( TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM SỐ 6 (1) 2011 )KHOA HOC — KŸ THUÂT XÂY DQG QUY TRÌNH REAL TIME PCR TRÊN 16S rRNA GEN CÚA VI KHUAN LAO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 112 ( 17 )TS Lí• Huy in Ái[.]
KHOA THUÂT TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠIHOC HỌC — MỞKŸTP.HCM - SỐ (1) 2011 17 112 XÂY DQG QUY TRÌNH REAL TIME-PCR TRÊN 16S rRNA GEN CÚA VI KHUAN LAO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TS Lí• Huy in Ái 'liỳy ã The Trvony Kim Phiômy,ã* Ho Thy Thanh Thiiyã*ã TĨM TÁT Him Into ‹an mưt nhGng henh nhiËm khuan thvčng găJ› nhat, nguy ën nhün yeu nhiÏm vi khuan Mycobucterium iubercufnsis PCR Ü thuat sinh hoc pliân tæ dævc st dyng làm phirong phóp phćit hien cčic tác nhân nhieiri täc hiét nhiËm viru.s hay cń‹ › i khuân khó nuói cay nhv hyp cua Mycohacterium tuhercułosis bait J›ht o'ng pháp nài ch‹› kit nhanh, xác i có dó nhay cao Vghić'n cúu nài' âvyc lhi c him nham m șc dích -xây ‹In-rig quy trinh Realtime• PCR en Jyng trình ty gen dírh 16S rRN.4, mưt trinh tv duvc únz ‹lung nhicu chic li‘nh vyc' phăn loai hoc- i tin tint hoc chain doán v hr›e L"húnz tơi üã ihùnh cưng lrong vicc thi t he moi/mau dô 16S r RN.ń km nh m phát hien vi khuün law hŸing thuat Realtime PCR dã xác d(nh thưng st i-/ tính dnc him cua he moi/mau dô lrên Iÿ ihuyêt thyc nghiem, d nhay cua moi/mÜu Jô guy trinh Realtime PCR phút hi ÿn DNA vi khn lao âit sƯ lỉong hùn toi thić'ii 10-’ ban suo/ml vù ú‘i the nghieni ąuy trinh Realtime PER phát him vi khuân lao 30 henh phiim ghi rihân it but tit Tù khóa: ó,S rRNA pen, Mycoharterium tuberculosis, Realtime PCR ABSTRACT C.urrentlv, tuberculosi,s i.s slill one ‹›ftlie mo,st common infe‹-tiou.s Ji.seasrs, mainly c‹iiiseJ hv Mycabacterium tubercula,si.s bae'lerium infection PCR IS II łtiolEC Nlar òiri/ogr IEChnią ue used lo ‹leiect infectious agent.f,e,s cia//J viruse.s or bacteria with slowly culture ‹i› in the ease ofMycobacterium tuberculosis because of its/ustne.s.s, accur‹iiene,s,s anJ high sensiti it U"e carried out this s tu‹iy in order to ‹develop ‹i p'roto‹ ol hased on Realtime PCR usinỗã I 6.$ rRNA gene as a tirget sequence which i.s cxtc•n.lively u.ord in taxonomy, molecular c› olul ion and medical diagnostics Web hiiv‹• suc'ceeded in Jesițming ltte primers/pi-ohes on the 165 rRNA gene to detect Mycobacterium tuberculosis hy Realtime PER, have iJcntifirJ the parameter-s oJ thr speci rein' i›ț the primers/prohe, theoretieall i' and cxpcrimentullv the Bens iti ity of the ț›rimers/ț›rohe in the Realtime PCR ț›rotoc’ol reacheJ to 10’ copies/ml, the protocol wa,s also tc.sted on I) samples given good results Kev words dS rIŁ4A gen, Mycohacíeriùt tuberculosis, Realtime Pi R MỊ DÀU Bênh lao vi khuân gây benh lao dã duoc biet rõ tù mot the ky nay‘ N híỵng lieu pháp chüa tf! băng k háng sinh tò hieu quà tü nhiỵng năm 1960 Tuy nhićn, nhúng thâp nićn 90 den nay, dã xuat hien nhieu chùng vi khuan lao kháng thuoc, rat khó chüã tF! Ua dang có nguy co lây lan rat nhanh, de doa hàng triêu nguòi the giói [1, 2] Viet Nam dímg thú 22 naóc có so bénh nhân lao cao tồn câu Năm 2007, Viet Nam c tính có 50 ca nhiem lao mói/nghìn dân ty le mac bcnh 92 ca/nghìn dân Ty lè lao da kháng thuoc tịng sơ ca nhiêm lao mćri 2.7%›, tông so ca dã qua dieu ti I 9% [2] 18 113 TẠP CHÍ KHOA HTAP ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞSO TP.HCM - SỐ 6- (1) 2011 CHỴ KHOA HOC (19) 2011 Hien nay, lao van mot nhùTig benh nhiêm khuân thng gap nhât, ánh hiróng chù u dên phơi vä cíing có thê ành hirịrig dên he than kinh trung irong, he bąch huyet, he tuan hoàn, he nieu duc, xtrong khóp Nguyên nhàn chù yeu nhiem vi khuan Mycobacierium tuberculosis V“e benh ly, khỗng 90%• trirÕng hip nhiem khuan lao tiêm an khòng trieu chug Chan doán benh nhân lao dã dtrqc th¡rc hien bang nhieu phaong phźp khác nhan nhtr ch;Jp X quang phoi, làm phàn log tuberculin, xét nghiem dàm tic tiep tìm tic khuan lao PCR Trong dó, PCR ky thuat sinh hpc phân tù dtrqc s’v dog làm phirong pháp phát hien tác nhân gây nhiêiu d{ac biet nhiêm virus hay vi khuan khó ni cay nhtr truòng hqp cúa Yfycrihacter ium tuher‹ulosis bòi phirøng pháp cho ket q nhanh, xác có nhąy cao Ter nhiiTlg năm 1960, thông tin ve vùng gen I 6S rRNA Jopc nhà khoa hoc tim hieu còng bo Hien nay, vùng ten 165 rRNA mot nhimg vù rig thông tin di truyen diryc sù dung bien nham de dinh danh, phân loąi xây ding phát sinh loài Các hiróng nghiên cćru st dqng vùng gen l 6S rRNA khơng chi giói hąn linh vyc phân loąi hpc, tien hóa hpc mà cịn hng den ïìng dung rong rãi linh v irc chan dốn y hpc, thùy sàn mơi trirịng [3, 4, 6] Vùng gen l 6S rRNA có kích thtróc khồng 1540 bp, mã húa cho phân t(r I 6S rRNA, mot thành phan quan cau thành neø tieu dam vj nhò cùa ribtisome Bên cąnh dac diêm ke trén, gen lćis rRNA vói dac trwg có nhieu vùng bào ton ó cap cho cà nhóm vi kh uan thtrc (Eubacteria) xen kë giiia vùng bào ton dó vùng bien dong nhung lai mang tính bào ton ị câp dơ lồi [3 5] Có the ke mot so cơng trình htróng drug dung US rRNA gen chan doán y hoc Radstrom ct al, 1994, l99fi, 2003, 2008; Xu ei n/, 2003; Le Huyen Ai Thuy ef n/, 2005; Marcello el o/, 2008; Tzanakaki et al, 2005; Rothman et a/, 2010; Chiba ei n/, 2009; vvv Viec sù dqng vùng gen l fiS rRNA phân loąi phà he hpc chi Mycobucteria chù yen @p trung tréø hai vùng trình ty siêu biè dong A B, tirøng Whig hai vùns ›! tFí HUcleotide I 30-210 430-500 (các vi trí duoc tính theo bio gen E cc›//) [7 ß) Trony thęs te, viec chan dốn dinh &nh vi kh lao ‹r nc ta thịi Sian qua chù yen dna vào vùng /S6II0 Dây mot trinh chèn có kích thtróc khống di 2,5 kb có măt hau het bơ gen lồi vi khuan lao Vi c sir dung 1S6 IU vói so bán hien dren mot @ gen nhieu copy làm trình tv dích làm tãng nhay cùa klthuat phat hien lên it nhieu Tuy nhiên, meat hąn che so 1trktig trính dơi thap hø fi trinh tu, khó di chuyen"’, dc mat ó mot so chùng vi khuân lao [9] Do dú, viec xõy dỗmg mot quy trinh dia trờn mot vỴing tririh ty khác nham sung cho tnrịng hip vùng 156110 bj mat di dòi hò1 Up thiet chan dốn phân ter bênh lao the giói, có rat nhieu cịng trình nghićn cúu st dung kÿ thu eat sinh hoc phâJi tií nhir Nested-PCR; Realtime-PCR, Multiplex realtime — PCR PCR-Reverse dot blot vvv, nham phat hien nhanh dinh danh phú’c hop MJ'c’o6ocfcJ io gây bènh lao ị ngi dia trén trìøh to US rRNA gen làm trình ter dích [ń 7, 10, 11 , 12, 13, 14, I S Nhóm nghiên chin chùng uu tien (pa chon kÿ’ thuat Realtime PCR nhanh khai thác uu diem cùa ky thuat nàş', cy the hąi che ngoąi nhiem (do không phài phân tích ket quà bang dies di), nhą & dăc hieu cúa Realtime PCR cúng dê dàng kiem soát NGLYÊN LIĘU VÀ PHU'ØNG PHÁP Ch úng vi hhuan lao Mzcohncierium tuberc ulosis MTB) !Wáu binh phÉm Màu benh pham dm, dich phet co hỗng nghi nhiem vi khuan lao cong ty throng mąi, d'lCh vu sán xuat Vlet Á cung cap Chon 19c 30 man benh pham dã dupe xác d!•h nhiem khuan lao MTB dtroc sù dung cho thù nghiem quy trinh vòa dtipc xây drug nghièn cúu 19 J 14 TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠIH@C HỌC MỞ TP.HCM - SỐ (1) 2011 KHOA — KY THUA? Bang !.Cáchem6i; maudó DNA tit mau dam benh nhân san d ipc xñ IQ bang phosphate bufTer vat irucolytic sol ution ket hop vñi N -Acety 1-I.-Cystcin sc duJv ly trich bang pliirr›iig phap sr dung phc- ‹ú dung tru‹tg nghiên ctru hot/ci lorofcrm, pho‹1y theo phuonü phép cria Chomczj nsti & Sacchi (1 3S7): 100 ¡i l hHyÉt tharih dirqc them vào 900 il frizol plus UNA sau dirqc tùa bang Isoprt paiiol vti chat trq tùa Glyco B tue UNI dirwc giri dung dich TI° l X (Tris-ED’l A) bào quàn -20"C cho dcn stf dun3 /I'ffr//imePCA Thiàt he m‹ri & mm Jii Càc trình tu’ ci’ia gen 16S rRN A diroc thu thâp tù ngân hàng gcn N C D l (http: w wu ncbi iilm.nih.gov) Viec thict ke mli, nhân doi hoi tuan thù càc nguyén tac ce ban de dam bào tinh dac hicu i toi mn cho r hàn iïn Real time PCk Các plian mem só di.ing Sao gom C lustal X L 81 (F.M Bl Châu Âu), Annhyb 4.522, nãiu 2004 (Oli 'ier Frlard, Hoa kev) Phan mém trtrc tuj du BLA Üd (NC i3I, leoa K/›’) h t Up:// w w u' ii c h i ul m ii i h go i /IJ L A ST/’, Phàn mêm Oli o Analyzer 3.Fl ID I, Ho.a k/v) http: /sc itoo1s idtdna.com/scitools’Apr lica- t ione ’Oligt Anais xer'' Moi i-à mau d‹\ sir dung nghiéli com dir‹ic tom tat bang dó S 77 moi xtiôi, TBr irá i ngirpc tronL mOi phan (ml rién biCt Kf?T QUA & THAt3 LL.JN Hin h : Vj trí bat cap cúa môi mau dvi trén trin h tu’ gen 165 rRh A cỳa x'i khuan lao Mycobacterium tuberculosis 61 qaai:ỗgaoyc qaaa Qtct cttcq aat actcgajtqg cỗ*acg;tq agt isca' t 20 115 TẠP CHÍ KHOA HT7jP ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC - SỐ 6- (1) CHI KHOA HtMỞ C TP.HCM SÖ (I9J 20ỵ2011 J Dõn ğ thcTi chtmg tć›i dã thøc hiên kháo sát cåc cỴac tính khác cüa moi I'd" mau"dị nhu cût‹ trt‹c kț r tóc, nhict núny cha*’ thänh phá n ’? CiC , v v) kćt qua (dđ lieu khơng trình hày) Aeu cho th‹a› hü moi'mau dỵ› v ùa thict źe dam hao t‹›t cá thơny so x‘ù› nću ”Fhù n hićm dđ may’ cúa 1zč m/mau d‹› Ï 6ù rRỵ'ł.4 yen c › i khuan )a‹ disc thiCt kc bank cfc phan úny Realtime PIER dia dô tu 10' 10' bàn sao'm1 Hìiih 3: Ket quä khäo sät nh¿ay Hình 2: Ket quă khäo sdt d}ac hieu cúa hue moi/man dõ lt1l S' bet quå cho this' cúc màu DNA F! PV, I ìBV x’à coli chat ket q ›á do‹ ng tính vći tùny cap moi chuyćn hiet dùna de phat hicn chúng (tin hieu htiynh quang vacrt trćn tin hieu nen) Vói căp moi phát hiȘn MTB str dung trčn cúc nyuon USA hán mau khác deu ch‹› kËt qtia âm tính ttín hieu hrtynh quany thap h‹Tn tin hieu nen), chi do‹Tng tính hc m‹›i/mau dč› phút hien M’Łß sù dyny DNA cùa M"ŁR Ket nàș k1zănÿ dtmh hc mûi/mau Jô cćia I ófi rRNA been Izì źhuech dai d{ac hieu ch‹› "JA 11’l*R 10 ban sao/tel khong có tin hieu; ó n/5iig I( DNA 41TI3 10' bàn sao/ml, piá tri C“t la 37.94; tircrnd úng lan I t giü t*! *› * • ác nong dO DN A M"FE 10', 10’, l0' 10' f›ili sao,' ml ›3.60; 29.95; 26.48 22.96 Do do, chù••s tơi ct ihc kct luJan nhąy cüa he moi/man dù rat t‹it i guy trình Realtime PC R trćn hc mJi/mau có thć phńt hicn DC A MT’B ‹ï north 0' bin 'm1 Thy n Eh m qttt frÌøźi benh yhóm C’hiJng tơ i lien hünh thu’ nglii¢m guy trình trćn DNA diryc tách chiet tù 3t) matt hć,nh pham nhicm lao nhan tù cont ty Vİct Á Set q tià cho thay › ńi 30 man thù deu cho ket ‹turn ¿ tính thirc hien phån unp• Realtime PC R rong dù man bcnh pham so IO cho kćt qiià dir‹mg tớnh vri viec rhỳt hin lirỗng DN A MTB thap nl›ït l.08F.+03 10.8 x10' bàn ml IBànp 2) Ket q uå may cûng hoàn toàri phù harp vńi ket qua tliù nhąy c ùa quy trình Realtimc PCR ń' trcn 116 TẠP CHÍ KHOA H ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ—TP.HCM - SỐ (1) 2011 KHOA HOC KY THUÂT Realtime PCR 30 man benh phâm “ Kit quã Realti i me PCR ' › ' e K í Ket qua Real time h i PCR e u m u k í Ket h qua i Realti e me u PCR m a n t ' m a n 1.30E +06= ł,3 xl0‘ 3.54E +03= 3.g4 xl0’ 1.30E 3.50 +08= E*08 1.3 = 3.5 xl0‘ xl0' 1.79E+ 1.56E 09 — +09= 1.79 1.5ó xl0’ x10' 7.t5E- 1.5lE LOS - *09= 7.15 1.51 xł0‘ x10’ 2.69E* I 9.95 05 S E*08 2.ó9 =9.9 x10' 22.ó8E *03 — 2.óR xl0' 29.7SE 2*03 = 9.75 xl0’ 26.23E 3*04 I›.23 xl0’ 23.29E 4*063.29 x lß" 23.29E 5+04 3.29 tilt‘ xl0‘ I.63E* 2.34E 07= *09= 1.63 2.34 xlf)" x10’ ń.34E 5.53 *08= .34 09= xl0‘ 5.53 21.7ßF 6+07 = 1.75 x10" 21.52E 7+07 = 1.*2 xt0" xl0’ 2.34E I +ò4= R 2.34 xl0ã 1.14E *II9 14 2.34E *09 = 2.34 xl0’ I.l3E *t)4= 1.13 x10" xÌ0’ 1.0SE* 4.77E 03 — +03 = 1.05 4.77 xìłł' xlf)' 9.7łł E 0õ'9.7 xÌ0‘ 4.0 0E *0S '4 xl0' 4.łłl JE* 08' xI0 ^ B\zóc dau, mot so ket quå Realtime PCR drręc tiep tuc thù nghiem trćn so lcrcmg mau dã dugc kiem chtmg ląi bang giåi trình ter benh pham Iún hen so sánh vói quy san pham PCR ket quà cúa cà hai ph‹foj1g trinh khäc dâ chuan hóa dć ćłúnh ciá tn dien pháp cho thay hồn tồn trùng khóp áp dung quy trình vàc th rc te KÉT LU N TÀI LIEU THAM KHÁO Benh lao da dang tiep tyc gây ành 1.WHO/HTM/TB/2008.394 (2008), Pnfi-ftr- htróng nghiém trpng den sùc khóe ngir’oi, ‹ ulosis ‹frug re.si›lun‹'‹• in fee 'orl‹l, 4“' mot benh mang tính xã hÿi chù yeu ò refiorl ltte WHØ/Ič!ATLD Glohul Pro¡c‹t on niróc nghèo dang phát triên Viec chàn dốn Anti-tuherculosis Drug Re s i.st‹ince Yurvcilvà phát hien sćrm benh lao cú y lance, Geneva, World Health nghỵa crrc ky quan tron g Orgaii ization v iec phòng chong, dieu tri 2.WHO/H’FM/TB/2009.411 (2009 bênh lây truy en Vói st I Glohal tuho try kinh ph í phía nhà trirịng berculosis ontro-l cùa Cơng ty Vițt Á nhóm Surveillance, Planning, nghièn cùu ch úng tơi Financing, WHO report dieu kien cho phép dã thirc 2009, Geneva, World Health hien nghiên cúu thu Organization dcręc nhỵing ket q nh‹ï sau: (I) thiet ke Le Huyen Ai Thuy, Duony Jïuong Giany, J'hai côrrg he moi/mâu dù 165 rRNA gen Kc Quan, Ho Huynh Thuy Duong (200*), nham phát hien vi khuan lao bang ky thuat Re- Ribos‹›mal RNA yencs an‹J o/›/y/i‹’ufr‹7r/ in aJtime PCR (2) Oã xác dinh thông so vê ruf›id diagnr›.sis ‹›Ț has ferial in/ccfl‹7n'.y tính dăc hiéu cùa he moi/mau dò trûn ly th\iyet ‹Ii'.sea.‹es, Proceeding of g" A-IMBN (Asia- th c nghiem, dô nhą}‘ cùa moi/mau dị Pacific International molecular biol network) quy trình Rea ltime PCR 4.Gregory M.C, Michael R, phát hien DNA vi khuân lao Susanne G, e/ al (2009) dat so lirong bàn mau toi thlêu Phy.Biology r›J' Wy 'r›hu‹-tcri, 10' bdn sao/m1; (3) Dã th ù Advances in microbial nghiem quy trình Realtime physiology, SS: 52 -1 82 PCR phàt hien vi khijân lao 30 mau benh phâm ghi nhan ket tot, mau Jill E Clarridge III (2Œt4}/ymfO{/ćiS’rfi\-'d Get' bgnh phâm vói lirong DNA bàn mau thap nhat JmrxeM is /drJ/ir’rzfíon ofBuckmin on phát hien diiqc có nong DNA 10.8x10' C'łini«2 wi‹mbiokify' ‹ml Infec ti‹ns Diseases, bàn sao/ml Quy trình via hình thành nên Clinical Microbiolo Reviews 17(4):ß4(ł—562 21 22 117 TẠP CHÍ KHOA HTAP ỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ SÖ TP.HCM - SỐ-6201 (1) 2011 CHÏ KHOA H@C ] (J9) I Soumitesh C, Danica H, Michele B, ct n/ 12.Richardson E.T, Samson D i3anaei N (20G7), A detailed analysis of 165 ribosomal (2009), RapidIdeHtyication o[ cobacferiym RNA gene segments for the diagnosi,s of lvherculosi.s and Nontuhurcuhwi tfycrfô/ãpathogenic bacteria, I Microbiol Methods, ria by Multiplex, Real-Time PCR, Journal 69(2): 330—339 of Clinical M icrobiology, 47(5): 1497—1502 7.Bo”ttger E C (1996), Approaches for iden- 13.Patel, I, B, Leonard D G, Pan X ct al ti]i‹ation of fmicroorganisms Despite longer experience with fatty acid profile DNAhased analysis offers several advantages, ASM News, 62: 247—250 2000), Sequent e-ba 'eJ ideofiJicofion of’ MycohaCferium sj›ecies fisifig the HicroSeq 50U 165 rDNA hacterial ideritiJi“cation,system, J Clin Microbiol, 38: 24f›—251 8.Enrico Tortoli (2003), Impu‹’t of Gene ie 14.Richard C l4, Luiz C O, Ray B R' rr ‹i/ Studies on Mycobucterial Tax‹›nomy the (2o03), PCR-BaseJ tlethuJ To Di i•i‘entiate New fy!cohacteria oJ’ the I990s, C.i inical il!z sub.›pecies oJtH• ycobacterium tubercul‹›sis Microbiology Reviews, 319—354 Complex on the Basis of Genomic Deletions 9.Barun M, Natalia E K, Pablo J B, Barry N Journal of Clinical Microbiology, 41(4): K (2006), Molecular EpidemiolO of l 637-1650 Tubercvlo.i i,s: Current In.rights, Cl inical Microbiology Reviews, 19(4): 658—685 15.Soo, P C, Horng Y, T, Hsueh P R, et al (2006) Direct and siinultaneou 10.Blanca I R, Diana Ct, Gregory L S, t•i p identification (2006), Selective enrichment and detection •f ! Hycohacterinm luherculo.si complex i›J‘ mycobactericil DNA in paucibacillary (kITBC) and Mycobacterium tuhei culo› is specimen,i, Microbiol Methods, 67(2): ( B) hy rayid mtiltiplrx nested PCR-ICT 220— 229 11.Cloud, J L., Neal H, Rosenberry R, ef al (2002), IJentiJicutiori ol“ Mycobacterium spp by using u commercial 165 rih‹›somal D.V"A sequencing kit and additional sequencing libraries, I.Clin Microbiol, 4G:400—406 os,soi , J Microbiol Methods, 66: 44 4S ... ter bênh lao the giói, có rat nhieu cịng trình nghićn cúu st dung kÿ thu eat sinh hoc phâJi tií nhir Nested -PCR; Realtime- PCR, Multiplex realtime — PCR PCR-Reverse dot blot vvv, nham phat hien... chèn có kích thtróc khống di 2,5 kb có măt hau het bơ gen loài vi khuan lao Vi c sir dung 1S6 IU vói so bán hien dren mot @ gen nhieu copy làm trình tv dích làm tãng nhay cùa klthuat phat hien lên... MJ''c’o6ocfcJ io gây bènh lao ị ngi dia trén trìøh to US rRNA gen làm trình ter dích [ń 7, 10, 11 , 12, 13, 14, I S Nhóm nghiên chin chùng uu tien (pa chon kÿ’ thuat Realtime PCR nhanh khai thác uu