Xây dựng quy trình khuếch Đại chọn lọc hbv rna trong mẫu huyết tương nhằm Đánh giá biến Động tải lượng hbv rna Ở bệnh nhân viêm gan mạn tính

Xây dựng quy trình khuếch Đại chọn lọc hbv rna trong mẫu huyết tương nhằm Đánh giá biến Động tải lượng hbv rna Ở bệnh nhân viêm gan mạn tính

V

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ NGUYỄN QUỲNH ANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI CHỌN LỌC HBV RNA TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NHẰM ĐÁNH GIÁ BIẾN ĐỘNG TẢI LƯỢNG HBV RNA Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN MẠN TÍNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Vũ Nguyễn Quỳnh Anh

XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI CHỌN LỌC HBV RNA TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NHẰM ĐÁNH GIÁ BIẾN ĐỘNG TẢI LƯỢNG HBV RNA Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN MẠN TÍNH

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Hồ Hữu Thọ, Học viện Quân y – Bộ Quốc phòng

TS Trần Đức Long, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

Hà Nội – Năm 2022

Bên cạnh đó, tôi thực sự biết ơn TS Trần Đức Long vì sự hỗ trợ tận tình của thầy trong suốt quá trình thực hiện luận văn cũng như thời gian học Thạc sĩ tại trường Đại học Khoa học tự nhiên Cảm ơn thầy vì đã luôn nhắc nhở từ những kiến thức khoa học cũng như những bài học trong cuộc sống Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới tất cả các Thầy Cô trong Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và toàn thể các Thầy Cô trong Bộ môn Di truyền nói riêng

vì đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại đây

Xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến một số các thành viên Phòng Công nghệ Gen

và Di truyền Tế bào đã giúp tôi có những ý tưởng hữu ích, sự khuyến khích và hỗ trợ

từ tất cả các thành viên trong quá trình thực hiện thí nghiệm cũng như góp ý về nội dung Luận văn của tôi

Hơn hết, tôi xin gửi lòng biết ơn chân thành của tôi vì tình yêu thương, sự quan tâm và sự cổ vũ không giới hạn đến từ gia đình tôi Tôi vô cùng biết ơn bà, bố và mẹ

vì tình yêu, sự quan tâm và hỗ trợ mà họ đã dành cho tôi Cảm ơn em trai tôi, và những người bạn thân thiết đã luôn là chỗ dựa tinh thần cho tôi lúc khó khăn Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người vì đã yêu thương và bao dung tôi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan viêm gan B mạn tính 3

1.1.1 Dịch tễ học 3

1.1.2 Chẩn đoán viêm gan B mạn tính 4

1.1.3 Điều trị viêm gan B mạn tính và những thách thức 6

1.2 Đặc điểm sinh học của virus viêm gan B 7

1.2.1 Phân loại học 7

1.2.2 Cấu trúc của hạt virus HBV 8

1.2.3 Cấu trúc của hệ gen virus 10

1.2.4 Chu trình nhân lên của virus 11

1.2.5 Đường lây nhiễm của virus HBV 17

1.3 Ý nghĩa dấu ấn phân tử HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT 17 1.3.1 Phát hiện dấu ấn phân tử HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT 17

1.3.2 Nguồn gốc của HBV RNA huyết tương 19

1.3.3 Ý nghĩa của dấu ấn HBV RNA huyết tương 20

1.3.4 Các nghiên cứu trên thế giới về HBV RNA 21

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu, vật liệu và hóa chất nghiên cứu 23

2.1.1 Đối tượng tham gia nghiên cứu 23

2.1.2 Vật liệu, hóa chất 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26

2.2.2 Phương pháp thu thập, bảo quản và tách chiết mẫu 26

2.2.3 Thiết kế trình tự primer và probe cho quy trình định lượng HBV RNA 27 2.2.4 Tổng hợp chứng dương HBV RNA in-vitro 28

2.2.5 Quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA huyết tương 29

2.2.6 Phân tích, xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA 31

3.1.1 Tối ưu nồng độ mồi 31

3.1.2 Tối ưu nồng độ probe 32

3.1.3 Tối ưu nồng độ chất phụ gia 33

3.1.4 Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược 34

3.1.5 Tối ưu thời gian bước phiên mã ngược 36

3.1.6 Tối ưu thể tích mẫu 37

3.2 Thiết lập quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA 38

3.2.1 Quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA tối ưu 38

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn quy trình RT-qPCR định lượng chọn lọc HBV RNA ……… 40

3.2.3 Xác định ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu lâm sàng của quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA 41

3.3 Đánh giá cặp mồi định lượng HBV RNA 43

3.4 Phân tích biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân VGBMT 45 3.4.1 Mô tả đặc điểm của các nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 45

3.4.2 Biến động tải lượng HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân ở các thời điểm điều trị khác nhau 47

3.4.3 Biến động tải lượng HBV RNA liên quan đến HBeAg ở các thời điểm điều trị khác nhau 52 3.4.4 Biến động tải lượng HBV RNA liên quan đến thanh thải HBeAg ở tháng thứ 6 ở các thời điểm điều trị khác nhau 58 KẾT LUẬN 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

3 ER Endoplasmic Reticulum – Mạng lưới nội chất

4 HBeAg Hepatitis B envelope Antigen – Kháng nguyên e

7 HBV Hepatis B Virus – Virus viêm gan B

8 HBsAg Hepatitis B surface Antigen – Kháng nguyên bề

mặt của HBV

11 RT-qPCR Reverse Transcription Realtime - quantitative

Polymerase Chain Reaction

12 rcDNA Relaxed circular DNA – DNA dạng vòng không

kín

13 pgRNA Pre-genomic RNA – RNA tiền hệ gen

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [89] 8

Hình 2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của HBV [46] 11

Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [38] 16

Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [38] 16

Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu 26

Hình 6: Mô tả khả năng chọn lọc của cặp mồi thiết kế 28

Hình 7: Kết quả tối ưu nồng độ mồi 31

Hình 8: Kết quả tối ưu nồng độ probe 32

Hình 9: Kết quả tối ưu nồng độ hai chất phụ gia là Mg2+ 33

Hình 10: Nhiệt độ bước phiên mã ngược 50oC 35

Hình 11: Nhiệt độ bước phiên mã ngược 55oC 35

Hình 12: Thời gian phiên mã ngược 15 phút 37

Hình 13: Kết quả tối ưu thể tích mẫu 38

Hình 14: Kết quả thiết lập bộ mẫu chuẩn đánh giá Realtime RT-PCR 40

Hình 15: Kết quả xây dựng đường chuẩn từ bộ mẫu chuẩn 40

Hình 16: Tải lượng HBV RNA ở nhóm chứng 42

Hình 17: Đánh giá khả năng “chọn lọc” của cặp mồi định lượng HBV RNA 43

Hình 18: Biến động tỉ lệ dương tính HBV RNA ở thời điểm trước điều trị và đang điều trị 3 – 6 tháng 48

Hình 19: Nồng độ HBV RNA ở thời điểm trước điều trị (logRNA0), sau điều trị 3 tháng (logRNA3) và sau 6 tháng (logRNA6) (P0-3 = 0.0019, P0-6 = 0.0001 < 0.05, P3-6 = 0.3176 > 0.05 (2)) 49

Hình 20: Biến động tỉ lệ dương tính của HBV RNA liên quan đến HBeAg ở các thời điểm điều trị khác nhau 55

Hình 21: Tỉ lệ dương tính của HBV RNA ở nhóm có thanh thải HBeAg (a) và không thanh thải HBeAg (b) qua các thời điểm khác nhau 60

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các dấu ấn virus học trong chẩn đoán viêm gan B mạn tính 5 Bảng 2: Máy móc, trang thiết bị 25 Bảng 3: Hóa chất nghiên cứu 25

Bảng 4: Các thành phần của phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạnLỗi! Thẻ

đánh dấu không được xác định

Bảng 5: Các thành phần phản ứng phiên mã RNALỗi! Thẻ đánh dấu không

được xác định

Bảng 6: Thành phần phản ứng RT-qPCR tối ưu 39 Bảng 7: Chu trình luân nhiệt tối ưu 39 Bảng 8: Kết quả đánh giá quy trình định lượng chọn lọc trên dải nồng độ 104 – 5

bản sao/µL trong 10 lần chạy 41 Bảng 9: Đặc điểm của các nhóm bệnh nhân VGBMT tham gia nghiên cứu 45 Bảng 10: Tỉ lệ dương tính của HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân ở thời điểm trước

điều trị và đang điều trị 3 – 6 tháng 48 Bảng 11: Tốc độ suy giảm nồng độ HBV RNA trong 6 tháng 50 Bảng 12: Tốc độ suy giảm nồng độ HBV DNA trong 6 tháng 51 Bảng 13: Tỉ lệ dương tính của HBV RNA ở hai nhóm HBeAg dương tính và âm

tính qua các thời điểm khác nhau 53 Bảng 14: Nồng độ HBV RNA ở hai nhóm HBeAg dương tính (HBeAg (+)) và

HBeAg âm tính (HbeAg(-)) ở các thời điểm điều trị khác nhau 56 Bảng 15: Tốc độ suy giảm nồng độ HBV RNA trong 6 tháng ở nhóm HBeAg

dương tính 57 Bảng 16 : Tốc độ suy giảm nồng độ HBV RNA trong 6 tháng ở nhóm HBeAg âm

tính 57 Bảng 17: Tỉ lệ dương tính của HBV RNA ở nhóm có thanh thải HBeAg (a) và

không thanh thải HBeAg (b) qua các thời điểm khác nhau 59 Bảng 18: Nồng độ của HBV RNA ở nhóm có thanh thải HBeAg (a) và không thanh

thải HBeAg (b) qua các thời điểm khác nhau 60 Bảng 19: Tốc độ suy giảm nồng độ HBV RNA ở nhóm bệnh nhân thanh thải

HBeAg (a) qua các thời điểm nghiên cứu 63

Bảng 20: Tốc độ suy giảm nồng độ HBV RNA ở nhóm bệnh nhân không thanh

thải HBeAg (b) qua các thời điểm nghiên cứu 64

NA (như lamivudine) trong một khoảng thời gian dài có thể dẫn đến các đột biến kháng thuốc và một số nguy cơ nghiêm trọng khác liên quan tới gan [122] Chính vì vậy, việc đánh giá được nồng độ của cccDNA ở các bệnh nhân có sử dụng dụng các thuốc kháng virus đồng đẳng nucleot(s)ide (nucleot(s)ide analogues - NA) như entecavir (ETV) và tenofovir là vô cùng quan trọng trong xác định thời điểm dừng điều trị cũng như đánh giá được hiệu quả của quá trình điều trị Tuy nhiên, việc đánh giá cccDNA lại yêu cầu phải sử dụng các mẫu mô sinh thiết, gây khó khăn trong quá trình đánh giá lâm sàng

Vai trò của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp tạo ra các DNA của virion [62] Do đó, nồng độ và hoạt động phiên mã của cccDNA trong gan

sẽ được phản ánh bởi nồng độ RNA của HBV (HBV RNA) Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm viêm gan B, HBV RNA là một dấu ấn sinh học mới đầy hứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân VGBMT [39, 76, 87] Tuy nhiên ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều những nghiên cứu liên quan đến HBV RNA Dù đã có những báo cáo ban đầu về quy trình định lượng HBV RNA, tuy nhiên quá trình đó vẫn cần sử dụng DNase trong quá trình tách chiết RNA để loại bỏ hoàn toàn sự có mặt của DNA và quá trình này vừa kéo

dài thời gian xử lý mẫu cũng như có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng của RNA Chính vì thế, nghiên cứu này đã được thực hiện với hai mục đích như sau:

1 Nghiên cứu thiết lập quy trình định lượng chọn lọc HBV RNA trong máu ngoại vi của bệnh nhân VGBMT

2 Tiến hành đánh giá biến động tải lượng virus ở các nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở các thời điểm lấy mẫu khác nhau

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan viêm gan B mạn tính

1.1.1 Dịch tễ học

Hiện nay trên thế giới ước tính có khoảng hai tỷ người đã từng nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV) [14], trong đó có khoảng 296 triệu người nhiễm viêm gan B mạn tính (VGBMT) (theo Tổ chức Y tế thế giới WHO) Tỷ lệ dương tính với HBsAg theo báo cáo là 3,6%, tuy nhiên tỷ lệ này có thể thay đổi tùy thuộc vào từng khu vực địa lý khác nhau, với tỉ lệ nhiễm ở khu vực có mức lưu hành thấp là 2%

và khu vực có mức lưu hành cao có thể lên đến 8% [69, 82] Các khu vực có tỉ lệ lưu hành thấp (dưới 2%) phân bố ở các các khu vực như Bắc Mỹ và Tây Âu; các nước có

tỷ lệ trung bình (2-7%) như các nước ở Địa Trung Hải, Đông Âu, Trung Á, Trung Đông và một vài nước Nam Mĩ; và các nước có tỷ lệ cao (trên 8%) là các nước ở Tây Phi, Nam Sudan và Đông Á [70, 83, 119] Tuy nhiên hiện tại tỉ lệ nhiễm đang giảm dần ở một vài quốc gia có tỉ lệ lưu hành cao nhờ cải thiện tình trạng kinh tế xã hội, các chương trình tiêm chủng phổ cập và phần nào đó là phác đồ điều trị kháng virus hiệu quả [11] Đồng thời, sự tăng trưởng của dân số cũng như vấn đề di cư cũng đang góp phần ảnh hưởng đến sự thay đổi tỉ lệ nhiễm ở một số các quốc gia được ghi nhận

có tỉ lệ lưu hành thấp như một vài quốc gia ở Châu Âu (như Ý, Đức), do tỷ lệ lưu hành HBsAg ở người di cư và tị nạn từ bên ngoài châu Âu cao hơn so với dân số bản địa [8, 26] Ngay cả với các quốc gia đã có chương trình tiêm chủng phổ cập cũng không thể ngăn ngừa đáng kể các trường hợp nhiễm HBV cấp tính, đặc biệt là ở những nhóm dân số có nguy cơ cao [33, 68] Số ca tử vong liên quan đến xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) tiến triển từ viêm gan B mạn tính tăng 33% trong giai đoạn 1990 - 2013, liên quan đến hơn 686.000 trường hợp trong năm 2013 trên toàn thế giới [85]

Sự khác biệt dẫn đến tỷ lệ nhiễm viêm gan B mạn tính khác nhau ở từng khu vực trên thế giới phần lớn liên quan đến độ tuổi có mối tương quan nghịch với nguy

cơ tiến triển thành mạn tính Tỷ lệ tiến triển từ nhiễm HBV cấp tính sang mạn tính là

khoảng 90% đối với trường hợp nhiễm khi còn trong thai kỳ của người mẹ [86], khoảng từ 20 - 50% cho trẻ em từ 1 đến 5 tuổi [91, 108] và nhỏ hơn 5% ở giai đoạn trưởng thành [91]

Việt Nam cũng được xếp vào nhóm các quốc gia có tỉ lệ nhiễm virus viêm gan

B cao nhất thế giới với tỉ lệ nhiễm trong dân số là từ 10 – 20% Tỉ lệ này có thể lên đến 31 – 54% ở những khu vực có nguy cơ cao [22] Các nghiên cứu mô hình đã dự đoán đến năm 2025, nước ta sẽ có khoảng 8 triệu trường hợp nhiễm viêm gan B mạn tính và khoảng 58.600 ca ung thư gan có liên quan đến HBV, và ước tính tỉ lệ tử vong hàng năm liên quan đến HBV là 40.000 ca/năm vào năm 2025 [66] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu trong nước cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV hiện tại thay đổi từ 10% đến 20% trong dân số nói chung và 20% đến 40% trong nhóm người từng có tiền sử sử dụng ma túy, người nhiễm HIV Tỷ lệ HBsAg dương tính ở những người hiến máu tình nguyện cũng tương tự như trong dân số nói chung từ 11,5 – 18,2% [65] Tỷ lệ mắc VGBMT cao cả ở khu vực nông thôn và thành phố, với tỷ lệ ước tính 10% ở thành phố Hồ Chí Minh [98], cao từ 17,6 % tới 19% ở một số khu vực nông thôn [64, 67] Tỷ lệ nhiễm HBV cũng thay đổi theo lứa tuổi, nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ này cao nhất ở những người 30 - 39 tuổi ở cả hai giới (19,3% ở nam và 14% ở nữ), tiếp đến là nhóm tuổi từ 40 - 49 tuổi với 18,6% nam giới và 13,4% nữ giới nhiễm HBV [65] Đến nay, nhiễm HBV mạn tính vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh lý gan ở Việt Nam với 42 - 50% bệnh nhân viêm gan virus, 47,8 – 87,6% tiến triển xơ gan và 34,8 - 80% tiến triển thành ung thư biểu mô tế bào gan [65]

1.1.2 Chẩn đoán viêm gan B mạn tính

Việc chẩn đoán nhiễm viêm gan B mạn tính sẽ được dựa trên nhiều yếu tố như: đặc điểm sinh hóa, virus học và mô học của nó cùng với việc loại trừ các nguyên nhân khác như HCV Các xét nghiệm chức năng gan định kỳ và xét nghiệm huyết thanh

để phát hiện kháng nguyên HBV (HBsAg và HBeAg) và kháng thể (HBs, HBc và anti-HBe) nên được thực hiện thường quy để đánh giá giai đoạn của bệnh viêm gan B mạn tính Có thể theo dõi nồng độ HBV DNA trong huyết thanh để xác

anti-định tiến triển bệnh và hiệu quả của liệu pháp kháng virus và xác anti-định đáp ứng với điều trị Sinh thiết gan là điều cần thiết để xác định chẩn đoán giai đoạn xơ hóa và phân loại tình trạng viêm hoại tử của gan [54].

Bảng 1: Các dấu ấn virus học trong chẩn đoán viêm gan B mạn tính [3]

Đánh gicá khả năng miễn dịch

HBeAg Kháng nguyên vỏ virus Đánh giá khả năng hoạt động của

virus HBV HBeAb Kháng thể đặc hiệu kháng

HBeAg

Đánh giá khả năng hoạt động của virus HBV và đánh giá sự chuyển đảo huyết thanh ở bệnh nhân đang điều trị

HBcAg Kháng nguyên lõi virus HBcAg là kháng nguyên chỉ hiện

diện trong tế bào gan bị nhiễm, không tìm thấy trong huyết thanh HBcAb IgM Kháng thể kháng lõi virus

typ IgM

Là kháng thể xuất hiện và gia tăng nồng độ rất nhanh trong giai đoạn viêm gan B cấp tính hoặc đợt cấp của viêm gan B mạn tính Sau giai đoạn cấp, nồng độ kháng thể này trong máu sẽ giảm dần HBcAb IgG Kháng thể kháng lõi virus

cũng như đánh giá tiêu chuẩn dừng điều trị

Theo Quyết định số 3310/QĐ-BYT ngày 29 tháng 7 năm 2019 của Bộ trưởng

Bộ Y tế ban hành về vấn đề chẩn đoán và điều trị viêm gan virus B đã có hướng dẫn

về chẩn đoán viêm gan B mạn tính được xác định bởi một trong hai điều kiện: (1) HBsAg và/ hoặc HBV DNA dương tính ≥ 6 tháng, hoặc (2) HBsAg dương tính và anti-HBc IgM âm tính

Việc chẩn đoán chính xác viêm gan B mạn tính là vô cùng quan trọng và có ảnh hưởng đến quá trình theo dõi cũng như tiên lượng điều trị ở bệnh nhân

1.1.3 Điều trị viêm gan B mạn tính và những thách thức

Mục đích chính trong quá trình điều trị viêm gan B mạn tính đó chính là ức chế quá trình nhân lên của virus HBV, cải thiện tình trạng của gan và ngăn ngừa diễn tiến xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) Những dòng thuốc điều trị hiện nay được chấp nhận bao gồm interferon-α (IFN-α) (10 mg/ngày), lamivudine (10 mg/ngày) và adefovir (10 mg/ngày) Đáp ứng điều trị được xác định là khi không phát hiện nồng độ HBV DNA trong huyết tương, HBeAg âm tính kéo dài có hoặc không có anti-HBe (chuyển đảo huyết thanh HBeAg) và cải thiện tình trạng gan, đưa các chỉ số men gan về giá trị bình thường, giảm quá trình hoại tử gan và xơ gan [16]

trưởng Bộ Y tế ban hành về vấn đề chẩn đoán và điều trị viêm gan virus B cũng đã chỉ dẫn nguyên tắc điều trị viêm gan B mạn tính bao gồm: (1) Lựa chọn ban đầu là các thuốc uống nucleot(s)ide analogues (thuốc đồng đẳng nucleot(s)ide – NA), chỉ dùng các phác đồ có pegylated interferon (Peg-IFN) với các trường hợp đặc biệt, (2) Điều trị với NA là quá trình điều trị lâu dài, có thể kéo dài suốt đời và (3) Tuân thủ điều trị

Thách thức trong quá trình quản lý và điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay chính là không có phương pháp có thể giúp chữa trị khỏi hoàn toàn do sự tồn tại dai dẳng của DNA vòng kín cộng hóa trị (closed circular convalent DNA – cccDNA) – một dạng genome DNA của virus tồn tại trong tế bào gan và là khuôn mẫu cho quá trình phiên mã các gen của virus Các loại thuốc kháng virus đang được áp dụng điều trị hiện nay đều chỉ có thể làm giảm tổn thương gan và ngăn ngừa các diễn tiến nghiêm trọng hơn của bệnh gan chứ không hoàn toàn loại bỏ cccDNA, nên viêm gan B mạn tính thường không được chữa khỏi hoàn toàn và bệnh nhân thường điều trị suốt đời [44] Tuy nhiên, quá trình điều trị thuốc kháng virus một thời gian dài có thể dẫn đến các vấn đề kháng thuốc Mặc dù quá trình chuyển đảo huyết thanh HBeAg cùng với

sự ức chế của HBV DNA được coi là một thời điểm dừng thuốc hợp lý, tuy nhiên tỷ

lệ tái phát cao (tỷ lệ 90%) Ngoài ra, quá trình thanh thải HBsAg được coi là thời điểm dừng thuốc lý tưởng về mức độ an toàn khi ngừng thuốc và cải thiện tiên lượng Tuy nhiên, tỉ lệ đạt thanh thải HBsAg thường thấp khi sử dụng thuốc điều trị đơn lẻ

và phác đồ điều trị cố định [113] Chính vì vậy, việc nghiên cứu một phác đồ điều trị

lý tưởng hoặc tìm ra những dấu ấn sinh học mới có thể xác định chính xác và hiệu quả thời điểm ngừng thuốc an toàn là vô cùng cần thiết trong quản lý và điều trị viêm gan B mạn tính

1.2 Đặc điểm sinh học của virus viêm gan B

1.2.1 Phân loại học

Hepatitis B virus (HBV) là virus thuộc họ Hepadnaviridae và có đặc tính phiên

mã ngược giống như các retrovirus khác

HBV bao gồm 8 kiểu gen (A-H) dựa trên sự khác biệt về trình tự lớn hơn 8%

và không vượt quá 17% [52, 92] Các kiểu gen này có sự phân bố ở các khu vực địa

lý khác nhau, như tuýp A và D thường xuất hiện ở Châu Phi, Châu Âu và Ấn Độ; tuýp B và C thường phân bố ở Châu Á; tuýp E được tìm thấy ở Tây Phi, và tuýp F xuất hiện ở cả Trung và Nam Mỹ Sự phân bố của tuýp G và tuýp H vẫn chưa rõ ràng, nhưng đã có những báo cáo cho rằng hai tuýp này đã xuất hiện ở Trung Mĩ và Nam

Âu [40] Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng có sự xuất hiện của các tuýp virus mới, như tuýp I là tuýp có độ tương đồng lớn với tuýp C là tuýp được phát hiện ở một số nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào và Đông Ấn [99]; và tuýp J được phát hiện ở một người Nhật Bản sống ở Borneo, là dạng tái tổ hợp giữa tuýp C

và HBV ở vượn [92]

Theo như nghiên cứu của nhóm tác giả TTT Bui và CS đã kết luận kiểu gen B

và C là hai kiểu gen chiếm ưu thế ở Việt Nam trong số tất cả các ca nhiễm HBV Giữa hai kiểu gen B và C thì B4 và C1 lần lượt là những subgenotype chính ở Việt Nam [6] Subgenotype C1 được chứng minh là có độc tính cao hơn so với kiểu gen

B với nhiều biến chứng như xơ gan và tiến triển tình trạng ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) nhanh hơn, chuyển đảo HBeAg chậm hơn khoảng 10 năm, tỉ lệ đột biến cao hơn và đáp ứng điều trị kém hơn với IFN hay Peg-IFN [12] Tuy nhiên, giữa các subgenotype lại không có quá nhiều sự khác biệt trong đáp ứng điều trị với thuốc NA, chính vì vậy thuốc kháng virus NA được sử dụng rộng rãi trong điều trị VGBMT

1.2.2 Cấu trúc của hạt virus HBV

Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV (A) Tiểu thể hình cầu lớn (tiểu thể Dane);

(B) Tiểu thể hình cầu nhỏ; (C) Tiểu thể hình ống [89]

Các nghiên cứu đã cho thấy HBV tồn tại trong huyết tương của bệnh nhân dưới 3 loại tiểu thể khác nhau (Hình 1): tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm, tiểu thể hình ống (tubular particle) kích thước 22nm có chiều dài

40 - 400nm và tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Tiểu thể hình cầu lớn (hay còn gọi là tiểu thể Dane) (Hình 1A) là cấu trúc hạt virus viêm gan B hoàn chỉnh với đầy đủ chức năng Còn tiểu thể hình cầu nhỏ (Hình 1B) và hình ống (Hình 1C) có nguồn gốc từ vỏ ngoài của hạt virus với bản chất là các vật chất dư thừa sau quá trình tổng hợp virus Đây chính là kháng nguyên bề mặt hay còn được biết với tên gọi là HBsAg Các tiểu thể này có thể đứng riêng rẽ hoặc tập hợp với nhau và không có khả năng gây bệnh do không chứa hệ gen của virus [37]

Cấu trúc virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp:

- Lớp ngoài: Lớp này bao gồm ba loại protein bề mặt của virus HBV (HBs), được phân loại theo kích thước: lớn (LHB), trung bình (MHB) và nhỏ (SHB)

Ba protein bề mặt này hình thành các kiên kết disulfide giúp duy trì cấu trúc của lớp

vỏ virus

- Lớp lõi: Cấu trúc nucleocapsid của HBV chứa bộ gen của HBV với chiều dài khoảng 3.2 kilobase (kb) và là phân tử DNA có một phần cấu trúc sợi đôi dạng vòng (relaxed circular DNA - rcDNA) [2, 3] Nucleocapsid là một cấu trúc nhị thập diện đều được hình thành bởi 240 phân tử protein capsid của virus với đường kính khoảng 27 nm [3, 46] Trong tổng số 183 – 185 phân tử axit amin (tùy thuộc vào kiểu gen của virus), khoảng 149 – 151 axit amin ở đầu N chịu trách nhiệm lắp ráp nucleocapsid Các axit amin đầu C của protein lõi đóng vai trò trong việc đóng gói phức hợp RNA tiền hệ gen (pregenomic RNA – pgRNA) và polymerase trong nucleocapsid Quá trình phiên mã ngược tổng hợp DNA của virus cũng được thực hiện trong nucleocapsid với vật chất được đưa vào nhờ các lỗ trên cấu trúc nucleocapsid [5]

1.2.3 Cấu trúc của hệ gen virus

Một trong những đặc điểm độc đáo của hệ gen HBV đó chính là cấu trúc bất đối xứng giữa hai sợi, hay còn được gọi là hệ gen DNA sợi đôi không khép kín (relax circular DNA – rcDNA) Hệ gen DNA có chiều dài khoảng 3,2 kb, cấu trúc sợi đôi không hoàn chỉnh, dạng vòng mã hóa cho bốn khung đọc mở (open reading frame - ORF) xếp chồng lên nhau Cấu trúc xếp chồng lên nhau của các vùng mã hóa khiến cho virus có thể sử dụng hệ gen với hiệu suất lên đến 150% (Hình 2) [118] Khung đọc mở có cấu trúc lớn nhất mã hóa cho enzyme polymerase của virus là enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp sợi âm của hệ gen virus với đặc tính phiên

mã ngược Khung đọc mở có cấu trúc lớn thứ hai mã hóa cho ba protein cấu trúc vỏ của virus: lớn (L-), trung bình (M-) và nhỏ (S-) Một khung đọc mở khác mã hóa cho protein precore hay còn biết đến là kháng nguyên E của virus (HBeAg) và protein core là protein có vai trò trong hình thành cấu trúc capsid của virus Cuối cùng, khung đọc mở có cấu trúc nhỏ nhất mã hóa cho protein X (HBx) [96]

Mặc dù gen S và C nằm ở các ORF riêng tuy nhiên chúng vẫn có thể tổng hợp các sản phẩm gen có chức năng khác nhau, do các gen này có các bộ ba mã mở đầu khác nhau [13, 46] Các ORF S và C lần lượt kéo dài đến preS1 (preS1 và preS2) và vùng preC ở đầu 5’ Ở các vùng ORF xếp chồng lên nhau có sự xuất hiện của các gen điều hòa là 4 promoter (preC/C, preS1/S và X) và 2 trình tự tăng cường (enhancer), các gen này cho phép sự biểu hiện của 7 protein khác nhau được phiên mã từ các bộ

ba mã mở đầu khác nhau bởi ít nhất 5 mRNA khác nhau với đuôi tự do Sản phẩm phiên mã đầu tiên có chiều dài 0,7 kb mã hóa cho protein HBx; các sản phẩm phiên

mã có chiều dài 2,1 kb và 2,4 kb lần lượt mã hóa cho M- và S-HBsAg, L-HBsAg [13] Sản phẩm phiên mã mã hóa cho cả protein core và polymerase là pregenomic RNA (pgRNA) Pregenomic RNA là mạch khuôn cho quá trình tổng hợp virus HBV

và được phiên mã ngược để hình thành nên hệ gen DNA của HBV Như chúng ta đã biết hệ gen của virus có chiều dài 3,2 kb, và chiều dài của pgRNA là 3,5 kb, tức là dài hơn hệ gen của virus, đó chính là bản sao “dự phòng” của hệ gen virus [62, 84] Hai vùng gen với 11 bp lặp lại được gọi là DR1 và DR2 nằm ở đầu 5’ ở cả sợi âm và

sợi dương và hai gen này có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của DNA virus [15, 46] Hai trình tự tăng cường (enhancer) kí hiệu là Enh1 và Enh2, giúp tăng biểu hiện của các sản phẩm gen virus đặc hiệu với tế bào gan [46]

Vùng ORF S mã hóa cho các protein bề mặt của virus (HBsAg có cấu trúc được phân chia và phân hóa tại các vùng preS1, preS1 và S với 3 bộ ba mã mở đầu AUG khác nhau [80] Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein M

và L-HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [13, 15, 94]

Hình 2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của HBV [46]

1.2.4 Chu trình nhân lên của virus

a Hấp phụ

Quá trình hấp phụ là một quá trình quan trọng thể hiện rõ tính đặc trưng và biên độ của tế bào gan, được xác định bởi yêu cầu của các yếu tố phiên mã được làm giàu trong tế bào gan như đã nhắc đến ở phần trên và sự biểu hiện trong tế bào gan của người Domain preS1 của protein vỏ L là yếu tố chính trong liên kết với thụ thể

trên tế bào gan [114] Thụ thể được xác định có tên là NTCP (sodium taurocholate cotransporting polypeptide) [2] Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng NTCP vốn có vai trò vận chuyển muối mật trong cơ thể được biểu hiện chính ở trong gan, và một số các chất chuyển xuyên màng, còn là một thụ thể cho quá trình hấp phụ HBV vào tế bào gan Quá trình gây nhiễm của HBV có thể bị ức chế trong tế bào gan của người bằng cách làm NTCP trở nên “im lặng” [114] NTCP còn được biết đến với cái tên SLC10A1 (Solute carrier family 10A1) là một thành phần trong họ chất chuyển SLC10 [110] NTCP thường khu trú ở màng đáy của tế bào gan và có vai trò chính trong vận chuyển muối mật từ hệ tuần hoàn vào gan [110] L-HBsAg của virus liên kết đặc hiệu với thụ thể preS1 đặc hiệu với virus và bước này cần sự hoạt hóa của virus dẫn đến sự lộ ra đầu N-terminal của L-protein trên bề mặt virus [100] Vùng từ

aa thứ 2 đến aa thứ 48 của preS1 của protein L-HBs có vai trò chính trong quá trình phát triển nhiễm HBV [110, 114] Gần đây, FTL (ferritin light chain) và kháng nguyên 1 của ung thư biểu mô tế bào vảy (SCCA1) đã được xác định là các đồng thụ thể tham gia vào quá trình hấp phụ của HBV vào tế bào gan [15]

b Xâm nhập và loại bỏ vỏ virus

Virus HBV có thể xâm nhập vào tế bào chủ bằng nhiều cơ chế khác nhau, bằng

cả con đường nhập bào và hòa trộn màng tế bào của vỏ virus [100] Sau khi liên kết với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào, virrion sẽ xâm nhập vào tế bào gan nhờ các yếu tố của tế bào vật chủ bằng con đường nhập bào [15] Quá trình nhập bào của virus xảy ra thông qua trung gian Clathrin [28] Capsid của virus cũng sẽ xâm nhập vào tế bào chất khi vỏ virus hòa trộn với màng tế bào sau khi nhập bào [3, 100] Tuy nhiên, cơ chế loại bỏ vỏ virus và sự di chuyển của nucleocapsid đến lỗ nhân vẫn còn chưa được chứng minh Những yếu tố vận chuyển như importin alpha và beta và nucleoporin 153 sẽ đảm bảo cho việc nucleocapsid được chuyển đến nhân tế bào [75, 81] Sự phân tán của nucleocapsid dẫn tới sự giải phóng ra nhân sinh chất của rcDNA virus với polymerase được liên kết cộng hóa trị với rcDNA

c Quá trình phiên mã/dịch mã

Sau khi hệ gen rcDNA của virus được giải phóng vào nhân của tế bào gan, enzyme polymerase của virus sẽ bắt đầu tiến hành quá trình sửa chữa nhằm hoàn thành sợi dương chưa được tổng hợp đầy đủ của virus HBV Enzyme này nằm ở đầu 5’ sợi âm được sử dụng cho quá trình tổng hợp sợi dương Một đoạn RNA ngắn có chức năng như một đoạn mồi cũng là một thành phần tham gia vào quá trình tổng hợp sợi dương Hai thành phần này sau khi tổng hợp sẽ bị các enzyme của tế bào chủ loại

bỏ ví dụ như proteinase [100] Một khi quá trình tổng hợp sợi dương hoàn thành, nó

sẽ đi cùng với sợi âm và được liên kết bởi liên kết cộng hóa trị ở hai đầu và hình thành nên cấu trúc siêu xoắn dạng vòng [120] DNA này còn được gọi là cccDNA (closed convalent ciruclar DNA) Các phân tử cccDNA có chứa protein giống và không giống histone, và DNA có cấu trúc giống như các hạt có cấu trúc như chất nhiễm sắc xếp hàng trên một cái dây Chúng được gọi là các tiểu nhiễm sắc thể được

sử dụng làm khuôn cho quá trình phiên mã cho tất cả các mRNA của virus [13, 100]

Sự xuất hiện của cccDNA trong tế bào gan bị nhiễm giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì tình trạng mạn tính của nhiễm HBV hay sự tái phát của bệnh

Sau khi rcDNA được tổng hợp hoàn toàn và tồn tại trong nhân ở dạng cccDNA, cccDNA sẽ sử dụng tất cả cơ chế phiên mã của tế bào (enzyme RNA polymerase II)

để tạo ra các protein để thực hiện tất cả các quá trình cần thiết cho virus như sinh tổng hợp và nhân lên của hệ gen virus Quá trình phiên mã được điều hòa bởi các yếu tố phiên mã của tế bào vật chủ (CREB, STAT1, STAT2, ), enzyme biến đổi chất nhiễm sắc (PCAF, HDAC1, ), các yếu tố nhân của tế bào gan, và các yếu tố của virus như protein lõi, protein điều hòa X [100, 120] Các yếu tố này góp phần điều hòa biểu hiện gen của virus bằng cách tương tác với promoter của 4 vùng ORF chính trong hệ gen virus [100] Có một số báo cáo đã chỉ ra rằng quá trình phiên mã được điều hòa bởi các cơ chế biến đổi di truyền ngoại gen (epigenetic) như methyl hóa cccDNA, acetyl hóa histone, [120] Sau khi tổng hợp ra các sản phẩm phiên mã là các mRNA (cùng pgRNA) có chiều dài khác nhau, chúng sẽ được vận chuyển ra tế bào chất để dịch mã ra các protein cần thiết cho virus như đã miêu tả ở phần trên

Quá trình đóng gói pgRNA vào nucleocapsid là bước tiếp theo trong chu trình của virus và bao gồm một chuỗi các cơ chế sử dụng các tác nhân của cả virus và tế bào vật chủ Polymerase có ba vùng chức năng, mỗi vùng tương ứng với các chức năng liên kết với mồi của DNA, phiên mã ngược (rt) và phân hủy pgRNA (RNase H) Terminal protein được phân chia từ vùng rt bằng vùng đệm vẫn chưa rõ chức năng Polymerase liên kết với tín hiệu “ε” ở đầu 5’ của pgRNA, một cơ chế bao gồm

sự kích hoạt quá trình đóng gói của phức hợp được tạo thành bởi protein lõi Trình tự C-terminus của protein lõi, như được đề cập ở trên là vùng giàu arginine và phosphoryl hóa các aa, cũng liên quan đến quá trình liên kết của pgRNA do quá trình đóng gói được kích hoạt Protein lõi còn liên quan đến sự khởi đầu quá trình phiên

mã ngược, đóng gói nucleocapsid [121]

Bước tiếp theo là quá trình tổng hợp vật chất di truyền của virus được thực hiện trong nucleocapsid Cấu trúc “ε” có một cấu trúc đặc biệt giúp tổng hợp đoạn mồi bao gồm 4 nu [63], được liên kết cộng hóa trị với vùng TP của polymerase thông qua liên kết phosphodiester giữa dTTP và nhóm hydroxyl của aa tyrosine trên terminal protein (vị trí 63) [111, 123] Phức hợp mồi - polymerase sẽ được dịch chuyển đến đầu 5’ của pgRNA, nơi mà phức hợp này sẽ lai với vùng DR1 với trình

tự mồi tương đồng Quá trình dịch chuyển đến đúng vị trí, như trường hợp này DR1 nằm ở đầu 3’ của pgRNA, được hỗ trợ bởi hai thành phần ω và φ, hai thành phần này

sẽ tương tác với tín hiệu ε [90] Quá trình tổng hợp sợi âm được khởi đầu bằng quá

trình phiên mã ngược ở đầu 5’ của pgRNA, có đoạn thừa khoảng 10 nu Mạch khuôn RNA cùng lúc đó sẽ bị hoạt tính của RNase H phân hủy dần, ngoại trừ 11-16 nu cuối cùng sẽ được chuyển sang vùng DR1 của đầu 5’ của pgRNA Đoạn ribonucleic này

sẽ được sử dụng là đoạn mồi cho quá trình tổng hợp sợi dương cho hệ gen virus [25] Đoạn mồi này sẽ lai với trình tự tương đồng trên DR2 ở đầu 5’ của sợi âm mới tổng hợp và một quá trình chuyển dịch mới được diễn ra Sợi dương mới được tổng hợp

sẽ được tiếp tục cho đến đầu 5’ của sợi âm DNA Quá trình tổng hợp cả hai sợi DNA xảy ra trong nucleocapsid và quá trình này được tạo điều kiện bởi lỗ trên các capsid cho phép các nucleotide di chuyển vào trong Tuy nhiên, một khi nucleocapsid trưởng thành được nảy chồi qua màng ER, nguồn nucleotide trong capsid sẽ bị cạn kiệt và

để lại sợi dương có chiều dài không hoàn chỉnh, đó là nguyên nhân tạo nên hệ gen là DNA sợi đôi không hoàn chỉnh của virus HBV [61]

e Tạo hạt virus hoàn chỉnh

Nucleocapsid hoàn chỉnh là các nucleocapsid có chứa rcDNA với một phần sợi đôi mới được tổng hợp với enzyme polymerase gắn vào đầu 5’ của DNA sợi âm Sau khi hoàn thành, nucleocapsid này sẽ được di chuyển theo hai con đường Trước khi đạt được lượng HBsAg đủ để gây nhiễm, các nucleocapsid sẽ được đưa trở lại nhân để làm giàu lượng cccDNA có trong nhân [45, 72] Ở giai đoạn cuối của biến đổi hình thái, virion sẽ nảy chồi qua màng ER nơi protein HBsAg đã khu trú sẵn trong lumen [17] Một yếu tố quyết định của những quá trình này đó chính là sự biến đổi hình thái và sắp xếp lại cấu trúc của L-HBsAg Rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy một nửa protein này nằm ở phía trong tế bào chất của ER với đầu N-terminus, từ đó liên kết với nucleocapsid để nảy chồi L-HBsAg với đầu tận cùng nằm trong lumen cho phép protein này hiện diện trên bề mặt của virion và do đó virus có thể dễ dàng tiếp cận thụ thể NTCP trong quá trình xâm nhập vào tế bào gan [5]

f Quá trình giải phóng virus

Giả thiết cho rằng protein HBsAg tích tụ trong khoảng trung gian giữa ER - phức hệ Golgi, virion sẽ được tích tụ trong lumen và theo con đường bài tiết trong

suốt quá trình thoát ra của tế bào, giống như con đường mà các tiểu thể của virus được giải phóng Hiện nay, có một số báo cáo cho thấy virion sử dụng một con đường khác dựa trên các phân tử protein liên kết với các phức hệ nội bào có khả năng vận chuyển, là các thành phần giúp hình thành các đa nang trong cơ thể [109]

Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [38]

Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [38]

1.2.5 Đường lây nhiễm của virus HBV

Theo WHO, HBV có thể tồn tại bên ngoài cơ thể ít nhất 7 ngày Trong khoảng thời gian đó, virus vẫn có khả năng lây nhiễm nếu như virus có thể xâm nhập vào cơ thể của một người không được bảo vệ bởi vaccine Quá trình ủ bệnh của virus HBV trung bình khoảng 75 ngày, nhưng có thể nằm trong khoảng từ 30 đến 180 ngày Virus

có thể được phát hiện trong khoảng từ 30 đến 60 ngày sau khi bị nhiễm virus và có thể kéo dài dai dẳng và phát triển thành viêm gan B mạn tính

Ở các vùng có mật độ lây nhiễm cao, HBV thường có xu hướng lây truyền từ

mẹ sang con trong khoảng thời gian mang thai, hoặc qua truyền thẳng (lây nhiễm qua máu người mang virus), đặc biệt là từ trẻ nhiễm virus sang trẻ không nhiễm trong khoảng 5 năm đầu Sự phát triển của viêm gan B mạn ở trẻ sơ sinh thường là do người

mẹ truyền sang trong khoảng thời gian mang thai hoặc trong 5 năm đầu đời

HBV còn lan truyền qua da hoặc niêm mạc với máu của người bị nhiễm bệnh

và một số dịch cơ thể, ví dụ như nước bọt, kinh nguyệt, dịch âm đạo và tinh dịch Lây truyền qua đường tình dục cũng có thể xảy ra, đặc biệt là người nam chưa tiêm vaccine

có quan hệ tình dục với người đồng giới và khác giới với nhiều người Nhiễm HBV

ở người trưởng thành có ít hơn 5% là dẫn đến hình thành tình trạng viêm gan mạn tính Sự lây truyền của virus còn có thể xảy ra qua việc sử dụng lại kim và ống tiêm

ở các trung tâm chăm sóc sức khỏe Thêm vào đó, sự lây nhiễm có thể xảy ra trong quá trình phẫu thuật, chăm sóc sức khỏe hay nha khoa, thông qua xăm hình hoặc qua

sử dụng dao cạo hoặc những vật dụng tương tự có nhiễm với máu của người mang virus

1.3 Ý nghĩa dấu ấn phân tử HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT

1.3.1 Phát hiện dấu ấn phân tử HBV RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT

Khoảng hơn hai mươi năm trước, cùng với HBV DNA, HBV RNA đã được tìm thấy trong huyết tương của bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính [39] Một số nghiên

cứu gần đây cũng đã chứng minh có sự hiện diện phổ biến của HBV RNA trong máu ngoại vi của bệnh nhân nhiễm HBV [21, 116] Sau đó, tác giả Colucci và CS đã sử dụng phương pháp lai Southern blot và Hadchouel cùng CS sử dụng kỹ thuật lai tại chỗ (in-situ hybridization) đã phát hiện HBV RNA không chỉ có ở những bệnh nhân HBsAg dương tính mà còn có ở những bệnh nhân HBsAg âm tính [24], cho thấy tiềm năng của dấu ấn sinh học này trong quá trình đánh giá, tiên lượng hiệu quả điều trị ở bệnh nhân VGBMT Tuy nhiên, các phương pháp này chưa đủ độ nhạy để phát hiện các bản sao phiên mã ở những bệnh nhân bị nhiễm HBV với nồng độ thấp trong máu ngoại vi [24] Ngoài ra, cũng có một số báo cáo về việc phát hiện HBV RNA trong máu ngoại vi bằng kỹ thuật PCR, nhưng những báo cáo này thực hiện trên số lượng bệnh nhân không nhiều Do đó, mối quan hệ giữa HBV RNA trong máu ngoại vi và đặc điểm lâm sàng chưa được khảo sát ở những báo cáo trên

Những năm sau đó, nhóm tác giả Shi và CS đã sử dụng phương pháp Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) – phương pháp PCR kết hợp với bước phiên mã ngược để phát hiện HBV RNA lưu hành trong máu ngoại vi của bệnh nhân VGBMT [59] Kết quả là đã phát hiện được HBV RNA ở 19/57 (37,1%) bệnh nhân có HBsAg dương tính và 1/10 (10%) bệnh nhân có HBsAg âm tính, trong khi đó 6 bệnh nhân khỏe mạnh đều không xuất hiện sự có mặt của HBV RNA Tần

số của HBV RNA dương tính được phát hiện ở những bệnh nhân có mức ALT cao, HBeAg huyết thanh dương tính và mức độ HBV DNA ≥ 0,7 Meq/ml

Năm 2015, tác giả Louis và CS đã sử dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR có độ nhạy cao để phát hiện và định lượng nồng độ HBV RNA trong huyết tương của những bệnh nhân viêm gan B mạn tính [34] Kết quả là đã phát hiện được HBV RNA trong huyết tương của tất cả bệnh nhân viêm gan B mạn tính có HBeAg dương tính và HBeAg âm tính Thêm vào đó, đã có nhiều báo cáo cho thấy HBV RNA có thể được

sử dụng như một dấu ấn phân tử mới trong đánh giá điều trị VGBMT với NA và IFN [23, 30, 31, 34, 76, 101], dự đoán nguy cơ xảy ra đột biến YMDD ở các bệnh nhân điều trị với lamivudine [27], và là một dấu ấn hữu ích cho thấy khả năng ngừng điều trị NA [97, 104] HBV RNA đã được chứng minh là được bao bọc bởi vỏ capsid do

chúng có thể bị ức chế bởi các kháng thể đặc hiệu với protein lõi của HBV (HBcAg)

và nồng độ của HBV RNA có thể tăng lên sau khi loại bỏ lớp vỏ virus [34] Hơn nữa, việc sử dụng phương pháp lai Northern blot và khuếch đại nhanh đầu 5’ của cDNA,

Lu và CS [55] đã cho thấy HBV RNA tồn tại trong huyết tương bệnh nhân chính là pregenomic RNA (pgRNA) và tồn tại ở dạng giống virion [104]

1.3.2 Nguồn gốc của HBV RNA huyết tương

Nguồn gốc của HBV RNA tồn tại trong huyết thanh vẫn còn đang được làm

rõ Một vài báo cáo cho thấy rằng HBV RNA tồn tại trong huyết tương chính là RNA tiền hệ gen (pregenomic RNA - pgRNA), một phân tử đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của hệ gen virus HBV [34, 104] Giả thuyết được đưa ra là sẽ có một vài virion virus HBV được giải phóng ra máu ngoại vi có chứa hệ gen là RNA, gần tương tự như các retrovirus [17] Giả thuyết này được củng cố bởi sự tồn tại của các virion có hệ gen là ssDNA đã được xác định bởi một vài đột biến HBc [117] Hơn nữa, snow goose hepatitis B virus (SGHBV) cũng giải phóng các virion có chứa ssDNA [10], ngược lại với hầu hết các hepadnavirus đã được xác định do hai vùng đặc hiệu (74 và 107) trong protein lõi của SGHBV [20] Do đó, sự xuất hiện của các virion không trưởng thành có chứa ssDNA có thể xảy ra ở những hoàn cảnh xác định, cho thấy rằng khả năng virion là RNA có thể xuất hiện là hoàn toàn có thể dưới những điều kiện nhất định Mặt khác, vẫn còn khả năng HBV RNA được phát hiện ở huyết tương có thể là trình tự pgRNA tồn tại trong cấu trúc lai DNA sợi âm - pgRNA [17, 60] và nồng độ của chúng trong máu có thể tăng lên khi quá trình tổng hợp DNA bị suy giảm bởi các chất ức chế quá trình phiên mã ngược [93] Thêm vào đó, một lượng nhỏ capsid có thể đóng gói RNA của virus HBV hay của vật chủ một cách không đặc hiệu (và quá trình đóng gói thiếu đi protein RT) Những quá trình đóng gói RNA không đặc hiệu này có khả năng ngăn chặn tín hiệu ức chế được giả định gây ra bởi pgRNA tới điều hòa âm tính quá trình hình thành nucleocapsid và giải phóng virion Nghiên cứu của Hu và CS đã cho thấy sự suy giảm hoặc ức chế quá trình phosphoryl hóa của vùng đầu tận C (C-terminal domain - CTD) của HBc có thể dẫn đến sự đóng gói của RNA không đặc hiệu (hầu hết là các RNA nhỏ cỡ tRNA) bởi các capsid của

HBV trong tế bào gan, tương đồng với các RNA không đặc hiệu được đóng gói bởi các capsid của HBV không trải qua quá trình phosphoryl hóa ở vi khuẩn [57]

1.3.3 Ý nghĩa của dấu ấn HBV RNA huyết tương

Như đã nhắc đến ở trên, có rất nhiều nghiên cứu gần đây xoay quanh việc sử dụng HBV RNA huyết tương như một dấu ấn sinh học để theo dõi biến động của cccDNA trong gan Về mặt lý thuyết, việc giải phóng các virion có chứa RNA sẽ độc lập với quá trình tổng hợp DNA virus và có thể phản ánh biểu hiện của pgRNA, RNA được đóng gói vào nucleocapsid chưa trưởng thành, hoàn thành quá trình đóng gói

và được giải phóng ra ngoài tế bào Nhờ vào độ nhạy vượt trội trong quá trình phát hiện và định lượng RNA khi so sánh với HBcAg (virion rỗng), HBV RNA huyết tương có tiềm năng trở thành một dấu ấn sinh học để có thể theo dõi biến động nồng

độ cccDNA khi quá trình tổng hợp DNA của virus bị ức chế khi điều trị với các loại thuốc kháng virus [29] Đã có rất nhiều báo cáo cho thấy nồng độ HBV RNA huyết tương suy giảm ít hơn và chậm hơn nhiều so với HBV DNA huyết tương trong suốt quá trình điều trị với RT inhibitor [23, 30, 31, 34, 76, 101] Một sự suy giảm RNA nhanh xảy ra khi mới bắt đầu quá trình điều trị với quá trình ức chế RT có khả năng

dự đoán sự thanh thải virus [112], và ngược lại, sự dai dẳng của HBV RNA huyết tương sau khi ức chế RT có liên quan đến nguy cơ virus tái hoạt động sau quá trình ngừng điều trị [4] Bên cạnh đó, có một số báo cáo cho thấy quá trình điều trị IFN có thể gây ra sự suy giảm đáng kể của HBV RNA hơn là ức chế RT [34] Như đã nhắc đến ở trên, cần phải xác định rõ nguồn gốc của RNA virus cũng như là cấu trúc nào

đã mang RNA đến máu ngoại vi, để có thể nhìn nhận một cách chính xác và tin cậy hơn về ý nghĩa của HBV RNA huyết tương đối với sự biểu hiện và nhân lên của virus

và đáp ứng quá trình điều trị Nếu như HBV RNA huyết tương đại diện cho các virion chưa trưởng thành, nó có thể phản ánh được nồng độ của cccDNA trong gan Tuy nhiên, đã có nghiên cứu phát hiện một đoạn ngắn HBV RNA trong mẫu huyết tương

có vẻ như lại được phiên mã từ HBV DNA tích hợp với hệ gen người và có thể được giải phóng vào máu ngoại vi trong sự vắng mặt có bất kỳ một dấu ấn khác của virus,

có thể phản ánh thay thế cho một RNA không chức năng của một virus khác Như vậy, rõ ràng HBV RNA không thể phản ánh được nồng độ của cccDNA trong gan

hay hoạt động phiên mã xảy ra trong gan Ngoài ra, quyết định khi nào ngừng điều trị thuốc kháng virus vẫn đang là một vấn đề quan trọng trong điều trị viêm gan B mạn tính [120] Ước tính rằng quá trình điều trị hiện nay có thể kéo dài trung bình khoảng 52 năm, thậm chí khi không xuất hiện sự kháng thuốc, để có thể hoàn toàn loại bỏ HBsAg [112], “tiêu chuẩn vàng” hiện nay để đạt được khi điều trị nhiễm HBV

1.3.4 Các nghiên cứu trên thế giới về HBV RNA

Vào năm 1996, Kock và CS lần đầu tiên xác định được sự tồn tại của HBV RNA trong máu ngoại vi của bệnh nhân VGBMT bằng cách sử dụng phương pháp RACE (Rapid amplification of complementary DNA (cDNA)-ends) [39] Sau khi tách chiết HBV RNA từ huyết thanh bệnh nhân, một trình tự mồi đặc biệt bao gồm một đoạn oligo(dT) kéo dài và một trình tự đuôi nhân tạo độc nhất được sử dụng làm mồi để phiên mã ngược tạo cDNA Sau đó, cDNA sẽ được PCR sử dụng mồi xuôi đặc hiệu và mồi ngược có đoạn tương đồng với phần đuôi của mồi sử dụng để phiên

mã ngược [78] Phương pháp này sau đó cũng đã được áp dụng để phát hiện HBV RNA ở các bệnh nhân viêm cầu thận có liên quan đến HBV và các bệnh nhân VGBMT đang điều trị hoặc đã điều trị thành công [23, 42, 87] Phương pháp real-time PCR dựa trên RACE sử dụng cặp mồi đặc hiệu được thiết kế cho phiên mã ngược theo nghiên cứu của tác giả Kairat và CS [36], sau đó đã được phát triển thành phương pháp định lượng chọn lọc 3’ polyadenylated HBV RNA Bên cạnh RACE-qPCR, phương pháp RT-qPCR với các cặp mồi đặc hiệu HBV thiết kế dựa trên các trình tự vùng gen X, C và S của hệ gen HBV cũng được thiết lập để định lượng HBV RNA [34, 73, 76, 104] Tuy nhiên, để tránh nhiễm DNA trong quá trình RT-qPCR, trong quy trình thường phải có thêm một bước xử lý DNase I trong quá trình tách chiết Một số quy trình khác không xử lý với DNase I để loại bỏ HBV DNA mà tiến hành định lượng đồng thời HBV acid nucleic tổng số và HBV DNA, sau đó nồng độ HBV RNA sẽ là hiệu số của hai nồng độ trên [27, 31] Quy trình QuantiGene được phát triển bởi tác giả Lam và CS sử dụng probe đặc hiệu với HBV, được thiết kế lai với ORF X để có thể định lượng trực tiếp RNA mà không cần phải tổng hợp cDNA hay khuếch đại PCR [43] Gần đây, tác giả Butler và CS đã phát triển một phương pháp

xét nghiệm tự động công suất lớn để định lượng HBV RNA, trong đó HBV RNA được tách chiết sử dụng hóa chất tách chiết chọn lọc RNA (Abbott mSample Preparation System), tiếp theo mẫu sẽ được khuếch đại bởi quy trình multiplex RT-qPCR phát hiện thiết kế dựa trên vùng gen HBV X và vùng lõi thực hiện trên hệ thống m2000 (Abbott Molecular) [7] Để đánh giá thêm hiệu suất xét nghiệm tự động, nhóm tác giả đã tiến hành so sánh với phương pháp xét nghiệm flRNA và cho thấy sự tương quan tốt giữa hai phương pháp Hiện nay, các nghiên cứu mới nhất liên quan đến HBV RNA đều tập trung vào đánh giá ý nghĩa lâm sàng của HBV RNA trong đáp ứng điều trị và tái phát sau điều trị, theo đó phối hợp với các dấu ấn khác nhằm thiết lập phương pháp giúp điều trị hiệu quả VGBMT

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, vật liệu và hóa chất nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng tham gia nghiên cứu

Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu: Thông qua hội đồng y đức của nơi thực

hiện nghiên cứu và những cá nhân tham gia nghiên cứu về tiến trình làm việc, ý nghĩa lâm sàng kỳ vọng Những cá nhân và bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều được phỏng

vấn, giải thích về ý nghĩa của nghiên cứu và có sự đồng ý hợp tác bằng văn bản

a Số lượng

- Nhóm chứng người khoẻ mạnh (n = 50), tiến hành thu thập khi đối tượng đồng ý tham gia nghiên cứu và đạt các tiêu chuẩn lựa chọn do nhóm nghiên cứu đặt ra

- Nhóm bệnh nhân VGBMT đáp ứng các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ, được lấy mẫu vào thời điểm trước khi bắt đầu điều trị Các bệnh nhân đều được chẩn đoán và đánh giá tình trạng lâm sàng tại Khoa Truyền nhiễm, Bệnh viện Quân Y 103 Trong đó, một số bệnh nhân được tiếp tục theo dõi lấy mẫu sau khi bắt đầu điều trị 3 tháng và 6 tháng Cụ thể như sau:

+ Trước khi bắt đầu điều trị (n = 115)

+ Sau thời điểm bắt đầu điều trị 12 tuần (n = 49)

+ Sau thời điểm bắt đầu điều trị 24 tuần (n = 46)

b Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân VGBMT

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân VGBMT : bệnh nhân VGBMT được xác định theo tiêu chuẩn của Hiệp hội gan mật Mỹ - 2009 [53]:

+ HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti-HBcIgG (+)

+ HBV DNA ≥ 105 bản sao/mL ở nhóm HBeAg (+) và ≥ 104 bản sao/mL

ở nhóm HBeAg (-)

+ ALT tăng liên tục hay từng đợt

c Tiêu chuẩn chọn nhóm chứng

Nhóm chứng là những người khỏe mạnh bình thường, trong đó tiền sử của bản thân cũng như gia đình người khỏe mạnh tham gia nghiên cứu chưa từng mắc các bệnh liên quan đến HBV hay những vấn đề về gan khác, cũng không có tiền sử lạm dụng rượu bia hay các chất kích thích Các mẫu huyết tương của các mẫu chứng tham gia đều được kiểm tra định lượng HBV DNA ở Khoa Truyền nhiễm, bệnh viện 103 và đều cho kết quả âm tính Các đối tượng nghiên cứu thuộc nhóm chứng đều được khám lâm sàng và thực hiện các xét nghiệm lâm sàng và cận lâm sàng cùng các dấu ấn của virus viêm gan trước khi thu thập mẫu máu

d Tiêu chuẩn loại trừ

Loại trừ những bệnh nhân ra khỏi nhóm bệnh nhân nghiên cứu khi có các tình trạng sau:

+ Đồng nhiễm virus viêm gan khác hoặc HIV

+ Bệnh nhân có tổn thương gan do nguyên nhân khác: rượu, do thuốc, do hóa chất, do bệnh gan tự miễn

+ Bệnh nhân đang trong giai đoạn thai kỳ và đang cho con bú

+ Bệnh nhân mắc các bệnh kết hợp như đái tháo đường, viêm đường mật

+ Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

Chống chỉ định sinh thiết gan cho những bệnh nhân có tình trạng sau:

+ Tỷ lệ Prothrombin < 70 %

+ Tiểu cầu < 100 G/l

+ Bilirubin tăng cao

+ Nhiễm trùng vùng da định sinh thiết

+ Bệnh nhân mắc các bệnh gây chảy máu: Hemophillie, suy gan có rối loạn đông máu, các bệnh tiểu cầu, bệnh sốt xuất huyết

+ Bệnh nhân mắc các bệnh đang có viêm mủ cấp: viêm đường mật, áp xe đường mật

+ Bệnh toàn thân: tim, bệnh phổi như xơ phổi, giãn phổi, khí phế thũng + Phụ nữ mang thai

2.1.2 Vật liệu, hóa chất

Bảng 2: Máy móc, trang thiết bị

3 Tủ an toàn sinh học cấp 2 G-series ESCO

Bảng 3: Hóa chất nghiên cứu

1 Hóa chất dùng trong tách chiết RNA

2 Hóa chất dùng trong phản ứng realtime RT-PCR

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp thu thập, bảo quản và tách chiết mẫu

- Quy trình kỹ thuật lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi: Mẫu máu tĩnh mạch

ngoại vi với thể tích 5 ml/lần được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA Trong vòng 6 giờ sau khi lấy, mẫu máu được vận chuyển đến phòng xét nghiệm, tách huyết tương bằng ly tâm lạnh 1500 g trong thời gian 10 phút và chuyển sang tube eppendorf 1.5 ml Phần huyết cầu sẽ được bảo quản trong ngân hàng cho mục đích phân tích gen bổ sung khi cần thiết Mẫu huyết tương và huyết cầu được bảo quản ở

tủ âm -20°C đến khi phân tích Tuy rằng có rất nhiều báo cáo trên thế giới lựa chọn

cả mẫu huyết thanh và huyết tương, nhưng trong nghiên cứu này nhóm nghiên cứu lựa chọn mẫu huyết tương do lấy mẫu huyết tương có một số ưu điểm so với lấy mẫu huyết thanh như: tiết kiệm thời gian, tăng thể tích thu (thể tích huyết tương thu được

sẽ nhiều hơn huyết thanh), tránh ảnh hưởng gây ra bởi các hiện tượng đông máu

- Tách chiết RNA từ huyết tương: RNA tổng số được tách chiết bằng bộ

kit QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit (Qiagen, Đức) sử dụng quy trình theo

khuyến cáo của nhà sản xuất Thể tích huyết tương sử dụng là 500 µL và thể tích RNA thu được sau quá trình tách chiết là 50 µL Các mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được bảo quản ở -80oC

2.2.3 Thiết kế trình tự primer và probe cho quy trình định lượng HBV RNA

Trình tự HBV DNA đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen trên database GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) với mã số hiệu là V0086 Vùng gen được lựa chọn thiết kế primer và probe cho quy trình định lượng HBV RNA là vùng gen S sau quá trình đánh giá sơ lược về độ ổn định cũng như tính đa hình và đột biến Vùng gen S được đánh giá là vùng trình tự pgRNA ổn định, đặc hiệu Tuy nhiên, không phải tất

cả vùng S đều ổn định Do vậy, việc tiến hành khảo sát vùng trình tự ổn định nhất thuộc gen S trên đối tượng người Việt Nam được thực hiện Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy vùng trình tự đầu N-terminal là vùng bảo thủ nhất của gen S Ngoài ra, vùng này cần thiết cho sự lắp ráp và giải phóng các hạt virion trưởng thành, tương tác với kháng nguyên bề mặt [74] Do đó, vùng đầu N-terminal của gen S được lựa chọn làm vùng gen đích cho thiết kế mồi, probe trong phản ứng RT-qPCR định lượng HBV RNA

Xác định được vùng bảo tồn là vùng gen S (kích thước khoảng 1200 nu, vùng N-terminal là vùng bảo tồn hơn cả (đã chứng minh trên), vùng này được đánh dấu để thiết kế mồi, probe

Trọng tâm của quá trình xây dựng quy trình đó là việc quá trình định lượng HBV RNA sẽ không bao gồm việc phải xử lý DNase, nhằm tiết kiệm bước cũng như thời gian thực hiện, đồng thời bảo toàn tính nguyên vẹn cho RNA, nên việc thiết kế cặp mồi đóng vai trò rất quan trọng Tham khảo nghiên cứu của tác giả Wang và CS [104], cặp mồi bao gồm mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế, trong đó mồi ngược

sẽ thiết kế vùng bắt cặp đặc hiệu với HBV RNA với chiều dài khoảng 10 nucleotide

và một đoạn kéo dài gồm 5 nucleotide ngẫu nhiên ở đầu 5’ sẽ giúp tạo ra các sản

phẩm cDNA với các đoạn "đuôi" giúp đánh dấu sản phẩm phiên mã ngược từ HBV RNA, từ đó giúp cho quá trình định lượng chính xác nồng độ HBV RNA

Cặp primer (bao gồm mồi xuôi và mồi ngược) và probe sau khi thiết kế sẽ được đánh giá chất lượng nhờ đánh giá với mẫu HBV DNA ở các nồng độ cao để chứng minh khả năng chọn lọc của cặp mồi và probe Sau đó, cặp primer và probe sẽ

được tối ưu sử dụng chứng dương HBV RNA in-vitro và đánh giá khả năng chọn lọc

với các mẫu bệnh phẩm

Hình 6: Mô tả khả năng chọn lọc của cặp mồi thiết kế

2.2.4 Tổng hợp chứng dương HBV RNA in-vitro

Chứng dương RNA là trình tự pgRNA phiên mã từ khuôn là trình tự DNA sợi

âm trên ngân hàng gen GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/) với mã

số hiệu là MF674382.1, genotype B, subtype B4 là trình tự hệ gen phổ biến nhất ở Việt Nam [2] Trình tự toàn bộ hệ gen HBV DNA đã được công bố trên ngân hàng gen GenBank

Trình tự DNA được tổng hợp nhân tạo và được đưa vào trong vector pJET1.2 Plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA đích được mở vòng bằng enzyme cắt giới hạn

XhoI và làm khuôn cho quá trình tổng hợp RNA in-vitro, để tạo chứng dương pgRNA

của HBV cho quy trình RT-qPCR và tạo bộ mẫu chuẩn HBV pgRNA

Quy trình tổng hợp RNA in-vitro được thực hiện theo quy trình của bộ kit

HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit của New England Biolabs (NEB) Sản phẩm sau tổng hợp sẽ được xử lý trực tiếp với DNase I để loại bỏ DNA còn dư thừa và được tinh sạch bằng bộ kit Monarch RNA Cleanup Kit (NEB)

Sau khi tổng hợp, RNA in-vitro được tổng hợp nhân tạo có nồng độ 2178

ng/µL, các chỉ số A260/A280: 2,17; A260/A230: 2,36 Như vậy chứng dương có nồng độ cao và độ tinh sạch tốt được sử dụng làm mẫu chuẩn dương cho quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA Dựa vào phần mềm NEBioCalculator, quy đổi nồng độ của HBV RNA chứng dương là 6,97 x 1012 bản sao/µl Chất lượng chứng

dương HBV RNA tổng hợp in-vitro đã được đánh giá trong các nghiên cứu liên quan

đến HBV RNA trước đó

Chứng dương sau đó được pha loãng xuống các nồng độ thấp hơn để được sử dụng trong quá trình tối ưu quy trình định lượng HBV RNA huyết tương mới được thiết lập

2.2.5 Quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA huyết tương

Realtime RT-PCR là kỹ thuật realtime PCR có bao gồm bước phiên mã ngược cùng với đó là giai đoạn khuyếch đại gen thu tín hiệu huỳnh quang như kỹ thuật realtime PCR thông thường Realtime RT-PCR được ứng dụng để phát hiện những tác nhân có bản chất di truyền là RNA thay cho DNA trong realtime PCR Thành phần của một phản ứng realtime RT-PCR giống như realtime PCR nhưng mẫu DNA được thay thế bằng RNA

HBV RNA huyết tương được định lượng dựa trên phương pháp RT-qPCR (PCR định lượng có bao gồm bước phiên mã ngược) với cặp primer và TaqMan probe được thiết kế trên vùng gen bảo tồn là vùng gen S của HBV RNA Từ cặp primer và

probe đã thiết kế nhóm nghiên cứu tiến hành tối ưu thành phần phản ứng cũng như chu trình nhiệt của quá trình realtime RT-PCR định lượng chọn lọc HBV RNA

2.2.6 Phân tích, xử lý số liệu

Nồng độ của HBV RNA huyết tương (đơn vị bản sao/ml huyết tương) được tính theo công thức sau:

C=Q x (VRNA/VPCR) x (1/Vext) Trong đó, C là nồng độ của trình tự đích cần tính (đơn vị là bản sao/ml huyết tương), Q là số bản sao trình tự đích xác định được từ phản ứng Realtime RT-PCR định lượng, VRNA tổng thể tích RNA thu được sau quá trình tách chiết, VPCR là thể tích RNA tách chiết dùng cho mỗi phản ứng PCR và Vext là thể tích huyết tương sử dụng để tách chiết (đơn vị là ml)

Các giá trị nồng độ sau đó sẽ được quy đổi về giá trị log10 bản sao/ml và được biểu hiện ở giá trị trung vị (median) cùng giá trị tứ phân vị (interquartile range – IQR)

So sánh sự khác biệt các nồng độ cũng như tốc độ suy giảm của HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân và các thời điểm điều trị khác nhau được thực hiện bởi kiểm định Mann-Whitney U và kiểm định Kruskal-Wallis Phần trăm tỉ lệ dương tính của HBV RNA ở các nhóm bệnh nhân và các thời điểm điều trị khác nhau được so sánh dựa vào kiểm định Chi-square Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện dựa trên phần mềm MedCalc (MedCalc Software Ltd) Giá trị P (two-tailed) nhỏ hơn 0.05 được xác định là sự khác biệt có ý nghĩa thống kê