ĐẶT VẤN ĐỀ 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm (VSATTP) là một trong những vấn đề được ưu tiên hàng đầu của mọi quốc gia trên thế giới VSATTP liên quan trực tiếp tới sức khỏe con người VSA[.]
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm (VSATTP) vấn đề ưu tiên hàng đầu quốc gia giới VSATTP liên quan trực tiếp tới sức khỏe người VSATTP khơng đảm bảo gây tổn thất không nhỏ cho kinh tế Ước tính năm có khoảng 34 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Những năm qua, kinh tế nước ta đổi mới, phát triển nhiều khởi sắc; đời sống nhân dân cải thiện Bên cạnh vụ ngộ độc thức ăn xảy thường xuyên, khắp nơi ngày nhiều mà nguyên nhân nhiễm khuẩn Có dạng ngộ độc chính do vi sinh vật: + Do thực phẩm ăn bị nhiễm vi khuẩn: Salmonella, shigella, E coli,Vibrio… + Do thực phẩm ăn bị nhiễm độc tố vi khuẩn: độc tố tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), độc tố vi khuẩn gây ngộ độc thịt (Clostridium botulinum), độc tố vi khuẩn gây nhiễm vào loại ngũ cốc, gia vị, loại thực phẩm khác Bacillus cereus (B.cereus) Ngộ độc nguyên nhân vi khuẩn chiếm khoảng 2/3 vụ ngộ độc thực phẩm Trong số nguyên vi khuẩn, B.cereus biết đến nguyên gây ngộ độc thực phẩm quan trọng nước phát triển phát triển, thu hút quan tâm mặt lâm sàng lẫn chẩn đoán phịng xét nghiệm B.cereus có mặt khắp nơi mơi trường, gây bệnh cách sinh độc tố Tại châu Âu từ năm 1973-1985 vụ ngộ độc thực phẩm B.cereus chiếm khoảng 17,8% trường hợp ngộ độc thực phẩm [12], Hà Lan 19% Đài Loan xếp thứ nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm [16].Tại Norway từ năm 1988-1993 B.cereus chiếm khoảng 33% tổng số nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, Iceland từ năm 1985-1992 tỷ lệ 47% tỷ lệ thấp quốc gia khác: Mỹ 1,3% Canada 2,2% B.cereus tìm thấy khoảng 25% sản phẩm thực phẩm lấy mẫu: kem, bánh, thịt, khoai tây, sữa, gạo Ô nhiễm sản phẩm thực phẩm thường xảy trước nấu [26] Có nhiều phương pháp xác định B.cereus gây ngộ độc thực phẩm: o Phương pháp định danh kinh điển dựa vào việc phân lập đặc tính sinh hóa, sinh lý B.cereus Tuy nhiên phương pháp xác định thực phẩm có hay khơng có B.cereus mà khơng phát thực phẩm có độc tố hay khơng o Phương pháp ELISA sử dụng để phát độc tố thực phẩm, nhiên phương pháp gián tiếp nên độ nhạy không cao [13] o Phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phản ứng khuyếch đại gen – Polymerase Chain Reaction (PCR) sử dụng rộng rãi nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng chẩn đoán tác nhân gây ngộ độc có thực phẩm Phương pháp cho phép xác định xác nhiễm thực phẩm với chủng vi khuẩn gây bệnh thơng qua có mặt đoạn gen đặc hiệu vi khuẩn gây bệnh.Ưu điểm kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, kể nguyên vật liệu Ở Việt Nam có vài nghiên cứu cơng bố việc sử dụng kỹ thuật PCR để phát nguyên gây ngộ độc thực phẩm vi khuẩn S.aureus, E coli O157, Salmonella… chưa đề cập đến việc xác định gen gây độc B.cereus thực phẩm Trên thưc tế, Việt Nam nước có điều kiện khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho B.cereus phát triển thực phẩm giải phóng độc tố, ý thức người dân chưa đầy đủ đặc biệt việc sử dụng nhiều sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm B.cereus không nhỏ Việt Nam việc nghiên cứu áp dụng kỹ thuật với nhiều cặp mồi có độ nhạy , độ đặc hiệu cao nhằm phát gen đặc hiệu B.cereus gây ngộ độc thực phẩm phản ứng để tiết kiệm thời gian kinh phí cần thiết có ý nghĩa thiết thực, giúp nghiên cứu sâu nguyên gây ngộ độc thực phẩm B.cereus Để góp phần kiểm sốt VSATTP, giảm chi phí xã hội thơng qua việc ngăn ngừa vụ ngộ độc thực phẩm B.cereus nâng cao lực kiểm soát VSATTP quan chức Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phát gen độc tố B cereus thực phẩm kỹ thuật multiplex PCR” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu xây dựng quy trình phát gen độc tố B cereus kỹ thuật Multiplex-PCR quy mơ phịng thí nghiệm Thử nghiệm quy trình để phát gen độc tố B.cereus số thực phẩm có nguồn từ gạo Hà nội CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM 1.1.1 Trên giới Ngày B.cereus coi nguyên quan trọng gây ngộ độc thực phẩm khơng phổ biến Salmonella lồi khác gây bênh qua thực phẩm [27] Tuy nhiên số lượng xác trường hợp ngộ độc thức ăn B.cereus không ghi nhận cách đầy đủ Giữa năm 1972 năm 1983 trường hợp ngộ độc thức ăn B.cereus chiếm 2% tổng số dịch bệnh truyền qua thực phẩm Năm 1980: ổ dịch báo cáo với trung tâm kiểm soát dịch bệnh, bao gồm thực phẩm thịt bò, gà tây … Năm 1981: ổ dịch báo cáo chủ yếu liên quan đến gạo, nhiều vụ dịch khác khơng báo cáo bị chẩn đốn sai triệu chứng tương tự nhiễm độc Staphylococcus aureus (B.cereus loại gây nôn) C.perfringens (B.cereus loại tiêu chảy) [24] 1.1.2 Ở Việt Nam Việc đời cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm đánh dấu bước quan trọng công tác quản lý chăm sóc sức khỏe cho nhân dân bao gồm bệnh lây truyền qua đường thực phẩm Ngộ độc thực phẩm vấn đề quan tâm hàng đầu Việt Nam, theo ước tính Y tế, riêng năm 2001 có 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Ở nước ta theo báo cáo y tế, có khoảng 38 trung tâm y tế có khả kiểm nghiệm loài vi khuẩn này, khoảng 60% tỉnh thành có lực kiểm nghiệm [8] Từ năm 2001-2006, nước ghi nhận 5600000 ca tiêu chảy ngộ độc thực phẩm, có 84 ca tử vong Riêng tháng đầu năm ngoái ghi nhận 750.000 ca tiêu chảy có 12 ca tử vong Thực tế theo chuyên gia phải gấp 10 lần số công bố Đặc biệt năm vừa qua xảy nhiều vụ dịch ngộ độc thực phẩm Salmonella, Staphylococcus aureus, phần lớn xảy bếp ăn tập thể khu công nghiệp … Tuy nhiên, chưa có thống kê rõ ràng nguyên gây vụ ngộ độc thực phẩm Điều phản ánh đầu tư chưa mức nguồn lực công tác tra giám sát VSATTP đặc biệt vào phòng xét nghiệm thực phẩm hạn chế ảnh hưởng đến công tác bảo đảm VSATTP Mặc dù xảy nhiều vụ ngộ độc thực phẩm mà nguyên B.cereus chưa có cơng bố tình hình ngộ độc thực phẩm B.cereus gây Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu nhằm xác định thực trạng ô nhiễm vi khuẩn thực phẩm Các giám sát tình trạng nhiễm thực phẩm năm vừa qua chủ yếu tập trung vào việc đánh giá thực trạng ô nhiễm thực phẩm với E.coli, staphylococus, vibrio… Việt Nam quốc gia có khí hậu nóng ẩm điều tạo điều kiện thuận lợi cho B.cereus phát triển thực phẩm giải phóng độc tố, ý thức người dân chưa đầy đủ đặc biệt việc sử dụng nhiều sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm B.cereus không nhỏ Việt Nam 1.2 VÀI NÉT VỀ BACILLUS CEREUS 1.2.1 Các nghiên cứu B.cereus Trên giới Các vụ ngộ độc thực phẩm B.cereus gặp nước phát triển phát triển Thức ăn nhiễm độc B.cereus khái niệm phổ biến khắp giới Q trình nấu chín khơng tiêu diệt vi khuẩn B Cereus có khả tạo thành dạng bào tử để tự vệ, ăn sau nấu bào tử khơng có hội phục hồi, điều kiện bảo quản không sau nấu bào tử nảy mầm, tạo thành tế bào sinh dưỡng nhân lên Đặc biệt cơm nhiễm B.cereus khơng có biểu khác thường mùi vị, màu sắc nên nhận biết, nhiều trường hợp ngộ độc cơm nguội lại lại nghĩ đến nguyên nhân ngộ độc loại thức ăn khác B Cereus có khả sản sinh nhanh phát triển nhiều loại thực phẩm khác như: rau sống, giá đỗ, bơ sữa [44] Đây mối lo ngại vệ sinh, an toàn thực phẩm cho nhiều quốc gia giới Vì việc nghiên cứu dịch tễ, chế bệnh sinh, độc tố B.cereus ngày trọng B.cereus lần Frankland phân lập mô tả năm 1887 Tuy nhiên, tận năm 1950, vi khuẩn Hauge cộng chứng minh nguyên gây vụ dịch ngộ độc thức ăn Các vụ dịch ngộ độc thức ăn B.cereus với đặc điểm nôn tiêu chảy [18] Để khẳng định B.cereus nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106/ml uống 200ml cocktail Sau 13h, ông cảm thấy đau bụng tiêu nhiều nước, triệu chứng dai dẳng khoảng 8h Hơn 20 năm sau, triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác chủng B cereus gây lại xuất công nhân người Anh Triệu chứng nặng triệu chứng nôn mửa kéo dài thời gian ngắn (chưa đến 5h), điều cho thấy nhiễm độc Việt Nam: Ở nước ta theo báo cáo từ y tế, có khoảng 38 trung tâm y tế có khả kiểm nghiệm lồi vi khuẩn này, khoảng 60% tỉnh thành có lực kiểm nghiệm Tuy nhiên phương pháp xét nghiệm dựa phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với xét nghiệm hóa sinh khác Phương pháp có nhược điểm thời gian lâu, nhiều ngày vài tuần, độ xác khơng cao khơng có khả động Kỹ thuật ELISA sử dụng để phát độc tố thực phẩm, nhiên qui trình tương đồi phức tạp phải có cán kinh nghiệm đào tạo thực được, kỹ thuật chưa áp dụng Việt Nam [13] Tại Việt Nam, có Trần Linh Thước CS ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xét nghiệm số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm như: E.coli, E.coli 0157 :H7, Salmonella spp, Shigella spp, V.cholerae, V.parahaemolyticus, C.perfringens, B.cereus, S.aureus, Listeria monocytocytes Campylobacter spp Trong nghiên cứu này, tác giả chọn gen gyr B để phát B.cereus thực phẩm cho kết phát tương đương với kết phương pháp nuôi cấy [8] Tuy nhiên, kỹ thuật nghiên cứu phát tồn B.cereus thực phẩm mà phát chủng vi khuẩn liệu có mang độc tố hay khơng 1.2.2 Một số hình ảnh Bacillus cereus Bacillus cereus kính hiển vi Khuẩn lạc Bacillus cereus môi trường thạch máu cừu 1.2.3 Đặc tính sinh học B.cereus B.cereus trực khuẩn kỵ khí, gram dương, rộng khoảng μm, dài khoảng 3-4μm, có khả sinh nha bào, bào tử dạng hình ovan sống sót xử lý nhiệt hóa chất [11], chúng có khả thích nghi với loạt điều kiện mơi trường, phân phối rộng rãi tự nhiên bụi, đất, loài động vật khác nhau, thường thấy hạt ngũ cốc, gạo, bột thực phẩm khơ lẫn lộn chung với gạo, mì, khoai, ngơ bị nhiễm từ đất q trình trồng trọt thu hoạch [32] Đặc điểm nuôi cấy: • Là loại vi khuẩn dễ mọc môi trường ni cấy vi khuẩn thơng thường • Tăng trưởng khoảng nhiệt độ 5-500C, tối ưu 35-400C • pH 4,5-9,3, thích hợp pH 7-7,2 • Trên mơi trường LB lỏng: đục • Trên mơi trường thạch MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin) môi trường thạch Mossel (cereus selective agar) vi khuẩn B cereus mọc tạo thành dạng khuẩn lạc có màu hồng phấn chung quanh có vịng sáng Tính chất sinh hóa: • Trên mơi trường đường: lên men glucose điều kiện hiếu khí kị khí, • Khử nitrat thành nitrit • Phân giải Tyroxin • Catalase (+), Citrate (+) Theo phân loại quốc tế B.cereus : • Ngành (phylum) firmicutes • Thuộc giới bacteria • Lớp (class) bacilli • Bộ (order) Bacillales • Họ (family) Bacillaceaem • Chi (genius) Bacillus • Lồi (species) Cereus Độc tố B.cereus : B.cereus gây bệnh sinh độc tố, B.cereus gây ngộ độc thức ăn sinh loại độc tố bao gồm [18].: Độc tố ly giải hồng cầu (Hbl), có khoảng 60% số chủng B.cereus và xem yếu tố gây độc B.cereus chế hoạt động nội độc tố chưa biết rõ Độc tố gây ly giải hồng cầu có thành phần protein B, L1, L2, protein mã hóa bởi gen nheA, nheB, nheC Độc tố ruột không ly giải hồng cầu (Nhe) độc tố có chất protein thành phần hầu hết chủng B.cereus sinh ra, với thành phần tương tự Hbl ; Độc tố khơng gây ly giải hồng cầu BL có protein liên kết B mã hóa gen hblA, protein ly giải L1 L2 mã hóa gen hblC hblD Tất hoạt động Hbl cần loại protein Độc tố T(BceT): độc tố có hoạt động sinh học tương tự Nhe có chất protein thành phần Độc tố FM (EntFM) độc tố có chất protein thành phần với vai trò đặc tính chưa biết đến Nội độc tố K (CytK), loại độc tố giống độc tố beta vi khuẩn Clostridium perfring CytK gần phát khoảng 85% số chủng B.cereus. Độc tố gây nơn (Emetictoxin) Độc tố có tên cereulide hình thành trước thực phẩm, nguyên nhân hội chứng nơn, chất dodecadepsipeptide có vòng acid amin với phân tử lượng 1,2 kDa và/ oxy acid [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] lặp lặp lại lần, bền với nhiệt, pH phân giải protein: hoạt động nhiệt độ 121 0C, có khả chịu điều kiện axit, độc tố gây nôn phát triển tốt thức ăn từ cơm, khoai tây nghiền, thực phẩm có nhiều tinh bột rau [9 ; 32], ... tài ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình phát gen độc tố B cereus thực phẩm kỹ thuật multiplex PCR” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Nghiên cứu xây dựng quy trình phát gen độc tố B cereus kỹ thuật Multiplex- PCR quy. .. sử dụng phương pháp Multiplex- PCR để xác định giới hạn lượng B .cereus phát số loại thực phẩm Nghiên cứu xây dựng qui trình phát gen độc tố ruột B .cereus thực phẩm kỹ thuật multiplex PCR vấn đề... spp Trong nghiên cứu này, tác giả chọn gen gyr B để phát B .cereus thực phẩm cho kết phát tương đương với kết phương pháp nuôi cấy [8] Tuy nhiên, kỹ thuật nghiên cứu phát tồn B .cereus thực phẩm