Khảo sát Điều kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của Độc tố thần kinh bont a và bont b tái tổ hợp từ vi khuẩn clostridium botulinum phân lập tại việt nam

Khảo sát Điều kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của Độc tố thần kinh bont a và bont b tái tổ hợp từ vi khuẩn clostridium botulinum phân lập tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Khuất Hoàng Thùy Linh

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH CHUỖI NHẸ ENDOPEPTIDE CỦA ĐỘC TỐ THẦN KINH BoNT/A VÀ BoNT/B

TÁI TỔ HỢP TỪ VI KHUẨN Clostridium botulinum PHÂN LẬP TẠI

VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Khuất Hoàng Thùy Linh

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH CHUỖI NHẸ ENDOPEPTIDE CỦA ĐỘC TỐ THẦN KINH BoNT/A VÀ BoNT/B

TÁI TỔ HỢP TỪ VI KHUẨN Clostridium botulinum PHÂN LẬP TẠI

VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Phạm Bảo Yên

Hà Nội – Năm 2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Bảo Yên đã hết lòng giúp đỡ, nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều tốt nhất cho em trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn tại Phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học, Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Đại học Quốc gia Hà Nội

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học đã nhiệt tình giảng dạy, truyền thụ cho em những kiến thức, hiểu biết và những kỹ năng, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Em cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trần Thị Minh Nguyệt đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ bảo em trong quá trình nghiên cứu cũng như cho em nhiều lời khuyên hữu ích trong cuộc sống Em cũng cảm ơn các em sinh viên tại Phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học đã giúp đỡ em trong thời gian qua

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân và bạn

bè đã luôn ở bên ủng hộ, khích lệ và động viên trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Học viên

Khuất Hoàng Thùy Linh

1.1 Bệnh ngộ độc botulism và vi khuẩn Clostridium botulinum 9

1.1.1 Lịch sử và phân loại bệnh ngộ độc botulism 9

1.1.2 Thực trạng bệnh ngộ độc botulism hiện nay 10

1.1.3 Vi khuẩn Clostridium botulinum 11

1.1.4 Triệu chứng và điều trị 13

1.2 Độc tố thần kinh botulinum và các protein trong chuỗi dẫn truyền thần kinh 14

1.2.1 Độc tố thần kinh botulinum 14

1.2.2 Các protein trong dẫn truyền thần kinh (SNARE) 17

1.2.3 Cơ chế cắt protein trong chuỗi dẫn truyền thần kinh của BoNT 20

1.3 Các nghiên cứu biểu hiện BoNT tái tổ hợp 21

1.3.1 Một số nghiên cứu về biểu hiện BoNT tái tổ hợp 21

1.3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện protein tái tổ hợp 23

1.3.3 Một số phương pháp đánh giá hiệu quả biểu hiện của protein tái tổ hợp 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Nguyên, vật liệu và thiết bị 32

2.1.1 Mẫu DNA của vi khuẩn C botulinum 32

2.1.2 Mẫu dịch tiết ngoại bào cho phản ứng cắt cơ chất 32

2.1.3 Các hóa chất và nguyên liệu khác 32

2.1.4 Thiết bị 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Phương pháp tách dòng, biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp 35

2.2.2 Xây dựng cách thức đánh giá hoạt tính protein tái tổ hợp trên nền cơ chất được thiết kế 43

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu bằng tin sinh học 44

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Tách dòng đoạn gen bonta-lc và bontb-lc từ chủng C botulinum Cb và chủng C botulinum NIFC672 46

3.1.1 Kết quả tách dòng đoạn gen bonta-lc và bontb-lc vào vector pGEM-T

46

3.1.2 Kết quả tách dòng vào vector biểu hiện của đoạn gen bontb-lc 49

3.2 Thiết kế vector biểu hiện chứa đoạn gen mã hóa cho bontb-lc 53

3.3 Xây dựng cách thức đánh giá hoạt tính của BoNT/A-LC và BoNT/B-LC tái tổ hợp trên nền cơ chất peptide đã được thiết kế 55

3.3.1 Đánh giá thời gian cố định mẫu trên bản gel 55

3.3.2 Đánh giá loại gel điện di SDS-PAGE 57

3.3.3 Đánh giá thời gian và cường độ dòng điện sử dụng trong điện di Tricine-SDS-PAGE 60

Tris-KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

KẾT LUẬN 62

KIẾN NGHỊ 62

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Nội dung tiếng Việt

1 6xHis-tag 6-Histidine-tag 6-Histidine-tag

2 APS Ammonium Persulfate Ammonium Persulfate

3 BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate

5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate

4 βME 2-mecaptoethanol 2-mecaptoethanol

5 BoNT Botulinum neurotoxin Độc tố thần kinh botulinum

6 BoNT/A Botulinum neurotoxin type A Độc tố thần kinh botulinum có

kiểu huyết thanh A

7 BoNT/A- LC BoNT/A light chain Chuỗi nhẹ của BoNT/A

8 BoNT/B Botulinum neurotoxin type B Độc tố thần kinh botulinum có

kiểu huyết thanh B

9 BoNT/B- LC BoNT/B light chain Chuỗi nhẹ của BoNT/B

11 bonta- lc BoNT/A light chain gene

fragment

Đoạn gen mã hóa cho chuỗi nhẹ của BoNT/A

13 bontb- lc BoNT/B light chain gene

fragment

Đoạn gen mã hóa cho chuỗi nhẹ của BoNT/B

14 bp base pair base pair

15 C botulinum Clostridium botulinum Clostridium botulinum

16 CDC Centers for Disease Control

and Prevention

Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh

17 E coli Escherichia coli Escherichia coli

18 GST-tag Glutathione-S-transferase-tag Glutathione-S-transferase-tag

19 IPTG Isopropyl

β-d-1-thiogalactopyranoside

Isopropyl thiogalactopyranoside

β-d-1-20 kb kilobase kilobase

21 kDa KiloDalton KiloDalton

22 LB Luria bertani Luria bertani

23 LD50 Median lethal dose Liều gây chết trung bình

24 MBP-tag Maltose binding protein-tag Maltose binding protein-tag

25 NBT nitro blue tetrazolium nitro blue tetrazolium

26 NIFC National Institute for Food

28 P pastoris Pichia pastoris Pichia pastoris

29 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

30 SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate

31 SDS-PAGE Sodium docecyl

sulfate-polyacrylamide gel

Sodium docecyl polyacrylamide gel

sulfate-electrophoresis electrophoresis

32 SNAP-25 Synaptosomal-associated

protein of 25 kDa

Synaptosomal-associated protein of 25 kDa

33 SNARE Soluble

N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor

Soluble sensitive factor attachment protein receptor

N-ethylmaleimide-34 TEMED Tetramethyl-ethylene-diamine Tetramethyl-ethylene-diamine

35 VAMP Vesicle-associated membrane

protein

Vesicle-associated membrane protein

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.Vi khuẩn C botulinum được nhuộm bằng Gentian tím dưới kính hiển vi 12

Hình 2 Cây phát sinh chủng loại dựa trên phân tích gen 16S rRNA [23] 15

Hình 3 Cấu trúc độc tố BoNT 16

Hình 4 Cấu trúc của SNAP-25 trong tế bào thần kinh [24] 17

Hình 5 Vị trí phân cắt của BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F và BoNT/G trên VAMP trong não chuột [59] 18

Hình 6 Cơ chế hoạt động của BoNT [80] 20

Hình 7 Chu trình phản ứng PCR 36

Hình 8 Vector pGEM-T và vị trí cắt của enzyme giới hạn 37

Hình 9 Vector biểu hiện và vị trí enzyme cắt giới hạn 38

Hình 10 Khuếch đại đoạn gen bonta-lc và bontb-lc 46

Hình 11 Kiểm tra khuẩn lạc mang vector pGEM-T có đoạn chèn bằng PCR 47

Hình 12 Tách dòng đoạn gen bontb-lc của chủng Cb vào vector pET-22b(+) 50

Hình 13 Tách dòng đoạn gen bontb-lc của chủng C botulinum Cb vào vector pETM33 52

Hình 14 Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp 54

Hình 15 Phân tích thời gian cố định mẫu sau điện di 56

Hình 16 Biểu đồ thể hiện lượng cơ chất peptide còn trên bản gel sau khi cố định mẫu trong các khoảng thời gian khác nhau 57

Hình 17 Điện di sản phẩm phản ứng cắt cơ chất trên gel Tris-Tricine-SDS-PAGE58 Hình 18 Sơ đồ quy trình đánh giá hoạt tính BoNT/A-LC và BoNT/B-LC tái tổ hợp trên nền cơ chất peptide thiết kế 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Trình tự các cặp mồi 33

Bảng 2 Thành phần bản gel polyacrylamide 34

Bảng 3 Thành phần phản ứng PCR 35

Bảng 4 Thành phần các đệm dùng trong tinh sạch 41

Bảng 5 Thành phần hóa chất sử dụng trong Western blotting 42

Bảng 6 Thành phần đệm chạy 44

Bảng 7 Trình tự của cơ chất peptide được thiết kế 55

MỞ ĐẦU

Ngày nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang trở thành vấn đề đáng lo ngại trên toàn xã hội Nguyên nhân gây nên ngộ độc thực phẩm có thể đến từ nhiều nguồn khác nhau như dư lượng các chất hóa học trong hoa quả, rau củ, nấm mốc từ thực phẩm bị hỏng và ôi thiu hay đến từ các vi sinh vật khác có khả năng sản xuất độc tố Một số vụ ngộ độc do tiêu thụ pate chay trong khoảng cuối năm 2020 đến 2022 đã dấy lên mối quan ngại sâu sắc về việc thanh kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm hiện nay Các vụ ngộ độc thực phẩm này được xác định được gây ra bởi vi khuẩn

Clostridium botulinum (C botulinum), một loại vi khuẩn kỵ khí có khả năng sinh

độc tố nguy hiểm

Độc tố thần kinh botulinum (BoNT) là loại độc tố mạnh nhất mà con người

biết đến hiện nay được sinh ra bởi các loài vi khuẩn thuộc chi Clostridium [51]

BoNT gây tê liệt thần kinh cơ thông qua việc ức chế quá trình xuất bào tại các synap thần kinh [65] Do độc tính của BoNT có thể gây chết người nên việc phát triển thuốc giải cho độc tố này là vô cùng cần thiết

Để thu được BoNT trực tiếp từ vi khuẩn C botulinum để làm đích phát triển

thuốc là vô cùng khó khăn do điều kiện an toàn phòng thí nghiệm nghiêm ngặt Vậy nên, tổng hợp BoNT tái tổ hợp là sự lựa chọn thích hợp Tuy nhiên, làm việc với độc tố này đòi hỏi điều kiện trang thiết bị đắt đỏ và cũng đặt ra thách thức cho vấn

đề an toàn sinh học Việc chỉ tổng hợp chuỗi nhẹ không chỉ đảm bảo các yêu cầu cho một đích phân tử để phát triển thuốc mà còn giải quyết vấn đề an toàn sinh học

Ở Việt Nam hiện nay, các nghiên cứu về BoNT chỉ mới dừng lại ở cấp độ gen mà chưa có các công trình sâu hơn về protein Vì vậy, với mong muốn có

những nghiên cứu về protein BoNT được sinh ra bởi các chủng C botulinum tại

Việt Nam nên đề tài: “Khảo sát điều kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ

endopeptidase của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam” được thực hiện với mục đích:

- Nhân dòng đoạn gen mã hóa cho bonta-lc và bontb-lc từ chủng

Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam

- Khảo sát điều kiện biểu hiện tối ưu của chuỗi nhẹ của độc tố thần

kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium

botulinum phân lập tại Việt Nam

- Tinh sạch chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ

hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam

- Xây dựng cách thức đánh giá hoạt tính của chuỗi nhẹ của độc tố thần

kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp trên nền cơ chất peptide đã được thiết kế

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh ngộ độc botulism và vi khuẩn Clostridium botulinum

1.1.1 Lịch sử và phân loại bệnh ngộ độc botulism

1.1.1.1 Lịch sử bệnh ngộ độc botulism

Ngộ độc botulism là một dạng ngộ độc gây liệt thần kinh cơ cấp tính xảy ra ở người và động vật có nguyên nhân do nhiễm độc tố thần kinh botulinum (BoNT) [31] Trước cuối thế kỷ XVIII, con người biết rất ít về ngộ độc botulism Justinus Kerner là người đầu tiên đã xuất bản chuyên khảo chi tiết đầu tiên về

“Fleischvergiftungen” (ngộ độc thần kinh) vào những năm 1820 Ông đã viết về sắc lệnh cấm sản xuất xúc xích huyết vì lý do tôn giáo, điều này vô tình đã cứu được nhiều mạng sống [77] Tuy nhiên, các mô tả đáng tin cậy đầu tiên liên quan đến ngộ độc thịt lại đến từ vụ ngộ độc xúc xích ở Württemberg xảy ra vào cuối thế kỷ XVIII [17] Qua việc nghiên cứu và thống kê các vụ ngộ độc trên thế giới, các nhà khoa học nhận định rằng các loại thực phẩm gây ra ngộ độc botulism rất khác nhau giữa các quốc gia và phản ánh văn hóa trong thói quen ăn uống của người dâ ntại quốc gia đó

1.1.1.2 Phân loại bệnh ngộ độc botulism

Bệnh ngộ độc botulism ở người được phân thành năm dạng cơ bản [17]: (1) Ngộ độc qua thực phẩm: thường phát sinh sau khi ăn phải thực phẩm đóng hộp bị

nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum (C botulinum) trong điều kiện kỵ khí, (2) Ngộ độc ở trẻ sơ sinh: xảy ra khi bào tử của vi khuẩn C botulinum nảy mầm và sản

sinh độc tố BoNT cục bộ trong ruột, (3) Ngộ độc đường ruột ở người lớn là những trường hợp hiếm gặp ở người lớn và là một biến thể của ngộ độc trẻ sơ sinh, (4)

Ngộ độc tại các vết thương: xảy ra khi vết thương của bệnh nhân nhiễm vi khuẩn C

botulinum và vi khuẩn phát triển trong điều kiện kỵ khí, (5) Ngộ độc do điều trị: đây

là tác dụng phụ của các liệu pháp điều trị tại chỗ có sử dụng độc tố BoNT như tiêm Botox thẩm mỹ hay các loại thuốc dùng để điều trị rối loạn dưỡng cơ

1.1.2 Thực trạng bệnh ngộ độc botulism hiện nay

1.1.2.1 Thực trạng trên thế giới

Ngộ độc botulism là một bệnh hiếm gặp tại các nước phát triển, tuy nhiên, hằng năm vẫn có các ca tử vong do các biến chứng của bệnh gây ra Tại Pháp, một quốc gia phát triển tiêu biểu tại châu Âu, mỗi năm có thể xảy ra từ 10 đến 25 vụ, thường là do ngộ độc thực phẩm Ngộ độc ở trẻ sơ sinh rất hiếm gặp (chỉ ghi nhận

17 trường hợp từ 2004- 2016) Do tiêu thụ nhiều giăm bông và các chế phẩm từ thịt lợn nên kiểu độc tố B rất phổ biến (khoảng 97% các mẫu bệnh phẩm chứa độc tố kiểu B) trong các trường hợp ngộ độc tại Pháp Tuy nhiên, các vụ ngộ độc nghiêm trọng có nguyên nhân là kiểu độc tố A, F và E đang ngày càng gia tăng tại quốc gia này [53]

Tại Mỹ, trong các năm từ 2001 đến 2017 đã có 326 trường hợp ngộ độc botulism được báo cáo Các vụ ngộ độc thường xảy ra lẻ tẻ và có tần suất trung bình

là 19 vụ mỗi năm Nguyên nhân ngộ độc thường đến từ các loại hoa quả hoặc các thực phẩm có nguồn gốc rau củ đóng hộp gây ra Kiểu độc tố gây bệnh phổ biến ở Mỹ là BoNT/A (khoảng 65%), tiếp theo là BoNT/E với khoảng 25% trường hợp ngộ độc đã ghi nhận có nguyên nhân là kiểu độc tố này Trong khi đó, xếp thứ ba về tần suất xuất hiện tại các vụ ngộ độc là BoNT/B (7%) Tuy không gây ra các trường hợp khẩn cấp về y tế cộng đồng nhưng do mức độ nghiêm trọng của các ca bệnh,

Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC) vẫn xếp C botulinum và

nhóm có nguy cơ sinh học cao, các cơ sở y tế của nước này cũng được khuyến nghị

là nên chứa sẵn một lượng nhất định thuốc kháng độc tố cho BoNT [39]

Theo thống kê của Hệ thống giám sát bùng phát dịch bệnh do thực phẩm quốc gia Trung Quốc công bố, trong giai đoạn từ tháng 1 năm 2004 đến tháng 12 năm 2020, trên toàn Trung Quốc đã xảy ra 80 vụ bùng phát ngộ độc có liên quan

đến C botulinum với tỷ lệ tử vong lên đến 14,25% Trong các vụ ngộ độc được

thống kê thì ngộ độc do BoNT/A được xác định là phổ biến nhất với tỷ lệ 51,85%, tiếp theo là BoNT/B có tỷ lệ xếp thứ hai thấp hơn về độ phổ biến (33,33%) Nghiên

cứu cũng chỉ ra rằng, nguyên nhân chính gây ra các vụ bùng phát ngộ độc đến từ đậu phụ thối và thịt bò khô không được bảo quản và chế biến dung cách [38] Đây cũng là hai món ăn đường phố phổ biến tại Trung Quốc Việc bảo quản và chế biến các món ăn đường phố từ lâu đã là một mối đe dọa về vệ sinh an toàn thực phẩm Ngoài hai món ăn được đề cập trên thì còn nhiều món ăn chế biến theo phương pháp truyền thống khác cũng chứa nguy cơ cao về ngộ độc thực phẩm

1.1.2.2 Tình hình tại Việt Nam

Tại Việt Nam, các vụ ngộ độc botulism chưa từng được ghi nhận trước đây Tuy nhiên, vụ ngộ độc xảy ra vào tháng 8 năm 2020 do ăn pate chay đã khiến ngành

y tế phải nhìn nhận lại nhiều ca bệnh trong quá khứ vì có thể các bệnh nhân tử vong bởi ngộ độc botulism mà không phải là đột quỵ hay một bệnh tiêu hóa cấp tính có triệu chứng tương tự Các mẫu bệnh phẩm trong vụ ngộ độc này được thu thập tại Bệnh viện Chợ Rẫy ghi nhận sự xuất hiện của gen độc tố BoNT/B [25] trong khi kết quả của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương (NIHE) lại cho thấy nguyên nhân gây ra ngộ độc là kiểu độc tố kép A(B) với gen mã hóa cho độc tố B là gen câm [1,45] Một số vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra vào năm 2021 cũng được xác định có nguyên

nhân đến từ thực phẩm nhiễm C botulinum Trong đó có vụ ngộ độc trẻ sơ sinh ở

Hà Nội được xác định nhiễm BoNT có kiểu độc tố kép A(B) với gen B là gen câm [46]

1.1.3 Vi khuẩn Clostridium botulinum

1.1.3.1 Đặc điểm của vi khuẩn Clostridium botulinum

Vi khuẩn C botulinum lần đầu được Emile Pierre van Ermengem phát hiện

vào năm 1895 từ một vụ ngộ độc botulism tại Bỉ Năm 1897, ông đã công bố kết quả phân lập của mình cùng với mô tả về yêu cầu nuôi cấy và độc tố của nó trên tạp

chí vi sinh học của Đức và gọi nó là Bacillus botulinus [12] Sau này, khi chi Bacillus gồm các vi khuẩn hiếu khí được tách riêng ra, Bacillus botulinus được đổi thành C botulinum thuộc chi Clostridium gồm các vi khuẩn kỵ khí [74]

C botulinum là một vi khuẩn Gram dương có hình que, sống kỵ khí, sinh bào

tử, di chuyển được và có khả năng sinh độc tố thần kinh botulinum Các bào tử của

C botulinum có sức đề kháng cao giúp vi khuẩn sống sót trong các điều kiện bất lợi

như nhiệt độ cao, môi trường có pH thấp hay điều kiện kỵ khí [49] C botulinum tồn tại phổ biến trong môi trường đất, nước và không khí bụi C botulinum sản sinh

độc tố trong môi trường kỵ khí như ở trong các loại đồ hộp hay thực phẩm muối chua có khả năng gây ngộ độc thực phẩm

Hình 1.Vi khuẩn C botulinum được nhuộm bằng Gentian tím dưới kính hiển vi

(https://microbe-canvas.com/)

1.1.3.2 Các con đường gây nhiễm vi khuẩn C botulinum

Nguồn gốc chủ yếu gây nhiễm C botulinum đến từ các loại thực phẩm đóng

hộp, đặc biệt là các loại thực phẩm có độ acid thấp (pH >4,6), thực phẩm chế biến sẵn có liên quan đến khoảng 10% số vụ bùng phát [78] Các loại thực phẩm này là môi trường lý tưởng cho vi khuẩn sinh trưởng và sản sinh độc tố Rau quả, cá, trái cây và gia vị là phương tiện truyền bệnh phổ biến nhất Ngoài ra, thịt bò, các sản phẩm từ sữa, thịt lợn, gia cầm và các loại thực phẩm khác cũng có thể gây bệnh [78] Các trường hợp ngộ độc ở trẻ sơ sinh thường do ăn phải bào tử vi khuẩn có trong thực phẩm, đặc biệt là ăn mật ong có chứa bào tử Các trường hợp ngộ độc đường ruột ở người lớn thường xảy ra trên các bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch

Mắt hoặc vết thương hở trên da đôi khi cũng là con đường xâm nhập của vi khuẩn và gây nhiễm độc tố Những trường hợp như vậy thường gây ra bệnh nghiêm trọng Ngoài ra, trong một số trường hợp ngộ độc botulism, bệnh nhân không hề

nhiễm C botulinum mà nguyên nhân gây ngộ độc đến từ việc đưa trực tiếp độc tố

vào cơ thể Những trường hợp này gọi là ngộ độc do điều trị Nguồn gốc thường đến từ các sản phẩm độc tố được sử dụng trong y khoa như tiêm Botox hay một số thuốc diều trị rối loạn dưỡng cơ và một số bệnh liên quan

1.1.4 Triệu chứng và điều trị

1.1.4.1 Các triệu chứng lâm sàng khi nhiễm bệnh

Các triệu chứng lâm sàng của bệnh bắt đầu từ các biểu hiện khó chịu như buồn nôn và nôn và có thể dẫn đến tử vong trong vòng 24 giờ nếu không được điều trị kịp thời Các triệu chứng đầu tiên thường bắt đầu từ 12- 36 giờ sau khi ăn phải chất độc Nhìn đôi, nhìn mờ, yếu nhãn cầu, khó phát âm, khó đọc, khó nuốt và khô miệng là các triệu chứng điển hình của bệnh Các triệu chứng tiếp theo là nhược cơ lan từ đầu xuống đến cổ, cánh tay và ngực, cuối cùng là lan xuống chân Các triệu chứng này có thể kèm theo đau dạ dày, buồn nôn và nôn [17]

Ngoài ra, một số bệnh nhân còn xuất hiện các triệu chứng khác như táo bón,

bí tiểu, giảm tiết các dịch cơ thể ( nước mắt, nước bọt,…), khó tập trung vào mắt và một vài trường hợp xuất hiện giãn đồng tử Tùy thuộc vào liều lượng độc tố mà bệnh nhân nhiễm phải mà các triệu chứng xảy ra trong vài giờ hay thậm chí kéo dài trong vài tuần [17,28,63] Tuy nhiên, các triêu chứng của ngộ độc botulism thường

dễ bị nhầm với triệu chứng của một số bệnh đường tiêu hóa, đột quỵ hay hội chứng Guilain – Barre khiến cho việc chẩn đoán và điều trị gặp nhiều khó khăn hơn

1.1.4.2 Các phương pháp điều trị khi mắc bệnh

Đối với các tình trạng nhiễm độc nhẹ, việc điều trị triệu chứng như hô hấp nhân tạo, đặt ống nội khí quản và mở khí quản, với các trường hợp năng hơn, đặt ống thông dạ dày hoặc nước tiểu sẽ trở thành sự lựa chọn ưu tiên [17,28,63] Thuốc chống độc được chỉ định cho các bệnh nhân mắc ngộ độc botulism do nguyên nhân

ngộ độc thực phẩm Tuy nhiên, hiệu quả của thuốc này vẫn chưa được kiểm chứng trên các dạng ngộ độc khác Ngoài ra, phản ứng quá mẫn vẫn có thể xảy ra với 9-20% các bệnh nhân được chỉ định sử dụng thuốc kháng huyết thanh có nguồn gốc

từ ngựa [17,63,76] Khi có biến chứng, bệnh nhân sẽ được chỉ định sử dụng kháng sinh Trước đây, tỷ lệ tử vong do ngộ độc thịt có thể lên tới 50% nhưng ngày nay, nhờ có sự can thiệp y tế thích hợp, tỷ lệ này đã giảm đáng kể Tuy nhiên, vẫn có khoảng 5-10% tử vong đối với các trường hợp ngộ độc botulism và 2% với ngộ độc botulism ở trẻ sơ sinh [17,28,63]

1.2 Độc tố thần kinh botulinum và các protein trong chuỗi dẫn truyền thần kinh

1.2.1 Độc tố thần kinh botulinum

1.2.1.1 Nguồn gốc và phân loại BoNT

Độc tố thần kinh botulinum (BoNT) (Bontoxilysin, EC 3.4.24.69) có công thức phân tử là C6760H10447N1743O2010S32 là một protein thuộc nhóm neurotoxin

thường do các vi khuẩn thuộc chi Clostridium sinh ra BoNT là chất độc nhất mà

con người biết đến hiện nay với liều gây chết trung bình (LD50) ở người là khoảng 1,3-2,1 ng/kg khi tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp, 10-13 ng/kg khi hít phải hoặc 1000 ng/kg khi uống [3]

Theo phân loại truyền thống, BoNT được phân thành 8 kiểu huyết thanh ( từ

A đến H, trong đó, kiểu H mới được công nhận vào năm 2014) được phân biệt với nhau bằng kháng huyết thanh động vật [35] Trong các kiểu độc tố thì BoNT/ A, BoNT/ B, BoNT/ E, BoNT/ F và BoNT/ H gây độc trên người và vật nuôi, trong khi BoNT/ C và BoNT/ D chỉ gây bệnh ở vật nuôi [59] Tuy nhiên chưa có báo cáo nào

về kiểu độc tố BoNT/ G- kiểu độc tố phân lập từ đất được ghi nhận là gây ra ngộ độc botulism [42] Ngoài ra, do sự sai khác của một số amino acid mà các BoNT được chia nhỏ thành các kiểu phụ A1, B5,… hay vùng trình tự mã hóa của độc tố

mã hóa cho cùng lúc hai kiểu độc tố dẫn đến BoNT được biểu hiện thành kiểu độc

tố kép AB, CD,A(F),…

Ngoài ra, một hệ thống phân loại BoNT dựa trên việc phân tích trình tự gen

16S rRNA cũng được đề xuất bởi Hill và cộng sự cho thấy mối quan hệ về mặt di truyền của các chủng chứa gen bont với nhau và với các loài khác cùng thuộc chi

Clostridium [23]

Hình 2 Cây phát sinh chủng loại dựa trên phân tích gen 16S rRNA [23]

1.2.1.2 Cấu trúc phân tử của BoNT

Mặc dù có sự biến đổi về trình tự acid amin, cũng như sự khác biệt về miễn dịch học, tất cả các kiểu huyết thanh của BoNT đều có chung một cấu trúc phân tử tương tự với nhau BoNT là một chuỗi polypeptide đơn, không hoạt động, dài 150 kDa Khi hoạt động và có hoạt tính, BoNT tách ra thành cấu trúc chuỗi đôi với chuỗi nhẹ (light chain- LC, có độ dài khoảng 50 kDa) có hoạt tính endopeptidase có khả năng phân cắt protein trong dẫn truyền thần kinh và chuỗi nặng (heavy chain-

HC, dài khoảng 100 kDa) được nối với nhau bằng liên kết disulfua Liên kết disulfua, các liên kết không cộng hóa trị và một đoạn duy nhất được cấu tạo bởi đầu tận cùng N của HC, được gọi là "vành đai" bao quanh miền LC [44,54,68] Việc giảm liên kết disulfua giúp giải phóng vị trí hoạt động khiến hoạt tính endopeptidase của chuỗi nhẹ LC được biểu hiện [35] Chuỗi nặng bao gồm hai miền

50 kDa (phần đầu amino- HC-N và phần đầu carboxyl- HC-C) HC-C chịu trách nhiệm liên kết đặc hiệu thần kinh với polysialoganglioside và miền bên trong của protein túi synap Miền HC-N đóng một vai trò quan trọng trong việc chuyển vị trí của chuỗi nhẹ qua màng của túi nội tiết vào tế bào chất [35]

Hình 3 Cấu trúc độc tố BoNT

(A: sơ đồ biểu diễn của BoNT, B: Cấu trúc tinh thể của BoNT/A, Miền xúc tác chuỗi nhẹ có màu xanh lam Miền chuyển vị chuỗi nặng có màu xanh lục, miền liên

kết với thụ thể đầu cuối N và đầu C có màu vàng và đỏ tương ứng Kẽm xúc tác

được thể hiện dưới dạng một quả bóng màu xám.) (BioModels Database, https://www.worldofmolecules.com/)

1.2.2 Các protein trong dẫn truyền thần kinh (SNARE)

Họ protein SNARE là một trong bốn liên họ protein lớn và quan trọng trong dẫn truyền thần kinh Họ protein SNARE gồm ba thành viên: synaptobrevin hay còn gọi là VAMP, syntaxin và SNAP-25 Sự hình thành phức hợp chuyển hóa bởi các protein SNARE trên các màng đối diện khiến các màng này liên hợp lại với nhau từ đó làm mất cân bằng điện tích âm của màng và khiến xung thân kinh vượt qua được hang rào năng lượng do cấu trúc phospholipid kép tạo ra và truyền đến tế bào đích

1.2.2.1 SNAP-25

SNAP-25 là một protein ưa nước gồm 206 acid amin liên kết với màng thông qua các gốc palmityl bằng liên kết thioeste với bốn gốc cysteine có khoảng cách gần

nhau ở trung tâm của protein (Hình 4) Các đầu tận cùng amino N) và carboxyl

(-C) có khả năng bảo tồn cao và cuộn gập liên kết phân tử [24]

Hình 4 Cấu trúc của SNAP-25 trong tế bào thần kinh [24]

Các độc tố thần kinh BoNT/A, E, C1 đã cắt một liên kết peptide đơn ở đầu tận cùng –C để phân cắt SNAP-25 Để BoNT/E phân cắt SNAP-25 tại Arg180-Ile181khi Arg180 tích điện dương và Ile181 có gốc kỵ nước Đây có thể là ứng dụng tiềm năng để thiết kế cơ chất nhận biết BoNT/E Trong khi đó, SNAP-25 bị phân cắt bởi BoNT/A đòi hỏi đầu tận cùng –N tích điện dương và sự xuất hiện của Gln197 tạo vị trí phân cắt Gln197- Arg198 Cơ chất tiềm năng cho BoNT/A có thể được thiết kế có

đầu tận cùng –N tích điện dương và vị trí phân cắt Gln- Arg xuất hiện [61] Ngoài

ra, do SNAP-25 tham gia cấu trúc của synaptobrevin (VAMP) và syntaxin nên BoNT/C1 được chứng minh là cắt đặc hiệu với syntaxin cũng phân cắt SNAP-25 tại

vị trí Arg198-Ala199 liền kề với BoNT/A [22,60]

SNAP-25 hầu hết nằm trên màng sinh chất ở các đầu tận cùng của các synap

và trên khắp sợi trục Trong các túi tiết và các màng bên trong cũng có thể tìm thấy một lượng nhỏ SNAP-25 [5,73] Sự biểu hiện SNAP-25 xuất hiện đồng thời cùng với quá trình tạo synap thần kinh Protein này thể hiện hoạt tính trong quá trình phát triển của các sợi trục và tính dẻo của synap [5]

1.2.2.2 Synaptobrevin (VAMP)

Synaptobrevin (VAMP) là một phần của phức hợp protein SNARE có vai trò kết nối và hợp nhất túi synap và đóng vai trò trung tâm trong quá trình xuất bào thần kinh gồm khoảng 120 acid amin (số lượng acid amin chính xác phụ thuộc vào nguồn gốc của protein) Phần trung tâm của VAMP (khoảng từ acid amin 30-96) được bảo tồn cao, tích điện, ưa nước và chứa vị trí phân cắt của tất cả các độc tố thần kinh Trong tế bào thần kinh, VAMP được neo vào các túi bằng một đuôi kỵ nước ở đầu tận cùng –C trong khi phần còn lại tiếp xúc với bào tương Các thử nghiệm trên chuột cho thấy, BoNT/B, BoNT/D và BoNT/F là các endopeptidase phân cắt đặc hiệu cho VAMP Các nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng trong khi BoNT/B chỉ hoạt động đặc hiệu trên kiểu đồng phân VAMP-2 thì kiểu độc tố D, F

và G lại phân cắt cả hai kiểu đồng phân [59]

Hình 5 Vị trí phân cắt của BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F và BoNT/G trên VAMP

trong não chuột [59]

Hình 5 đã thể hiện vị trí phân cắt của ba loại độc tố trên VAMP-1 và

VAMP-2 não chuột Các vị trí phân cắt này gợi ý cho việc thiết kế cơ chất peptide tiềm năng để nhận biết ba loại độc tố BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F và BoNT/G hoặc

là một ứng dụng tiềm năng trong việc tìm kiếm chất ức chế ba loại protein này Trong khi BoNT/B chỉ có thể phân cắt VAMP-2 của chuột tại vị trí Gln76-Phe77 do VAMP-1 có sự thay thế Val cho Gln thì ba kiểu độc tố còn lại có vị trí phân cắt duy nhất trên cả hai kiểu đồng phân (vị trí phân cắt Lys61-Leu62 trên VAMP-1 và Lys59-Leu60 trên VAMP-2 với BoNT/D; liên kết peptide Gln60-Lys61 trên VAMP-1 và Gln58-Lys59 trên VAMP-2 là vị trí phân cắt của BoNT/F [60]; Ala81-Ala82 trên VAMP-2 và Ala83-Ala84 tại VAMP-1cho BoNT/G [13]) Ở động vật có xương sống,

cả hai dạng đồng phân của VAMP đều cùng được biểu hiện, trong đó, tỷ lệ xuất hiện của VAMP-2 trong tế bào thần kinh chiếm ưu thế hơn

1.2.2.3 Syntaxin

Syntaxin là một họ protein chủ yếu được định vị trong màng trước synap có liên kết với synaptotagmin Syntaxin có vai trò trong điều chỉnh lượng túi synap có sẵn được giả phóng qua quá trình xuất bào [43] Syntaxin có nhiều dạng đồng phân, Trong đó, đồng phân syntaxin 1A và 1B xuất hiện với tần suất chiếm ưu thế và liên kết với SNAP-25 và VAMP-2 tạo thành một phức hợp protein SNARE có vai trò quan trọng trong giải phóng chất dẫn truyền thần kinh [61]

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, BoNT/C là một endopeptidase phụ thuộc kẽm

có khả năng phân cắt chọn lọc đối với syntaxin 1A và 1B Chỉ khi syntaxin 1A và 1B được chèn vào lớp phospholipid kép thì BoNT/C mới có khả năng phân cắt liên kết peptide Lys253-Ala254 trên syntaxin 1A và Lys252-Ala253 đối với syntaxin 1B Tuy nhiên, liên kết Lys-Ala tại các vị trí khác có đầu –C không bị thủy phân lại không bị phân cắt bởi protein này Điều này có thể giải thích do khi syntaxin 1A và 1B chèn vào màng tại lớp phospholipid kép mang liên kết Lys-Ala đã tạo ra một cấu trúc không gian phù hợp với vị trí hoạt động của BoNT/C Tuy nhiên, BoNT/C không

phân cắt các đồng phân khác của syntaxin, thậm chí đồng phân syntaxin 4 trong một

số điều kiện có thể kháng lại BoNT/C [66]

1.2.3 Cơ chế cắt protein trong chuỗi dẫn truyền thần kinh của BoNT

Các BoNT ngăn chặn sự giải phóng Acetylcholine (Ach) từ các đầu mút vận động khiến cho các cơ xương không thể co lại mặc dù vẫn xuất hiện các điện thế hoạt động đi đến các đầu mút vận động [67] Cơ chế hoạt động của BoNT được thể

hiện trong Hình 6 dưới đây

Hình 6 Cơ chế hoạt động của BoNT [80]

Đầu tiên, miền liên kết thụ thể trên chuỗi nặng của BoNT liên kết với thụ thể

bề mặt polysialoganglioside (PSG) trên bề mặt tế bào Sau đó, độc tố đi vào trong tế bào thông qua một tương tác với một thụ thể bề mặt khác (synaptotagmin (thụ thể p65) đối với độc tố BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D và BoNT/G hoặc glycosylated đối với BoNT/A và BoNT/E) [9,29,41,75], sau đó cư trú trong các túi synap Khi dòng ion H+ xuất phát từ các bơm proton acid hóa các túi synap đã kích hoạt các protein vận chuyển Ach trong màng túi xâm nhập và cô đặc Ach tế bào Tại thời điểm này, nếu BoNT không có mặt, các túi synap sẽ sẵn sàng hợp nhất với màng trước synap

và giải phóng Ach vào khe synap Tuy nhiên, sự có mặt của BoNT đã cản trở các bước giải phóng này bằng cách chuyển chuỗi nhẹ trong các túi synap sang tế bào

chất dưới sự hỗ trợ của miền chuyển dịch (đầu tận cùng –N) trên chuỗi nặng và được hoạt hóa dưới sự hoạt động của các enzyme phân cắt như hsp90 và

thioredoxin reductase trong hệ thống thioredoxin Lúc này chuỗi nhẹ có hoạt tính sẽ

vô hiệu hóa các protein trong chuỗi dẫn truyền thần kinh (SNARE) cần thiết cho việc giải phóng Ach Các protein SNARE mục tiêu được phân cắt đặc trưng cho

cắt bởi BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F và BoNT/G; còn BoNT/C cắt cả SNAP–25 và syntaxin Việc các protein SNARE bị vô hiệu hóa khiến Ach không được giải phóng vào các khe synap từ đó dẫn đến việc tê liệt các tín hiệu thần kinh hóa học và

có thể gây liệt cơ [26,30] Thời gian bán hủy của chuỗi nhẹ BoNT và thời gian tổng hợp của protein SNARE sẽ quyết định thời gian tê liệt của các tín hiệu thần kinh [32] Ngoài ra, nếu lượng độc tố tham gia vào quá trình phân cắt đủ lớn có thể dẫn đến việc tê liệt hoàn toàn chuỗi dẫn truyền thần kinh, từ đó có thể dẫn tới tử vong cho người và động vật

1.3 Các nghiên cứu biểu hiện BoNT tái tổ hợp

1.3.1 Một số nghiên cứu về biểu hiện BoNT tái tổ hợp

Từ khi phát hiện nguyên nhân của bệnh ngộ độc thịt đến từ độc tố thần kinh

botulinum của vi khuẩn C botulinum, các nhà khoa học đã có những nghiên cứu

nhằm tìm ra thuốc và vaccine giúp giảm thiểu các nguy cơ tử vong Vào những năm

1930 của thế kỷ trước, một độc tố bất hoạt lần đầu được thử nghiệm trên người Năm 1965, vaccine PBT được thử nghiệm dưới sự cấp phép của CDC Mỹ cho các trường hợp có nguy cơ cao Vaccine này đã được chứng minh là an toàn và được sử dụng cho những người có nguy cơ mắc bệnh cao Khi công nghệ DNA tái tổ hợp ngày càng phát triển, việc phát triển vaccine thế hệ tiếp theo cũng được áp dụng công nghệ này Năm 2004, vaccine tiểu đơn vị tái tổ hợp là miền liên kết thụ thể của BoNT đầu tiên được thử nghiệm lâm sàng trên người Vaccine rBV A/B đã được chứng minh là an toàn và dung nạp tốt với liều thử nghiệm [64]

Công trình nghiên cứu của Smith và cộng sự năm 1998 về việc sử dụng trình

tự các gen mã hóa cho đầu tận cùng –C của chuỗi nặng của BoNT/A và BoNT/B để tổng hợp vaccine đã cho một kết quả đáng khả quan với liều gây chết trên chuột MLD50 có tiêm vaccine là 106 đối với cả hai kiểu độc tố A và B Các thử nghiệm tiếp theo trên chuột đã chứng minh, sản phẩm tái tổ hợp có khả năng bảo vệ cao với liều gây chết MLD50 từ 102 đến 106 [23]

Cùng năm 1998, nghiên cứu của Byrne và cộng sự đã tổng hợp một gen mã hóa cho vùng liên kết trong chuỗi nặng của BoNT/A (BoNT/A-Hc) Gen tổng hợp

này được tạo ra với các vị trí enzyme giới hạn NcoI ở đầu 5’ và SmaI ở đầu 3’ để chèn vào vector biểu hiện trong E coli là pTrc99 Sau đó, đoạn gen tổng hợp được chèn vào vector pHILD4 và được biểu hiện trong Pichia pastoris (P pastoris)

GS115 Protein tái tổ hợp thu được được tinh sạch bằng sắc ký FPLC Sản phẩm tái

tổ hợp trong nghiên cứu này được đánh giá là một ứng của viên vaccine tiềm năng trong các nghiên cứu về hiệu lực và hiệu quả [6]

Năm 2017, các thử nghiệm phát triển vaccine mới của Webb và cộng sự cũng cho kết quả đáng mong đợi Nghiên cứu đã tách dòng và gắn thành công đoạn gen mã hóa cho tiểu đơn vị HC của bốn loại BoNT là BoNT/B1, BoNT/C1, BoNT/E1 và BoNT/F1 vào vector biểu hiện pPICZA của nấm men và đưa vào biểu hiện trong chủng Pichia pastoris (P pastoris) X-33 với khung đọc mở tổng hợp của tiểu đơn vị được thiết kế với ba đột biến trong vị trí hoạt động xác tác HEXXH của BoNT-LC là thay thế hai gốc histidine và một gốc acid glutamic đơn lẻ thành alanine Protein tái tổ hợp được biểu hiện ra có dung hợp thêm 6xHis-tag giúp tinh sạch dễ dàng hơn Việc sử dụng tiểu đơn vị HC của độc tố BoNT không mới nhưng trong nghiên cứu này vaccine được phát triển đã có khả năng chống lại hầu hết các kiểu độc tố được biết đến hiện nay Ngoài khả năng miễn dịch tương đồng so với vaccine rBV A/B thế hệ thứ hai đã được chứng minh là an toàn thì kết quả nghiên cứu còn tạo ra sản phẩm có thể chống lại các loại độc tố BoNT biến dị, điều mà rBV A/B chưa làm được [50]

Các thử nghiệm của Saffarian và cộng sự (2016) đối với chuỗi nhẹ BoNT/A

tái tổ hợp được tổng hợp và ký hiệu là TAT- BoNT/A(1-448) Nghiên cứu đã tách dòng được đoạn gen vào vector biểu hiện pET-28a(+) và tạo ra một protein tái tổ hợp có hoạt tính của chuỗi nhẹ BoNT/A có chứa một đầu gắn 6xHis-tag, đầu còn lại dung hợp một trình tự của liên kết kỵ nước (GSGSGS) [55,56] Plasmid tái tổ hợp

được sao chép trong tế bào E coli BL21 (DE3) và được nuôi cấy trong môi trường

LB có chứa kanamycin Protein tái tổ hợp TAT- BoNT/A(1-448) có khả năng xâm nhập trực tiếp vào tế bào như một BoNT/A tự nhiên do có chứa trình tự của TAT, một peptide nhập bào Các nghiên cứu tiếp theo đã đưa ra điều kiện tối ưu để biểu hiện TAT- BoNT/A(1-448) tái tổ hợp trong điều kiện bình thường và biến tính Nghiên cứu đã chỉ ra điều kiện nhiệt độ và nồng độ chất cảm ứng phù hợp để kết quả biểu hiện thu được BoNT/A tái tổ hợp dạng hòa tan là nhiều nhất [56]

Périer và cộng sự (2021) đã mô tả được đặc tính của một BoNT/A1 tái tổ hợp

in vivo được biểu hiện trong E coli bằng cách thử nghiệm trên cơ xương ngón tay

của chuột nhắt và chuột đồng Các thử nghiệm cho kết quả đáng ngạc nhiên là các đặc tính mà BoNT/A1 tái tổ hợp thể hiện không quá khác biệt so với một BoNT/A1

tự nhiên [50]

1.3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện protein tái tổ hợp

Cùng với sự phát triển nhanh chóng của việc sản xuất protein tái tổ hợp thì những khó khăn và hạn chế của ngày càng tăng lên và biểu hiện rõ ràng hơn Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của việc biểu hiện và sản xuất protein tái

tổ hợp, đặc biệt là sử dụng vật chủ E coli

1.3.2.1 Protein tái tổ hợp đích

Trong khi biểu hiện một protein ngoại lai, điều đầu tiên cần phải quan tâm là protein tái tổ hợp mục tiêu và mục đích biểu hiện của protein này Các thử nghiệm cần xác định rõ ràng xem protein này xuất phát từ đâu, có những yếu tố nào có thể ảnh hưởng đến protein khi nuôi cấy với chủng tự nhiên, đây là một protein tan hay tồn tại trong thể vùi cùng một số yếu tố khác Về mục đích khi tạo ra protein tái tổ

hợp, nghiên cứu cần xác định rõ xem tại sao cần tạo ra protein tái tổ hợp hay protein được biểu hiện ra được dùng để làm gì Nếu protein tái tổ hợp được tạo ra nhằm sản xuất kháng thể thì việc yêu cầu protein tái tổ hợp được biểu hiện ở dạng hòa tan là không cần thiết vì sản phẩm biểu hiện yêu cầu có trình tự của protein chính xác chứ không yêu cầu nghiêm ngặt về cấu trúc gấp trong không gian [33] Trong trường hợp này, việc biểu hiện protein ở dạng thể vùi là phù hợp hơn vì có thể hạn chế tối

đa và bảo vệ protein khỏi sự tiếp xúc với các protease và giảm thiểu đáng kể việc protein quan tâm bị phân cắt bởi protease [48] Tuy nhiên, trong đa phần các nghiên cứu đều yêu cầu các protein tái tổ hợp được biểu hiện dưới dạng hòa tan để tạo ra một protein có cấu trúc không gian phù hợp và có hoạt tính mà nghiên cứu quan tâm đến

1.3.2.2 Vector biểu hiện

Việc sử dụng các vector biểu hiện khác nhau sẽ ảnh hượng đến khả năng biểu hiện đoạn gen mục tiêu do sự khác nhau của promoter có mặt trong vector hoặc các cấu trúc được dung hợp trong vector có thể ảnh hưởng đến quá trình hòa

tan protein tái tổ hợp trong vật chủ E coli Promoter là yếu tố được quan tâm đầu

tiên khi lựa chọn vector biểu hiện do đây là yếu tố quyết định cường độ và thời gian phiên mã [48] Vì vậy, chỉ khi vector được lựa chọn có một promoter đủ mạnh thì protein tái tổ hợp quan tâm mới được biểu hiện nhiều và phù hợp với mục đích biểu hiện Tuy nhiên, nếu protein tái tổ hợp là độc hại thì vector được lựa chọn nên có promoter làm giảm khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp Các hệ thống vector

pET chứa promoter T7 được sử dụng phổ biến nhất ở E coli giúp protein tái tổ hợp

được biểu hiện mạnh mẽ Chỉ khi có mặt chất cảm ứng như IPTG, T7 RNA polymerase được phiên mã dưới sự hoạt động của T7 promoter từ đó bắt đầu phiên

mã protein mục tiêu Tuy nhiên, do promoter T7 là một promoter mạnh nên trong điều kiện không có chất cảm ứng vẫn có thể phiên mã một lượng nhỏ để tạo T7 RNA polymerase Điều này khiến cho protein được biểu hiện trước cảm ứng gây độc cho vật chủ từ đó dẫn đến tế bào ngừng tăng trưởng hoặc gây chết tế bào [40]

Một yếu tố khác được chú ý đến là các cấu trúc được dung hợp trong vector biểu hiện Các cấu trúc này sẽ được sao chép cùng trong khung sao chép với gen của protein tái tổ hợp Các cấu trúc được dung hợp có thể được loại bỏ khỏi protein tái tổ hợp sau biểu hiện và tinh sạch bằng phương pháp thủy phân protein [18] Vector pET có chứa cấu trúc 6-Histidine (6xHis-tag) thường được lựa chọn để thu protein tái tổ hợp do His-tag có ái lực nhỏ hơn ở mức biểu hiện cao khi có mặt promoter mạnh và có sẵn hệ thống tinh sạch sau biểu hiện Tuy nhiên, trình tự chứa 6-Histidine có thể làm giảm tính tan của protein tái tổ hợp mục tiêu được biểu hiện Ngoài ra, hệ thống pGEX hoặc các vector pET có dung hợp GST-tag hoặc MBP-tag

có thể được sử dụng để tăng khả năng biểu hiện của protein đích Tuy nhiên, hạn chế của hai cấu trúc dung hợp này là có kích thước khá lớn (GST: 25 kDa và MBP:

44 kDa) có thể hạn chế và can thiệp vào hoạt động của protein tái tổ hợp nếu không được phân tách đúng cách ra khỏi protein sau khi biểu hiện và tinh sạch protein Các vị trí phân cắt như thrombin, SUMO protease,… có thể được thiết kế để loại bỏ GST-tag và MBP-tag ra khỏi protein tái tổ hợp Ngoài ra, việc không biểu hiện gen đích có thể xảy ra do dịch chuyển khung trong khung đọc của quá trình nhân bản khiến codon kết thúc xuất hiện, protein sẽ bị ngắn lại và có thể bị bất hoạt [15]

1.3.2.3 Vật chủ (dòng tế bào biểu hiện)

Các chủng E coli dùng trong biểu hiện cũng là một yếu tố gây ảnh hưởng

đến quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp Tùy vào mục đích và vector tái tổ hợp mà

dòng tế bào biểu hiện được lựa chon là khác nhau E coli BL21 và các biến chủng

của nó thường xuyên được lựa chọn để biểu hiện protein tái tổ hợp do những chủng

này thiếu ompT và lon protease OmpT là một endoprotease của vi khuẩn có khả năng phân cắt T7 RNA polymerase, trong khi Lon (La) được mã hóa bởi gen lon là

một enzyme phụ thuộc vào ATP sẽ nhanh chóng phá hủy các protein gấp cuộn và

tái tổ hợp Việc loại bỏ lon và ompT đã làm tăng khả năng biểu hiện và làm tăng

tính ổn định của protein tái tổ hợp [15, 33]

Đôi khi để biểu hiện một số protein khó biểu hiện như protein màng, protein chứa các codon hiếm, protein chứa liên kết disulfide hay protein gây độc cho tế bào, các vật chủ được lựa chọn để biểu hiện protein tái tổ hợp phải được biến đổi để có thể biểu hiện được các protein trên [48] Thêm vào đó, việc promoter hoạt động quá mạnh mẽ cũng có thể gây ức chế hoạt động chủa tế bào biểu hiện hoặc gây chết tế

bào Để giảm thiểu việc biểu hiện các yếu tố gây độc cho tế bào, E coli BL21 đã

được cải tiến giúp tế bào vật chủ hạn chế tối đa các bất lợi trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai Vì vậy, mọi đặc tính của protein mục tiêu cần được xem xét đến khi chọn chủng biểu hiện tối ưu

1.3.2.4 Các điều kiện nuôi cấy

Ở vi khuẩn E coli, quá trình phiên mã và dịch mã được kết hợp chặt chẽ với

nhau nên việc sử dụng các chất xúc tác giúp biểu hiện mạnh hay nồng độ chất cảm ứng quá cao có thể dẫn đến việc các protein tổng hợp lại dẫn đến cấu trúc gấp trong không gian hay đổi nên việc giảm tốc độ phiên mã và/ hoặc tốc độ dịch mã có thể tạo điều kiên cho protein tái tổ hợp được tổng hợp và gấp nếp trong không gian đúng cách Nhiệt độ được sử dụng trong qua trình biểu hiện cũng ảnh hưởng đáng

kể đến kết quả thu được [15] Việc sử dụng nhiệt độ cao trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp có thể thúc đẩy quá trình tăng trưởng tế bào, tuy nhiên, do tốc độ tăng trưởng tế bào cao nên có thể dẫn tới xác suất mất plasmid cao hơn và kích thích phân chia sai vector biểu hiện dẫn đến không biểu hiện được gen tái tổ hợp, đặc biệt là đối với tế bào mang plasmid được biểu hiện [52] Mặc dù các phản ứng tổng hợp thường được ưu tiên thực hiện ở điều kiện nhiệt độ cao do sự phụ thuộc nhiệt độ của các tương tác kỵ nước quyết định phản ứng nhưng việc sử dụng nhiệt

độ thấp có khả năng cải thiện mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp Trong điều kiện nhiệt độ thấp, protein được phiên mã và dịch mã chậm hơn, tế bào cũng phân chia chậm hơn giúp protein tái tổ hợp sau khi được tổng hợp sẽ cuộn gấp đúng như mong muốn [48]

Nồng độ chất cảm ứng cũng ảnh hưởng đến lượng protein tái tổ hợp có thể thu được sau biểu hiện Nếu nồng độ chất cảm ứng được sử dụng cho quá trình biểu hiện thấp thì có thể dẫn đến không cảm ứng và nồng độ protein tái tổ hợp được tạo

ra thấp Tuy nhiên, nếu sử dụng nồng độ chất cảm ứng quá cao thì chất cảm ứng trong trường hợp này có thể trở thành một chất ức chế gây ức chế cho quá trình phát triển và sản xuất protein tái tổ hợp của tế bào Việc giảm nồng độ chất cảm ứng có thể ảnh hưởng đến sự giảm tốc độ phiên mã, từ đó gây ảnh hưởng đến quá trình biểu hiểu hiện protein tái tổ hợp Ngoài ra, nồng độ chất cảm ứng, tiêu biểu là IPTG, được sử dụng trong quá trình biểu hiện cũng quyết định khả năng hòa tan của protein tái tổ hợp được biểu hiện [52] Vì vậy, cần giữ nồng độ chất cảm ứng ở một mức phù hợp đối với từng loại protein được biểu hiện Theo nghiên cứu của Ramirez và cộng sự (1994) thì nồng độ IPTG phù hợp được sử dụng trong quá trình biểu hiện nằm trong khoảng từ 0 đến 1 mM Đây là mức độ IPTG mà ở đó nồng độ

chất cảm ứng không gây ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của E coli hoặc nồng độ

tế bào tối đa [38] Tuy nhiên, nồng độ chất cảm ứng được sử dụng cho biểu hiện protein tái tổ hợp cũng được quyết định bởi tế bào vật chủ biểu hiện Ngoài ra chất cảm ứng được sử dụng trong biểu hiện cũng được quyết định bởi vật chủ được lựa chọn cho biểu hiện Vì vậy, tùy thuộc vào vật chủ được lựa chọn mà quyết định khoảng nồng độ chất cảm ứng và chất cảm ứng phù hợp

1.3.2.5 Phương pháp nuôi cấy

Ngoài các yếu tố trên thì phương pháp nuôi cấy cũng quyết định đến lượng protein tái tổ hợp thu được sau biểu hiện Việc lựa chọn phương pháp nuôi cấy phù hợp giúp tối đa hóa lượng protein tái tổ hợp sau biểu hiện thu được Mỗi phương pháp lại có ưu và nhược điểm khác nhau, tùy thuộc vào loại protein tái tổ hợp cần biểu hiện, tế bào biểu hiện được lựa chọn cùng với các điều kiện nuôi cấy và điều kiện phòng thí nghiệm mà lựa chọn phương pháp nuôi cấy phù hợp nhất Trong các phương pháp nuôi cấy thì phương pháp nuôi cấy theo mẻ thường xuyên được sử dụng do có thể kiểm soát được các yếu tố trong quá trình nuôi cấy Với phương

pháp này, ngay từ khi bắt đầu nuôi cấy, các chất dinh dưỡng cần thiết phải được cung cấp bằng cách đưa vào môi trường tăng trưởng [33]

Nói tóm lại, để tăng cường khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp dưới dạng pha tan cần khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện Việc lựa chọn các yếu tố biểu hiện lý tưởng giúp quá trình biểu hiện cho kết quả cao, phù hợp với

kỳ vọng cũng như có thể dẫn đến sự thuận lợi trong các nghiên cứu tiếp theo

1.3.3 Một số phương pháp đánh giá hiệu quả biểu hiện của protein tái tổ hợp

Tùy vào các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình biểu hiện và bản chất của protein mà các protein tái tổ hợp được biểu hiện ra có hiệu quả khác nhau Tùy vào mục đích nghiên cứu, các phương pháp được lựa chọn phù hợp để đánh giá hiệu quả biểu hiện của protein tái tổ hợp

1.3.3.1 Đánh giá hiệu quả biểu hiện bằng điện di SDS-PAGE

Điện di polyacrylamide với SDS là một kỹ thuật thường xuyên được sử dụng trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích phân tách các protein được mô tả bởi Laemmli [36] Kỹ thuật này được mô tả trong quá trình Laemmli nghiên cứu một protein không rõ nguồn gốc di truyền được gọi là IP trên phage T4

Ngày nay, các nghiên cứu về protein vẫn sử dụng điện di để phân tách các hỗn hợp protein phức tạp, khảo sát các thành phần hỗn hợp protein, xác định các biến đổi sau dịch mã hay xác minh tính đồng nhất của các mẫu protein Trong kỹ thuật này, SDS được sử dụng như một chất tích điện âm có khả năng làm biến tính protein và tạo ra tỷ lệ điện tích trên khối lượng không đổi cho phép protein được phân tách dựa trên kích thước SDS-PAGE sử dụng bộ ba đệm để phân tách protein: (1) đệm chứa Tris- glycine được sử dụng cho cả hai điện cực, (2) dung dịch đệm Tris- Cl có pH 6,8 dành cho gel cô và (3) dung dịch đệm Tris- Cl khác có pH 8,8 dành cho gel tách Các thành phần và sự không liên tục của pH trong các đệm đã phối hợp hoạt động với nhau để phân tách các protein [15] Tuy nhiên, không phải protein nào cũng có thể chạy trong SDS-PAGE, pepsin là một ví dụ điển hình cho

trường hợp này khi protein này chạy không ổn định trong SDS-PAGE Lúc này cần chọn một hệ thống điện di khác phù hợp hơn Ngoài ra, khi protein cần phân tích có kích thước nhỏ hơn 10 kDa thì hệ thống điện di Tris- Glycine- SDS-PAGE cũng không còn phù hợp do khả năng liên kết yếu của SDS với protein khiến các protein

có kích thước nhỏ có thể bị mất trong quá trình điện di Tuy nhiên, có thể sử dụng điện di gradient hoặc hệ thống điện di Tris- Tricine- SDS-PAGE để khắc phục tình trạng này

Hệ thống điện di Tris- Tricine- SDS-PAGE có khả năng giúp phân tách các protein có kích thước gần bằng nhau và kích thước nhỏ hơn 10 kDa Hệ thống này

có sự khác biệt dễ nhận thấy nhất so với hệ thống điện di Tris- Glycine- SDS-PAGE

là việc thay thế glycine bằng tricine trong bộ đệm điện cực Tuy nhiên, việc khó thu hồi các protein quan tâm từ bản gel điện di để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo là một nhược điểm khiến nó ít được sử dụng phổ biến như Tris- Glycine- SDS-PAGE

là [18, 19] Dù vậy, đây vẫn là một lựa chọn phù cho các nghiên cứu với các protein

có kích thước nhỏ

1.3.3.2 Đánh giá hiệu quả biểu hiện bằng Western blotting

Western blotting (WB) hay còn được gọi là protein blotting hoặc immunoblotting là kỹ thuật được phát triển từ DNA (Southern) blotting và RNA (Northern) blotting do Towbin và cộng sự mô tả [69] Đây là kỹ thuật thường được sử dụng trong xác định protein WB cho phép chuyển protein từ gel SDS sang màng hấp phụ sau đó sử dụng các mẫu dò kháng thể chứa các kháng thể chống lại các protein cần phân tích cùng với các bước hiện màu giúp khẳng định sự có mặt của protein quan tâm [37] Tùy vào tính chất của protein cần xác định cùng với kháng thể được sử dụng mà bước hiện màu sẽ khác nhau Hiện nay, hai hệ hiện màu được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất cho WB là hiện màu huỳnh quang và hiện màu có sử dụng cơ chất NBT/BCIP [81]

Cùng với sự ra đời của WB thì khả năng phân giải cao của điện di trên gel cũng đạt được khả năng ứng dụng tối đa Trước đây, khi chưa có WB, SDS-PAGE

bị hạn chế khả năng tiếp cận bởi các đầu dò phân tử WB đã trở thành một công cụ hữu ích và mạnh mẽ để mô tả và phát hiện sự có mặt của protein, đặc biệt là các protein có hàm lượng thấp [34]

1.3.3.3 Đánh giá hiệu quả biểu hiện bằng ELISA

ELISA hay xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme được mô tả độc lập lần đầu vào năm 1971 bởi Engvall và Perlmann [11] và bởi van Weemen và Schuurs [70] ELISA khác với các phương pháp cổ điển ở chỗ các tương tác kháng nguyên-kháng thể cụ thể được nhận ra bởi sự kết hợp của một chất đánh dấu enzyme và một chất phản ứng, thường là kháng thể Do có độ nhạy cao mà các chất đánh dấu enzyme có thể được phát hiện bằng phản ứng của chúng với chất nền thích hợp Hơn nữa, các bước của phản ứng ELISA bao gồm các thành phần phản ứng và không phản ứng được tách ra riêng biệt cho phép các thành phần không phản ứng

và có thể ức chế không liên quan dễ dàng được loại bỏ [8]

ELISA có nhiều ưu điểm như độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian để nhận kết quả ngắn, có tính linh hoạt (có thể sử dụng mẫu dịch chiết thô hoặc mẫu đã tinh sạch), chi phí thấp và độ chính xác trong định lượng Ngoài ra, các phản ứng ELISA

có thể đồng thời thực hiện được nhiều mẫu nên được ứng dụng rộng rãi để định lượng các protein quan tâm [8]

1.3.3.4 Đánh giá hiệu quả biểu hiện bằng thử hoạt tính

Một trong số các phương pháp được dùng để đánh giá hiệu quả của biểu hiện protein, đặc biệt là protein tái tổ hợp là thử hoạt tính của protein đó với cơ chất đặc hiệu Tùy vào đặc tính của protein được biểu hiện mà sử dụng các phương pháp thử hoạt tính khác nhau

Với đặc tính thủy phân cơ chất para-nitrophenyl palmitate (pNPP) của lipase nên các nghiên cứu có liên quan đến hoạt tính của lipase thường sử dụng phản ứng thủy phân cơ chất pNPP hoặc các dẫn xuất của pNPP [37,71] để đánh giá hoạt tính của lipase Đặc biệt là với các nghiên cứu với lipase tái tổ hợp

Nuss và cộng sự (2010) đã sử dụng ba đoạn peptide được tổng hợp có trình

tự tương tự một phần của SNAP-25 và VAMP và chứa vị trí phân cắt đặc hiệu của BoNT/A, BoNT/B và BoNT/E [47] Feng cũng đã sử dụng một trình tự peptide tổng hợp tương tự một phần của SNAP-25 cho đề tài nghiên cứu của mình nhưng ngắn hơn đoạn mà Nuss và cộng sự đã sử dụng [14]

Ngoài các phương pháp được đề cập ở trên thì còn rất nhiều phương pháp khác có thể được sử dụng để định lượng protein từ đó đánh giá được hiệu quả của việc biểu hiện protein tái tổ hợp Tùy vào bản chất của protein được quan tâm hay các ứng dụng của protein đó vào các nghiên cứu tiếp theo mà tiến hành lựa chọn một phương pháp phù hợp Việc lựa chọn phương pháp đánh giá hiệu quả của biểu hiện protein tái tổ hợp cũng góp phần có vào việc đánh giá chính xác và mô tả các đặc tính của protein được quan tâm

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên, vật liệu và thiết bị

2.1.1 Mẫu DNA của vi khuẩn C botulinum

Mẫu DNA tổng số Cb được phân lập từ chủng vi khuẩn C botulinum Cb chứa đoạn gen mã hóa cho bontb-lc và mẫu DNA tổng số của chủng C botulinum NIFC 672 chứa đoạn gen mã hóa cho bonta-lc và bontb-lc được cung cấp bởi Viện

Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (NIFC) Các mẫu được bảo quản

ở -20oC

2.1.2 Mẫu dịch tiết ngoại bào cho phản ứng cắt cơ chất

Các mẫu dịch tiết ngoại bào chứa một lượng nhỏ BoNT/A và BoNT/B được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (NIFC) Các mẫu này được dùng làm đối chứng cho quy trình thử hoạt tính của BoNT/A-LC và BoNT/B-LC tái tổ hợp trên nền cơ chất được thiết kế

2.1.3 Các hóa chất và nguyên liệu khác

Các chủng vi sinh vật được sử dụng bao gồm chủng E coli TOP10 (Novagen, Mỹ), chủng E coli BL21 (DE3)- RIL (Novagen, Mỹ), chủng E coli C41

(Lucigen Corp, Anh) được bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các vector thương mại sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm vector tách dòng pGEM-T (Promega, Mỹ), vector biểu hiện pET-22b(+) (Novagen, Mỹ) và pETM33-Nsp5-Mpro (Addgene, Mỹ)

Các cặp mồi sử dụng trong PCR, nhân dòng được trình bày trong Bảng 1

Đoạn gen bonta-lc và bontb-lc được khuếch đại lần lượt bằng hai cặp mồi bonta và

bontb có trình tự mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) đã được công bố trong nghiên cứu

trước đó [27] được thiết kế ở hai vị trí khác nhau nhằm xác định chính xác trình tự gen

bontb-F

bontb-R

5'-AAAATAAGGAGGAGAATATTTATGCC-3' 5'-CTGGAGCTTTAACACTTTTACAC-3' 1345 bp T7-promoter

T7-terminator

5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' pUC19-F

pUC19-R

5'-GCTGCAAGGCGATTAAGTTG-3' 5'-GTTGTGTGGAATTGTCACG-3'

Các hóa chất và bộ kit được sử dụng trong đề tài được đặt mua từ các hãng hóa chất uy tín, tin cậy và đạt độ tinh sạch dành cho các nghiên cứu trong sinh học phân tử Các bộ kit được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR/ Gel (ABT, Việt Nam), Bộ kit tinh sạch plasmid (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: 10X Mastermix MyTaqTM HS Mix- Bioline (Meridian Bioscience, Mỹ), nước cất Thành phần hóa chất dùng cho điện di DNA: Agarose (Serva, Đức), dung dịch đệm TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA), 6X Loading Dye (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) Các

enzyme giới hạn được sử dụng: NcoI, NdeI (New England Biolabs, Mỹ), SacI

(Fermentas, Mỹ) Hóa chất dùng trong cảm ứng biểu hiện gen: Xgal 20 mg/ml, IPTG 1 M, môi trường LB, kháng sinh: 200 mg/ml ampicillin và 100 mg/ml kanamycin

Thành phần hóa chất dùng trong điện di polyacrylamide với SDS- PAGE

nằm trong Bảng 2

Bảng 2 Thành phần bản gel polyacrylamide Loại gel Tên hóa chất Gel tách (µl) Gel cô (µl)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách dòng, biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp

2.2.1.1 Khuếch đại đoạn gen mã hóa cho bonta-lc và bontb-lc bằng kỹ thuật

PCR

Sự khuếch đại đoạn gen bonta-lc 1418 bp và đoạn gen bontb-lc 1345 bp bằng cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự chủng C botulinum Cb và chủng C botulinum 672 (NIFC 672) đã công bố DNA tổng số của chủng C

botulinum NIFC 672 và chủng C botulinum Cb được tinh sạch và sử dụng làm

khuôn cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR) có thành phần được mô tả trong Bảng

3 với chu trình phản ứng trong Hình 7

Hình 7 Chu trình phản ứng PCR

(A: chu trình phản ứng của bonta, B: chu trình phản ứng của bontb)

Sản phẩm PCR sau phản ứng khuếch đại được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, sau đó được tinh sạch bằng bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR

2.2.1.2 Điện di DNA trên gel agarose

Chuẩn bị bản gel agarose cho việc điện di plasmid hoặc sản phẩm PCR bằng cách pha agarose trong đệm TAE nồng độ 1% (1g agarose hòa tan trong 100 ml đệm TAE) Gel agarose được làm nóng chảy thành dạng gel lỏng trong lò vi sóng trong 2- 3 phút, bổ sung chất nhuộm DNA (Redsafe 1X), lắc đều và đổ vào khuôn

có cắm sẵn lược để tạo thành các giếng Bản gel được đặt vào bể chứa đệm TAE Mẫu DNA hoặc mẫu plasmid đã được trộn với 6X Loading Dye được tra vào từng giếng kèm theo thang chuẩn 1 kb Điện di được thực hiện bằng nguồn điện 90- 110V trong thời gian 20- 30 phút Sau khi điện di, bản gel được soi dưới ánh sáng

UV và chụp ảnh

2.2.1.3 Tách dòng đoạn gen mã hóa cho bonta-lc và bontb-lc vào vector tách

dòng pGEM-T và vector biểu hiện pET-22b(+) hoặc pETM33

Sản phẩm PCR của đoạn gen mã hóa cho bonta- lc và bontb- lc sau khi được

tinh sạch bằng bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR được nối vào vector tách dòng pGEM-T bằng enzyme T4 DNA ligase Phản ứng ligate gồm các thành phần: 1 µl T4 DNA ligase; 5 µl đệm 2X của T4 DNA ligase, 1 µl vector pGEM-T và khoảng

100 ng sản phẩm PCR sau tinh sạch Phản ứng nối được thực hiện tại nhiệt độ

phòng trong 3 giờ Sau đó, sản phẩm nối được biến nạp vào dòng tế bào khả biến E

coli TOP10 và nuôi qua đêm trên đĩa thạch LB có bổ sung Xgal 0,02 mg/ml, IPTG

100 mM và ampicillin 0,2 mg/ml Khuẩn lạc trắng trên đĩa thạch được chọn để đem

đi làm phản ứng PCR với cặp mồi vector pUC19 để kiểm tra xem đoạn gen đích đã vào vector chưa Các khuẩn lạc chứa plasmid có đoạn chèn sẽ được đem đi nuôi lỏng qua đêm và tách plasmid

Hình 8 Vector pGEM-T và vị trí cắt của enzyme giới hạn

(Màu đỏ: vị trí cắt đồng thời với vector pET-22b(+); Màu xanh: vị trí cắt đồng thời

với vector pETM33)

(https://worldwide.promega.com/)

Plasmid chứa đoạn gen đích và vector biểu hiện pET-22b(+) được xử lý đồng

thời với NdeI và NcoI (hoặc xử lý đồng thời cùng vector biểu hiện pETM33 với