Nghiên cứu sử dụng dòng chuột icr Ứng dụng trong kiểm Định công hiệu vắc xin chứa thành phần ho gà vô bào

Nghiên cứu sử dụng dòng chuột icr Ứng dụng trong kiểm Định công hiệu vắc xin chứa thành phần ho gà vô bào Nghiên cứu sử dụng dòng chuột icr Ứng dụng trong kiểm Định công hiệu vắc xin chứa thành phần ho gà vô bào

TỔNG QUAN

VI KHUẨN HO GÀ VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn

Vi khuẩn ho gà Bordetella pertussis là dạng trực khuẩn Gram âm hiếu khí và không di động, kích thước nhỏ (khoảng 0,8 μm x 0,4 μm) [8, 27] B pertussis là vi khuẩn có cấu trúc 2 đầu nhỏ, hình que, hình cầu hoặc hình trứng và không sinh bào tử Chúng là một trong 8 loài thuộc chi Bordetella và là một trong 7 loài gây bệnh, hầu hết đều có liên quan đến nhiễm trùng đường hô hấp ở người và các động vật khác do mang các yếu tố độc lực, độc tố ho gà và các yếu tố hình thành khả năng thường trú trên khí quản [12, 40]

Hình 1: Hình ảnh của vi khuẩn Bordetella pertussis dưới kính hiển vi điện tử [33]

Vi khuẩn có sức đề kháng rất yếu, bị chết trong 1 giờ dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng mặt trời trực tiếp hoặc thuốc sát khuẩn thông thường

Về nuôi cấy, B pertussis khó phân lập, trên các môi trường dinh dưỡng thông thường [3, 5] B pertussis là vi khuẩn ưa máu nên phải nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng được làm giàu bởi máu, có bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết Bordet-Gengou (1906) đã tìm ra môi trường thích hợp được gọi là môi trường BG

5 gồm khoai tây, glycerol và máu để phân lập vi khuẩn này B pertussis bị ức chế bởi các acid béo không bão hoà, các sulfit hình thành trong quá trình chuẩn bị môi trường nuôi cấy (nhất là công đoạn khử trùng ướt) và các peroxit hữu cơ [3] Nên phải bổ sung tinh bột để hấp phụ các chất này Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của vi khuẩn này là từ 35 0 C - 37 0 C [46]

Trên môi trường BG, sau 3-6 ngày, B pertussis mọc thành những khuẩn lạc nhỏ, hình vòm, mặt nhẵn bóng và sáng như một giọt thuỷ ngân [3]

Hình 2: Vi khuẩn ho gà khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu BG [45]

Ho gà là một bệnh truyền nhiễm cấp tính và rất dễ lây lan, vi khuẩn ho gà có khả năng lây nhiễm từ người bệnh qua người lành thông qua ho và hắt hơi Khi người lành tiếp xúc trực tiếp với chất nhầy khí dung của những người bị nhiễm bệnh, vi khuẩn B pertussiss sẽ bám vào lông mao của tế bào biểu mô đường hô hấp Việc gắn kết ban đầu này làm tăng tiết chất nhày dẫn đến việc mất các tế bào có lông và không có lông ở biểu mô đường hô hấp [12, 47] Tại đây, vi khuẩn ho gà sinh trưởng và tạo ra các yếu tố độc lực làm tê liệt các lông nhung của tế bào biểu mô và gây viêm đường hô hấp, cản trở quá trình làm sạch dịch tiết ở phổi Độc tố vi khuẩn được tạo ra trong đường hô hấp góp phần vào quá trình sinh bệnh tại chỗ và toàn thân mặc dù nhiễm trùng không lan rộng hơn nữa [31, 47] Để thoát khỏi phản ứng miễn dịch của vật chủ, vi khuẩn ho gà cũng có các yếu tố hoạt động khác,

6 chúng liên kết với các tế bào thực bào hoặc giải phóng độc tố nhắm vào các tế bào thực bào bao gồm độc tố ho gà (PT), hemagglutinin dạng sợi (FHA), fimbriae (FIM), độc tố adenylate cyclase (ACT), độc tố tế bào khí quản (TCT), lipooligosacarit (LOS) và độc tố hoại tử da (DNT) [24, 40]

Hình 3: Quá trình lây nhiễm vi khuẩn ho gà [14]

Bệnh ho gà điển hình có thể kéo dài hàng tuần sau khi khởi phát được đặc trưng bởi cơn ho kịch phát dữ dội và các vấn đề hô hấp phức tạp bao gồm ngưng thở và viêm phổi, cũng như tăng bạch cầu rõ rệt, tăng huyết áp phổi Bệnh có thể trở nên nghiêm trọng ở trẻ nhỏ [40]

1.1.2 Các yếu tố độc lực của vi khuẩn ho gà

1.1.2.1 Các yếu tố bám dính

Các yếu tố độc lực góp phần làm cho vi khuẩn bám dính vào biểu mô đường hô hấp trong quá trình lây nhiễm FHA (Filamentous Haemagglutinin), Fimbriae (FIM), Pertatin (PRN) đều tham gia vào quá trình bám dính của vi khuẩn, trong đó FHA là yếu tố chính gây ra sự xâm lấn của vi khuẩn lên toàn bộ đường hô hấp [17, 47]

FHA là một protein bề mặt có cấu trúc dạng sợi bao gồm các tiểu đơn vị có khối lượng phân tử 220 kDa, liên kết lỏng lẻo với màng ngoài của vi khuẩn và được tiết vào môi trường nuôi cấy trong quá trình sinh trưởng Phân tử FHA có ít nhất ba vị trí liên kết riêng biệt: một vị trí dành cho glycosaminoglycan, một vị trí dành cho carbohydrate và một trình tự arginine-glycine-aspartic acid (RGD) Sau khi liên kết với phản ứng bạch cầu integrin/protein, phức hợp này thúc đẩy sự kết dính với thụ thể của bổ thể 3 (CD11b/CD18) [23, 47] Gây miễn dịch bằng FHA có khả năng bảo vệ chuột chống lại các tác nhân gây bệnh do B pertussis qua đường hô hấp

Việc cho thêm FHA vào vắc xin ho gà vô bào chỉ chứa PT (Pertussis toxin) được chứng minh là làm tăng khả năng bảo vệ chống lại ho gà trong các nghiên cứu về thử nghiệm hiệu quả của vắc xin ở người [3]

FIM, hay còn gọi là lông nhung, đóng vai trò là ngưng kết kháng nguyên, có tác dụng hỗ trợ việc bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vật chủ Fim 1 có ở hầu hết các tế bào B pertussis và hai loại fimbriae khác biệt về mặt huyết thanh học, được chỉ định là serotype 2 và 3, bao gồm các tiểu đơn vị chính Fim2 và Fim3 đặc hiệu cho các chủng ho gà khác nhau Các tiểu đơn vị chính liên kết với glycosaminoglycan và tiểu đơn vị phụ liên kết với α 5 β 1 -integrin kháng nguyên rất muộn 5 (VLA-5; CD49e/CD29), được biểu hiện trên nhiều loại tế bào, bao gồm các tế bào biểu mô và bạch cầu đơn nhân của con người [17, 22] Các vắc xin ho gà vô bào có thêm thành phần Fim có tác dụng bảo vệ tốt hơn loại không chứa Fim [8]

Pertactin là một protein có trọng lượng 69-kDa liên kết với màng ngoài của vi khuẩn và là thành phần có mặt trong tất cả các chủng vi khuẩn có độc lực Prn có vai trò gắn kết và xâm lấn lên các tế bào vật chủ Prn cũng có các vị trí gắn arginine-glycine-aspartic và tương tác với các integrin vật chủ tương tự như FHA Trong một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, Prn được cho thêm vào vắc xin vô bào có chứa PT và FHA làm tăng khả năng bảo vệ của cơ thể chống lại bệnh ho gà [8, 29]

Hình 4: Mô hình cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn ho gà [54]

1.1.2.2 Yếu tố độc lực Độc tố ho gà (Pertussis Toxin)

Hình 5: Mô hình cấu trúc của độc tố ho gà PT [30]

Pertussis Toxin (PT) là một protein độc tố bao gồm năm tiểu đơn vị từ S1 đến S5 với cấu trúc AB5, đặc trưng cho nhiều độc tố vi khuẩn PT bao gồm 1 tiểu đơn vị A-protomer PTS1 (tiểu đơn vị độc tố ho gà 1), chứa hoạt tính enzyme và một oligome B gồm 4 tiểu đơn vị khác nhau PTS2, PTS3, PTS4 và PTS5 theo tỷ lệ 1:1:2:1 [20, 30], làm trung gian liên kết của chất độc với các tế bào nhân chuẩn [17, 47]

Protomer A bao gồm một tiểu đơn vị S1 chịu trách nhiệm về hoạt động của ADP-ribosyltransferase, xúc tác quá trình ribosyl hóa ADP của gốc cystein trong tiểu đơn vị α của phân họ protein G i/o, trong khi B-oligomer bao gồm S2, S3, S5 và hai tiểu đơn vị S4 chịu trách nhiệm liên kết với các thụ thể bề mặt tế bào chủ và đưa A-protomer vào tế bào nhận

1.1.2.3 Các yếu tố độc lực khác a Độc tố adenyl cyclase Độc tố Adenylate cyclase (Adenyl cyclase toxin-ACT) là một yếu tố độc lực quan trọng khác do B pertussis tiết ra AC (Adenyl cyclase) có khả năng xâm nhập vào đường hô hấp trên, gây ra tăng lượng cAMP nội bào [3] cAMP vòng ức chế đáp ứng miễn dịch tại chỗ bằng cách ức chế hiện tượng hóa ứng động bạch cầu đa nhân trung tính và ức chế hiện tượng thực bào Adenylate cyclase là một protein có

VẮC XIN PHÒNG BỆNH

Vắc xin là một chế phẩm sinh học mang tính kháng nguyên có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật có cấu trúc kháng nguyên giống vi sinh vật gây bệnh, đã được xử lý để đảm bảo tính an toàn Vắc xin tương tác với hệ thống miễn dịch và tạo ra một đáp ứng miễn dịch tương tự như tạo ra bởi các nhiễm trùng tự nhiên nhưng không gây bệnh hoặc gây các biến chứng tiềm tàng [4]

Khi vắc xin được đưa vào cơ thể, dưới tác động của kháng nguyên có trong vắc xin sẽ gây ra đáp ứng miễn dịch bảo vệ đặc hiệu thông qua con đường: miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào [1] Hệ thống miễn dịch đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể, phòng chống bệnh tật Khi cơ thể bị xâm nhập bởi các kháng nguyên lạ sẽ sinh ra đáp ứng miễn dịch nhằm chống lại và loại bỏ kháng nguyên đó [9] Tuy nhiên, kháng nguyên sinh đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào loại vắc xin và từng ca bệnh Và đa số trẻ em có thể được bảo vệ khỏi bệnh ho gà sau mũi vắc xin đầu tiên

Bệnh ho gà là mối lo ngại về sức khỏe định kỳ trên toàn thế giới, ở cả các nước phát triển và đang phát triển Trước khi có vắc xin, bệnh ho gà phát triển mạnh và bùng nổ thành dịch có tính chu kỳ khoảng 3 - 4 năm ở nhiều nước Việc sử dụng vắc xin cùng với việc cải thiện đời sống và chăm sóc sức khoẻ, tỷ lệ mắc bệnh ho gà trên thế giới đã giảm dần những năm gần đây

Năm 2019 có số ca mắc bênh ho gà cao nhất trong 5 năm trở lại đây với 145.486 trường hợp trên toàn thế giới [35]; Trung Quốc là quốc gia có số ca mắc bệnh ho gà cao nhất toàn cầu ghi nhận 30.027 ca,; theo sau đó là Nhật Bản: 16.845 ca, Nga: 14.407 ca, Úc: 12.021 ca và Ấn Độ 11.875 ca [42] Năm 2022 ghi nhận có 62.646 người mắc bệnh ho gà [35] Ở Việt Nam, bệnh ho gà lưu hành ở mọi nơi trong cả nước Khi chưa thực hiện chương trình tiêm chủng mở rộng (TCMR), bệnh ho gà thường xảy ra và phát triển thành dịch ở nhiều địa phương, đặc biệt nghiêm trọng ở miền núi là nơi có điều kiện y tế và kinh tế thấp Trong vụ dịch, bệnh thường diễn biến nặng, dễ tử vong do bị bội nhiễm, gây biến chứng viêm phổi, viêm phế quản-phổi, nhất là ở trẻ dưới 5 tuổi và trẻ suy dinh dưỡng Từ năm 1986, chương trình TCMR được phát triển rộng khắp trong cả nước Sau nhiều năm tiêm vắc xin DPT (vắc xin Bạch hầu, Ho gà, Uốn ván) tỷ lệ mắc và chết do bệnh ho gà đã giảm rất rõ rệt Tỷ lệ mắc trung bình thời kỳ 1991-1995 của cả nước là 7,5/100.000 dân Từ năm 1993, tỷ lệ tiêm DPT được duy trì ở mức trên 90%, có năm đạt trên 95% (1997, 2000) với chất lượng tiêm chủng được cải thiện nên tỷ lệ mắc trung bình của cả nước trong thời kỳ 1996-

2000 đã giảm xuống 1,8/100.000 dân Trong 20 năm trở lại đây từ năm 2002- 2022, số trường hợp mắc ho gà có sự biến động qua các năm Số ca mắc ho gà cao nhất là

1013 ca vào năm 2019 và thấp nhất là 20 ca năm 2022 [2, 6]

Có 2 loại vắc xin phòng bệnh ho gà phổ biến đang được lưu hành trên thế giới và Việt Nam là vắc xin ho gà toàn tế bào (wP) và vắc xin ho gà vô bào (aP)

1.2.2 Vắc xin ho gà toàn tế bào

Vắc xin ho gà toàn tế (wP) bào được phát triển lần đầu tiên vào năm 1941 là hỗn dịch của toàn bộ vi khuẩn B pertussis đã bất hoạt [18] Những năm 1940, vắc xin này được kết hợp với giải độc tố uốn ván và bạch hầu để trở thành vắc xin đa giá bạch hầu, uốn ván, ho gà (DTP) và được phổ biến rộng rãi trên thế giới [36, 44] Hầu hết các loại vắc xin DTwP có chứa muối nhôm làm chất bổ trợ và thiomersal làm chất bảo quản Vắc xin ho gà toàn tế bào là vắc xin được tinh chế từ vi khuẩn ho gà sau khi vi khuẩn này được nuôi cấy, tăng sinh trong môi trường và làm bất hoạt bằng nhiệt độ hoặc formalin [1] Chủng ho gà được nhân lên và cấy chuyển trong môi trường có bổ sung máu Sau đó vi khuẩn được lên men trong môi trường Verwey và thu tế bào Sinh khối vi khuẩn sau đó sẽ được bất hoạt bằng nhiệt độ thu được huyền dịch ho gà đậm đặc Huyền dịch ho gà này sau đó sẽ được phối hợp với giải độc tố bạch hầu, uốn ván để trở thành vắc xin đa giá Bản chất của vắc xin wP là toàn bộ tế bào vi khuẩn bị bất hoạt nên vắc xin ho gà toàn tế bào thường gây ra các phản ứng bất lợi nhỏ như mẩn đỏ và sưng tại chỗ tiêm cùng với sốt Phản ứng cục bộ có xu hướng tăng theo tuổi và số lần tiêm [21, 38] ; Vắc xin wP không được khuyến cáo tiêm chủng cho thanh thiếu niên và người lớn [36, 44] Tuy nhiên vắc xin ho gà toàn tế bào vẫn được sử dụng khá rộng rãi ở các nước trên thế giới do giá thành rẻ và vẫn đạt được hiệu quả bảo vệ khi được tiêm đúng và đủ liều

Hình 7: Một số vắc xin ho gà toàn tế bào A: Vắc xin SII (Ấn Độ)- B: Vắc xin DPT (Việt Nam)

Một số vắc xin ho gà toàn tế bào đang được lưu hành tại Việt Nam có thể kể đến như DPT (IVAC- Việt Nam), Combefive (Biological E- Ấn Độ), SII (SII- Ấn Độ)

1.2.3 Vắc xin ho gà vô bào Để giải quyết các phản ứng bất lợi quan sát thấy với vắc-xin toàn tế bào, vắc- xin ho gà vô bào aP đã được phát triển Đây là dạng vắc xin tinh chế chỉ chứa các thành phần kháng nguyên tinh khiết của B pertussis như độc tố ho gà bất hoạt ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp với các thành phần khác của vi khuẩn ho gà như: haemagglutinin dạng sợi, kháng nguyên fimbrial và pertactin Những kháng nguyên không cần thiết khác của vi khuẩn được loại bỏ và sau đó được xử lý bằng formalin để giải độc Những kháng nguyên không cần thiết khác của vi khuẩn ví dụ như thành phần LPS có thể gây ra các phản ứng sau tiêm chủng như sưng, mẩn đỏ hay sốt Việc loại bỏ các kháng nguyên này sẽ làm cho vắc xin ho gà vô bào ít phản ứng phụ và an toàn hơn Một số vắc xin ho gà vô bào được sử dụng phổ biến hiện nay tại Việt Nam ví dụ như: Hexaxim, Adacel (Sanofi- Pháp); Infanrix, Boostrix (GSK- Bỉ) … Đối với loạt tiêm chủng cơ bản, tiêm vắc xin aP không ghi nhận tần suất tác dụng phụ cao hơn khi so sánh với nhóm đối chứng Mặc dù ở những liều tiếp theo, tỷ lệ sưng tấy cao hơn đã được ghi nhận thấy dẫn đến việc chỉ định sử dụng các vắc xin giảm hàm lượng kháng nguyên cho nhóm tuổi thanh thiếu niên và người lớn [32]

Vắc xin ho gà vô bào hiện nay thường bao gồm một hoặc nhiều thành phần kháng nguyên khác nhau và với các nồng độ khác nhau Các kháng nguyên này lại được hấp phụ với các tá dược có nồng độ khác nhau nên được coi là sản phẩm khác biệt và duy nhất Các thành phần của vắc xin ho gà vô bào bao gồm: PT (độc tố ho gà được giải độc về mặt hóa học hoặc di truyền), haemagglutinin dạng sợi (FHA), protein màng ngoài pertactin 69kDa, kháng nguyên Fim-2 và Fim-3 Ngoài ra, các kháng nguyên riêng lẻ này có thể bắt nguồn từ các chủng B pertussis khác nhau và được tinh sạch bằng nhiều phương pháp khác nhau [32, 44]

Mặc dù việc sử dụng vắc xin aP đã dần thay thế cho vắc xin wP ở các nước công nghiệp hóa do giảm thiểu tác dụng phụ, dù chi phí sản xuất và phát triển vắc xin aP cao hơn đáng kể so với vắc xin wP Song ở các nước đang phát triển và chậm phát triển do hiệu quả bảo vệ tương đối của vắc xin wP và aP là tương đương nhau và tác dụng phụ của vắc xin wP chấp nhận được nên, vắc xin wP vẫn là vắc xin được lựa chọn [21, 32].

CÁC MÔ HÌNH KIỂM ĐỊNH CÔNG HIỆU VẮC XIN HO GÀ

1.3.1 Các mô hình kiểm định

Hiện nay do sự đa dạng của các công thức vắc xin, với hàm lượng và loại kháng nguyên khác nhau nên cần phải thiết lập quy trình chuẩn, phù hợp với từng sản phẩm vắc xin thương mại Việc chấp nhận các tiêu chuẩn tham chiếu và tiêu chí

Hình 8: Một số vắc xin ho gà vô bào

19 phát hành riêng cho sản phẩm là cần thiết [28] Đối với vắc xin ho gà vô bào cũng vậy, cần phải thiết lập quy trình thử nghiệm công hiệu vắc xin aP và lựa chọn mô hình thử nghiệm phù hợp nhất có thể để đánh giá chính xác hiệu lực của vắc xin trước khi đưa ra thị trường [50, 51]

Có hai phương pháp hiện đang được sử dụng cho việc đánh giá khả năng sinh miễn dịch trên chuột sau khi được tiêm vắc xin ho gà vô bào: xét nghiệm khả năng miễn dịch ở chuột (MIT) và thử thách trên não chuột (MICA)

MIT là mô hình không gây chết động vật thí nghiệm được thiết kế để đánh giá phản ứng của kháng thể ở chuột sau khi được tiêm miễn dịch với các kháng nguyên Thử nghiệm này dành riêng cho từng sản phẩm và cần phải có vắc xin tham chiếu (hoặc đối chứng) phù hợp cho từng sản phẩm cụ thể Khả năng sinh miễn dịch có thể được đo bằng lượng kháng thể được tạo ra sau khi tiêm với một liều thử nghiệm xác định hoặc bằng liều kháng nguyên gây ra phản ứng kháng thể có thể đo lường, được xác định ở một tỷ lệ chuột nhất định (ví dụ: liều gây miễn dịch hiệu quả trung bình, ED50)

MICA là mô hình thử thách gây chết ở chuột nhằm phát hiện hoạt động bảo vệ của vắc xin Mẫu thử và chất chuẩn phải được pha loãng liên tục để tạo ra ít nhất ba độ pha loãng logarit thích hợp Mỗi độ pha loãng nên được tiêm ổ bụng với liều 0,5 ml cho ít nhất 16 con chuột để gây miễn dịch Dung dịch tiêm thử thách nên được tiêm vào não động vật sau 21 ngày tiêm vắc xin Hiệu lực của vắc xin được tính toán tương đối với vắc xin tham chiếu, hoạt tính bảo vệ phải được biểu thị bằng đơn vị quốc tế IU Trong một số thử nghiệm, PT đã được chứng minh là có tác dụng tăng cường hiệu lực tương đối của vắc xin, tùy thuộc vào dòng chuột và điều kiện kiện xét nghiệm…[38, 51]

MICA được coi là một mô hình phù hợp vì nó có thể cung cấp phép đo định lượng về hiệu quả bảo vệ và nó đã được sử dụng để kiểm tra công hiệu vắc xin ở một số nước như Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc MICA cũng được đánh giá là phương pháp:

- Đặc trưng cho vắc xin ho gà vô bào mới về khả năng bảo vệ ở động vật

- Cấp phép sử dụng vắc xin ho gà vô bào mới

- Để đánh giá tác động tiềm ẩn của những thay đổi trong sản xuất

- Để phục vụ như một bài kiểm tra hiệu lực để xuất xưởng lô sản xuất [50, 51]

Chính vì thế trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp MICA để đánh giá công hiệu của vắc xin ho gà vô bào aP

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và kiểm định

Các nước Phương Tây Ở các nước này thường phản đối đối với thử nghiệm MICA vì lý do kỹ thuật và phúc lợi động vật [55] Ở hầu hết các nước có sản phẩm xuất khẩu ví dụ như Bỉ, Pháp… thường sử dụng phương pháp MIT cho thử nghiệm kiểm tra hiệu lực đối với các loại vắc xin [48, 49]

Chuột sẽ được tiêm miễn dịch ở độ pha thích hợp, sau thời gian miễn dịch chúng sẽ được lấy máu, tách huyết thanh và chuẩn độ bằng phương pháp ELISA Dựa vào vắc xin mẫu chuẩn đã biết trước công hiệu, tính kết quả của vắc xin mẫu thử [48, 49]

Vắc xin ho gà toàn tế bào đã được sản xuất và sử dụng ở Trung Quốc từ những năm 1950 Vắc xin DTaP được cấp phép lần đầu tiên vào năm 1995 cho đến nay, đã có sáu loại vắc xin ho gà vô bào từ các nhà sản xuất địa phương đã được cấp phép và năm loại vắc xin khác đang được phát triển [52] Các vắc xin này là sản phẩm đồng tinh chế hai thành phần (PT và FHA) và được sử dụng kết hợp với vắc xin Bạch hầu và Uốn ván Tất cả vắc xin ho gà vô bào được cấp phép cho thị trường Trung Quốc phải đạt hiệu lực ≥ 8,0 IU/ml đối với phương pháp thử nghiệm hiệu lực chính thức được đưa vào Dược điển là MICA [51, 54]

Kể từ khi vắc xin ho gà vô bào được sản xuất và đưa ra thị trường tại Nhật Bản vào năm 1981, MICA là thử nghiệm bắt buộc phải sự dụng cho việc xuất xưởng Vắc xin ho gà vô bào của Nhật Bản chủ yếu chứa PT và FHA và tuân thủ các đặc điểm kỹ thuật của MICA [52] Chúng được chứng minh là có hiệu quả trên lâm sàng vì tỷ lệ mắc bệnh ho gà liên tục giảm ở Nhật Bản cho đến nay [25, 51]

Vắc xin ho gà toàn tế bào được đưa vào chương trình tiêm chủng quốc gia của Hàn Quốc từ năm 1956 Năm 1984 vắc xin ho gà vô bào được cấp phép [50] và đưa vào sử dụng từ năm 1986 Phòng thí nghiệm kiểm soát Quốc gia (NCLs) ở Hàn Quốc sử dụng MICA để đánh giá hiệu lực của các thành phần ho gà mặc dù một số sản phẩm có nguồn gốc từ châu Âu chỉ được đánh giá về tính nhất quán bằng xét nghiệm khả năng sinh miễn dịch [51, 52]

Hiện nay, mẫu chuẩn Quốc tế (MCQT) của NIBSC (mã JNIH- 3) cho phương pháp thử thách trên chuột nhắt đã được lưu hành và sử dụng ở nhiều quốc gia Tại Việt Nam cũng đã sản xuất mẫu chuẩn Quốc gia vắc xin ho gà vô bào nên việc sử dụng phương pháp thử thách trên chuột nhắt được thực hiện sẽ thuận lợi hơn Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia ho gà vô bào đông khô 72IU/ml có nguồn gốc từ B pertussis 509 chứa kháng nguyên PT và FHA đã được tinh sạch và bất hoạt

1.3.3 Mô hình động vật thí nghiệm

Một trong những thách thức lớn nhất trong việc nghiên cứu cơ chế bệnh sinh của vi khuẩn ho gà là phát triển các mô hình động vật phản ánh chính xác bệnh ởngười, vì các động vật thí nghiệm được sử dụng không phải là vật chủ tự nhiên của

B pertussis không tự nhiên gây bệnh cho động vật Tuy nhiên, các thí nghiệm trên động vật đã có những đóng góp quan trọng cho sự hiểu biết hiện nay

[37] Chuột nhắt, chuột cống, thỏ, chó, chồn sương và các loài linh trưởng đã được sử dụng làm mô hình vật chủ để nghiên cứu Sự xâm chiếm đường hô hấp của chuột bởi vi khuẩn ho gà giống người, nhưng chuột không ho và do đó nhiễm trùng không lây từ chuột này sang chuột khác [26, 40, 50]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGUYÊN VẬT LIỆU

- Chuột nhắt trắng ICR, 3-4 tuần tuổi, 13-17g, Khoa Động vật thí nghiệm- NICVB

- Chuột nhắt trắng Swiss, 3-4 tuần tuổi, 13-17g, Khoa Động vật thí nghiệm- NICVB

Sau khi chọn lựa, chuột được phân vào các lồng, chia riêng chuột đực cái vào các lồng khác nhau Ở mỗi thử nghiệm đều sử dụng:

+ 30 con được nuôi song song để kiểm chứng độc lực của chủng thử thách B pertussis 18323 (10 con/1 độ pha/ 1 lồng)

+ 10 con nuôi song song để tiêm não bằng dung dịch đệm Casein 1% để kiểm chứng sự phá huỷ não không đặc hiệu (chứng âm)

Chuột được phân ngẫu nhiên vào các lồng Mỗi lồng 12-13 con cùng giới, mỗi độ pha gồm 2 lồng (đối với nhóm chuột tiêm miễn dịch) Chuột được đánh dấu nhằm phân biệt giữa các độ pha và giữa các lô thử nghiệm

Vắc xin mẫu chuẩn ho gà vô bào: 72 IU/ống

Vắc xin mẫu thử chứa thành phần ho gà vô bào: các vắc xin đa giá chứa nhiều thành phần khác nhau của các nhà sản xuất khác nhau bao gồm:

2.1.3 Hóa chất và môi trường và chủng giống

- Chủng Bordetella pertussis 18323 (đông khô)

- Môi trường thạch Bordet-Gengou (BD)

- Nước muối sinh lý (NICVB)

2.1.4 Dụng cụ và trang thiết bị

- Cân phân tích (Mettler Toledo)

- Máy đo quang (Thermo Fisher)

- Bình nito lỏng (Việt Nam)

- Pipet nhựa vô khuẩn 5ml, 10ml, 25ml (Corning)

- Pipet man loại 20àl, 1000àl và đầu cụn tương ứng (Corning)

- Tuýp nhựa vô khuẩn loại 5ml, 15ml, 50ml (Corning)

- Thùng đựng đá (Việt Nam)

Nghiên cứu được thực hiện tại khoa Khoa kiểm định vắc xin Vi khuẩn và Khoa Động vật thực nghiệm thuộc Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu: Hồi cứu, tiến cứu và mô tả thực nghiệm

Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu

- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn ho gà: cấy trang và cấy ria dùng để nuôi cấy và thu sinh khối vi khuẩn ho gà- chủng thử thách cho thử nghiệm công hiệu vắc xin

- Phương pháp tiêm ổ bụng: đưa kim vào phần tư thấp bên trái của bụng ở một góc 45 o Sử dụng phương pháp tiêm ổ bụng để tiêm miễn dịch cho chuột cả vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử

Hình 9: Hình ảnh chủng ho gà

- Phương pháp tiêm não chuột: tiêm tại điểm cách 2-3mm với điểm giữa của đường nối tai trái và mắt trái của chuột Tiêm thử thách với chủng ho gà B pertussis

18323 để xác định công hiệu của vắc xin thông qua mối tương quan giữa vắc xin mẫu chuẩn (đã biết trước công hiệu) và vắc xin mẫu thử

- Phương pháp lấy máu tim thỏ: đặt ngón tay cái bên trái vào vị trí ức của thỏ, ấn sâu và dồn về phía trước Ngón trỏ của tay trái đặt chếch lên mỏm tim 45 độ so với vị trí ức Xác định được vị trí và lấy máu Máu thỏ được lấy dùng để pha thạch máu phục vụ cho việc nuôi cấy chủng thử thách

- Phương pháp đo quang: chủng ho gà sau khi nuôi cấy và thu sinh khối sẽ tiến hành xác định độ đục của huyền dịch vi khuẩn bằng thiết bị đo OD ở bước sóng 590nm

- Phương pháp tính kết quả: sử dụng phần mềm WHO program, Probit Analysis và xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê

2.2.1 Nuôi cấy, cất giữ và đánh giá sự ổn định của chủng ho gà đông băng B pertussis 18323

Nuôi cấy chủng ho gà B pertussis 18323 trên các môi trường thạch BG bổ sung lượng máu thỏ với tỷ lệ khác nhau để đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng Chọn ra môi trường thạch phù hợp nhất để nuôi cấy và cất giữ Sau mỗi 3 tháng, kiểm tra liều LD50 của chủng để đánh giá sự ổn định cũng như dò được độ pha thích hợp dùng cho mỗi lần thử thách a Nuôi cấy và cất giữ chủng ho gà

Pha thạch máu BG bổ sung máu thỏ

Pha môi trường thạch BG bổ sung lượng máu thỏ lần lượt là 7%, 15%, 30% (Phụ lục 1)

Quy trình nuôi cấy và cất giữ chủng

- Các đĩa môi trường thạch BG được đặt vào tủ ấm 30 phút trước khi cấy chủng Ống chủng ho gà đông khô 18323 được lau sạch bên ngoài bằng bông thấm

27 cồn 70% Cưa ampoul ở giữa 1/3 trên và 2/3 dưới, dùng miếng bông gạc vô khuẩn để bẻ tại vị trí cưa

- Dùng pipet Pasteur để hoàn nguyên chủng trong 60l dung dịch casein sau đó cấy lên hai đĩa thạch máu BG (BG1) Ủ trong tủ ấm 35 0 C/ 72h

- Từ mỗi đĩa BG1 dùng que cấy chuyển sang 2 đĩa BG khác (4 đĩa BG2) Ủ trong tủ ấm 35 0 C/ 48h

- Từ mỗi đĩa BG2 dùng que cấy chuyển sang 2 đĩa (8 đĩa BG3) Ủ trong tủ ấm

- Thu nhận sinh khối tế bào: Chọn những đĩa BG3 có các khuẩn lạc B pertussis thuần khiết và điển hình để thu sinh khối Từ mỗi bước cấy chuyển, đều tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng và lựa chọn môi trường bổ sung lượng máu phù hợp nhất để tiến hành nuôi cấy và cất giữ chủng

- Từ các đĩa BG3, thu các khuẩn lạc và tiến hành đo quang sinh khối của chủng ho gà để xác định nồng độ vi khuẩn Chia các ống nhỏ và giữ chủng với nồng độ khoảng 10 10 VKHG /ml và bảo quản trong nitơ lỏng b Đánh giá sự ổn định của chủng ho gà

Chủng ho gà được cất giữ tại nồng độ khoảng 10 10 vi khuẩn/ml, sau khi cất giữ

3 tháng trong nitơ lỏng thì chủng được pha loãng và tiêm trên chuột để xác định liều gây chết tối thiểu LD50 của chủng

Công thức pha loãng được trình bày trong bảng sau:

Bảng 1: Công thức pha chủng thử thách

A1:10 10 VKHG /2ml 1ml chủng + 1 ml dung dịch Casein

A2:10 9 VKHG /2ml 1ml A1 + 9 ml dung dịch Casein

A3:10 8 VKHG /2ml 1ml A2 + 9 ml dung dịch Casein

A4= 10 5 VKHG /0,02ml 1ml A3 + 9 ml dung dịch Casein

A5: 5.10 4 VKHG /0,02ml 5 ml A4 + 5 ml dung dịch Casein

A6: 5.10 3 VKHG /0,02ml 1ml A5 + 9 ml dung dịch Casein

A 7 : 500 VKHG /0,02ml 1ml A 6 + 9 ml dung dịch Casein

A 8 :100 VKHG /0,02ml 1ml A 7 + 4 ml dung dịch Casein

A 9 : 20 VKHG /0,02ml 1ml A 8 + 4 ml dung dịch Casein

Sử dụng 4 công thức A7, A8, A9, A10 tiêm não cho 4 nhóm chuột nhắt trắng ICR 6 tuần tuổi, trọng lượng từ 28-35g/chuột Liều tiêm/đường tiêm: 0,02 ml/con/não Theo dõi chuột 14 ngày, dựa vào số chuột còn sống, số chuột chết và tổng số của các độ pha A7, A8, A9, tính ra liều LD50 LD50 của chủng được tính bằng phần mềm Probit Analysis LD50 của chủng thử thách phải chứa khoảng 50-

Vì chủng ho gà được cất giữ nồng độ khoảng 10 10 vi khuẩn/ml vì vậy mà khi dò liều LD50 có thể nằm ngoài khoảng tiêu chuẩn Vì vậy cần phải dò để xác định và điều chỉnh lại độ pha A1 cho phù hợp

2.2.2 Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của cả Swiss và ICR đối với vắc xin ho gà vô bào

Dưới đây là sơ đồ tóm tắt các bước thực hiện:

Hình 10: Quy trình thực hiện đánh giá đáp ứng miễn dịch của cả chuột Swiss và

- Nghiên cứu khả năng đáp ứng miễn dịch song song trên cả chuột nhắt trắng Swiss và ICR bằng cách pha loãng vắc xin ở nhiều nồng độ khác nhau

- Sau thời gian miễn dịch là 21 ngày, tiến hành thử thách với chủng ho gà

18323 Nếu trong thời gian theo dõi miễn dịch, số lượng chuột chết quá 6% thì phải nhắc lại thử nghiệm

- Theo dõi hàng ngày và đếm số lượng chuột sống/tổng số Dựa vào số lượng chuột sống/tổng số, tính kết quả thông qua vắc xin mẫu chuẩn đã biết trước công hiệu bằng phần mềm WHO program và đánh giá kết quả

- Từ các kết quả, đánh giá khả năng sinh miễn dịch của 2 dòng chuột Swiss và ICR Xác định tính chính xác của quy trình và thống nhất quy trình thử nghiệm Tiến hành thử nghiệm trên cả 2 dòng chuột Swiss và ICR để đánh giá về khả năng đáp ứng miễn dịch đối với tất cả các loại vắc xin đang được lưu hành tại Việt

Nam bao gồm: Infanrix hexa, Hexaxim, Petaxim, Tetraxim cho trẻ em và Adacel, Boostrix cho người lớn và phụ nữ mang thai a Tiêm miễn dịch

Chuẩn bị chuột thử nghiệm

- Sau khi chọn lựa, chuột được phân vào các lồng, chia riêng chuột đực cái vào các lồng khác nhau Chuột được phân chia vào các lồng như sau:

 Nhóm tiêm vắc xin thử nghiệm

 Nhóm tiêm vắc xin mẫu chuẩn: 25 con/độ pha/2 lồng

 Nhóm tiêm vắc xin mẫu thử: 25 con/độ pha/2 lồng

 Nhóm tiêm chứng dương: 30 con ( 10 con/độ pha, tiêm 3 độ pha A7, A8, A9)

 Nhóm tiêm chứng âm: 10 con được tiêm bằng dung dịch Casein

- Nhóm chứng dương và nhóm chứng âm được nuôi song song cùng với nhóm tiêm vắc xin

- Tất cả các thao tác pha vắc xin và pha chủng đều tiến hành trong phòng sạch

- Dùng bút viết kính ghi lên tuýp các thông tin: loạt vắc xin và từng độ pha

- Vắc xin thử và vắc xin chuẩn đều được tiến hành pha loãng bậc 5 sao cho

ED50- liều bảo vệ ít nhất 50% động vật thí nghiệm phải nằm trong độ pha loãng loãng nhất và đặc nhất

- Mẫu chuẩn và mẫu thử được pha loãng với nước muối sinh lý Tiến hành đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên nhiều độ pha loãng để xác định được khoảng miễn dịch thích hợp của các vắc xin đối với hai dòng chuột Sau khi xác định được khoảng miễn dịch, tiến hành pha loãng với ít độ pha hơn để xác định độ pha thích hợp dùng cho gây đáp ứng miễn dịch và giảm thiểu số động vật thí nghiệm sử dụng

Vắc xin mẫu chuẩn được pha loãng như sau:

Bảng 2: Pha loãng vắc xin mẫu chuẩn cho thử nghiệm

A = 1/10 2ml vắc xin + 18 ml NMSL

Vắc xin mẫu thử được pha loãng như sau:

Bảng 3: Pha loãng vắc xin mẫu thử cho thử nghiệm

A = 1 20ml vắc xin mẫu thử

- Vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử được pha loãng và tiêm cho chuột ở các độ pha khác nhau với liều tiêm/ đường tiêm: 0,5ml/ổ bụng/con (Phụ lục 2) b Tiêm miễn dịch cho chuột

- Tiến hành tiêm trên các nhóm chuột sau khi chúng đã được ăn uống đầy đủ 1h

- Dùng bơm tiêm loại 3 ml có khắc vạch 0,5 ml, tiêm miễn dịch cho chuột ở cả loạt vắc xin mẫu thử và mẫu chuẩn

- Liều/ đường tiêm: 0,5 ml /ổ bụng/con

- Theo dõi miễn dịch 21 ngày, số lượng chuột chết không được quá 6%/ độ pha c Tiêm thử thách

- Sau khi tiêm miễn dịch 21 ngày, chuột được tiêm thử thách với chủng ho gà

- Yêu cầu đối với chủng thử thách: giá trị pha loãng đảm bảo LD50 nằm trong khoảng từ 50-400 vi khuẩn Chủng ho gà B pertussis 18323 chứa khoảng 10.10 9

VKHG/ml (A0) được pha loãng bậc 5 theo công thức sau:

Lựa chọn môi trường BG với tỷ lệ máu thỏ phù hợp cho nuôi cấy chủng ho gà B pertussis 18323

Việc sử dụng máu cừu để sản xuất thạch máu nuôi cấy chủng ho gà đã được thực hiện từ những năm 90 và cho kết quả tốt, ổn định Tuy nhiên việc nuôi cừu và lấy máu cừu tại Việt Nam ngày càng khó khăn Sử dụng máu thỏ trong công thức sản xuất môi trường BG thay thế cho máu cừu để nuôi cấy chủng ho gà B pertussis

18323 dùng cho thử thách sẽ là một bước thuận lợi lớn trong kiểm định Ngoài giá thành hạ thì máu thỏ lại là nguyên liệu dễ kiếm và sẵn có Trong nghiên cứu này, máu thỏ sẽ được sử dụng thay thế cho máu cừu, bổ sung vào môi trường BG với tỷ lệ 7%, 15% và 30% nhằm đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn và thu hồi sinh khối vi khuẩn B pertussis 18323 Kết quả thu được như sau:

Sau khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn B pertussis ở 35°C/72h, chúng tôi nhận thấy trên môi trường BG bổ sung 7% bề mặt thạch và khuẩn lạc của vi khuẩn tương đối khô, khuẩn lạc mọc không mịn và đều như trên môi trường 15% và 30% máu thỏ Khi tiến hành cấy chuyển, môi trường thạch khô giúp việc thu hoạch sinh khối và cấy chuyển dễ dàng hơn tuy nhiên kích thước khuẩn lạc ở môi trường 7% nhỏ và không bóng mịn

Hình 11: Chủng ho gà B pertussis khi nuôi cấy trên môi trường BG bổ sung 15% máu thỏ

Với 2 môi trường 15% và 30% vi khuẩn B pertussis mọc khá mịn và đều với kích thước khuẩn lạc như nhau Ở môi trường BG bổ sung 30% máu thỏ bề mặt thạch mềm và gây khó khăn hơn trong việc thu hoạch và cấy chuyển Trong khi đó, môi trường bổ sung 15% máu thỏ vừa đủ dinh dưỡng để vi khuẩn ho gà sinh trưởng mà việc thu hoạch và cấy chuyển chủng cũng thuận lợi hơn Vì vậy, môi trường BG bổ sung 15% máu thỏ được lựa chọn làm môi trường nuôi cấy B pertussis thay thế cho công thức thạch BG bổ sung 30% máu cừu sử dụng trước đây

Bảng 4: Kết quả nuôi cấy vi khuẩn ho gà B pertussis 18323 trên môi trường BG bổ sung 7%, 15%, 30%

Môi trường BG bổ sung máu thỏ

Hình thái khuẩn lạc B pertussis

7% Khô, không mịn + Khô, dễ thu hoạch và cấy chuyển

15% Mịn, mọc đồng đều ++ Mềm vừa đủ, dễ thu hoạch và cấy chuyển

30% Mịn, mọc đồng đều ++ Mềm, khó thu hoạch và cấy chuyển

Chủng ho gà sau khi được nuôi cấy trên môi trường BG bổ sung 15% máu thỏ sẽ được thu hoạch để lấy sinh khối Sinh khối của vi khuẩn ho gà được pha loãng để đo OD Tiêu chuẩn OD của dịch huyền phù khoảng 0,5-0,55 ở bước sóng 590nm tương đương khoảng 10 10 vi khuẩn/ml Dịch huyền phù này được chia nhỏ ra các ống, mỗi ống chứa khoảng 10 10 vi khuẩn/ml và được giữ ở nitơ lỏng.

Đánh giá sự ổn định của chủng thử thách

Tham khảo quy trình kiểm định tại Nhật Bản, chủng vi khuẩn sau khi nuôi cấy sẽ được dùng để tiêm thử thách trên não chuột Sử dụng chủng ngay sau khi nuôi cấy như vậy sẽ mất nhiều thời gian cho việc nuôi cấy và việc xác định liều LD50-

38 liều gây chết tối thiểu 50% động vật thí nghiệm của chủng thử thách cũng dao động khá lớn và có thể rơi ra ngoài khoảng cho phép, dẫn đến kết quả thử nghiệm không có giá trị Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nuôi cấy, chia nhỏ ra và cất giữ chủng, đồng thời xác định được khoảng nồng độ pha loãng chủng đã cất giữ phù hợp với việc thử thách Quá trình này không cần giai đoạn nuôi cấy và chỉ cần dò liều lại LD50 của chủng thử thách khi cần thiết

Sau mỗi 3 tháng bảo quản, từ ống chủng gốc được cất giữ A0= 10 10 vi khuẩn/ml sẽ đươc pha loãng để xác định liều LD50 như sau: tiêm não 3 độ pha A7, A8, A9 cho

30 con chuột (mỗi độ pha 10 con), dựa vào số lượng chuột sống tính kết quả trên phần mêm Probit Analysis Thông qua số liệu kết quả liều LD50 của chủng thử thách, đánh giá sự ổn định của chủng theo thời gian theo dõi Kết quả được tổng hợp ở bảng:

Bảng 5: Kết quả dò liều LD50 của chủng thử thách

Hình 12: Theo dõi kết quả LD50 của chủng ho gà theo thời gian bảo quản

Tiêu chuẩn liều LD50 của chủng thử thách đối với thử nghiệm ho gà vô bào phải nằm trong khoảng từ 50-400 vi khuẩn là đạt yêu cầu

Kết quả đánh giá cho thấy giá trị LD50 dao động xung quanh ngưỡng cho phép không giảm dần theo thời gian Theo kết quả đánh giá tính ổn định của chủng thử thách như hình 12 và bảng 5, ta thấy LD50 ở mốc thời gian cất giữ 3 tháng là 295,940 vi khuẩn Tiếp theo mốc 12 tháng giảm nhẹ là 255,737 vi khuẩn Tương tự mốc thời gian 24 tháng và 36 tháng LD50 lần lượt là 219,063 và 243,405 vi khuẩn Với thử nghiệm sinh học trong cùng thời điểm cũng có sự khác nhau giữa các ống, ở đây là sau 36 tháng Giá trị thấp nhất của liều LD50 là 175,216, giá trị cao nhất của liều LD50 là 295,940 Các giá trị này đều nằm trong khoảng TB±2SD với điều kiện bảo quản chủng chuẩn trong khoảng tin cậy 95% Điều này cho thấy, chủng khi được giữ trong nito lỏng với nhiệt độ khoảng -196⁰C ổn định qua thời gian theo dõi

Sự dao động của các kết quả này là do tính chất đặc điểm sinh học của từng cơ thể chuột, khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm khác nhau đôi chút, tuy nhiên kết quả vẫn nằm trong giới hạn yêu cầu từ 50-400 tế bào vi khuẩn và ổn định

Số lượng tế bào vi kh uẩn

TB-2SD Giới hạn dưới Kết quả

Giới hạn trên TB+2SD

Hình 13: Hình ảnh tiêm não chuột nhắt

Trước mỗi lần làm thử nghiệm, liều LD50 thực tế của chủng thử thách đều phải xác định để qua đó đánh giá chất lượng chủng thử nghiệm có đạt yêu cầu hay không và có thể điều chỉnh lại độ pha loãng sao cho phù hợp nhất với những lần kiểm định sau Việc cất giữ chủng và đánh giá sự ổn định của chủng giúp cho việc kiểm định có giá trị nhanh hơn, chủ động hơn, đưa ra kết quả đáng tin cậy cho đánh giá chất lượng vắc xin ho gà vô bào.

Đánh giá sự đáp ứng miễn dịch trên cả 2 dòng chuột nhắt trắng Swiss và ICR đối với các vắc xin ho gà vô bào

Chuột Swiss là dòng chuột được sử dụng tại NICVB từ những năm đầu làm công tác kiểm định vắc xin ho gà Dòng chuột này đáp ứng miễn dịch khá tốt, đưa ra kết quả kiểm định nhanh, chính xác Tuy nhiên, hồ sơ chất lượng về nguồn gốc và kiểm soát chất lượng không đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn của WHO Dòng chuột ICR là một dòng chuột mới, khoảng đáp ứng miễn dịch của từng loại vắc xin với từng loại chuột là khác nhau, nên chúng tôi tiến hành dò miễn dịch trên nhiều độ pha loàng khác nhau để xác định được khoảng miễn dịch thích hợp Sau khi xác

41 định được khoảng miễn dịch thích hợp, với ít độ pha loãng hơn thì sẽ giảm thiểu số động vật thí nghiệm sử dụng

Vắc xin mẫu chuẩn ho gà toàn tế bào chứa 66 IU/ml được sử dụng tiêm cho chuột có độ pha loãng đầu tiên là 1/30 với hàm lượng là 1,1 IU/0,5ml/con Vắc xin ho gà vô bào chỉ chứa các kháng nguyên đặc hiệu vì vậy mà khi sử dụng mẫu chuẩn ho gà vô bào chứa 72 IU/ml, chúng tôi đưa ra hàm lượng kháng nguyên với liều tiêm cho chuột ở độ pha đậm đặc nhất cao hơn với độ pha loãng là 1/10 với hàm lượng là 3,6 IU/0,5ml/con Từ các độ pha này tiếp tục pha loãng bậc 5 để tiêm miễn dịch cho chuột

Với vắc xin mẫu thử, các vắc xin ho gà toàn bào phối hợp nhiều thành phần dùng cho tiêm chủng như vắc xin DPT, SII đang lưu hành tại Việt nam, liều miễn dịch được sử dụng là 1/5 đối với độ pha loãng đầu tiên- độ pha đậm đặc nhất Theo nguyên tắc pha loãng đối với mẫu vô bào là cần đậm đặc hơn nên khi tiến hành dò liều miễn dịch của vắc xin ho gà vô bào chúng tôi sử dụng độ pha đặc hơn so với vắc xin ho gà toàn tế bào Sử dụng vắc xin không pha loãng cho mỗi chuột ở độ pha đầu tiên Các độ pha dùng tiếp theo được pha loãng bậc 5 Vắc xin thương mại được sử dụng cho thử nghiệm này là vắc xin Tetraxim chứa 4 thành phần

Theo khuyến cáo của WHO, liều thử thách dùng cho thử nghiệm công hiệu ho gà vô bào và vắc xin ho gà toàn tế bào, liều thử thách chứa khoảng 10 5VKHG /0,02ml [38] Theo quy trình kiểm định chất lượng tại Nhật Bản, liều thử thách được sử dụng chứa khoảng 5.10 4VKHG /0,02ml [19] Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành dò với 2 liều thử thách là 10 5VKHG /0,02ml và 5.10 4VKHG /0,02ml của mẫu chuẩn ho gà vô bào và vắc xin mẫu thử thương mại Tetraxim trên chuột ICR và Swiss Kết quả được trình bày ở bảng 6

Bảng 6: Kết quả dò đáp ứng miễn dịch trên 2 dòng chuột Swiss và ICR

Từ kết quả bảng trên cho thấy chuột Swiss hoàn toàn không được bảo vệ ở cả

2 liều thử thách 10 5VKHG /0,02ml và 5.10 4VKHG /0,02ml Liều tiêm miễn dịch đậm đặc Độ pha

Vắc xin mẫu chuẩn ho gà vô bào

Số lượng chuột sống/tổng số (chuột)

Liều thử thách 5.10 4VKHG /0,02ml Swiss

Tetraxim Swiss ICR Swiss ICR

43 nhất là 1/10 ở vắc xin mẫu chuẩn và 1 liều tiêm ở vắc xin mẫu thử Tetraxim đều không gây đáp ứng miễn dịch ở chuột Swiss; không có chuột nào được bảo vệ ở tất cả các độ pha loãng vắc xin khi chuột Swiss được tiêm thử thách với chủng tạo bệnh

Tuy nhiên, mẫu chuẩn và mẫu thử Tetraxim có kết quả khác biệt và rõ ràng đối với chuột ICR

- Ở các nồng độ pha loãng giống nhau của vắc xin mẫu chuẩn, vắc xin mẫu thử tỷ lệ sống và chết có sự khác biệt rõ ràng khi được tiêm thử thách với chủng gây bệnh khác nhau

 Đối với liều thử thách là 10 5VKHG /0,02ml

Hình 14: Số lượng chuột sống/Tổng số khi dò trên vắc xin mẫu chuẩn và mẫu thử ở các độ pha khác nhau với liều thử thách 10 5VKHG /0,02ml

- Ở độ pha 1/10- 1/50- 1/250 của vắc xin mẫu chuẩn, với nồng độ vắc xin càng cao, tỷ lệ thuận, số lượng chuột được bảo vệ sẽ nhiều hơn, tương ứng lần lượt là 6- 2-1 Tuy nhiên số lượng chuột ICR sống- chuột được bảo vệ bởi vắc xin ở độ pha cao nhất (A=1/10) nhỏ hơn 50% (6/25) tổng số động vật thí nghiệm được sử dụng ở độ pha này Vì vậy khoảng ED50 rơi ra ngoài khoảng gây đáp ứng miễn dịch

Số lượng chuộ t số ng Độ pha Đáp ứng miễn dịch ở độ pha thử thách 10 5VKHG /ml (Vắc xin mẫu chuẩn)

Số lượng chuộ t số ng ( chuộ t) Độ pha Đáp ứng miễn dịch ở độ pha thử thách 10 5VKHG /ml (Vắc xin mẫu thử)

Với vắc xin Tetraxim, độ pha 1- 1/5-1/25 cũng quan sát thấy có sự sống/chết rõ ràng Với liều tiêm cao nhất là 1- tương đương với 1 liều vắc xin không pha loãng thì số lượng chuột được bảo vệ chỉ đạt 12/25 con

Với liều thử thách này, số lượng chuột được bảo vệ dao động ở giới hạn ≤50% vì vậy mà các lần thử nghiệm tiếp theo rất khó đảm bảo vì ED50 có thể nằm ngoài khoảng pha miễn dịch khi đó thử nghiệm không có giá trị Có 2 cách để điều chỉnh, tăng liều miễn dịch hoặc giảm liều thử thách sao cho ED50 nằm trong khoảng cho phép giữa liều tiêm miễn dịch cao nhất và liều miễn dịch thấp nhất Liều miễn dịch với vắc xin mẫu chuẩn có thể tăng lên là 1/2 đối với vắc xin mẫu chuẩn nhưng đối với vắc xin mẫu thử liều miễn dịch 1 liều tiêm/ chuột là liều đậm đặc nhất, nên không thể tăng liều vắc xin mà phải thay thế bằng giảm liều thử thách nhưng vẫn đảm bảo thử nghiệm có giá trị là lựa chọn tốt nhất cho thử nghiệm này

 Đối với liều thử thách là 5.10 4VKHG /0,02ml

Kết quả đánh giá độ tin cậy của thử nghiệm thể hiện ở hình 17

Hình 15: Số lượng chuột sống/Tổng số khi dò trên vắc xin mẫu chuẩn và mẫu thử ở các độ pha khác nhau với liều thử thách 5.10 4VKHG /0,02ml

Kết quả cho thấy khi giảm liều thử thách xuống 5.10 4VKHG /0,02ml thì ≥ 50% chuột ICR được bảo vệ ở độ pha loãng của vắc xin mẫu chuẩn là A=1/10 và B=1/50 và A=1, B=1/5, C= 1/25 với vắc xin mẫu thử Ở các công thức pha loãng C và D của vắc xin mẫu chuẩn và D của vắc xin mẫu thử có dưới 50% chuột ICR được bảo

Số lượng chuộ t số ng ( chuộ t) Độ pha Đáp ứng miễn dịch ở độ pha thử thách 5.10 4VKHG /ml

Số lượng chuộ t số ng ( chuộ t) Độ pha Đáp ứng miễn dịch ở độ pha thử thách 5.10 4VKHG /ml (Vắc xin mẫu thử)

45 vệ Chính vì thế chúng tôi nhận thấy với liều miễn dịch là 1/10-1/50-1/250 với vắc xin mẫu chuẩn và 1/5- 1/25- 1/125 đối với vắc xin mẫu thử Tetraxim, là đủ mạnh để có thể bảo vệ khi chuột được tiêm với liều thử thách 5.10 4VKHG /0,02ml đảm bảo thử nghiệm có giá trị với tiêu chí của ED50 Vì vậy, liều thử thách 5.10 4VKHG /0,02ml được chúng tôi lựa chọn cho các thử nghiệm tiếp theo

Từ các kết quả trên, chúng tôi đưa ra nhận định chuột Swiss không có đáp ứng miễn dịch trong khi chuột ICR lại có đáp ứng miễn dịch khá tốt Liều miễn dịch đối với vắc xin mẫu chuẩn được sử dụng là 1/10- 1/50- 1/250 và liều miễn dịch đối với vắc xin mẫu thử Tetraxim là 1/5- 1/25- 1/125 là những liều có khả năng gây đáp ứng miễn dịch thích hợp để bảo vệ chuột với liều thử thách 5.10 4VKHG /0,02ml/chuột

3.3.2 Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của một số vắc xin thương mại

Với nhận định sơ bộ về đáp ứng miễn dịch của dòng chuột Swiss và ICR với vắc xin chứa thành phần ho gà aP, chuột Swiss không có đáp ứng đối với vắc xin mẫu chuẩn và không có đáp ứng đối với vắc xin mẫu thử là Tetraxim chứa 4 thành phần: bạch hầu, ho gà, uốn ván, bại liệt Tuy nhiên, chúng tôi vẫn tiến hành thực hiện trên 2 dòng chuột với các loại vắc xin mẫu thử ho gà vô bào khác Các vắc xin ho gà vô bào lưu hành tại Việt Nam được phối hợp các thành phần khác nhau của các nhà sản xuất khác nhau vì vậy chưa thể khẳng định chuột Swiss không có đáp ứng đối với vắc xin Tetraxim là không có đáp ứng với các vắc xin khác Vậy nên chúng tôi vẫn sử dụng chuột Swiss cho việc dò khoảng đáp ứng trên các vắc xin mẫu thử khác

Từ kết quả trên cho thấy vắc xin Tetraxim tạo được miễn dịch trên chuột ICR nhưng để khẳng định chuột ICR có đáp ứng miễn dịch với các mẫu thử các loại vắc xin ho gà vô bào khác hay không thì trong thí nghiệm này chúng tôi tiếp tục đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột ICR với các loại vắc xin khác nhau

46 Đối với mẫu chuẩn, sau khi xác định được khoảng đáp ứng miễn dịch trên chuột ICR, chúng tôi vẫn sử dụng 3 độ pha 1/10- 1/50- 1/250 cho các thử nghiệm tiếp theo

Xây dựng quy trình kiểm định công hiệu vắc xin ho gà vô bào sử dụng chuột ICR

Từ những kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột ICR với các vắc xin khác nhau trên, chúng tôi đưa ra quy trình kiểm định cụ thể cho các vắc xin chứa thành phần

56 ho gà vô bào như sau:

Chuột nhắt trắng ICR, 3-4 tuần tuổi Sau khi chọn lựa, chuột được phân vào các lồng, chia riêng chuột đực cái vào các lồng khác nhau

- 75 con chia làm 3 độ pha dùng cho miễn dịch vắc xin chuẩn tương ứng với 3 độ pha 1/10- 1/50- 1/250 (25 con/độ pha/2 lồng)

- 75 con chia làm 3 độ pha dùng cho miễn dịch vắc xin thử tương ứng với 3 độ pha 1/5- 1/25- 1/125 (25 con/độ pha/2 lồng)

- 30 con được nuôi song song để kiểm chứng độc lực của chủng thử thách B pertussis 18323 (10 con/độ pha, được tiêm từ dung dịch A7, A8, A9)

- 10 con nuôi song song để tiêm não bằng dung dịch đệm Casein 1% để kiểm chứng sự phá huỷ não không đặc hiệu

- Chuột được phân ngẫu nhiên vào các lồng Mỗi lồng 12-13 con cùng giới, mỗi độ pha gồm 2 lồng (đối với nhóm chuột tiêm miễn dịch) Chuột được đánh dấu nhằm phân biệt giữa các độ pha và giữa các lô thử nghiệm Nhóm chứng âm và chứng dương được nuôi song song cùng với chuột được tiêm miễn dịch bằng vắc xin

- Nước muối sinh lý vô khuẩn

- Dung dịch Casein 1% vô khuẩn

- Vắc xin mẫu chuẩn ho gà vô bào: 72IU/ml

- Vắc xin mẫu thử: vắc xin chứa thành phần ho gà vô bào

- Tuýp nhựa vô khuẩn loại 50 ml, 15 ml, 5ml

- Pipet nhựa vô khuẩn 5ml, 25ml

- Pipet AID, micropipet loại 20àl, loại 1000 àl và đầu cụn tương ứng

- Kim hamilton và đầu kim tương ứng

- Khay inox, thùng đựng đá, găng tay y tế, hộp xốp có đá, giá để tuýp, bơm tiêm nhựa 3ml vô khuẩn

3.4.4 Các bước tiến hành a Pha tiêm miễn dịch

- Tất cả các thao tác pha vắc xin và pha chủng đều tiến hành trong phòng sạch

- Dùng bút viết kính ghi lên tuýp các thông tin: loạt vắc xin và từng độ pha

- Vắc xin thử và vắc xin chuẩn đều được tiến hành pha loãng bậc 5 sao cho

ED50 phải nằm trong độ pha loãng loãng nhất và đặc nhất

Vắc xin mẫu chuẩn đông khô được pha loãng như sau

Bảng 13: Pha loãng vắc xin mẫu chuẩn cho thử nghiệm

A = 1/10 2ml vắc xin mẫu chuẩn + 18 ml NMSL

Vắc xin mẫu thử: vắc xin chứa thành phần ho gà vô bào được pha loãng như sau:

Bảng 14: Pha loãng vắc xin mẫu thử cho thử nghiệm

A = 1/5 5ml vắc xin mẫu thử + 20 ml NMSL

C = 1/125 5 ml B + 20 ml NMSL b Tiêm miễn dịch cho chuột

- Tiến hành tiêm trên các nhóm chuột sau khi chúng đã được ăn uống đầy đủ 1h

- Dùng bơm tiêm loại 3 ml có khắc vạch 0,5 ml, tiêm miễn dịch theo thứ tự cho cả loạt vắc xin mẫu thử và mẫu chuẩn Liều/ đường tiêm: 0,5 ml/con/ổ bụng c Tiêm thử thách

- Sau khi tiêm miễn dịch 21 ngày, chuột được tiêm thử thách với chủng ho gà

- Liều LD50 được dò trước khi tiêm thử thách, có thể tham khảo kết quả của các lô kiểm định trước hoặc tiến hành dò lại liều LD50 của chủng ho gà

Pha loãng chủng thử thách: Chủng ho gà B pertussis 18323 chứa khoảng

10 10 /ml (A0) được pha loãng bậc 5 sao cho:

- Tiêm não 10 chuột (Nhóm chứng âm A10), mỗi con 0.02ml dung dịch Casein 1% để có những thông tin về sự phá huỷ não không đặc hiệu

- Tiêm 3 nhóm chứng dương, mỗi nhóm 10 con (được nuôi song song cùng với chuột đã tiêm miễn dịch), mỗi con 0,02 ml các độ pha theo thứ tự: A9 - A8 - A7 để kiểm tra độc lực của chủng thử thách

- Dung dịch A5 chứa 5.10 4 VKHG / 0,02 ml/ chuột dùng để tiêm thử thách cho nhóm chuột đã tiêm vắc xin thử nghiệm và vắc xin mẫu chuẩn

- Liều tiêm/đường tiêm: 0,02ml/não/con

- Vị trí tiêm: tại điểm cách 2-3mm với điểm giữa của đường nối tai trái và mắt trái của chuột

- Theo dõi chuột sống/tổng số sau 14 ngày, đọc và tính kết quả thử nghiệm

- Trong quá trình pha và tiêm thử thách, dung dịch vi khuẩn phải giữ trong đá lạnh

- Thời gian tính từ khi bắt đầu tan băng đến khi kết thúc thí nghiệm không quá

- Những chuột chết trong 3 ngày đầu sau tiêm thử thách được cho là chuột chết không mang tính đặc hiệu của ho gà được loại bỏ khỏi số liệu tính toán cho kết quả Do đó chỉ những chuột chết từ ngày thứ 4 đến ngày 14 mới được tính kết quả d Tính kết quả Đánh giá thử nghiệm có giá trị:

- Trong suốt thời gian miễn dịch cho đến ngày thử thách số chuột trong mỗi độ pha không được chết quá 6%

- ED50 của vắc xin chuẩn và ED50 vắc xin thử nghiệm nằm giữa độ pha loãng nhất và độ pha đặc nhất của vắc xin chuẩn và vắc xin thử tương ứng

- Liều LD50 của chủng thử thách phải chứa 50-400 vi khuẩn

- Thử nghiệm phải đạt đựơc tiêu chuẩn của chương trình Whoprogram đặt ra về đường thẳng và đường song song của mối tương quan đáp ứng liều Đánh giá kết quả thử nghiệm

Thử nghiệm đạt yêu cầu nếu công hiệu ho gà  8IU/ml và giới hạn dưới của khoảng tin cậy 95% của công hiệu đạt  4IU/ml [38].

Xác định giá trị sử dụng của quy trình

Xác định giá trị sử dụng của quy trình: là quá trình thiết lập một hoặc nhiều hơn các đặc tính: độ đúng, độ chính xác, độ tuyến tính, vùng tuyến tính, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ mạnh phù hợp với từng phương pháp Sử dụng độ chính xác trung gian để đánh giá mức độ thống nhất giữa các kết quả thử nghiệm độc lập Thực hiện thử nghiệm cùng một phương pháp, đánh giá kết quả của 10 lần thử nghiệm vào 10 ngày khác nhau

Bảng 15: Kết quả thực hiện 10 lần với vắc xin Tetraxim Độ

Vắc xin mẫu chuẩn Vắc xin mẫu thử

Hình 18: Kết quả công hiệu của 10 lần thử nghiệm trên cùng 1 mẫu vắc xin

Vì các thử nghiệm công hiệu thành phần ho gà vô bào kéo dài: 35 ngày/1 lần thử nghiệm với số lượng động vật thí nghiệm lớn, để thiết kế tiêu chí đánh giá tính chính xác trung gian nên chúng tôi thực hiện 10 lần riêng rẽ gối nhau trên cùng một mẫu thử là Tetraxim cùng 1 loạt Theo biểu đồ phân phối chuẩn độ chính xác của thử nghiệm càng cao khi hệ số biến thiên (CV %) càng nhỏ Trong thử nghiệm sinh học, mức độ dao động của các kết quả tương đối lớn, tiêu chuẩn của hệ số biến thiên của thử nghiệm thường nằm trong khoảng 20-50% Giá trị CV= 27,15% của 10 lần thử nghiệm của vắc xin Tetraxim nằm trong khoảng trên và gần sát với giới hạn dưới của tiêu chuẩn cho thấy thử nghiệm khá ổn định qua các lần thực hiện Kết quả của 10 lần thử nghiệm độc lập cho giá trị công hiệu nằm trong khoảng ±2SD tương ứng với độ chính xác của mỗi lần lặp lại thử nghiệm trong khoảng tin cậy 95%

Như vậy, quy trình này đạt độ chính xác trung gian, phù hợp cho việc áp dụng vào thực hiện thường quy Việc xác định chuột ICR có đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin ho gà vô bào vô cùng có ý nghĩa thực tế, giúp cho việc kiểm định chất lượng của vắc xin này được thực hiện thường quy tại Việt Nam do chủ động được nguồn cung cấp động vật thí nghiệm Ngoài ra, xác định được khoảng đáp ứng miễn

Cô ng hiệu v ắc xin (I U/m l)

Công hiệu của vắc xin Tetraxim

TB- 2SD Công hiệu TB+ 2SD

63 dịch và đưa ra độ pha loãng của các vắc xin thương mại sẽ giúp cho việc kiểm định chất lượng vắc xin này được chủ động kịp thời khi có mẫu, chúng tôi không phải dò tìm nồng độ pha loãng, gây mất thêm thời gian và nhân lực (con người và nguyên vật liệu), thêm nữa số lượng độ pha giảm tối thiểu (3 độ pha) nên giảm số lượng chuột thí nghiệm đáng kể, giảm chi phí cho mỗi lần thử nghiệm

Với những ưu việt của kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã thành công trong việc thiết lập quy trình kiểm định mới với thành phần ho gà vô bào sử dụng dòng chuột mới ICR