng nào do ngu n lây nghiễm HBV rất đa dạng (đường máu từ người mang vi rút viêm gan B mạn tính, lây nhiễm từ quan hệ tình dục, từ mẹ sang con, ) Hiện tại, chưa có phương pháp điều trị kháng vi rút cụ thể được khuyến nghị cho những người mắc bệnh nên biện pháp phòng bệnh chủ động hiệu quả nhất hiện nay là tiêm phòng vắc xin viêm gan B cho người lớn và trẻ sơ sinh

Năm 1980, vắc xin viêm gan B đầu tiên được điều chế từ huyết tương người mang HBsAg trong máu b ng phương pháp siêu ly tâm đ ra đời Tới năm 1986, vắc xin viêm gan B biến đổi gen đầu tiên được phát triển với HBsAg tái tổ hợp tạo ra bước ngoặt lịch sử, vắc xin Viêm gan B tái tổ hợp dần thay thế vắc xin dạng Plasma Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đến nay vắc xin viêm gan B chất lượng và đặc biệt đa dạng chủng loại: đơn giá và vắc xin phối hợp đ lưu hành trên thị trường Đối với tất cả các vắc xin bắt buộc phải được kiểm tra an toàn và hiệu quả công hiệu trước khi đưa ra thị trường sử dụng Các kĩ thuật kiểm tra công

hiệu hiện tại đang sử dụng là phương pháp In vitro và hoặc In vivo đánh giá tính

sinh miễn dịch của vắc xin trên động vật thí nghiệm

Trước kia, ở thử nghiệm đánh giá công hiệu in vivo các viện Kiểm định Quốc

gia và các nhà sản xuất vắc xin Viêm gan B thường sử dụng dòng chuột BALB c Tuy nhiên theo xu hướng của thế giới, Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế (NICVB) nhập về giống chuột ICR để thử nghiệm tiến hành thay thế các dòng chuột cũ như Swiss, BALB c Qua quá trình quan sát, theo dõi đây là dòng chuột có chất lượng tốt, sinh sản nhanh, dễ lấy máu và cho kết quả ổn định Do mỗi loại vắc xin sẽ tạo miễn dịch với một số dòng chuột khác nhau, ở các thế hệ lai

khác nhau, các điều kiện nuôi khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau nên việc nghiên cứu chuyển đổi thay thế dòng chuột ở từng khu vực là riêng biệt và thiết thực

Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu sử dụng dòng chuột ICR thay thế dòng chuột

BALB/c ứng dụng trong kiểm định công hiệu vắc xin viêm gan B” đ thực hiện

nh m mục tiêu: (1) Đánh giá đƣợc sự phù hợp của dòng chuột ICR đối với thử nghiệm công hiệu vắc xin Viêm gan B và thẩm định quy trình kiểm định (2) Xây

dựng đƣợc quy trình chuẩn cho thử nghiệm công hiệu vắc xin viêm gan B (in vivo)

trên dòng chuột ICR tại điều kiện của NICVB, Việt Nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Các loại kháng nguyên của vi rút Viêm gan B

HBcAg tập hợp lại để tạo thành capsid của vi rút Capsid là một icosahedron bao g m 120 bản sao của homodimer protein capsid Mỗi đơn vị T=4 bao g m 4 HBcAg đơn phân (hai dime; AB và CD) Capsid HBcAg có tính sinh miễn dịch cao, tạo ra cả phản ứng miễn dịch của tế bào B và tế bào T; tuy nhiên, những phản ứng đó không bảo vệ cơ thể chống lại nhiễm HBV Với tính linh hoạt và khả năng sinh miễn dịch, các capsid HBcAg có thể được sử dụng làm chất mang cho các epitope trong vắc xin

HBcAg t n tại dưới dạng dime hòa tan với miền liên kết RNA [33, 45] Các dimer trạng thái Hình dạng của HBcAg có thể thay đổi tác động đến trạng thái chức năng của chúng Chính vì vậy khả năng HBcAg chuyển đổi giữa các trạng thái cấu trúc khác nhau là rất quan trọng đối với chức năng của nó trong quá trình tổng hợp capsid và vi rút học HBV [42]

- HBeAg (một biến thể của HBcAg) là một loại protein được tiết ra bởi HBV HBeAg có 2 phần chức năng chính Nó chịu trách nhiệm vận chuyển protein đến mạng lưới nội chất và liên kết với HBcAg thông qua liên kết disulfide nội phân tử giúp ổn định cả HBcAg và HBeAg Ngoài ra HBeAg rất quan trọng đối với đặc tính trốn tránh miễn dịch của HBV [42]

- HBsAgBa loại kháng nguyên bề mặt (vỏ) (HBsAg) của vi rút Viêm gan B có liên quan với nhau, có chung một miền S Chúng được dịch từ các codon khởi đầu trong khung khác nhau và do đó được phân biệt b ng phần mở rộng đầu cuối N của chúng HBsAg nhỏ (HBsAgS) chỉ bao g m miền S có kích thước 226 axit amin (aa), protein HBsAg trung bình (HBsAgM) có phần mở rộng ở đầu N là 55 aa (miền tiền S2) và HBsAg lớn (HBsAgL) có phần mở rộng bổ sung là 108 aa hoặc 119 aa (miền tiền S1) tùy thuộc vào kiểu gen [17, 34] Ngoài việc phân loại theo kiểu gen, HBV còn được phân biệt b ng bốn tuýp huyết thanh chính dựa trên khả năng phản ứng với HBsAg Tất cả các kiểu gen đều có khả năng phản ứng kiểu huyết thanh chung chống lại vị trí kháng nguyên chính được gọi là yếu tố quyết định “a”, nhưng biểu hiện thêm hai yếu tố quyết định kháng nguyên allelic loại trừ lẫn nhau là “d” hoặc “y” và “w” hoặc “r” Các yếu tố quyết định kháng nguyên của HBsAg n m ở

vùng vòng hở của miền S HBsAg và kháng thể chống lại HBsAg (anti-HBs) là những dấu hiệu huyết thanh quan trọng Việc mất HBsAg và chuyển đổi huyết thanh thành kháng thể kháng HBs là dấu hiệu của khả năng miễn dịch và sự phục h i sau viêm gan B cấp tính hoặc m n tính [17, 24, 36]

Hình 1: Khung đọc mở của gen HBV [26]

Ngoài ra HBsAg còn là thành phần chính chiếm hơn 90% hàm lượng trong vắc xin Viêm gan B

Phòng ngừa

Viêm gan B có thể được phòng ngừa b ng vắc xin Tất cả trẻ sơ sinh nên được tiêm chủng càng sớm càng tốt sau khi sinh (trong vòng 24 giờ) Tiếp theo là hai hoặc ba liều vắc xin viêm gan B cách nhau ít nhất 4 tuần

Vắc xin tăng cường thường không cần thiết cho những người đ hoàn thành loạt tiêm chủng ba liều Vì vắc xin bảo vệ chống viêm gan B trong ít nhất 20 năm và có thể là suốt đời [16]

Viêm gan B có thể lây truyền từ mẹ sang con nên ngoài vắc xin người ta còn dùng thuốc kháng vi rút để ngăn ngừa lây truyền

Trong trường hợp người mẹ mắc HBV, để tránh lây truyền người ta sử dụng thuốc kháng vi rút để ngăn ngừa lây truyền trong khi chưa được tiêm vắc xin Nhưng sau đó vẫn phải tiêm bổ sung vắc xin

1.2 Vắc xin Viêm gan B

1.2.1 Lịch sử và sự phát triển của vắc xin viêm gan B

a Trên thế giới

Vắc xin viêm gan B đầu tiên được cấp phép bán trên thị trường từ năm 1982 là vắc xin có ngu n gốc từ huyết tương [40, 43] Nhà vi trùng học người Mỹ Maurice Hilleman đ sản xuất các vắc xin này b ng cách thu hoạch các hạt HBsAg (hạt 22nm) từ huyết tương của những người hiến tặng bị nhiễm HBV m n tính không có triệu chứng [38] Các phần tử trong huyết tương được tinh chế ở mức độ cao và bất kỳ phần tử lây nhiễm nào còn sót lại đều bị bất hoạt bởi sự kết hợp khác nhau của urê, pepsin, formaldehyde và nhiệt [40, 43] Vắc xin có ngu n gốc từ huyết tương đ được nghiên cứu thành công lâm sàng trên người và sau đó được cấp phép sử dụng rộng r i

Vắc xin HBV đầu tiên này được sản xuất dưới tên Heptavax B (Merck Sharp và Dohme, MSD) và Hevac B (Institut Pasteur) nhắm đến một số nhóm có nguy cơ cao, là trọng tâm chính của chương trình tiêm chủng vào thời điểm đó Tùy thuộc vào quy trình tinh chế và bất hoạt, thành phần của các SVP HBsAg có ngu n gốc từ huyết tương có thể khác nhau và chúng có thể chứa hoặc không chứa một lượng nhỏ HBsAgM, cung cấp miền preS2 ngoài HBsAg Vắc xin Hevac-B chứa 1%–2% HbsAgM [15, 36].Ngược lại, vắc xin Heptavax-B không chứa protein preS2 do bước bất hoạt b ng protease, tuy nhiên loại vắc xin này không can thiệp vào tính kháng nguyên đặc hiệu của HBsAg Các vắc xin có ngu n gốc từ huyết thanh tương tự sau đó được sản xuất từ nhiều nhà sản xuất khác nhau, chẳng hạn như Hepavax-B (Green Cross, Korea), Hepaccine-B (Cheil, Korea) và GCC VAC (Green Cross Corporation, Osaka) [14, 38] Những hạn chế do việc cung cấp huyết tương người từ những bệnh nhân bị nhiễm m n tính và rủi ro liên quan đến các sản phẩm có ngu n gốc từ người do nhiễm protein và phải đối mặt với sự hiện diện tiềm ẩn của các mầm bệnh khác lây truyền qua máu, đặc biệt là vi rút viêm gan C khi sử dụng vắc xin SVP HBsAg có ngu n gốc từ huyết tương người Những lo ngại về an toàn đối với các sản phẩm từ ngu n gốc con người, cùng với những tiến bộ trong công nghệ DNA tái tổ hợp và công nghệ sinh học, đ dẫn đến sự phát triển của vắc xin viêm gan B tái tổ hợp

Năm 1986, cùng với sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp, vắc xin viêm gan B tái tổ hợp đầu tiên được phát triển, tạo ra vắc xin HBV thế hệ thứ hai

thay thế hoàn toàn vắc xin có ngu n gốc từ huyết tương [40] HBsAg nhân lên trong tế bào nấm men mang lại tiềm năng sản xuất số lượng lớn vắc xin, an toàn hơn, tinh sạch hơn và chủ động hơn về ngu n gốc Vắc xin tái tổ hợp có ngu n gốc từ nấm men, được sử dụng rộng r i nhất, sản xuất b ng cách biểu hiện protein HBsAg trong

các tế bào nấm men biến đổi gen như (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris,

Hansenula polymorpha) chứa gen HBsAg của HBV tự tổng hợp thành các hạt

giống như vi rút (VLP) và việc sử dụng nó làm vắc xin dẫn đến khả năng tăng hiệu quả, gây đủ miễn dịch kháng vi rút bảo vệ chống lại nhiễm trùng HBV Các hạt HBsAg tái tổ hợp khác với các hạt vi rút tự nhiên ở chỗ thiếu miền tiền S của HBsAg và thiếu quá trình glycosyl hóa do chúng được sản xuất trong men Vắc xin viêm gan B tái tổ hợp là một cột mốc đáng nhớ trong lĩnh vực vắc xin vì chúng là vắc xin đầu tiên dựa trên VLPs [40, 43, 45]

Vắc xin viêm gan B tái tổ hợp có tính sinh miễn dịch cao, an toàn và hiệu quả Ở trẻ sơ sinh, trẻ em và thanh niên khỏe mạnh, một loạt các lịch tiêm chủng đ được chứng minh là tạo ra mức độ bảo vệ huyết thanh lớn hơn 95% [45]

Các vắc xin viêm gan B có ngu n gốc từ tế bào nấm men, được phân phối rộng r i, Engerix ® -B (GlaxoSmithKline) và Recombivax HB™ (Merck Sharp và Dohme) lần lượt sử dụng nhôm hydroxit hoặc nhôm hydroxyphosphate sulfat làm chất bổ trợ [19] Chất bổ trợ dựa trên nhôm được sử dụng rộng r i kèm theo các phản ứng phụ sau tiêm vắc xin như kích hoạt cơ chế gây sốt, sưng đau vết tiêm sau khi tiêm chủng

Song song với đó vắc xin có ngu n gốc từ tế bào động vật có vú cũng đ được tiến hành nghiên cứu Tế bào sử dụng g m tế bào bu ng trứng (CHO) của chuột đ ng Trung Quốc (GenHevacB, SciBVac) hoặc tế bào chuột (C1271) (Hepacare, Medeva Pharma) đ được sử dụng để tạo ra vắc xin [52] Vắc xin GenHevac B (Sanofi Pasteur) bao g m các SVP HBsAgS HBsAgM theo tỷ lệ 80:20 và được so sánh trong lâm sàng với vắc xin Hevac B có ngu n gốc từ huyết tương người, cả hai loại vắc xin đều tạo ra kháng thể đối với HBsAg ở >90% số người tham gia (497 người trong độ tuổi từ 18-40 tuổi) [40, 43]

Tuy vậy trên thị trường vắc xin phòng vi rút viêm gan B hiện nay hầu hết các nhà sản xuất lớn đều đang sử dụng công nghệ vắc xin tái tổ hợp có ngu n gốc từ nấm men vì nó mang lại nhiều ưu điểm hơn 2 loại vắc xin còn lại

b Tại Việt Nam (Vabiotech)

Nhìn chung, vắc xin đ tác động trực tiếp đến sức khỏe, đ ng thời mang lại lợi ích gián tiếp cho sự phát triển kinh tế và x hội Năm 1997, giáo sư Thu Vân và các cộng sự sau 10 năm nghiên cứu đ sản xuất được vắc xin phòng viêm gan B thế hệ đầu tiên (plasma) của Việt Nam sản xuất được cấp phép [35] Sau đó theo xu hướng chung của thế giới không còn sử dụng vắc xin plasma, Việt Nam đ nhập bulk từ Berna Biotech, Hàn Quốc sản xuất vắc xin tái tổ hợp r-HBvax

Năm 2005 Vabiotech (Việt Nam) nhận chuyển giao công nghệ từ Berna (Hàn Quốc) và Vabiotech đ nghiên cứu phát triển thành công vắc xin Viêm gan B tái tổ hợp Gene-HBvax Vắc xin này đ được cấp số đăng ký năm 2011 [35, 46] Vắc xin viêm gan B tái tổ hợp (Gene-HBvax) là một loại vắc xin vi rút tiểu đơn vị

tái tổ hợp không gây nhiễm, HBsAg từ tế bào nấm men (Hansenula polymorpha)

được m hóa b ng công nghệ tái tổ hợp DNA [5] Sản phẩm này được điều chế dưới dạng dung dịch, hơi trắng đục, sản xuất b ng công nghệ di truyền nuôi cấy tế bào nấm men, có mang gen m hóa sinh tổng hợp HBsAg, sau đó được tinh chế và bất hoạt Vắc xin viêm gan B được triển khai lần đầu trong chương trình TCMR từ năm 1997 ở những khu vực có nguy cơ cao Từ năm 2003, được sự hỗ trợ của Liên minh toàn cầu về vắc xin và tiêm chủng (GAVI), vắcxin viêm gan B được triển khai trên toàn quốc cho trẻ dưới 1 tuổi Qua điều tra cho thấy sự thành công rõ rệt khi xu hướng nhiễm vi rút VGB đ giảm một cách rõ rệt ở các nhóm trẻ sinh ra từ 2000-nay [4]

1.2.2 Cơ chế sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng vi rút Viêm gan B

Quy trình sản xuất: Từ DNA plasmid của vi khuẩn, cắt plasmid b ng enzyme giới hạn và gắn vào đó đoạn gen sinh tổng hợp protein kháng nguyên bề mặt vỏ HBsAg của vi rút Viêm gan B DNA tái tổ hợp này được chuyển vào tế bào nấm men Lên men thu sinh khối r i phá vỡ tế bào, tinh sạch và thu HBsAg; Bổ sung tá chất, chất bảo quản để tạo vắc xin Viêm gan B tái tổ hợp có hàm lượng kháng nguyên HBsAg khoảng 20 µg ml

Vắc xin tái tổ hợp HBV được sản xuất b ng cách nhân bản gen HBsAg của virus trong tế bào nấm men Hệ thống nấm men có màng phức tạp mang khả năng tiết ra protein glycosylate Điều này làm cho nó có thể tạo ra một plasmid sao chép tự động chứa gen HBsAg gần Ipromoter men rượu dehydrogenase (ADH) Gen

HBsAg chứa trình tự dài 6bp trước AUG tổng hợp methionine ở đầu N Điều này được kết hợp với trình khởi động ADH được nhân bản trong vectơ nấm men PMA-56.[44]

Hình 2: Quy trình sản xuất vắc xin Viêm gan B tái tổ hợp [29]

Plasmid tái tổ hợp được đưa vào tế bào nấm men Tế bào nấm men biến nạp được nhân lên trong môi trường không có trytophan Các tế bào đ biến đổi sẽ được chọn Các tế bào nấm men nhân bản được nuôi cấy để biểu hiện gen HBsAg Trình tự gen được chèn này biểu hiện và tạo ra các hạt tương tự như hạt HBV 22 mm vì những hạt này được tạo ra trong huyết thanh của bệnh nhân HBV Các hạt HBsAg biểu hiện có sự tương đ ng về cấu trúc và tính sinh miễn dịch với các hạt phân lập từ tế bào nhiễm HBV của bệnh nhân [41] Nhờ vậy sản phẩm tái tổ hợp này tạo ra khả năng sinh miễn dịch rất cao

HBsAg sản xuất từ tế bào động vật có vú chứa hỗn hợp các sản phẩm được

không được glycosyl hóa Qua các nghiên cứu cho thấy cả 2 loại vắc xin tái tổ hợp này đều có hiệu lực và cho hiệu giá kháng thể bảo vệ (anti-HBs) cao ở những người đ được tiêm vắc xin [35] Tuy nhiên quy trình sản xuất từ tế bào nấm men là có hiệu quả hơn và được sử dụng nhiều hơn

Việc tách chiết và tinh khiết HBsAg từ bất kỳ ngu n nào là một quy trình phức tạp và khác hoàn toàn với việc tinh khiết các protein khác Vì lượng kháng nguyên trong nguyên liệu đầu (huyết tương, dung dịch ly giải nấm men hoặc dịch nuôi tế bào động vật) chỉ chứa khoảng 1% lượng protein toàn phần [32] Nên việc tách chiết và tinh khiết HBsAg phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau Trong lịch sử các nhà khoa học đ nghiên cứu và tiến hành những phương pháp như sau:

Gerin dựa vào tỷ trọng và kích thước hạt HBsAg để phát triển quy trình tinh khiết b ng phương pháp siêu ly tâm HBsAg sẽ được tách khỏi hỗn dịch nguyên liệu đầu và hầu hết các protein huyết thanh hay protein của tế bào vật chủ b ng phương pháp ly tâm cân b ng trong các dung dịch gradient chlorua cesium hoặc bromua kalium và cuối cùng là ly tâm phân vùng (Rate zonal) trong dung dịch saccharoza [35]

Pillot và cs., Duinel và Krijnen đ hoàn thiện phương pháp tinh khiết HBsAg b ng phương pháp hấp phụ với Aerosil bao g m phản hấp phụ với dung dịch đệm borat ở pH tăng dần [1, 9]

Ngoài ra, một số nhà nghiên cứu còn đưa ra phương pháp sắc ký và sắc ký miễn dịch ái lực

Ngày nay, quy trình tinh khiết HBsAg đ dần hoàn thiện với sự kết hợp của các phương pháp trên, mỗi nhà sản xuất có một quy trình tinh sạch, cô đặc riêng Vắc xin HBvaxPro (h ng MSD) được tinh sạch b ng vi lọc, siêu lọc; ly giải b ng hấp phụ vào aerosyl r i phản hấp phụ khỏi silica b ng dung dịch đệm borat ấm, độ tinh khiết của HBsAg thu được > 99% Vắc xin Engerix (h ng GSK) được tinh chế b ng sắc ký màng lọc, sắc ký trao đổi ion, siêu ly tâm trong dung dịch muối CsCl, lọc vô trùng loại bỏ muối, độ tinh khiết của HBsAg thu được > 95% Các nhà sản xuất Hàn Quốc, Việt Nam đ tinh chế vắc xin qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: Xử lý PEG và xử lý Aerosol; Giai đoạn 2: Sắc ký trao đổi ion, siêu ly tâm và sắc ký lọc gel, độ tinh khiết của HBsAg thu được ≥ 95%

1.2.3 Cơ chế hoạt động của vắc xin

Vắc xin là một tiểu đơn vị không lây nhiễm của vi rút, mang khả năng miễn dịch chủ động Các kháng thể đƣợc tạo ra b ng cách tiêm vắc xin mang lớp vỏ protein bên ngoài hoặc kháng nguyên bề mặt Điều này dẫn đến khả năng bảo vệ chống lại tất cả các kiểu gen (A đến H) của vi rút và mang lại khả năng miễn dịch rộng r i [27]

Hình 3: Minh họa cơ chế hoạt động của kháng nguyên kháng thể trong vắc

Kháng nguyên có thể đƣợc các tế bào B nhận biết trực tiếp, tạo ra phản ứng miễn dịch yếu, với sự gắn kết của kháng nguyên với vùng Fab trên thụ thể tế bào B và tín hiệu thứ cấp từ các cytokine do tế bào T-helper giải phóng; Các tế bào B bắt

đầu siêu đột biến soma ở vùng Fab, điều này làm tăng thêm sự phù hợp tương ứng giữa vùng Fab và kháng nguyên [13]

Các tế bào B trưởng thành thành các tế bào plasma để tạo ra các kháng thể trung hòa

Hình 4:Kháng nguyên bề mặt viêm gan B

Trong kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBsAg), miền preS (preS1 + preS2) đóng vai trò chính trong quá trình lây nhiễm vi rút viêm gan B ở người (HBV) vào các tế bào gan b ng cách tạo điều kiện cho HBV gắn và xâm nhập, đ ng thời chứa một số T- và B- có khả năng miễn dịch epitope của tế bào [19, 45]

1.3.4 Chất bổ trợ trong vắc xin HBV tái tổ hợp

Vắc xin tái tổ hợp hiện đại độ tinh sạch rất cao và chứa ít thành phần kháng nguyên hơn (tính sinh miễn dịch kém hơn) Do đó, việc bổ sung các chất bổ trợ là điều cần thiết để tạo ra phản ứng miễn dịch tốt hơn Trong số các chất bổ trợ, muối nhôm được sử dụng rộng r i Các muối này có thể tạo thành các hạt không hòa tan, gây ra sự lưu giữ và giải phóng dần dần các kháng nguyên vắc xin giống như một kho dự trữ, và do đó tạo ra khả năng miễn dịch bẩm sinh Các hệ tá dược khác nhau được sử dụng với vắc xin HBV tái tổ hợp là AS01B (liposomal), AS01E (liposomal), AS02A (nhũ tương dầu trong nước), AS02B (nhũ tương dầu trong

nước), AS02V (nhũ tương dầu trong nước), AS03 (α-tocopherol và squalene trong nhũ tương dầu trong nước), AS04 (0,5 mg liều nhôm photphat hydroxit trong natri clorua và nước)

Đặc biệt khi thêm chất bổ trợ nhôm nh m mục đích tăng cường, tăng tốc và kéo dài phản ứng miễn dịch [37] Giúp cho kháng nguyên tan từ từ kích thích miễn dịch, chống sốc và tránh bị đào thải

1.3 Kiểm tra chất lượng vắc xin vắc xin HBsAg

1.3.1 Kiểm tra chất lượng của vắc xin viêm gan B

Theo WHO TRS 978, phụ lục 4 năm 2013 đối với vắc xin Viêm gan B [2, 11]

Kiểm tra đánh giá chất lượng vắc xin là rất quan trọng vì nhiều lý do: Đầu tiên vắc xin phải đủ an toàn để tiêm chủng trong cùng một thời điểm cho nhiều triệu người khỏe mạnh Thứ hai là do vắc xin là sản phẩm có ngu n gốc từ vi sinh vật sống có phân tử phức tạp, dễ bị biến tính do nhiệt độ và thời gian bảo quản nên cần phải có một công hiệu nhất định để có thể đủ gây đáp ứng miễn dịch ngăn chặn được bệnh có liên quan Bởi vậy, việc kiểm tra đánh giá chất lượng vắc xin phải được thực hiện trong từng loạt sản xuất và ở từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu đến thành phẩm cuối cùng)

Việc đảm bảo chất lượng vắc xin là một công việc phức tạp bắt đầu từ công việc kiểm định ngu n nguyên liệu đầu, giám sát quy trình sản xuất và tuân theo thực hành sản xuất tốt (GMP) một cách nghiêm ngặt để xuất xưởng vắc xin có chất lượng tốt và đ ng đều Việc kiểm tra đánh giá chất lượng vắc xin đòi hỏi phải khách quan và chính xác với đội ngũ cán bộ trung thực, có tay nghề và trình độ chuyên môn Phải tuân thủ chặt chẽ các quy trình, các phương pháp, kỹ thuật của WHO và kiểm định quốc gia quy định, nh m đảm bảo độ chính xác cao

Yêu cầu bắt buộc đối với vắc xin phải được kiểm tra chất lượng trước khi xuất xưởng và đưa ra thị trường đối với vắc xin viêm gan B là hiệu quả và an toàn An toàn bao g m các thử nghiệm về mặt hóa lý như (cảm quan, vô trùng, pH, thể tích, hàm lượng các chất hóa học t n dư, pH, độ thẩm thấu, chất bảo quản, ổn định, % hấp phụ); về sinh học g m: (chất gây sốt, vô khuẩn, an toàn chung), các thử nghiệm này được thực hiện theo quy trình thống nhất toàn cầu hoặc trong một nước [12, 31, 49] Hiệu quả bảo vệ được đánh giá qua thử nghiệm công hiệu và nhận dạng

1.3.2 Các phương pháp kiểm tra công hiệu hiện nay

Tùy công nghệ sản xuất với mỗi một vắc xin, chủng sử dụng sẽ có một phương pháp kiểm tra công hiệu, nhận dạng riêng Trong đó, có 2 phương pháp

kiểm tra công hiệu nhận dạng in vivo và công hiệu nhận dạng in vitro

Các phương pháp được tóm tắt sơ bộ như sau:

Phương pháp in vivo: là những thử nghiệm đánh giá công hiệu, hiệu quả qua

tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm thường sử dụng thường là các loài gặm nhấm như chuột, thỏ Phương pháp thường áp dụng cho các vắc xin bất hoạt như DPT, dại…

Phương pháp in vitro: là những thử nghiệm đánh giá công hiệu hiệu quả bảo

vệ của vắc xin qua hàm lượng kháng nguyên Trong đó g m 1 số phương pháp sử dụng phổ biến:

- Gây nhiễm trực tiếp trên tế bào (CCID50, PFU, ): Áp dụng cho các vắc xin sống giảm độc lực (Ví dụ như Sởi, quai bị, Rubella Rota )

- Phương pháp hóa miễn dịch phù hợp : ELISA, SRD, Điện di, HPLC + ELISA (Áp dụng cho các vắc xin: Viêm gan A, Viêm gan B, IPV, HPV ) + SRD (Áp dụng cho các vắc xin: Cúm, Dại, )

+ Điện di tạo cột tên lửa (Rocket) ( Áp dụng cho thử nghiệm công hiệu xác định hàm lượng vắc xin Thương hàn vi…)

Phương pháp kết hợp in vivo và in vitro: Tiêm miễn dịch trên động vật thí

nghiệm, lấy máu, tách huyết thanh, kiểm tra tính sinh miễn dịch hiệu giá kháng thể b ng 1 trong 2 phương pháp trực tiếp trên tế bào hoặc ELISA

- Trên tế bào: Áp dụng cho vắc xin: Viêm n o Nhật Bản, Chân tay miệng - ELISA: Áp dụng cho vắc xin: Viêm gan A, Viêm gan B, HPV và CIMAvax

1.3.3 Phương pháp kiểm tra công hiệu áp dụng cho vắc xin Viêm gan B

a Phương pháp in vitro [6]: Xác định hàm lượng kháng nguyên HBsAg b ng

ELISA Sử dụng bộ kít sinh phẩm chuẩn đoán HbsAg one Version ULTRA của hãng DIA.PRO – Italia

Nguyên lý xét nghiệm In vitro ELISA sanwich sử dụng phiến gắn kháng thể

đặc hiệu HBsAb:

Kỹ thuật phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, đôi khi nó còn được gọi là EIA (Enzyme ImmunoAssay)) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate, TMB (3,5,3’,5’- Tetramethylbenzidine), ABTS (2,2-Azino-di (3-ethyl-benzathiazoline) sulphonic acid)…) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu thể hiện đ xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được n ng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Kỹ thuật ELISA g m ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:

+ Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể Trong đó kháng thể đơn dòng đặc hiệu của HBsAg cố định trên bề mặt của phiến kít + kháng thể đơn dòng thứ 2 kết hợp HRP Phức hợp miễn dịch đặc hiệu được hình thành khi mẫu chứa HBsAg

+ Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử (oxygen) từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Ở phương pháp này chúng ta có thể kết luận được có đủ kháng nguyên để tạo ra kháng thể để bảo vệ cơ thể không nhưng để chứng minh nó có thể tạo được

kháng thể đặc hiệu không thì chúng ta phải thực hiện phương pháp in vivo

b Phương pháp in vivo [7]:

Hình 5: Quy trình các bước kiểm tra công hiệu bằng phương pháp in vivo

(1) Pha tiêm miễn dịch tùy với từng loại vắc xin và với từng loại chuột (theo chi tiết mục 2.2.2)

(2) Động vật thí nghiệm phù hợp (chi tiết mục 1.4) (3) Chuột sau tiêm theo dõi 5 tuần, sau đó lấy máu tách huyết thanh

(4) Kiểm tra b ng kit HBsAb theo nguyên tắc: In vivo ELISA Phiến gắn kháng

nguyên đặc hiệu HbsAg Nguyên lý: Các phiến được gắn phủ kháng nguyên HBsAg sau đó nhỏ mẫu chứa kháng thể HBsAb, kháng thể thu được sẽ được phát hiện bởi HBsAg được đánh dấu b ng HRP liên kết đặc hiệu với kháng thể thứ 2 Enzym này liên kết đặc biệt với các giếng b ng cách tác động lên hỗn hợp cơ chất chất nhiễm sắc, tạo ra tín hiệu quang tỷ lệ với lượng HBsAb trong mẫu và có thể được phát hiện b ng đầu đọc ELISA

Mặc dù có 2 phương pháp kiểm tra công hiệu vắc xin Viêm gan B, tuy nhiên

với những vắc xin mới việc kiểm tra công hiệu in vivo là điều bắt buộc Vì thử nghiệm kiểm tra công hiệu b ng phương pháp in vitro chúng ta có thể định lượng

được hàm lượng HBsAg trong 1 liều (0,5ml cho trẻ con và 1ml cho người lớn), vắc xin có đủ để tạo đáp ứng miễn dịch bảo vệ hay không trong một thời gian ngắn (3-5 ngày) Nhưng lượng HBsAg có tạo được kháng thể đặc hiệu HBsAb hay không thì

phải chứng minh b ng phương pháp in vivo Sau quá trình tiêm miễn dịch, nuôi

chuột 4-5 tuần cũng kiểm tra được thêm cả tính an toàn của vắc xin đối với cơ thể

(1) • Pha vắc xin tiêm miễn dịch

4-5 độ pha

(2) • Tiêm miễn dịch trên chuột phù hợp

4-5 tuần (3)

• Lấy máu

tách huyết thanh (4)

• Kiểm tra kháng thể b ng HBsAb

sống từ đó tạo cơ sở khoa học để đưa vắc xin ra thử nghiệm lâm sàng trên người và sử dụng rộng r i

1.4 Các mô hình động vật sử dụng trong thử nghiệm đánh giá công hiệu vắc xin Viêm gan B

Do tính hướng loài của vi rút HBV đặc biệt hẹp nên các mô hình in vivo cho

nghiên cứu của chúng liên tục được thử nghiệm và phát triển để thay thế kịp thời Các nghiên cứu đầu tiên hiệu quả sử dụng trên tinh tinh, khỉ lông xù, khỉ capuchin nhưng bị cấm do vấn đề đạo đức [18, 45, 52] Chuột chù Tupaia belangeri được phát hiện nhạy cảm với HBV ở người nhưng cũng dần bị hạn chế do thiếu kháng

thể tupaia [21, 39] Các thành viên khác của họ HepDNAaviridae, chẳng hạn như vi

rút viêm gan vịt và vi rút viêm gan woodchuck đ được sử dụng cho các nghiên cứu về sự nhân lên và sinh bệnh học của HBV trong vật chủ của chúng Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể so với tình trạng bị nhiễm HBV ở người [48, 53] Hơn nữa, các hạn chế về đạo đức và chi phí cao cho việc duy trì và chăm sóc động vật đ hạn chế việc sử dụng các mô hình động vật này Do đó, các mô hình HBV sử dụng các chủng chuột trong phòng thí nghiệm là các mô hình động vật được đặc biệt quan tâm cho nghiên cứu HBV [20] Năm 1985, chuột biến đổi gen biểu hiện protein vỏ HBV đầu tiên đ được phát triển là dòng chuột C57BL 6 và BALB c [21]

Hiện nay, theo xu hướng phát triển khoa học kĩ thuật, nhận thấy một số bất cập của dòng chuột trên, một số nước như Thái Lan, Hàn Quốc [18] đ và đang nghiên cứu chuyển đổi sang các dòng chuột mới Điển hình với vắc xin Viêm gan B, dòng chuột mới như ICR cho kết quả thử nghiệm có sinh miễn dịch đặc hiệu [21, 23, 30] Tóm tắt một số kết quả thử nghiệm trên chuột với công hiệu vắc xin Viêm gan B cho kết quả như sau:

Bảng 1: Chuột sử dụng trong thí nghiệm gây miễn dịch vắc xin ở NICVB

Dại, viêm n o Nhật Bản, DPT

NMRI

Có ngu n gốc từ chuột Swiss Thụy Sĩ, từ Lausanne (C Lynch-1926), được truyền sang Poiley (1937), được duy trì như một chủng lai đến F51 (tên là NIH PI) r i truyền đến viện Nghiên cứu Y học Hải quân(1955) và sau đó là Viện nhân giống phòng thí nghiệm trung ương (Hannover - 1958) [28]

Viêm gan A, CIMAvax…

ICR

Chuột ICR là sản phẩm lai tạo từ chuột Swiss Thụy Sĩ vào năm 1926 về Viện nghiên cứu Rockefeller và năm 1948 chuyển qua Viện Nghiên cứu Ung thư (Institute of Cancer Research - ICR) Chuột ICR đ được các công ty Charles River chính thức phát triển và công bố bắt đầu đưa vào thương mại từ những năm 1959 và hiện tại, nhiều nhà nghiên cứu trên khắp thế giới đ tiến hành lai tạo ra ngu n ICR riêng phục vụ cho mục đích nghiên cứu hoặc thương mại [22] Mlac: ICR là dòng chuột ICR có ngu n gốc Nhật Bản từ những năm 1980, nhập về NLAC (Thái Lan) phát triển thành dòng chuột riêng của Trung tâm lấy tên là Mlac: ICR [3]

Viêm gan B, Cimavax, dại, DPT…

BALB/c

Chuột BALB c là một chủng chuột bạch tạng được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, một số dòng phụ phổ biến được tạo ra [23] Đây là một trong những mô hình lai cận huyết được sử dụng rộng r i nhất trong nghiên cứu y sinh và đặc biệt được sử dụng trong nghiên cứu bệnh truyền nhiễm và miễn dịch học [47]

Viêm gan B

Dòng chuột ICR và chuột BALB c cùng là các dòng chuột nhắt được nuôi phổ biến trong phòng thí nghiệm Trong đó, ICR là dòng chuột không thuần chủng còn BALB c là dòng chuột thuần chủng nhưng đ duy trì qua rất nhiều thế hệ Chuột Mlac:ICR có ngu n gốc từ Đại học Mahidol, Thái Lan đ được chuyển giao

từ năm 2017 và nuôi làm đối tượng chuột thí nghiệm chính tại Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Việt Nam Ở thử nghiệm đánh giá công hiệu vắc xin VGB của các nhà sản xuất khác nhau, Viện đ sử dụng dòng chuột BALB c - một dòng chuột kích thước nhỏ, sinh sản chậm và khó quản lý Khi sử dụng dòng chuột này gặp rất nhiều khó khăn cho quá trình chuẩn bị động vật và kiểm định Gần đây nhiều quốc gia đ từng bước nghiên cứu chuyển đổi sang các dòng chuột khác có đáp ứng miễn dịch tốt hơn, nuôi dễ dàng hơn, phù hợp hơn

1.5 Thẩm định thử nghiệm

Trước khi đưa vào sử dụng thường quy một quy trình phải được thẩm định để chứng minh đáp ứng tiêu chuẩn về độ đúng, độ chính xác, độ đặc hiệu, độ tuyến tính theo KĐQG 34 và Validation of analytical assays (WHO/VSQ/97.02) [10, 50, 51] Trong đó :

Bảng 2: Các tiêu chí cần xác định tuỳ theo các loại thử nghiệm khác nhau

dạng

Xác định độ tinh khiết

Xác định công hiệu

Xác định thành

Thẩm định toàn phần: là xem xét và đánh giá một cách khoa học tất cả các

thông số quy định cho một quy trình mới chưa có trong dược điển Tiêu chí dấu X

Thẩm định một phần: xem xét và đánh giá một hay nhiều thông số cần xác

định phù hợp với quy trình đ có trong dược điển Tiêu chí dấu X

Tái thẩm định: được áp dụng khi quy trình đ được thẩm định có sự thay đổi

Loại thẩm định này được áp dụng khi: thay đổi phần mềm, vị trí đặt máy, nguyên liệu đầu vào, kỹ thuật, trang thiết bị, dụng cụ) Tiêu chí dấu X

Bảng 3: Tiêu chí cho thẩm định [8]

Phương pháp thử

Tiêu chí thẩm định Độ

đúng

Độ chính

xác

Độ mạnh

Tính tuyế

n tính

Độ đặc hiệu

LOD LOQ

Xác định hàm lượng phương pháp hóa học (Sử dụng đường chuẩn để tính kết quả)

Xác định hàm lượng phương pháp hóa học (Không sử dụng đường chuẩn để tính kết quả - tính trực tiếp: phương pháp chuẩn độ)

Cảm quan (phương pháp thử không có kết quả b ng số cụ thể, kết quả chỉ được biểu hiện đạt hoặc không đạt: cảm quan mẫu thử, kiểm tra chất lượng môi trường…)

XXX

Phương pháp thử chỉ sử dụng phép đo b ng TTB (đo pH, mật độ quang và độ phân tán của vắc xin BCG đông khô)

XXX

1.5.2 Các tiêu chí trong thẩm định

a Độ đúng

Độ đúng của một quy trình phân tích thể hiện sự gần trùng hợp giữa giá trị tìm được với một giá trị thực quy ước hoặc một giá trị đối chiếu được chấp nhận Có 3 cách xác định độ đúng: Sử dụng mẫu chuẩn khác; Thêm chuẩn vào mẫu thử (Spike); So sánh kết quả được thực hiện với kết quả của phương pháp tiêu chuẩn hoặc phương pháp khác có giá trị (đ được thẩm định)

Tính kết quả: Tính n ng độ hàm lượng công hiệu của mẫu thử tại mỗi độ pha đối với từng thử nghiệm Tính n ng độ hàm lượng công hiệu trung bình của mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn tại mỗi độ pha (Xtb)

Tiêu chuẩn đánh giá: + Sử dụng mẫu chuẩn: So sánh kết quả thu được với giá trị đ biết trước của mẫu chuẩn tại mỗi độ pha b ng cách tính t: t < tα

+ Thêm chuẩn vào mẫu thử: Tính phần trăm độ thu h i (R%) Thử nghiệm hóa học áp dụng tiêu chuẩn của AOAC, với thử nghiệm Elisa là 50%-150%

+ So sánh kết quả được thực hiện với kết quả của phương pháp tiêu chuẩn hoặc phương pháp khác có giá trị (đ được thẩm định): So sánh kết quả thu được với giá trị đ biết trước của mẫu thử (X) tại mỗi độ pha b ng cách tính t: t < tα

Đối với một số thử nghiệm sinh học có thể không xác định độ đúng nếu: (Không có mẫu chuẩn phù hợp Phương pháp đã có độ đặc hiệu cao)

b Độ chính xác

Độ chính xác của quy trình là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử nghiệm riêng rẽ Độ chính xác được đánh giá b ng độ phân tán của các kết quả thử nghiệm so với giá trị trung bình và thường được biểu thị b ng độ lệch chuẩn hoặc b ng hệ số biến sai độ lệch chuẩn tương đối khi quy trình thử hoàn thiện được tiến hành lặp lại trên những mấu thử giống nhau, riêng biệt được rút ra từ một lô vật liệu đ ng nhất Độ chính xác được chia thành:

Độ lặp lại: Thực hiện thử nghiệm trong cùng một phòng xét nghiệm, cùng người thao tác và sử dụng cùng một thiết bị, hóa chất, mẫu thử đ ng nhất (từ khâu chuẩn bị và xử lý mẫu), trong khoảng thời gian ngắn (6 lần ngày)

Độ chính xác trung gian: Diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng xét nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác

6 lần 6 ngày khác nhau; với thử nghiệm hóa học thực hiện trong 10 lần 10 ngày khác nhau)

Tính kết quả và tiêu chuẩn: + Tính giá trị trung bình, SD và CV + Đối với thử nghiệm sinh học: tùy loại thử nghiệm sử dụng và áp dụng tiêu chuẩn đối với hệ số biến thiên như sau:

Kit ELISA: CV <10% ELISA tự gắn: CV ≤ 20% Tế bào: CV n m trong khoảng từ ≤30%

In vivo: CV n m trong khoảng từ ≤50%

Xác định hiệu giá vi rút: CV ≤ 330% (0.5 log)

c Độ tuyến tính và vùng tuyến tính

Độ tuyến tính của một phương pháp thử là khả năng cho các kết quả tỷ lệ thuận với lượng chất có trong mẫu thử Để xác định độ tuyến tính và vùng tuyến tính cần đưa ra các dữ liệu sau: Phương trình h i quy đơn biến (y = ax + b) và hệ số tương quan (r)

Tính kết quả: Sử dụng kết quả trong phần xác định độ đúng + Tính giá trị trung bình, SD và %RSD của từng ngày thử nghiệm + Tính đường h i quy tuyến tính R của từng ngày thử nghiệm + Tính độ thu h i tại mỗi điểm chuẩn (Δi)

Tiêu chuẩn đánh giá: + R2: phụ thuộc vào n ng độ hàm lượng chất có trong mẫu thử, bản chất của mẫu thử, phương pháp thử Thông thường 0.6< R2<1

+ % RSD phụ thuộc vào n ng độ hàm lượng chất có trong mẫu thử, bản chất của mẫu thử, phương pháp thử Thông thường % RSD ≤ 20%

+ Δi n m trong khoảng ± 15% so với giá trị lý thuyết

Tiêu chuẩn đánh giá: + Có tín hiệu của chất cần tìm khi có mặt của chất đó trong mẫu + Không có tín hiệu chất cần tìm khi không có mặt chất cần tìm trong mẫu

e Độ mạnh

Độ mạnh là khả năng của quy trình tạo ra những kết quả phân tích có độ chính xác và độ đúng chấp nhận được trong các điều kiện khác nhau Có 2 cách xác định độ mạnh:

+ Bố trí 2 nhóm người thực hiện khác nhau + Bố trí 1 nhóm người thực hiện trên 2 nhóm trang thiết bị (máy móc, pi pét, địa điểm …) khác nhau

Tiêu chuẩn đánh giá: + Tính SD, %RSD của từng nhóm + %RSD của từng nhóm phụ thuộc vào n ng độ hàm lượng chất có trong mẫu thử, bản chất của mẫu thử, phương pháp thử

+ t test ≤ t bảng (t bảng tra trong bảng phân phối Student) tại mức ý nghĩa α = 0,05, tức với độ tin cậy 95%

f Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)

- LOD: Là lượng mẫu nhỏ nhất mà một quy trình kỹ thuật có thể phát hiện được nhưng không định lượng được giá trị thực của nó Giá trị này càng nhỏ thì quy trình (phương pháp) càng “nhạy”

- LOQ: Giới hạn định lượng là lượng nhỏ nhất trong mẫu phân tích có thể định lượng được và thoả m n tính đúng, tính chính xác Xác định LOQ b ng cách pha lo ng đến n ng độ tối thiểu có thể phát hiện được chất thử với tính đúng và tính chính xác theo yêu cầu

LOD và LOQ được tính b ng một trong các cách sau: Sử dụng kết quả trong phần độ đúng:

+ LOD = 3,3*s/a + LOQ = 10*s/a Thường áp dụng đánh giá trong quá trình phát triển bộ kít và sinh phẩm định lượng kháng nguyên b ng ELISA SRD

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu

Tuýp 15 ml (3 cái), tuýp eppendorf (30 cái): Corning hoặc Thermo Fisher Scientific

Bơm tiêm 1ml và 3ml Máy lắc (Thermo VT 04 VR) Máy ly tâm (Sanyo, m : FR 30 VR hoặc FR 35 VR) Tủ lạnh, tủ âm sâu (-700C) (SANYO Mã : FR 49 VR) Máy rửa phiến ELISA (Chromate –M : ES 06 VR hoặc Biorad) Máy đọc và in ELISA (Chromate –M : ES 06 VR hoặc Biorad) Máy ủ 37°C (Chromate –M : ES 06 VR hoặc Biorad)

Cốc thủy tinh 250 ml, 500 ml (SCHOTT DURAN) Dụng cụ gây mê chuột: Việt Nam

Bút viết kính, túi đựng rác, bông c n, bông gòn: Việt Nam Trung Quốc Trong đó: Tất cả các pipet, thiết bị sử dụng trong thử nghiệm này phải được thẩm định hiệu chuẩn Mọi dụng cụ, thiết bị đều được rửa sạch, tiệt trùng (nhiệt độ UV) trước khi sử dụng

2.1.5 Địa điểm và thời gian nghiên c u

Đề tài được thực hiện tại khoa Động vật thực nghiệm và khoa Kiểm định vắc xin vi rút - Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (Nationnal Institute for Control of Vaccine and Biologicals ) (NICVB)

Thời gian nghiên cứu: 10 2022 - 09/2023

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Mô tả, h i cứu và tiến cứu

- Các phương pháp, kĩ thuật sử dụng (In vitro và In vivo)

Phương pháp tiêm miễn dịch Phương pháp lấy máu tách huyết thanh Phương pháp ELISA

- Phương pháp tính toán và xử lý thống kê

2.2.1 Thiết kế thí nghiệm

Hình 7: Các bước thiết kế trong thí nghiệm

a Đánh giá và dò tìm độ pha phù hợp, tối ƣu hóa quy trình kiểm tra công hiệu vắc xin Viêm gan B (Gene-HBvax):

Nghiên cứu đƣợc tiến hành nhƣ bảng:

Bảng 4: Các thử nghiệm đánh giá tính sinh miễn dịch công hiệu vắc xin

Viêm gan B và dò liều trên chuột

1 Chuột Swiss 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 10/10/2022-14/11/2022 2 Dò liều (ICR) 1 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 28/10/2022-02/12/2022 3 Dò liều (ICR) 2 1/32; 1/64; 1/128; 1/256; 1/512 14/12/2022-18/01/2023 4 Dò liều (ICR) 3 1/128; 1/256; 1/512; 1/1024;

b Thẩm định quy trình: “Kiểm định công hiệu vắc xin Viêm gan B (Gene HBvax) đối với dòng chuột ICR ( độ chính xác trung gian, độ đặc hiệu)

- Độ đặc hiệu: (10 giếng phiến)

Bố trí thí nghiệm: làm cùng độ chính xác trung gian và sử dụng mẫu thiết kế

theo sơ đ sau:

Hình 8: Độ đặc hiệu trong thẩm định Phương pháp tính kết quả: So sánh OD của mẫu chứng âm và chứng dương

với giá trị cut-off

Tiêu chuẩn đánh giá: Kết quả của từng lần thử nghiệm và 6 lần thử nghiệm:

Mẫu chứng dương có OD > cut- off Mẫu chứng âm có OD ≤ cut -off - Độ chính xác trung gian:

Bố trí thí nghiệm: Thử nghiệm được tiến hành 6 lần vào 6 thời điểm khác

nhau trên cùng 1 vắc xin mẫu chuẩn và mẫu thử Thẩm định với độ pha cuối cùng đ dò được ở Bảng 4 (Kết quả dò liều 3)- Tiến hành như Bảng 5:

Độ đặc hiệu

Chứng âm

Kháng huyết thanh chuột không tiêm vắc xin (5 giếng)

Chứng âm của kit (Cal1)

Kháng huyết thanh chuột tiêm vắc xin khác (Viêm gan A) (5 giếng)

Chứng dương

Chuột tiêm vắc xin mẫu chuẩn

Chứng dương của kit (Cal2, Cal5)

Bảng 5: Các thử nghiệm thẩm định

1 Thẩm định 1

1/128; 1/256; 1/512; 1/1024; 1/2048

Phương pháp tính kết quả: Kết quả sẽ được tính theo phần mềm

Probit-Analysis cho từng lần thẩm định, tiêu chuẩn từng lần làm thử nghiệm phải thỏa m n các tiêu chí phần mềm và bộ kít đưa ra Sử dụng công cụ Excel tính:

Tính : Công hiệu trung bình của mẫu chuẩn: Xtb = ∑Ci/n Độ lệch chuẩn: SD

Hệ số biến thiên: %CV = SD Xtb x100% Trong đó : Ci: Công hiệu (% dương tính); n: số lần thực hiện

Tiêu chuẩn chấp thuận: Từng lần thử nghiệm đều đạt yêu cầu và có giá trị;

CV của 6 lần thử nghiệm n m trong khoảng ≤50% 63-69]

Ngoài ra tính toán so sánh kết quả với dữ liệu h i cứu của thử nghiệm công

hiệu in vivo vắc xin này trên dòng chuột BALB c

c Xây dựng quy trình chuẩn Kiểm tra công hiệu in vivo cho vắc xin Viêm

gan B trên dòng chuột ICR

Pha dung dịch pha lo ng: Dung dịch stock Nhôm (Al(OH)3) + dung dịch nước muối sinh lý theo tỷ lệ 1 21

Lắc kĩ các lọ vắc xin, dùng bơm tiêm hút vắc xin từ các lọ, hộn vào 1 ống vô trùng có nút đậy, lắc đều sau đó pha lo ng thành các độ pha khác nhau theo Bảng6:

Bảng 6: Cách pha loãng vắc xin thử nghiệm và mẫu chuẩn Quốc gia

Kí hiệu độ pha loãng

loãng

Al(OH)3) + NMSL (1/21)

A A (n ng độ gốc tùy

theo thiết kế thử nghiệm)

Chuột sau khi tiêm miễn dịch được chăm sóc và theo dõi trong suốt thời gian miễn dịch

b Lấy máu và tách huyết thanh

Sau 5 tuần miễn dịch, gây mê và lấy máu tim chuột (Phụ lục 34) Máu được chứa trong các tuýp eppendorf, riêng tùng con

Để máu ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 2 giờ, sau đó để ở 4°C trong 2 giờ

Ly tâm các tuýp eppendorf chứa máu tốc độ 4000 vòng phút trong 10 phút ở